CN110709517B

CN110709517B - 新型启动子和利用其生产l-氨基酸的方法

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Publication number: CN110709517B
Application number: CN201980000946.9A
Authority: CN
Inventors: 崔先亨; 张真淑; 金亨俊; 尹炳勋; 李智软; 崔允祯
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2018-03-09
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2023-05-30
Anticipated expiration: 2039-03-08
Also published as: AU2019232209B2; US20210002654A1; US11352608B2; CA3073607C; CN110709517A; SG11202002185SA; ZA202001382B; KR102132342B1; BR112020004575A2; JP7018128B2; AR114670A1; TW201940501A; TWI714015B; WO2019172702A1; KR20190106815A; AU2019232209A1; EP3763819A4; JP2021514602A; EP3763819A1; BR112020004575B1

Abstract

本公开涉及新型启动子和利用该启动子生产L‑氨基酸的方法，并且更具体地涉及具有启动子活性的新型多核苷酸、包含该多核苷酸的载体和棒状杆菌属微生物、利用该微生物生产L‑氨基酸的方法和发酵组合物。

Description

新型启动子和利用其生产L-氨基酸的方法

技术领域

本公开涉及新型启动子和利用该启动子生产L-氨基酸的方法，并且更具体涉及具有启动子活性的新型多核苷酸、包含该多核苷酸的载体和棒状杆菌属(Corynebacterium)的微生物、利用该微生物生产L-氨基酸的方法和发酵组合物。

背景技术

L-谷氨酸是通过发酵生产的代表性氨基酸，并且具有独特的、特别的味道，因此是广泛用于食品领域以及医学领域和其他动物饲料领域的重要氨基酸。

已知生产L-谷氨酸的一般方法包括利用短杆菌属(Brevibacterium)或棒状杆菌属微生物和包括其突变菌株的棒状细菌(Amino Acid Fermentation，Gakkai ShuppanCenter：195-215，1986)或者利用大肠杆菌(Escherichia coli)或芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、青霉菌属(Penicillum)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)等微生物(美国专利号3,220,929和6,682,912)的发酵方法。当通过微生物发酵生产L-谷氨酸时，除L-谷氨酸之外的各种物质——包括有机酸——也混合在发酵产物中。

这些有机酸是酸性有机化合物，并且包括乳酸、乙酸、甲酸、柠檬酸、草酸、尿酸等。食品中的有机酸表现出酸味和鲜味，并具有通过降低食物的pH值来防止腐烂的作用。公知乳酸占据通过微生物发酵产生的有机酸的最大部分。

然而，由于通过发酵产生的乳酸部分较高，所以发酵产物的酸味增加，因此适口性可能降低。因此，需要调节通过微生物发酵生产的发酵产物中的乳酸产量。

在此背景下，本发明人已致力降低生产L-谷氨酸的微生物中的有机酸生产力。由此，本发明人开发了具有本公开的启动子活性的新型多核苷酸，并且发现该多核苷酸可以增加菌株中的L-谷氨酸生产力并且其可以降低乳酸生产力，从而完成本公开。

发明内容

[技术问题]

本公开的一个目的是提供具有启动子活性的多核苷酸，其中SEQ ID NO：2的核苷酸序列的第37位核苷酸被G取代。

本公开的另一目的是提供载体，其包含该多核苷酸；和与该多核苷酸可操作地连接的编码目标蛋白的基因。

本公开的再一目的是提供棒状杆菌属微生物，其包含该多核苷酸；和与该多核苷酸可操作地连接的编码目标蛋白的基因。

本公开的再一目的是提供生产目标物质的方法，包括：在培养基中培养棒状杆菌属微生物；和从培养基中回收目标物质。

本公开的再一目的是提供制备发酵组合物的方法，包括通过在培养基中培养棒状杆菌属微生物而进行发酵。

本公开的再一目的是提供通过上述方法制备的发酵组合物。

[技术方案]

在下文中，将详细描述本公开。同时，本公开中公开的每个描述和实施方式可以应用于其他描述和实施方式。也就是说，本公开中公开的各种要素的所有组合都落入本公开的范围内。此外，以下公开的具体描述不应被解释为限制本公开的范围。

为了实现上述目的，本公开的一个方面提供了具有启动子活性的多核苷酸，其中SEQ ID NO：2的核苷酸序列的第37位核苷酸被G取代。

如本文所用，术语“SEQ ID NO：2的核苷酸序列”可以指编码乳酸脱氢酶(LDH)的基因的启动子序列的一部分。

具体地，术语“乳酸脱氢酶”是指使用丙酮酸作为底物生产乳酸(1actate或lacticacid)的酶，并且在本公开中可互换地称为“LDH”。具体地，乳酸脱氢酶的基因可以包括SEQID NO：3的核苷酸序列，并且其蛋白质可以包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列，但是这些不限于此。

如本文所用，术语“启动子”是指编码区上游的非翻译核苷酸的序列，其包括聚合酶结合结构域并且具有启动子的靶基因向mRNA转录起始活性，即，聚合酶所结合以启动基因转录的DNA结构域，并且可以位于mRNA转录起始区域的5′区。具体地，启动子的靶基因可以是乳酸脱氢酶，但不限于此。

