TWI710634B

TWI710634B - 新穎的5'-肌苷酸脫氫酶及使用該脫氫酶製備5'-肌苷酸的方法

Info

Publication number: TWI710634B
Application number: TW108125833A
Authority: TW
Inventors: 李智惠; 朴素靜; 白珉知; 張眞淑; 尹炳勳
Original assignee: 南韓商Ｃｊ第一製糖股份有限公司
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2019-07-22
Publication date: 2020-11-21
Also published as: CN111183218B; EP3705572A1; US11066687B2; KR101956510B1; CA3051217A1; MY193486A; AU2018386358B2; MX2019007397A; BR112019020962B1; US20210139939A1; SG11201909227XA; JP2020533947A; JP6873244B2; CN111183218A; ZA201906063B; EP3705572A4; WO2020022547A1; RU2728334C1; AU2018386358A1; BR112019020962A2

Abstract

本案提供5'-肌苷酸脫氫酶之變異體、包括該變異體之微生物以及使用該微生物製備5'-肌苷酸之方法。

Description

新穎的5'-肌苷酸脫氫酶及使用該脫氫酶製備5'-肌苷酸的方法

本揭示內容涉及5'-肌苷酸脫氫酶之變異體“包含該變異體之微生物以及使用該變異體製備5'-肌苷酸之方法。

5'-肌苷酸(5'-肌苷單磷酸鹽，後文稱為IMP)是一種基於核苷酸的物質，是核酸生物合成代謝系統的中間物質，且用於多種領域，如醫療產品和醫療應用。IMP是一種與5'-鳥苷酸(5'-鳥嘌呤單磷酸鹽，後文稱為GMP)廣泛用作食品調味添加劑或用於食品的材料。已知IMP本身有牛肉風味，並且已知增強麩胺酸單鈉(後文稱為MSG)如GMP的風味。因此，IMP作為基於核苷酸的味道的調味料受到了很多關注。

製備IMP的方法包括酶促降解從酵母細胞中提取的核糖核酸的方法、藉由醱酵而產生化學磷酸化肌苷的方法(Agri.Biol.Chem.,36,1511(1972)等)、培養能夠直接產生IMP的微生物然後在其培養物中回收IMP的方法等。其中，最常用的方法是使用能夠直接產生IMP的微生物的方法。

同時，處於天然狀態的酶在工業應用中所需的活性、安定性、光學異構體的受質特異性等方面並不總是表現出最佳性質。因此，已經進行了各種嘗試以通過其胺基酸序列等的突變來改善酶，使得它們變得適合於所欲用途。其中，已經應用酶的合理設計和定點誘變以改善酶功能。然而，在許多情況下，存在的缺點是關於目標酶結構的訊息不充分或結構-功能關係的訊息不清楚，因此，該等方法不能有效應用。在這方面，據報導，已經進行了通過從酶基因的隨機誘變構建的突變酶庫篩選所需性狀的酶的定向進化方法，而嘗試改善酶，導致其活動地改善。

本案發明人已進行了廣泛的研究，藉由微生物醱酵直接生產IMP的方法以高產率生產IMP，並且已經識別了涉及IMP生產力的蛋白質的變異體，從而完成了本揭示內容。

本揭示內容的目的是提供5'-肌苷酸脫氫酶的變異體。

本揭示內容的另一個目的是提供編碼5'-肌苷酸脫氫酶的變異體的多核苷酸。

本揭示內容的又一個目的是提供包含多核苷酸的載體。

本揭示內容的另一個目的是提供產生5'-肌苷酸的微生物，包括5'-肌苷酸脫氫酶的變異體和載體。

本發明的另一個目的是提供一種製備5'-肌苷酸的方法，該方法包括在培養基中培養棒狀桿菌屬(Corynebacterium)微生物的步驟；從該微生物或該培養基中回收5'-肌苷酸。

較佳具體例係詳述如下。同時，本申請案中揭露的個別描述和具體實施例也可以應用於其他描述和具體實施例。也就是說，本申請案中揭露的各種元件的所有組合都落入本申請案的範疇內。此外，本申請案的範疇不受以下具體描述的限制。

為了實現上述目的，本揭示內容的一個態樣提供了5'-肌苷酸脫氫酶的變異體，其具有包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸取代的多肽。具體地，本揭示內容提供了5'-肌苷酸脫氫酶的變異體，其具有包括SEQ ID NO：2的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸取代的多肽，其中該胺基酸取代包括選自由從N-端算起第377個位置的胺基酸經蘇胺酸取代和第499個位置的胺基酸經異亮胺酸取代所組成群組中的至少任一者。本揭示內容的另一態樣提供了具有5'-肌苷酸脫氫酶活性的5'-肌苷酸脫氫酶的變異體，該變異體具有胺基酸序列，該胺基酸序列包含SEQ ID NO：2的第377個位置的胺基酸經蘇胺酸取代和第499個位置的胺基酸經異亮胺酸取代。具體地，5'-肌苷酸脫氫酶的變異體可以包括SEQ ID NO：2的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸的取代，其中該胺基酸取代可以包含選自由從N-端算起第377個位置的胺基酸經蘇胺酸取代和第499個位置的胺基酸經異亮胺酸取代所組成群組中的至少任一者。

