TWI714015B - 新穎啓動子及使用該啓動子製造l-胺基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本揭示係有關於新穎啟動子及使用該啟動子製造L-胺基酸的方法，及更特定言之，係有關於具有啟動子活性之新穎多核苷酸、包含該多核苷酸之載體及棒狀桿菌(Corynebacterium)屬之微生物、使用該微生物製造L-胺基酸的方法、及發酵組成物。

Description

新穎啟動子及使用該啟動子製造L-胺基酸的方法
本揭示係有關於新穎啟動子及使用該啟動子製造L-胺基酸的方法，及更特定言之，係有關於具有啟動子活性之新穎的多核苷酸包含該多核苷酸之載體及棒狀桿菌(Corynebacterium)屬之微生物使用該微生物製造L-胺基酸的方法及發酵組成物。
L-麩胺酸乃藉發酵製造的代表性胺基酸，具有獨特的與眾不同的味道，因而其乃廣用於食品領域以及醫藥領域及其它動物飼料領域的重要胺基酸。
已知L-麩胺酸的典型製造方法包括使用短桿菌(Brevibacterium)屬或棒狀桿菌屬微生物及棒狀菌群細菌，包括其突變菌株的發酵方法(胺基酸發酵(Amino Acid Fermentation)，創價出版中心(Gakkai Shuppan Center)：195-215,1986)；或使用大腸桿菌(Escherichia coli)或桿菌(Bacillus)、鏈絲菌(Streptomyces)、青黴菌(Penicillum)、克雷白氏菌(Klebsiella)、歐文氏菌(Erwinia)、泛生菌(Pantoea)等屬之微生物的發酵方法(美國專利案第3,220,929及6,682,912號)。當透過微生物發酵製造 L-麩胺酸時，除了L-麩胺酸以外的各種物質(包括有機酸類)被混入發酵產物內。
此等有機酸乃酸性有機化合物，包括乳酸、乙酸、甲酸、檸檬酸、草酸、尿酸等。食物中的有機酸具有酸味及鮮味，及具有藉降低食物的pH而防止食物腐敗的效果。一般已知乳酸占透過微生物發酵產生的有機酸中之最大部分。
然而，隨著藉發酵產生的乳酸比例的較高，發酵產品中的酸味增加，結果，適口性可能減低。因此，需要調整透過微生物發酵製造的發酵產物中之乳酸產量。
有鑑於此，本發明人已經致力於減少L-麩胺酸產生性微生物的有機酸生產力。結果，本發明人已發展出本揭示之具有啟動子活性的新穎多核苷酸，及發現該多核苷酸能够增加菌株的L-麩胺酸生產力，且發現其能減少乳酸生產力，因而完成本揭示。
本揭示之一目的係提供一種具有啟動子活性之多核苷酸，其中該SEQ ID NO：2之核苷酸序列的第37個核苷酸係經以G取代。
本揭示之另一目的係提供一種載體，其包含該多核苷酸；及可操作式鏈接至該多核苷酸的編碼標靶蛋白質之基因。
本揭示之又另一目的係提供一種棒狀桿菌屬之微生物，其包含該多核苷酸；及可操作式鏈接至該多核苷酸的編碼標靶蛋白質之基因。
本揭示之又另一目的係提供一種用於製造標靶物質之方法，其包含：於培養基內培養該棒狀桿菌屬之微生物；及自該培養基回收該標靶物質。
本揭示之又另一目的係提供一種用於製造發酵組成物之方法，其包含經由於培養基內培養該棒狀桿菌屬之微生物而加以發酵。
本揭示之又另一目的係提供一種經由前述方法製造的發酵組成物。
後文中，將以細節描述本揭示。同時，於本揭示中披露的各記載及具體例可應用至其它記載及具體例。換言之，於本揭示中披露的各種元素的全部組合皆係落入於本揭示之範圍內。又復，後文披露的特定記載不應解譯為限制本揭示之範圍。
為了達成上述目的，本揭示之一態樣提供一種具有啟動子活性之多核苷酸，其中該SEQ ID NO：2之核苷酸序列的第37個核苷酸係經以G取代。
如於本文中使用，術語「SEQ ID NO：2之核苷酸序列」可指稱編碼乳酸脫氫酶(LDH)之基因的啟動子序列之一部分。
特別地，術語「乳酸脫氫酶」係指使用丙酮酸鹽作酶基質而製造乳酸鹽(亦即乳酸)的酵素，及於本揭示中可被互換地命名為「LDH」。特定言之，乳酸脫氫酶的基因可包括SEQ ID NO：3之核苷酸序列，及其蛋白質可包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列，但非受此所限。
如於本文中使用，術語「啟動子」係指在編碼區上游的未經 轉譯之核苷酸序列，其包括聚合酶結合域，及其具有用於將啟動子的標靶基因轉錄成mRNA的轉錄起始活性，亦即，聚合酶結合到其上以起始基因轉錄的DNA域，及其可位在mRNA轉錄起始區的5’-區。特定言之，啟動子的標靶基因可以是乳酸脫氫酶，但非受此所限。
本揭示之多核苷酸為於其中SEQ ID NO：2之核苷酸序列，亦即，乳酸脫氫酶基因的啟動子序列係經突變的多核苷酸。特定言之，突變可以是以G取代T，T為如上序列的第37個核苷酸。因此，該多核苷酸可由SEQ ID NO：1之核苷酸序列組成。