本公开的多核苷酸是这样的多核苷酸：其中SEQ ID NO：2的核苷酸序列，即乳酸脱氢酶基因的启动子序列，发生突变。具体地，突变可以是用G取代T——即上述序列的第37位核苷酸。因此，多核苷酸可以由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成。

具体地，术语“修饰”是指遗传或非遗传稳定的表型变化，并且在本公开中可以互换地称为“突变”。

具体地，该多核苷酸可具有相对于不包括多核苷酸修饰的多核苷酸的活性发生改变(增加或减少)的启动子活性。因此，可以调控(增加或减少)与该多核苷酸可操作地连接的靶基因的表达和由靶基因编码的蛋白质的活性，并且进一步可以调控靶基因以外的基因的表达。

基于本公开的目的，该多核苷酸可以是用于减弱乳酸脱氢酶活性的多核苷酸。

另外，该多核苷酸可以是增加L-谷氨酸的产量和/或降低乳酸的产量的多核苷酸。

已知乳酸脱氢酶参与乳酸的生产，但其与L-谷氨酸生产的关系未知并且首次被本发明人确定。具体地，本发明人首次确认了通过乳酸脱氢酶启动子修饰造成乳酸脱氢酶活性降低、以及因此增加L-谷氨酸产量和减少乳酸产量的作用。

在此，“L-谷氨酸(L-glutamic acid或L-glutamate)”是指一种氨基酸并且被分类为非必需氨基酸。已知L-谷氨酸是中枢神经系统中最常见的兴奋性神经递质。此外，由于L-谷氨酸具有鲜味，由此开发了谷氨酸一钠(MSG)并广泛用作增味剂。它一般通过生产L-谷氨酸的微生物的发酵来生产。

另外，术语“乳酸”是一种具有酸味的有机酸。此外，乳酸用作用于食用目的的水果提取物、糖浆和软饮料的酸味剂，并且用于在醇发酵早期阶段防止腐生细菌的繁殖。乳酸一般通过在生产乳酸的微生物中发酵而生产。另外，如果过量生产，发酵产物的质量可能由于过度酸味而劣化，因此乳酸的浓度需要在培养期间被适当调节。

具体地，多核苷酸可以是由SEQ ID NO：1的核苷酸序列构成的多核苷酸。

另外，本公开的核苷酸序列可以通过已知的诱变方法进行修饰，如定向进化、定点诱变等。

因此，多核苷酸可包括这样的多核苷酸：包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少60％，具体地至少70％，更具体地至少80％，还更具体地至少83％、84％、88％、90％、93％、95％或97％的同源性的核苷酸序列。显然，具有这种同源性的多核苷酸序列——其一部分被删除、修饰、取代或添加——也在本公开的范围内，只要所得多核苷酸序列具有与SEQ ID NO：1的核苷酸序列基本上同等或相应的生物活性。

如本文所用，术语“同源性”可以表示与给定核苷酸序列的匹配程度，并且可以以百分比(％)表示。在本公开中，具有与给定核苷酸序列相同或相似的活性的同源序列表示为“％同源性”。与核苷酸序列的同源性可以通过例如算法BLAST(参见Karlin andAltschul，Pro.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873(1993))或FASTA(参见Pearson，MethodsEnzymol.，183，63，1990)来确定。基于此算法，已经开发了被称为BLASTN或BLASTX的程序(参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)。

如本文所用，术语“严格条件”是指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。例如，这种严格条件在文献中有具体描述(例如，J.Sambrook et al.)。例如，严格条件可包括这样的条件：具有高同源性的基因(例如，60％或更多，具体地90％或更多，更具体地95％或更多，还更具体地97％或更多，还更具体地99％或更多)可以彼此杂交，而具有较低同源性的基因不能彼此杂交；或常规DNA杂交(southern hybridization)的条件(即，在相应于60℃，1×SSC，0.1％SDS，具体地60℃，0.1×SSC，0.1％SDS；更具体地68℃，0.1×SSC，0.1％SDS的盐浓度和温度下，洗涤一次，以及具体地两次或三次的条件)。杂交需要两个核苷酸具有互补序列，尽管根据杂交的严重程度，碱基之间的错配是可能的。术语“互补”用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，就DNA而言，腺苷(腺嘌呤，adenosine)与胸腺嘧啶互补，并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开还可以包括基本上相似的核苷酸序列以及与整个序列互补的分离的多核苷酸片段。

具体地，可以利用包括在Tm值55℃下的杂交步骤的杂交条件和利用上述条件检测具有同源性的多核苷酸。另外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此。本领域普通技术人员可以根据其目的适当地调整Tm值。杂交多核苷酸的适当严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且变量是本领域公知的(参见Sambrook et al.，supra，9.50-9.51，11.7-11.8)。

具体地，表述“由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成”是指不排除在使用限制酶时核苷酸的添加、删除和/或突变——其可能在将相应多核苷酸与靶基因连接并用作启动子时连接靶基因的过程中发生。

例如，可以非限制地包括由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成的具有启动子活性的多核苷酸，只要其包括具有本公开的启动子活性并且在严格条件下与互补序列杂交的核苷酸序列，该互补序列是与SEQ ID NO：1的核苷酸序列的全部或一部分互补的序列。

此外，本公开的多核苷酸可以与编码目标蛋白的基因可操作地连接。

如本文所用，术语“基因表达调控序列”是指包含本公开的多核苷酸并且能够表达与该多核苷酸可操作地连接的靶基因的序列。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指具有启动子活性的本公开的多核苷酸功能地(functionally)连接至基因序列以起始和介导靶基因转录。可以利用本领域已知的基因重组技术实现与基因序列的可操作连接，并且可以通过使用本领域已知的限制酶和连接酶进行位点特异性DNA切割和连接，但是这些不限于此。

此外，本公开的基因表达调控序列可以进一步包括用于调控实施基因转录的启动子以外的基因转录的任何操纵序列，以及编码适当的mRNA核糖体结合位点、DNA等以调控转录和翻译的终止的序列。

例如，除了启动子之外，适于原核生物的调控序列还可以进一步包括核糖体结合位点，但不限于此。根据本领域普通技术人员所需，本公开的具有启动子活性的多核苷酸可以由如上所述用于调控基因表达的序列组成。

在本公开中，靶基因是指编码目标蛋白(其表达在微生物中被调控)的基因。

例如，该基因可以是参与选自氨基酸(谷氨酸等)、有机酸(乳酸等)及其组合的产物生产的基因，但不限于此。具体地，该基因可以是编码参与氨基酸(谷氨酸等)生物合成的酶的基因和/或编码参与有机酸(乳酸等)生物合成的酶的基因，但是不限于此。更具体地，该基因可以是编码乳酸脱氢酶(LDH)的基因，但不限于此。本领域普通技术人员可以通过诸如美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)(NIH)的GenBank的已知数据库容易地获得编码LDH的基因的序列。

例如，本公开的基因表达调控序列与编码LDH的基因序列可操作地连接，因此可以增加微生物中谷氨酸的产量并且可以减少乳酸的产量。

本公开的又一方面提供了包含该基因；该多核苷酸；和与该多核苷酸可操作地连接的编码目标蛋白的基因的载体。

该多核苷酸如上所述。

具体地，目标蛋白可以是乳酸脱氢酶(LDH)。

如本文所用，术语“载体”是指具有能够在适当的宿主中表达靶基因的遗传物质的人工DNA分子，并且是指包含该多核苷酸或适当的基因表达调控序列；和与该调控序列可操作地连接的编码目标蛋白的基因的核苷酸序列的DNA构建体。

本公开中使用的载体没有具体限制，只要其可以在宿主细胞中表达，并且本领域已知的任何载体可以用于转化宿主细胞。常规载体的实例可包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。

例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、λLB3、λBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A、Charon21A等；并且作为质粒载体，可以使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的那些。

另外，可以通过用于在宿主细胞中进行染色体插入的载体，用本公开的具有启动子活性的多核苷酸替换染色体中的内源启动子。例如，可以使用载体pECCG117、pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC、pCES208、pXMJ19等，但这些不限于此。

另外，多核苷酸在染色体中的插入可以通过本领域已知的任何方法完成，例如通过同源重组。

由于可以通过诱导同源重组将本公开的载体插入染色体中，可以另外包括选择标记物以确认基因插入染色体成功。选择标记物用于筛选被载体转化的细胞，换句话说，用于确定多核苷酸是否被插入。可以使用提供可选择的表型(如抗药性、营养缺陷、毒剂抗性或表面蛋白表达)的标记物。在用选择剂处理的环境中，只有表达选择标记物的细胞才能存活，或者细胞显示不同的表型，因此可以通过该方法选择成功转化的细胞。

如本文所用，术语“转化”是指将包含多核苷酸或基因表达调控序列和编码目标蛋白的基因的载体导入宿主细胞中以允许基因在宿主细胞中表达。此外，只要靶基因可以在宿主细胞中表达，转化的多核苷酸和编码目标蛋白的基因是位于宿主细胞的染色体上还是染色体外是无关紧要的，并且两种情况都被包括在内。

转化方法可以包括所有将基因表达调控序列和编码目标蛋白的基因导入细胞的方法，并且可以通过根据宿主细胞选择本领域己知的适当标准技术来进行。例如，可以从电穿孔、磷酸钙(CaPO₄)沉淀、氯化钙(CaCl₂)沉淀、微注射、聚乙二醇(PEG)技术、DEAE-葡聚糖技术、阳离子脂质体技术和乙酸钾-DMSO技术中选择适当的标准技术，但不限于此。

本公开的又一方面提供了包含所述多核苷酸；和与所述多核苷酸可操作地连接的编码靶基因的基因的棒状杆菌属微生物。

所述多核苷酸和与所述多核苷酸可操作地连接的编码靶基因的基因如上所述。

如本文所用，术语“微生物”包括所有野生型微生物和天然或人工遗传修饰的微生物，并且其可以是因外源基因插入或内源基因活性增强或减弱而具有特定减弱或增强的机制的微生物。

在本公开中，微生物可包括所述多核苷酸，具体地所述多核苷酸和/或与所述多核苷酸可操作地连接的编码靶基因的基因。可选地，微生物可包括所述多核苷酸或基因表达调控序列和包含所述多核苷酸或基因表达调控序列和编码目标蛋白的基因的载体，但不限于此。另外，可以通过转化将所述多核苷酸、编码目标蛋白的基因和载体导入微生物中，但不限于此。此外，只要该基因可以在微生物中表达，所述多核苷酸和编码目标蛋白的基因是位于染色体上还是位于染色体外是无关紧要的。