特別地，術語「修飾(modification)」係指遺傳上穩定的或非遺傳上穩定的表現型改變，且於本揭示中可與稱作為「突變」者互換。
特定言之，該多核苷酸具有啟動子活性，該活性相對於不包括該多核苷酸修飾的多核苷酸活性係經修飾(增加或減少)。因此，可操作式鏈接至該多核苷酸的標靶基因之表達及由該標靶基因編碼的蛋白質活性可經調節(增加或減少)，及又復，標靶基因以外的基因之表達可經調節。
為了達成本揭示之目的，多核苷酸可以是用於衰減乳酸脫氫酶之活性的多核苷酸。
此外，多核苷酸可以是用於增加L-麩胺酸的產量及/或用於減少乳酸的產量者。
已知乳酸脫氫酶係涉及乳酸的製造，但其與L-麩胺酸的製造間之關係未明，且係由本發明人首次加以識別。特別地，本發明人首次確證藉由修飾乳酸脫氫酶之啟動子而減低乳酸脫氫酶活性，以及因相同修飾而增加L-麩胺酸的產量及減少乳酸的產量之效果。
於本文中，「L-麩胺酸」或「L-麩胺酸鹽」係指一種胺基酸，其被歸類為非必需胺基酸。L-麩胺酸已知為中樞神經系統中最常見的興奮性神經傳遞物質。此外，因L-麩胺酸具有鮮味，故已自其中發展出麩胺酸一鈉(MSG)，及廣用作為提鮮劑(風味提升劑)。其通常係透過L-麩胺酸生產性微生物發酵製造。
此外，術語「乳酸」乃一種具有酸味的有機酸。此外，乳酸被使用作為食用目的的水果萃取物、糖漿、及軟性飲料的酸味劑，且被使用來預防在酒精發酵早期的腐生菌增殖。乳酸通常係由乳酸生產性微生物發酵製造。此外，若過量製造，則發酵產物的品質可能因過度酸味而變差，因此，於培養期間，乳酸濃度須經適當調整。
特定言之，多核苷酸可以是由SEQ ID NO：1之核苷酸序列組成者。
此外，本揭示之核苷酸序列可藉已知之突變發生方法加以修飾，諸如導向演化、位點導向突變等。
因此，多核苷酸可包含下述多核苷酸，其包括與SEQ ID NO：1之核苷酸序列具有至少60%、特別地至少70%、更特別地至少80%，及又更特別地至少83%、84%、88%、90%、93%、95%、或97%同源性的核苷酸序列。顯然具有此種同源性的多核苷酸序列(其中一部分係經刪除、修飾、取代、或添加)也係落入於本揭示之範圍內，只要結果所得的多核苷酸序列具有實質上等於或相當於SEQ ID NO：1之核苷酸序列的生物活性即可。
如於本文中使用，術語「同源性」可指示與指定核苷酸序列的匹配程度，及可以百分比(%)呈現。於本揭示中，具有與指定的核苷酸序 列相同活性或相似活性的同源性序列係以「%同源性」呈現。與核苷酸序列的同源性例如，可藉演算法BLAST(參考Karlin and Altschul,Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993)或FASTA(參考Pearson,Methods Enzymol.,183,63,1990))測定。基於此演算法，已發展出稱作BLASTN或BLASTX的程式(參考http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)。
如於本文中使用，術語「嚴苛條件」係指允許在多核苷酸間之特定雜交的條件。舉例言之，此等嚴苛條件係特別描述於參考文獻(例如，J.Sambrook等人)。舉例言之，嚴苛條件可包括於其中具有高度同源性(例如，60%或以上，特別地90%或以上，更特別地95%或以上，又更特別地97%或以上，及又更特別地99%或以上)的基因能够彼此雜交，而具有較低同源性的基因無法彼此雜交的條件；或習知南方雜交的條件(亦即，於對應於60℃，1xSSC，0.1% SDS；特別地於60℃，0.1xSSC，0.1% SDS；及更特別地於68℃，0.1xSSC，0.1% SDS的鹽濃度及溫度洗滌一次，及特別地洗滌兩次或三次的條件)。雜交要求兩個核苷酸具有互補序列，但取決於雜交的苛刻度，鹼基間可能有錯配。術語「互補」係用來描述能够彼此雜交的核苷酸鹼基間之關係。舉例言之，就DNA而言，腺嘌呤係與胸腺嘧啶互補，及胞嘧啶係與鳥嘌呤互補。因此，本揭示也可包括實質上相似的核苷酸序列，以及與整個序列互補的經分離之多核苷酸片段。
特定言之，具有同源性的多核苷酸可使用包括於55℃之Tm值之雜交步驟的雜交條件檢測，及使用前述條件檢測。此外，Tm值可以是60℃、63℃、或65℃，但非受此所限。熟諳技藝人士可根據其目的適當地調整Tm值。多核苷酸的雜交適當嚴苛度係取決於多核苷酸的互補長度及互 補程度，及變量為業界眾所周知(參考Sambrook等人，參見上文，9.50-9.51，11.7-11.8)。
特別地，表示法「由SEQ ID NO：1之核苷酸序列組成」意味著，當使用限制酶時，並不排除當該對應多核苷酸接合到標靶基因且用作為啟動子時，可能於鏈接到標靶基因之處理程序期間出現的核苷酸之添加、刪除、及/或突變。
舉例言之，由SEQ ID NO：1之核苷酸序列組成的具有啟動子活性之多核苷酸可涵括其中，而無特殊限制，只要其包括具有本揭示之啟動子活性的核苷酸序列，及其於嚴苛條件下與SEQ ID NO：1之核苷酸序列的全部或部分互補序列雜交即可。
又復，本揭示之多核苷酸可操作式鏈接至編碼標靶蛋白質之基因。
如於本文中使用，術語「基因表達調節序列」係指一序列其包括本揭示之多核苷酸，及其能够表達可操作式鏈接至該多核苷酸的標靶基因。
如於本文中使用，術語「可操作式鏈接」表示具有啟動子活性之本揭示之多核苷酸係功能上鏈接至該基因序列，以起始並媒介標靶基因的轉錄。與基因序列的可操作式鏈接可使用業界已知之基因重組技術達成，位點特異性DNA裂解與接合可藉由使用業界已知之限制酶及接合酶進行，但非受此所限。
又復，本揭示之基因表達調節序列可進一步包括任何操縱子序列(其係用於調節用以進行基因轉錄的該啟動子以外的基因轉錄)，以及 編碼合宜mRNA核糖體結合位點、DNA等的序列(其係用於調節轉錄及轉譯的結束)。
舉例言之，除了啟動子之外，適用於原核生物的調節序列可進一步包括核糖體結合位點，但非受此所限。如熟諳技藝人士要求，具有啟動子活性的本揭示之多核苷酸可由如上述用於調節基因表達的序列組成。
於本揭示中，標靶基因係指編碼標靶蛋白質之基因，其表達係將在微生物體內調節者。
舉例言之，基因可以是涉及選自於由下列所組成之組群中之產物製造的基因：胺基酸類(麩胺酸等)、有機酸類(乳酸等)、及其組合，但非受此所限。特定言之，基因可以是編碼涉及胺基酸類(麩胺酸等)之生合成的酶之基因，及/或編碼涉及有機酸類(乳酸等)之生合成的酶之基因，但非受此所限。更特定言之，基因可以是編碼乳酸脫氫酶(LDH)之基因，但非受此所限。編碼LDH之基因序列可由業界熟諳技藝人士透過已知基因庫，諸如美國國家衛生院(NIH)的基因存庫(GenBank)容易地取得。
舉例言之，本揭示之基因表達調節序列係可操作式鏈接至編碼LDH之基因序列，因而可增加微生物體的麩胺酸產量及可減少乳酸的產量。
本揭示之又另一態樣提供一種載體，其包含該基因；該多核苷酸；及可操作式鏈接至該多核苷酸的編碼標靶蛋白質之基因。
多核苷酸係如前文描述。
特定言之，標靶蛋白質可以是乳酸脫氫酶(LDH)。
如於本文中使用，術語「載體」係指具有能够在合宜宿主體表達標靶基因的遺傳物質之人造DNA分子，及係指DNA構成體，其包括多核苷酸或合宜基因表達調節序列；及可操作式鏈接至該調節序列的編碼標靶蛋白質之基因的核苷酸序列。
本揭示中使用的載體並無特殊限制，只要其能於宿主細胞內表達即可，業界已知之任何載體皆可被使用來轉形宿主細胞。習知載體之實施例可包括天然質體或重組質體、黏接質體、病毒、及噬菌體。
舉例言之，至於噬菌體載體或黏接質體載體可使用pWE15、M13、λLB3、λBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A、Charon21A等；及至於質體載體，可使用基於pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等者。
此外，染色體內之內生性啟動子，可透過宿主細胞內用於染色體插入的載體，而以具有啟動子活性之本揭示之多核苷酸置換。舉例言之，可使用載體pECCG117、pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC、pCES208、pXMJ19等，但非受此所限。
此外，多核苷酸之插入染色體內可藉業界已知之任何方法達成，例如藉同源重組達成。
因本揭示之載體可藉誘導同源重組而被插入染色體內，故可額外地涵括選擇標記以確證基因已成功地插入染色體內。選擇標記係用於篩選以該載體轉形的細胞，換言之，選擇標記係用於判定該多核苷酸是否已被插入。可使用提供可選擇表現型的標記，諸如抗藥性、營養缺陷型、對毒性劑之抗性、或表面蛋白質之表達的標記。於已使用選擇劑處理的環 境中，唯有表達該選擇標記的細胞能够存活，或細胞顯示不同的表現型，因此，已成功地轉形的細胞可透過此種方法加以選擇。
如於本文中使用，術語「轉形」係指包含多核苷酸或基因表達調節序列及編碼標靶蛋白質之基因的載體被導入宿主細胞內，以許可該基因於宿主細胞內表達。又復，只要標靶基因能在宿主細胞內表達，則已轉形的多核苷酸及編碼標靶蛋白質之基因是否係位在宿主細胞的染色體或在染色體外無關緊要，兩種情況皆係涵括在內。
轉形方法可包括將基因表達調節序列及編碼標靶蛋白質之基因導入細胞內的全部方法，及取決於宿主細胞，可藉選用業界已知之合宜標準技術進行。舉例言之，合宜標準技術可選自於電穿孔、磷酸鈣(CaPO4)沈澱、氯化鈣(CaCl2)沈澱、微注射、聚乙二醇(PEG)技術、DEAE-葡聚糖技術、陽離子性微脂粒技術、及乙酸鋰-DMSO技術，但非受此所限。
本揭示之又另一態樣提供一種棒狀桿菌屬之微生物，其包含該多核苷酸；及可操作式鏈接至該多核苷酸的編碼標靶蛋白質之基因。