基于本公开的目的，包含所述多核苷酸和编码目标蛋白的基因的微生物可以是其中L-谷氨酸产量增加并且乳酸产量减少的微生物。

例如，该微生物可以具有其中乳酸脱氢酶活性减弱的多核苷酸。

在本公开中，微生物可以被没有限制地包括在内，只要其是其中导入了本公开的具有启动子活性的多核苷酸以使该多核苷酸作为启动子操作的微生物。

具体地，微生物可以是棒状杆菌属微生物；更具体地，可以是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)或黄杆菌(Corynebacteriumflavum)；并且具体地，可以是谷氨酸棒状杆菌，但不限于此。

本公开的又一方面提供了生产目标物质的方法，包括：在培养基中培养棒状杆菌属微生物；和从培养基回收目标物质。

多核苷酸和微生物如上所述。

在本公开中，目标物质可以是氨基酸。具体地，除非另有说明，氨基酸可以是L-型氨基酸，并且可以是选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸及其组合的氨基酸，但不限于此。

更具体地，氨基酸可以是谷氨酸，但不限于此。

如本文所用，术语“培养”是指在人工控制的环境条件下培养微生物。在本公开中，利用具有所述多核苷酸的微生物生产目标物质的方法可以通过本领域公知的方法进行。具体地，培养可以以分批方法或连续方法进行，如补料分批方法或重复补料分批方法，但不限于此。用于培养的培养基必须满足所用具体菌株的要求。适用于培养棒状杆菌菌株的培养基是本领域已知的(例如，Manual ofMethods for General Bacteriology，AmericanSociety for Bacteriology，Washington D.C.，USA，1981)。

可用于培养基的碳源可以是糖和碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂质，如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油；脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸(steric acid)、亚油酸；醇，如甘油和乙醇；和有机酸，如乙酸。这些材料可以单独使用或组合使用，但不限于此。

可以使用的氮源的实例包括蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽提取物、玉米浆、豆粕和尿素、或无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源也可以单独使用或组合使用，但不限于此。

可用于培养基的磷源可包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或相应的含钠盐。此外，培养基可含有细胞生长所必需的金属盐，并且除了上述材料外还可补充有生长必需的物质，如氨基酸和维生素。此外，可以使用适于培养基的前体。上述原料可以以分批或连续的方式充足地加入培养物中。

在微生物培养期间，培养物的pH可以通过适当的碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾或氨；或酸性化合物如磷酸或硫酸来调节。可以通过消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯调节发泡。可通过导入氧气或含氧气体混合物(例如空气)来维持培养物的有氧条件。

培养物(培养基)的温度可以一般是20℃至45℃，具体地25℃至40℃。培养可以持续直到获得期望产量的目标物质，具体地10小时至160小时。

从培养物(培养基)中回收目标物质可以通过本领域已知的常规分离方法进行。对于分离方法，可以使用诸如离心、过滤、层析(色谱法，chromatography)、结晶等方法。例如，可以通过离子交换色谱法分离通过低速离心培养基以除去生物质而获得的上清液，但不限于此。在可选的方法中，可以通过进行从培养产物(培养基)中分离细菌细胞和过滤的方法，在没有另外的纯化过程的情况下回收目标物质。在另一种可选的方法中，可以回收目标物质，并且回收步骤可以进一步包括纯化过程。

本公开的又一方面提供了制备发酵组合物的方法，包括通过在培养基中培养棒状杆菌属微生物而进行发酵。

本公开的又一方面提供了通过上述方法制备的发酵组合物。

多核苷酸和微生物如上所述，并且在培养基中培养微生物的步骤也如上所述。

如本文所用，术语“发酵组合物”是指通过在培养基中培养本公开的微生物而获得的组合物。此外，发酵组合物可包括在培养微生物然后适当的后处理后获得的液体或粉末形式的组合物。具体地，适当的后处理过程可以包括，例如，培养微生物的过程、去除细菌细胞的过程、浓缩过程、过滤过程和混合载体的过程，并且还可以包括干燥过程。在一些情况下，后处理过程可以不包括纯化过程。通过培养本公开的微生物获得的发酵组合物的特征在于，谷氨酸产量增加同时乳酸产量减少，从而使得可以提供最佳味道。

另外，“发酵组合物”不排除含有液体或粉末形式的组合物的调味产品(例如，粉末状汤产品、零食调味产品等)。此外，“发酵组合物”不排除进一步包括通过非发酵方法获得的物质或通过非天然方法获得的其他物质的情况，只要通过培养本公开的微生物获得的组合物被包含在其中。

[有益效果]

本公开的新型启动子可以被导入生产氨基酸的微生物中，从而增加微生物中的氨基酸产量并减少有机酸产量。具体地，当利用本公开的新型启动子制备L-谷氨酸时，发酵产物中L-谷氨酸和有机酸的量被调节以改善发酵产物的味道和适口性。

具体实施方式

在下文中，将结合所附示例性实施方式详细描述本公开。然而，本文公开的示例性实施方式仅用于示例目的，而不应被解释为限制本公开的范围。

实施例1：选择用于降低乳酸生产力的突变菌株

实施例1-1：通过UV照射诱导随机突变

为了选择其中L-谷氨酸(其为发酵目标产物)的生产力被提高并且其中乳酸(其降低发酵产物的适口性)的生产力被降低的突变菌株，将野生型谷氨酸棒状杆菌(ATCC13869)接种在含有琼脂的营养培养基上，并在30℃下培养16小时。在室温下用UV照射数百个如此获得的菌落，以诱导在菌株中基因组的随机突变。

实施例1-2：关于突变诱导菌株的发酵效价和菌株选择的实验

然后，进行关于其中已诱导随机突变的突变菌株的发酵效价的实验。

将各菌落在营养培养基中传代培养，然后在发酵培养基中培养5小时。然后，向各培养基以0.4％的浓度加入25％吐温40，然后将各菌落再培养32小时。

营养培养基：

葡萄糖1％，肉汁0.5％，聚蛋白胨1％，氯化钠0.25％，酵母提取物0.5％，琼脂2％，尿素0.2％，pH 7.2

发酵培养基：

原糖6％，碳酸钙5％，硫酸铵2.25％，一磷酸钾0.1％，硫酸镁0.04％，硫酸铁(10mg/L)，生物素(0.3mg/L)，盐酸硫胺(0.2mg/L)

在上述条件下培养各菌落，然后选择生产L-谷氨酸的、L-谷氨酸产量等于或大于野生型谷氨酸棒状杆菌(ATCC13869)所产的突变菌株。另外，对于所选择的突变菌株，通过YSI测量L-谷氨酸的浓度，并通过HPLC测量乳酸的浓度。L-谷氨酸和乳酸的测量浓度示于表1中。

[表1]

菌株	L-谷氨酸(g/L)	乳酸(g/L)
			ATCC13869	14.5	1.5
ATCC13869-m1	15.1	1.2
			ATCC13869-m2	14.0	0.7
ATCC13869-m3	17.7	1.5
			ATCC13869-m4	13.9	2.0
ATCC13869-m5	14.4	1.8
			ATCC13869-m6	16.7	0.9
ATCC13869-m7	18.8	0.4
			ATCC13869-m8	16.2	0.7
ATCC13869-m9	18.9	0.1
			ATCC13869-m10	12.4	2.1
ATCC13869-m11	13.8	2.1
			ATCC13869-m12	15.7	1.4
ATCC13869-m13	15.3	0.8
			ATCC13869-m14	16.4	1.0
ATCC13869-m15	17.2	1.1
			ATCC13869-m16	18.2	0.7

基于表1，选择“ATCC13869-m7”和“ATCC13869-m9”作为其中与野生型菌株所产相比L-谷氨酸产量增加并且乳酸产量减少的菌株。

实施例2：通过基因测序确认突变

为了确认突变菌株的基因突变，将菌株ATCC13869-m7和ATCC13869-m9中的基因与野生型菌株的基因进行比较。

结果是，发现菌株ATCC13869-m7和ATCC13869-m9在编码乳酸脱氢酶的基因的启动子区域的特定位置含有相同的突变。

具体地，确认ATCC13869-m7和ATCC13869-m9含有这样的突变：其中SEQ ID NO：2的启动子区域序列中的第37位核苷酸T被G取代。确认SEQ ID NO：2启动子区域是棒状杆菌属微生物，更具体地野生型谷氨酸棒状杆菌(ATCC13032、ATCC13869和ATCC14067)中通常包含的序列。

因此，在实施例3和4中，试图确认上述突变是否影响棒状杆菌属微生物中谷氨酸和乳酸的产量。

实施例3：导入有突变的菌株的制备和乳酸产量的确认

实施例3-1：导入有突变的菌株的制备

试图制备导入有实施例2中确认的突变的突变菌株。具体地，为了将突变导入野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13869和ATCC13032(即，为了用G取代SEQ ID NO：2多核苷酸序列的第37位核苷酸)，设计75-mer长度的含有目标突变的反向寡核苷酸。

具体地，利用电脉冲法(Appl.Microbiol.Biotechnol.，1999，52：541-545)，将SEQID NO：5的寡核苷酸(30μg)转化到野生型谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13869和ATCC13032中，然后向其加入复合液体培养基(1mL)。然后将所得物在以160rpm振荡的同时在30℃下培养30分钟。然后，将培养基在冰上培育10分钟，在4℃以4000rpm离心10分钟，然后除去上清液以获得微生物细胞。然后，向其加入1mL的10％甘油溶液(4℃)并混合，然后将所得物在4℃下以4000rpm离心10分钟。除去上清液，然后洗涤微生物细胞。再次重复此过程以再次洗涤微生物细胞，并向其加入10％甘油溶液(4℃和0.1mL)以制备用于下一次转化的菌株。然后，利用上述电脉冲法，用SEQ ID NO：5的寡核苷酸重复转化过程10次，然后将所得物接种在复合平板培养基上，以获得菌落(Nat.Protoc.，2014Oct；9(10)：2301-16)。