該多核苷酸及可操作式鏈接至該多核苷酸的編碼標靶蛋白質之基因係如前文描述。
如於本文中使用，術語「微生物」包括野生型微生物及天然基因修飾的或人工基因修飾的微生物全體，及其可以是因外來基因的插入或因內生性基因活性之增強或衰減而具有特定衰減機制或增強機制的微生物。
於本揭示中，微生物可包括該多核苷酸，特定言之，該多核苷酸及可操作式鏈接至該多核苷酸的編碼標靶蛋白質之基因。另外，微生物可包括該多核苷酸或該基因表達調節序列、及涵括該多核苷酸或基因表 達調節序列及編碼標靶蛋白質之基因的載體，但非受此所限。此外，該多核苷酸、編碼標靶蛋白質之基因、及載體可藉轉形而被導入微生物體內，但非受此所限。再者，只要基因可在微生物體內表達，則多核苷酸及編碼標靶蛋白質之基因是否係位在染色體或在染色體外無關緊要。
為了達成本揭示之目的，涵括該多核苷酸及編碼標靶蛋白質之基因的微生物可以是於其中L-麩胺酸的產量增加而乳酸的產量減少者。
舉例言之，微生物可具有於其中乳酸脫氫酶的活性衰減的多核苷酸。
於本揭示中，可涵括微生物而無特殊限制，只要其為具有啟動子活性之本揭示之多核苷酸被導入其中，使得其操作為啟動子的微生物即可。
特定言之，微生物可以是棒狀桿菌屬之微生物；更明確言之，可以是麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)或黃棒狀桿菌(Corynebacterium flavum)；及最明確言之，可以是麩胺酸棒狀桿菌，但非受此所限。
本揭示之又另一態樣提供一種用於製造標靶物質之方法，其包含：於培養基內培養該棒狀桿菌屬之微生物；及自該培養基回收該標靶物質。
該多核苷酸及微生物係如前文描述。
於本揭示中，標靶物質可以是胺基酸。特定言之，除非另行陳述，否則胺基酸可以是L-型胺基酸，及可以是選自於由下列所組成之組群中之胺基酸：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、蘇胺酸、絲 胺酸、半胱胺酸、麩胺醯胺、蛋胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、苯基丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、脯胺酸、及其組合，但非受此所限。
更明確言之，胺基酸可以是麩胺酸，但非受此所限。
如於本文中使用，術語「培養」係指在人為控制的環境條件下培養微生物。於本揭示中，使用具有該多核苷酸的微生物製造標靶物質之方法可藉業界廣用的方法進行。特定言之，培養可以批次法或連續法進行，諸如進料批次法或重複式進料批次法進行，但非受此所限。使用於培養的培養基須滿足所採用的特定菌株的需求。適合用於培養棒狀桿菌菌株的培養基為業界已知(例如，美國細菌學會出版的普通細菌學方法手冊，美國華盛頓特區，1981年)。
可被使用於培養基的碳源可以是醣類及碳水化合物類，諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、澱粉、及纖維素；油類及脂質類，諸如大豆油、葵花籽油、花生油、及椰子油；脂肪酸類，諸如棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸；醇類，諸如甘油及乙醇；及有機酸類，諸如乙酸。此等材料可分開使用或組合使用，但非受此所限。
可使用的氮源之實施例包括蛋白腖、酵母萃取物、肉汁、麥芽萃取物、玉米穗軸浸液、黃豆粉、及尿素；或無機化合物類，諸如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨、及硝酸銨。氮源也可分開使用或組合使用，但非受此所限。
可被使用於培養基的磷源可包括磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、或相對應的含鈉鹽類。此外，培養基可含有細胞生長所必需的金屬鹽類， 及除了以上材料之外，可被補充以生長所必需的物質，諸如胺基酸類及維生素類。又，可使用適合用於培養基的前驅物。上述原料物質可以批次式或連續式適當地進料入培養。
於微生物之培養期間，培養的pH可藉適合的鹼性化合物諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、或氨，或酸性化合物諸如磷酸或硫酸加以調整。發泡可藉消泡劑諸如脂肪酸聚二醇酯加以調整。培養的需氧條件可藉導入氧氣或含氧氣體混合物(例如，空氣)予以維持。
培養(基)之溫度通常可以是20℃至45℃，特定言之，25℃至40℃。培養可持續直到獲得標靶物質的期望產量為止，特定言之，歷時10小時至160小時。