对所得菌落的基因序列进行分析的结果是，确认目标突变被导入菌株。另外，将其中导入突变的菌株命名为“ATCC13869：：ldh-pro-1mt”和“ATCC13032：：ldh-pro-1mt”。

实施例3-2：确认乳酸的产量

以与实施例1-2中相同的方式培养实施例3-1中制备的突变菌株ATCC13869：：ldh-pro-1mt和ATCC13032：：ldh-pro-1mt以及其野生型谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13869和ATCC13032。

培养完成后，测量各培养基中L-谷氨酸和乳酸的浓度。L-谷氨酸和乳酸的测量浓度示于下表2中。

[表2]

菌株	L-谷氨酸(g/L)	乳酸(g/L)
			ATCC13869	14.5	1.5
ATCC13869：：ldh-pro-1mt	19.2	0.0
			ATCC13032	8.2	2.7
ATCC13032：：ldh-pro-1mt	10.8	0.3

如表2所示，确认其中导入突变的谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13869：：ldh-pro-1mt生产的L-谷氨酸浓度比野生型谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13869生产的浓度高约4.7g/L(约32％)。另一方面，野生型谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13869生产1.5g/L乳酸，但在培养菌株ATCC13869：：ldh-pro-1mt的培养基中未测量到乳酸。

此外，确认其中导入突变的谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13032：：ldh-pro-1mt生产的L-谷氨酸浓度比野生型谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13032生产的浓度高约2.6g/L(约32％)。另一方面，野生型谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13032生产2.7g/L乳酸，但在培养菌株ATCC13032：：ldh-pro-1mt的培养基中测量到痕量的乳酸(0.3g/L)。

也就是说，确认在微生物中突变增加了L-谷氨酸生产力并降低了乳酸生产力。

此外，菌株ATCC13869：：ldh-pro-1mt被命名为CA02-9209，并于2018年2月28日被保藏于布达佩斯条约规定的国际保藏机构韩国微生物保藏中心(Korean Culture Centerof Microorganisms，KCCM)，并被指定登录号KCCM12227P。

实施例4：确认其中导入突变的菌株KFCC11074中生产的酶活性和乳酸量

实施例4-1：导入突变的载体的制备

为了确认突变是否除了野生型菌株之外在谷氨酸生产力提高的菌株中也呈现相同的效果，还尝试将突变导入被称为谷氨酸生产菌株的菌株KFCC11074(韩国专利号10-0292299)。

具体地，构建用于基因取代的载体，以用G取代该菌株中包含的SEQ ID NO：2的多核苷酸序列的第37位核苷酸。用ATCC13869基因组DNA作为模板，通过PCR获得用于构建该载体的基因片段。基于在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)GenBank(NIH GenBank)中登记的谷氨酸棒状杆菌(ATCC13869)的基因和相邻序列的信息，制备包括SEQ ID NO：6、7、8和9的多核苷酸的引物。

在95℃变性5分钟后，在以下条件下进行总共30个循环的PCR：在95℃变性20秒，在55℃退火20秒，和在72℃聚合30秒。然后，聚合反应在72℃下进行5分钟。更具体地，获得利用SEQ ID NO：6和7的引物扩增的多核苷酸(500bp)和利用SEQ ID NO：8和9的引物扩增的多核苷酸(500bp)。通过利用输注酶(infusion enzyme)，将获得的两种DNA片段连接到载体pDZ(韩国专利号10-0924065和国际公开号2008-033001)——其已经用限制酶BamHI和SalI消化，从而制备用于基因取代的载体。将制备的载体命名为“pDZ-ldh-pro-1mt”。用于载体制备的引物序列的信息显示在下表3中。

[表3]

实施例4-2：其中导入突变的KFCC11074的制备和乳酸产量的确认

将在实施例4-1中制备的用于基因取代的载体导入菌株KFCC11074中，以制备“KFCC11074：：ldh-pro-1mt”，其是其中导入突变的谷氨酸生产菌株。将其中未导入突变的谷氨酸棒状杆菌菌株KFCC11074和菌株KFCC11074：：ldh-pro-1mt各自以与实施例1-2相同的方式培养。

培养完成后，测量各培养基中L-谷氨酸和乳酸的浓度。L-谷氨酸和乳酸的测量浓度示于下表4中。

[表4]

菌株	L-谷氨酸(g/L)	L-乳酸(g/L)
			KFCC11074	9.1	22.5
KFCC11074：：ldh-pro-1mt	17.1	6.5

如表4所示，确认其中导入突变的谷氨酸棒状杆菌菌株KFCC11074：：ldh-pro-1mt生产的L-谷氨酸浓度比其中未导入突变的谷氨酸棒状杆菌菌株KFCC11074生产的浓度高约8g/L(约88％)。

另一方面，确认由菌株KFCC11074：：ldh-pro-1mt生产的乳酸浓度比其中未导入突变的谷氨酸棒状杆菌菌株KFCC11074生产的浓度低17g/L。

也就是说，再次确认突变增加了微生物中的L-谷氨酸生产力并降低了乳酸生产力。

实施例4-3：确认其中导入了突变的KFCC11074的酶LDH的活性

由于确认了在实施例4-2中制备的菌株KFCC11074：：ldh-pro-1mt中降低乳酸生产力的机制，并且由于确认了突变被包含在乳酸脱氢酶(LDH)的启动子中，试图确定取决于突变的乳酸脱氢酶的活性，乳酸脱氢酶是生产乳酸的酶。

具体地，以下列方式评价该酶的活性。首先，将细胞在烧瓶(250mL)中的具有下述组成的培养基#3(25mL)中以200rpm在30℃下培养6小时。然后，通过以4000rpm将细胞沉淀10分钟除去上清液，并使用20mM Tris-HCl(25mL，pH7.5)重复细胞洗涤三次。洗涤后，除去上清液，用20％Tris(pH 7.5)中15％的甘油缓冲液(2mL)重新悬浮细胞以进行细胞提取。将重新悬浮的细胞(1mL)置于珠管(bead tube)中，并使用均质器在46/30秒的条件下均质化六次。然后，将所得物以13000rpm在4℃下离心20分钟。

培养基#3：

葡萄糖2％，聚蛋白胨1％，(NH₄)₂SO₄ 1％，KH₂PO₄ 0.52％，K₂HPO₄ 1.07％，酵母提取物1％，尿素0.15％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，d-生物素(1.8mg/L)，硫胺-HCl(9mg/L)，泛酸钙(9mg/L)，烟酰胺(60mg/L)

然后，进行Bradford测定以确认和标准化从珠管获得的上清液(样品)中所含蛋白质的浓度。Bradford测定获得了标准曲线(参考下表5和6)，并确认了样品的浓度。具体地，将1x Biorad蛋白质测定试剂(980μL)加入到总体积为20μL的样品中，然后涡旋，以测量595nm处的吸光度约3分钟。

[表5]

[表6]

细胞提取物	1∶10稀释	1v5稀释	1∶20稀释	1∶50稀释
					细胞提取物(μL)	2	4	(1/10)10	(1/10)4
提取缓冲液(μL)	18	16	10	16
					总体积(μL)	20	20	20	20

然后，使用反应溶液(其组成比例示于下表7中)进行菌株KFCC11074和KFCC11074：：ldh-pro-1mt中乳酸脱氢酶活性的实验。此外，使用30mM丙酮酸钠作为起始剂(starter)。此外，在表8中所示的条件下测量的两种菌株中乳酸脱氢酶的活性显示在下表9中。

[表7]

反应溶液	每1个反应
		0.2M Tris-HCl pH 7.5(μL)	500
30mM丙酮酸钠(μL)	100
		6.6mMNADH(μL)	50
细胞提取物(mg/mL)	178μg
		DDW	上至1mL

[表8]

[表9]

菌株	LDH活性(U)
		KFCC11074	0.398
KFCC11074：：ldh-pro-1mt	0.150

如表9所示，确认了在其中导入突变的菌株中乳酸脱氢酶的活性降低。

也就是说，确认了突变降低了微生物中的乳酸脱氢酶活性，从而降低了乳酸生产力。

总之，本公开的多核苷酸是包括突变(其中单个核苷酸被取代)的乳酸脱氢酶启动子，因此该多核苷酸可以减弱野生型菌株或谷氨酸生产菌株中的乳酸脱氢酶活性——通过突变的启动子的活性；结果是，作为发酵的目标产物的谷氨酸的生产力增加，并且进一步，降低发酵产物适口性的乳酸的生产力降低。因此，本公开的多核苷酸可以有效地用于各种工业领域，以高产率生产谷氨酸。

根据前述内容，本公开所属领域的普通技术人员将能够理解，在不修改本公开的技术思路或重要特征的情况下，本公开可以以其他具体形式实施。在这方面，本文公开的示例性实施方式仅用于示例目的，不应解释为限制本公开的范围。相反，本公开意图不仅涵盖示例性实施方式，还涵盖可以被包括在由所附权利要求限定的本公开的精神和范围内的各种替代形式、修改、等同形式和其他实施方式。

国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约

国际表格

原始保藏接收证明

根据第7.1条发出

至：CJ第一制糖株式会社

330，DONGHO-RO，JUNG-GU，首尔100-400，

大韩民国

上述译文内容与原文一致无误，特此证明。

2018年3月8日

专利代理人孙敏(印)