自培養(基)回收標靶物質可藉業界已知之習知分離方法進行。至於分離方法，可使用諸如離心、過濾、層析、結晶等方法。舉例言之，藉由於低速離心培養基以去除生質，所獲得的上清部份，可藉離子交換層析術分離，但非受此所限。於替代方法中，藉由自培養產物(培養基)進行細菌細胞之分離與過濾程序，可回收標靶物質而無需額外純化處理程序。於另一替代方法中，可回收標靶物質，回收步驟可進一步包括純化處理程序。
本揭示之又另一態樣提供一種用於製造發酵組成物之方法，其包含經由於培養基內培養該棒狀桿菌屬之微生物而加以發酵。
本揭示之又另一態樣提供一種經由前述方法製造的發酵組成物。
該多核苷酸及微生物係如前文描述，及於培養基內培養微生物之步驟係如前文描述。
如於本文中使用，術語「發酵組成物」係指於培養基內培養本揭示之微生物所得的組成物。又復，發酵組成物可包括在培養微生物之後，隨後接著合宜後處理，獲得的呈液體或粉末形式的組成物。特別地，合宜的後處理程序可包括，例如，培養微生物之處理程序、去除細菌細胞之處理程序、濃縮程序、過濾程序、及混合載劑之程序，及進一步包括乾燥程序。於某些情況下，後處理程序可不包括純化程序。藉由培養本揭示之微生物所得的發酵組成物，其特徵在於麩胺酸之產量增加而乳酸之產量減少，因而使得其可能提供最佳口味。
此外，「發酵組成物」並不排除含有該組成物的呈液體或粉末形式的調味產品(例如，粉狀湯品、零食調味產品等)。再者，「發酵組成物」並不排除於其中進一步包括藉非發酵法獲得的物質或藉非自然法獲得的另一物質的情況，只要其中含有藉由培養本揭示之微生物所得的發酵組成物即可。
本揭示之新穎啟動子可被導入可製造胺基酸的微生物體內，藉此增加胺基酸之產量而減低有機酸之產量。特定言之，當L-麩胺酸係使用本揭示之新穎啟動子製造時，發酵產物中之L-麩胺酸及有機酸類的含量係經調整，以改善發酵產物的口味與適口性。
(較佳實施例之詳細說明)
後文中，將使用隨附之具體實施例以細節描述本揭示。然而， 本文中揭示的具體實施例僅係用於例示性目的，而不應解釋為限制本揭示之範圍。
實施例1：用於減少乳酸生產力之突變菌株的選擇
實施例1-1：藉UV輻照而誘導隨機突變
為了選擇於其中L-麩胺酸(其乃發酵之標靶產物)的生產力改良，及於其中乳酸(其降低了發酵產物的適口性)的生產力減低的突變菌株，野生型麩胺酸棒狀桿菌(ATCC13869)被接種至含營養介質的瓊脂，及於30℃培養16小時。數以百計的如此所得的菌落於室溫以紫外光輻照，而誘導菌株體內基因體的隨機突變。
實施例1-2：突變誘導性菌株的發酵效價及菌株的選擇之實驗
後文中，進行突變菌株(於其中已誘導隨機突變)的發酵效價之實驗。
各個菌落在營養培養基中次培養，及然後於發酵培養基中培養5小時。其後，以0.4%濃度添加25%吐溫(tween)40至各個培養基，及然後各個菌落再度培養32小時。
營養培養基：
葡萄糖1%，肉汁0.5%，多聚蛋白腖1%，氯化鈉0.25%，酵母萃取物0.5%，瓊脂2%，尿素0.2%，pH 7.2
發酵培養基：
粗糖6%，碳酸鈣5%，硫酸銨2.25%，一磷酸鉀0.1%，硫酸鎂0.04%，硫酸鐵(10毫克/升)，生物素(0.3毫克/升)，鹽酸噻胺(0.2毫克/升)
各個菌落係在前述條件下培養，及然後，抉選出L-麩胺酸生 產性突變菌株，其產量係等於或大於野生型麩胺酸棒狀桿菌(ATCC13869)所製造的產量。此外，至於所抉選的突變菌株，L-麩胺酸之濃度係藉YSI測量，及乳酸之濃度係藉HPLC測量。測得的L-麩胺酸及乳酸之濃度係顯示於表1。
Figure 108107855-A0202-12-0016-1
根據表1，「ATCC13869-m7」及「ATCC13869-m9」被抉選出作為，相較於野生型菌株所製造的產量，於其中L-麩胺酸的產量增加而乳酸的產量減少的菌株。
實施例2：透過基因定序確證突變
為了確證突變菌株的基因突變，菌株ATCC13869-m7及ATCC13869-m9之基因係與野生型菌株的基因作比較。
結果，發現菌株ATCC13869-m7及ATCC13869-m9在編碼乳酸脫氫酶之基因的啟動子區中之特定位置，含有相同突變。
特定言之，證實ATCC13869-m7及ATCC13869-m9含有突變，於其中，在SEQ ID NO：2之啟動子區的序列中，第37核苷酸T係經以G取代。證實SEQ ID NO：2之啟動子區乃共通地涵括於棒狀桿菌屬微生物，更特定言之，野生型麩胺酸棒狀桿菌(ATCC13032、ATCC13869、及ATCC14067)中之序列。
因此，於實施例3及4中，試圖證實以上突變是否影響棒狀桿菌屬微生物體的麩胺酸及乳酸之產量。
實施例3：被導入突變的菌株之製備與乳酸產量之確證
實施例3-1：被導入突變的菌株之製備
嘗試製備於實施例2中確證被導入突變的突變菌株。特定言之，為了將突變導入野生型麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869及ATCC13032體內(亦即，為了以G取代SEQ ID NO：2之核苷酸序列的第37個核苷酸)，含有標靶突變的反向寡核苷酸係設計為具有75單體單位(mer)長度。
特定言之，SEQ ID NO：5之寡核苷酸(30微克)係使用電脈衝 法，被轉形入野生型麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869及ATCC13032(Appl.Microbiol.Biotechnol.,1999,52：541-545)，及然後複雜液態培養基(1毫升)添加至其中。然後，所得產物於30℃培養30分鐘，同時以160rpm振搖。其後，培養基在冰上培育10分鐘，於4℃以4000rpm離心10分鐘，及然後去除上清部份，獲得微生物細胞。其後，添加1毫升10%甘油溶液(4℃)至其中及混合，及然後所得產物於4℃以4000rpm離心10分鐘。去除上清部份，及然後微生物細胞經洗滌。此種程序再度重複一次，以再度洗滌微生物細胞，10%甘油溶液(4℃及0.1毫升)添加至其中，以製備用於下次轉形的菌株。其後，使用前述電脈衝法，使用SEQ ID NO：5之寡核苷酸重複轉形處理程序10次，及然後所得產物置於複雜平板培養基上以獲得菌落(Nat.Protoc.,2014 Oct；9(10)：2301-16)。
至於執行所得菌落之基因序列的分析結果，證實標靶突變被導入菌株內。此外，突變被導入其中的該等菌株被命名為「ATCC13869：：ldh-pro-1mt」及「ATCC13032：：ldh-pro-1mt」。
實施例3-2：乳酸產量之確證
於實施例3-1中製備的突變菌株ATCC13869：：ldh-pro-1mt及ATCC13032：：ldh-pro-1mt，及其野生型麩胺酸棒狀桿菌菌株ATCC13869及ATCC13032係以實施例1-2之相同方式培養。
培養完成後，於各個培養基中之L-麩胺酸及乳酸之濃度係經測量。L-麩胺酸及乳酸之測量得的濃度係顯示於下表2中。
Figure 108107855-A0305-02-0020-2
如於表2中顯示，證實於其中被導入突變的麩胺酸棒狀桿菌菌株ATCC13869：：ldh-pro-1mt，由其所製造的L-麩胺酸之濃度係比由野生型麩胺酸棒狀桿菌菌株ATCC13869所製造者更高達約4.7克/升(約32%)。另一方面，野生型麩胺酸棒狀桿菌菌株ATCC13869製造1.5克/升乳酸，但於培養菌株ATCC13869：：ldh-pro-1mt的培養基中未測量得乳酸。
此外，證實於其中被導入突變的麩胺酸棒狀桿菌菌株ATCC13032：：ldh-pro-1mt，由其所製造的L-麩胺酸之濃度係比由野生型麩胺酸棒狀桿菌菌株ATCC13032所製造者更高達約2.6克/升(約32%)。另一方面，野生型麩胺酸棒狀桿菌菌株ATCC13032製造2.7克/升乳酸，但於培養菌株ATCC13032：：ldh-pro-1mt的培養基中測量得微量乳酸(0.3克/升)。
換言之，確證突變提高了微生物體的L-麩胺酸的生產力，及減低了乳酸的生產力。
此外，菌株ATCC13869：：ldh-pro-1mt定名為CA02-9209，於2019年6月5日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存號碼BCRC 910901。
實施例4：於其中被導入突變的菌株KFCC11074中之酶活性及乳酸產量之確證
實施例4-1：於其中被導入突變的載體之製備
為了證實除了野生型菌株之外，在具有麩胺酸之改良生產力的菌株體，突變是否具有相同效應，試圖將突變導入菌株KFCC11074中(韓國專利案第10-0292299號)，該菌株已知為麩胺酸生產性菌株。
特定言之，建構用於基因取代的載體，以將G取代該菌株所含的SEQ ID NO：2之核苷酸序列的第37個核苷酸。用於建構該載體的基因片段係使用ATCC13869基因體DNA作模板，藉聚合酶連鎖反應PCR獲得。根據登錄在美國國家衛生院基因存庫(NIH GenBank)的麩胺酸棒狀桿菌(ATCC13869)基因上的及相鄰序列上的資訊，製備涵括SEQ ID NO：6、7、8、及9之多核苷酸的引子。
於95℃變性歷時5分鐘後，於下列條件下進行聚合酶連鎖反應PCR共計30週期：於95℃變性歷時20秒，於55℃降溫黏合歷時20秒，及於72℃聚合歷時30秒。其後，於72℃進行聚合反應為時5分鐘。更明確言之，獲得使用SEQ ID NO：6及7之引子擴增的多核苷酸(500bp)及使用SEQ ID NO：8及9之引子擴增的多核苷酸(500bp)。所得的兩個DNA片段藉使用輸注酶(infusion enzyme)而被接合至載體pDZ(韓國專利案第10-0924065號及國際公開案第2008-033001號)(其已經使用限制酶BamHI及SalI消化)，及藉此製備用於基因取代的載體。所製備的載體命名為「pDZ-ldh-pro-1mt」。使用於載體製備的引子序列上的資訊係顯示於下表3。