序列表

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 新型启动子和利用其生产L-氨基酸的方法

<130> OPA18460

<150> KR 10-2018-0028184

<151> 2018-03-09

<160> 9

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LDH启动子区域

<400> 1

tggtctgacc acattttcgg acataatcgg gcataagtaa aggt 44

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌

<400> 2

tggtctgacc acattttcgg acataatcgg gcataattaa aggt 44

<210> 3

<211> 945

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌

<400> 3

atgaaagaaa ccgtcggtaa caagattgtc ctcattggcg caggcgatgt cggagttgca 60

tacgcatatg cactgatcaa ccaaggcatg gcagaccacc ttgcgatcat cgacattgat 120

gaaaagaaac tcgaaggcaa cgtcaaggac ttaaaccatg gtgttgtgtg ggccgattcc 180

cgcacccgcg tcactaaggg aacctacgct gactgcgaag acgcagccat ggttgtcatt 240

tgtgccggcg cagcccaaaa gccaggcgag acccgcctcc agctggtgga caaaaacgtc 300

aagattatga aatccatcgt cggcgatgtc atggacagcg gattcgacgg catcttcctc 360

gtggcgtcca acccagtgga tatcctgacc tacgcagtgt ggaaattctc cggcttggaa 420

tggaaccgcg tgatcggctc cggaactgtc ctggactccg ctagattccg ctacatgctc 480

ggcgaactct atgaagtggc accaagctcc gtccacgcct acatcatcgg cgaacacgga 540

gacaccgaac ttccagtcct gtcctccgcg accatcgccg gcgtatcgct tagccgaatg 600

ctggacaaag acccagagct tgagggccgt ctagagaaaa ttttcgaaga cacccgcgac 660

gctgcctatc acattatcga cgccaagggc tccacttcct acggcatcgg catgggtctt 720

gctcgcatca cccgcgcaat cctacaaaac caagacgttg cagtcccagt ctctgcactg 780

ctccacggtg aatacggtga ggaagacatc tacatcggca ccccagctgt ggtgaaccgc 840

cgaggcatcc gccgcgttgt cgaactagaa atcaccgacc acgagatgga acgcttcaag 900

cattccgcaa ataccctgcg cgaaattcag aagcagttct tctaa 945

<210> 4

<211> 314

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒状杆菌

<400> 4

Met Lys Glu Thr Val Gly Asn Lys Ile Val Leu Ile Gly Ala Gly Asp

1 5 10 15

Val Gly Val Ala Tyr Ala Tyr Ala Leu Ile Asn Gln Gly Met Ala Asp

20 25 30

His Leu Ala Ile Ile Asp Ile Asp Glu Lys Lys Leu Glu Gly Asn Val

35 40 45

Lys Asp Leu Asn His Gly Val Val Trp Ala Asp Ser Arg Thr Arg Val

50 55 60

Thr Lys Gly Thr Tyr Ala Asp Cys Glu Asp Ala Ala Met Val Val Ile

65 70 75 80

Cys Ala Gly Ala Ala Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Gln Leu Val

85 90 95

Asp Lys Asn Val Lys Ile Met Lys Ser Ile Val Gly Asp Val Met Asp

100 105 110

Ser Gly Phe Asp Gly Ile Phe Leu Val Ala Ser Asn Pro Val Asp Ile

115 120 125

Leu Thr Tyr Ala Val Trp Lys Phe Ser Gly Leu Glu Trp Asn Arg Val

130 135 140

Ile Gly Ser Gly Thr Val Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Met Leu

145 150 155 160

Gly Glu Leu Tyr Glu Val Ala Pro Ser Ser Val His Ala Tyr Ile Ile

165 170 175

Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Leu Pro Val Leu Ser Ser Ala Thr Ile

180 185 190

Ala Gly Val Ser Leu Ser Arg Met Leu Asp Lys Asp Pro Glu Leu Glu

195 200 205

Gly Arg Leu Glu Lys Ile Phe Glu Asp Thr Arg Asp Ala Ala Tyr His

210 215 220

Ile Ile Asp Ala Lys Gly Ser Thr Ser Tyr Gly Ile Gly Met Gly Leu

225 230 235 240

Ala Arg Ile Thr Arg Ala Ile Leu Gln Asn Gln Asp Val Ala Val Pro

245 250 255

Val Ser Ala Leu Leu His Gly Glu Tyr Gly Glu Glu Asp Ile Tyr Ile

260 265 270

Gly Thr Pro Ala Val Val Asn Arg Arg Gly Ile Arg Arg Val Val Glu

275 280 285

Leu Glu Ile Thr Asp His Glu Met Glu Arg Phe Lys His Ser Ala Asn

290 295 300

Thr Leu Arg Glu Ile Gln Lys Gln Phe Phe

305 310

<210> 5

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 5

caagagcttg tgcccggatt cctttgttac acctttactt atgcccgatt atgtccgaaa 60

atgtggtcag accaa 75

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

cggtacccgg ggatcctgtg ggtggcgttg ta 32

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

ctttgttaca cctttactta tgcccgatta tgt 33

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

gtaaaggtgt aacaaaggaa tccgggcaca agc 33

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

atgcctgcag gtcgacccac actgcgtagg tc 32

Claims

1.具有启动子活性的多核苷酸，其中所述多核苷酸由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸与编码目标蛋白的基因可操作地连接。

3.载体，包含权利要求1所述的多核苷酸；和与所述多核苷酸可操作地连接的编码目标蛋白的基因。

4.根据权利要求3所述的载体，其中目标蛋白是乳酸脱氢酶。

5.棒状杆菌属微生物，包含根据权利要求1所述的多核苷酸；和与所述多核苷酸可操作地连接的编码目标蛋白的基因。

6.根据权利要求5所述的微生物，其中所述多核苷酸由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成。

7.根据权利要求5所述的微生物，其中所述目标蛋白是乳酸脱氢酶。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的微生物，其中所述棒状杆菌属微生物是谷氨酸棒状杆菌。

9.用于生产目标物质的方法，包括：

在培养基中培养根据权利要求5-7中任一项所述的棒状杆菌属微生物，和

从培养的所述培养基回收所述目标物质。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述目标物质是氨基酸。

11.用于制备发酵组合物的方法，包括通过在培养基中培养根据权利要求5-7中任一项所述的棒状杆菌属微生物进行发酵。