Figure 108107855-A0202-12-0021-3
實施例4-2：於其中被導入突變的KFCC11074之製備及乳酸產量之確證
已於實施例4-1中製造的用於基因取代的載體，被導入菌株KFCC11074內以製備「KFCC11074：：ldh-pro-1mt」，其乃於其中被導入突變的麩胺酸生產性菌株。於其中未被導入突變的麩胺酸棒狀桿菌菌株KFCC11074，及菌株KFCC11074：：ldh-pro-1mt各自係以實施例1-2之相同方式培養。
培養完成後，於各個培養基中之L-麩胺酸及乳酸之濃度係經測量。L-麩胺酸及乳酸之測量得的濃度係顯示於下表4中。
Figure 108107855-A0202-12-0021-4
如於表4中顯示，證實於其中被導入突變的麩胺酸棒狀桿菌菌株KFCC11074：：ldh-pro-1mt，由其所製造的L-麩胺酸之濃度，係比由其中未被導入突變的麩胺酸棒狀桿菌菌株KFCC11074所製造者，更高達約8克/升(約88%)。
另一方面，證實由菌株KFCC11074：：ldh-pro-1mt所製造的乳酸濃度，係比由其中未被導入突變的麩胺酸棒狀桿菌菌株KFCC11074所製造者，更低達約17克/升。
換言之，再度證實了突變提高微生物體的L-麩胺酸生產力，及減低乳酸生產力。
實施例4-3：於其中被導入突變的KFCC11074之酶LDH活性之確證
因已於實施例4-2中製備的菌株KFCC11074：：ldh-pro-1mt中之乳酸生產力減低的機制經證實，且因已確證突變係含在乳酸脫氫酶(LDH)的啟動子，故試圖根據突變來識別乳酸脫氫酶(其為乳酸產生性酶)的活性。
特定言之，酶活性係以下述方式評估。首先，細胞於燒瓶(250毫升)內於培養基#3(25毫升)(其具有下示組成)中，以200rpm於30℃培養6小時。其後，藉以4000rpm沈澱細胞歷時10分鐘去除上清部份，及使用20mM Tris-HCl(25mL,pH 7.5)重複進行細胞洗滌三次。洗滌之後，去除上清部份，及使用細胞萃取用的15%甘油緩衝液(2毫升)於20mM Tris(pH 7.5)再度懸浮細胞。再度懸浮的細胞(1毫升)置於珠粒管內，及使用均化器於46/30秒之條件下均化六次。其後，所得產物以13000rpm於4℃離心20分鐘。
培養基#3：
葡萄糖2%，多聚蛋白腖1%，(NH4)2SO4 1%，KH2PO4 0.52%，K2HPO4 1.07%，酵母萃取物1%，尿素0.15%，MgSO4．7H2O 0.05%，d-生物素(1.8毫克/升)，噻胺-HCl(9毫克/升)，泛酸鈣(9毫克/升)，菸鹼醯胺(60毫克/升)
其後，進行布拉弗(Bradford)分析試驗，以驗證與標準化得自珠粒管的上清液(樣本)中所含的蛋白質濃度。參考如下表5及表6，布拉弗分析試驗獲得標準曲線，及確證樣本之濃度。特別地，1x伯樂(Biorad)蛋白質分析試驗試劑(980微升)添加至具有總體積20微升的樣本，及然後渦旋以測量於595奈米(nm)的吸光比歷時約3分鐘。
Figure 108107855-A0202-12-0023-5
Figure 108107855-A0202-12-0023-6
其後，於菌株KFCC11074及KFCC11074：：ldh-pro-1mt的乳酸脫氫酶活性的實驗係使用反應溶液進行，其組成比係顯示於下表7。又復，使用30mM丙酮酸鈉作為起始劑。又復，於表8顯示的條件下測量的，於二菌株之乳酸脫氫酶的活性係顯示於下表9。
Figure 108107855-A0202-12-0024-7
Figure 108107855-A0202-12-0024-8
Figure 108107855-A0202-12-0025-9
如於表9中顯示，確證於其中被導入突變的菌株，乳酸脫氫酶之活性減低。
換言之，證實突變減低了微生物體的乳酸脫氫酶活性，因而減少了乳酸的生產力。
總言之，本揭示之多核苷酸乃涵括於其中單一核苷酸經取代的突變之乳酸脫氫酶的啟動子，及因此，多核苷酸能够透過突變啟動子之活性而衰減野生型菌株或麩胺酸產生性菌株的乳酸脫氫酶活性；結果，作為發酵標靶產物的麩胺酸之生產力增加，及又復，降低發酵產物之適口性的乳酸之生產力減低。據此，本揭示之多核苷酸能有效地使用於各個工業領域，用以高產率生產麩胺酸。
綜上所述，熟諳本揭示之相關技藝人士將瞭解，未經修改本揭示之技術構思或必要特性，本揭示可以其它特定形式具體實施。就此方面而言，本文中揭示的具體實施例係僅用於例示性目的，而不應解釋為限制本揭示之範圍。相反地，本揭示意圖涵蓋不僅該等具體實施例，同時也涵蓋可被涵括於如隨附之申請專利範圍界定的本揭示之精髓及範圍內的各個替代例、修改例、相當例、及其它具體例。
【生物材料寄存】
國外寄存單位：韓國微生物保存中心(國際寄存機構)
寄存號碼：KCCM12227P
寄存日期：2018年2月28日
國內寄存單位：財團法人食品工業發展研究所
寄存號碼：BCRC 910901
寄存日期：2019年6月5日
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<120> 新穎啟動子及使用該啟動子製造L-胺基酸的方法
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<160> 9
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LDH啟動子區
<400> 1
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<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 麩胺酸棒狀桿菌
<400> 2
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<210> 3
<211> 945
<212> DNA
<213> 麩胺酸棒狀桿菌
<400> 3
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<210> 4
<211> 314
<212> PRT
<213> 麩胺酸棒狀桿菌
<400> 4
Figure 108107855-A0305-02-0029-8
Figure 108107855-A0305-02-0030-12
<210> 5
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 5
Figure 108107855-A0305-02-0030-13
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 6
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<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
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<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子
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<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 9
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Claims (11)

  1. 一種具有啟動子活性之多核苷酸，其中SEQ ID NO：2之核苷酸序列的第37個核苷酸係經G取代。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之多核苷酸，其中該多核苷酸係可操作式鏈接至編碼標靶蛋白質的基因。
  3. 一種載體，其包含如申請專利範圍第1項所述之多核苷酸；及可操作式鏈接至該多核苷酸的編碼標靶蛋白質之基因。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之載體，其中該標靶蛋白質為乳酸脫氫酶。
  5. 一種棒狀桿菌(Corynebacterium)屬之微生物，其包含如申請專利範圍第1項所述之多核苷酸；及可操作式鏈接至該多核苷酸的編碼標靶蛋白質之基因。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之微生物，其中該標靶蛋白質為乳酸脫氫酶。
  7. 如申請專利範圍第5或6項所述之微生物，其中該棒狀桿菌屬之微生物為麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)。
  8. 一種用於製造標靶物質之方法，其包含：於培養基內培養如申請專利範圍第5或6項所述之棒狀桿菌屬之微生物；及自該經培養的培養基回收該標靶物質。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該標靶物質為胺基酸。
  10. 一種用於製造發酵組成物之方法，其包含經由於培養基內培養如申請專利範圍第5或6項所述之棒狀桿菌屬之微生物而加以發酵。
  11. 一種發酵組成物，其係由如申請專利範圍第10項所述之方法所製造，且係增加麩胺酸的產量的同時減少乳酸的產量。
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