如本文所用，術語“5'-肌苷酸脫氫酶”是指涉及產生5'-肌苷酸(5'-肌苷單磷鹽；IMP)的蛋白質。關於本揭示內容的目的，該術語可與肌苷-5'-單磷酸鹽脫氫酶、IMP脫氫酶、肌苷酸脫氫酶、IMPDH等互換使用。

在本揭示內容中，SEQ ID NO：2是指具有5'-肌苷酸脫氫酶活性的胺基酸序列。具體地，SEQ ID NO：2是由guaB基因編碼的具有5'-肌苷酸脫氫酶活性的蛋白質的序列。SEQ ID NO：2的胺基酸序列可以從NCBI GenBank獲得，NCBI GenBank是公共數據庫。例如，SEQ ID NO：2的胺基酸序列可以源自停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)，但不限於此，並且可以包含具有與上述胺基酸序列相同活性的任何序列而沒有限制。此外，胺基酸序列可包括SEQ ID NO：2的胺基酸序列或與SEQ ID NO：2的胺基酸序列具有80%或更高同源性或同一性的胺基酸序列，但不限於此。具體地，胺基酸序列可包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列或與SEQ ID NO：2的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源性或同一性的胺基酸序列。具有同源性或同一性的胺基酸序列可為彼等來自上述範圍者，排除具有100%同一性的序列，或者可為具有少於100%同一性的序列。此外，顯而易見的是，具有刪除、修飾、取代或添加一些胺基酸的胺基酸序列的蛋白質也落入本發明的範疇，只要其具有同源性或同一性並且表現出對應上述蛋白質所具者的功效即可。

如本文所用，術語“5'-肌苷酸脫氫酶的變異體”可與具有產生IMP的能力的變異多肽、產生IMP的變異多肽、具有5'-肌苷酸生產力的變異多肽、產生5'-肌苷酸的變異多肽、具有5'-肌苷酸脫氫酶活性的變異多肽、5'-肌苷酸脫氫酶變異體等互換使用。此外，該蛋白質可以源自棒狀桿菌屬，特別是停滯棒狀桿菌，但不限於此。

5'-肌苷酸脫氫酶的變異體可以包括從SEQ ID NO：2的胺基酸序列中N端算起第377個位置及/或第499個位置的變異。5'-肌苷酸脫氫酶的變異體可以是第377個位置的胺基酸經另一個胺基酸取代、第499個位置的胺基酸經另一個胺基酸取代、或第377個位置經另一個胺基酸取代的胺基酸及第499個位置的胺基酸經另一個胺基酸取代取代者，且與彼等包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列者或來自野生型的未修飾的5'-肌苷酸脫氫酶相比，具有弱活性。如上述，此5'-肌苷酸脫氫酶的變異體是指彼等從SEQ ID NO：2及/或與SEQ ID NO：2具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的同源性或同一性的胺基酸中的N-端算起第377個位置及/或第499個位置具有胺基酸變異的變異體。

具體地，5'-肌苷酸脫氫酶的變異體可以在SEQ ID NO：2的胺基酸序列中的第377個位置的胺基酸經蘇胺酸取代、第499個位置的胺基酸經異亮胺酸取代、或第377個位置的胺基酸經蘇胺酸取代和第499個位置的胺基酸經異亮胺酸取代，並且與包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列的多肽相比，該多肽可具有減弱的5'-肌苷酸脫氫酶活性，但不限於此。

關於本揭示內容的目的，包含5'-肌苷酸脫氫酶變異體的微生物的特徵在於產生的IMP的量增加。這是重要的，因為本揭示內容的5'-肌苷酸脫氫酶的變異體可以增加產生的IMP量，而棒狀桿菌屬的野生型菌株不能產生IMP，或者，即使它可以產生IMP，只能產生很少量的IMP。

具體地，包含具有在SEQ ID NO：2所示的胺基酸中的第377個位置的胺基酸經另一個胺基酸取代、第499個位置的胺基酸經另一個胺基酸取代、或第377個位置的胺基酸經另一胺基酸取代和第499個位置的胺基酸經另一胺基酸取代的胺基酸序列的5'-肌苷酸脫氫酶的變異體包含選自由SEQ ID NO：6、7以及8所組成群組中的至少任一者。更具體地，具有在SEQ ID NO：2的胺基酸序列中的第377個位置的胺基酸經蘇胺酸取代、第499個位置的胺基酸經異亮胺酸取代、或第377位置的胺基酸經蘇胺酸取代和在第499個位置的胺基酸經異亮胺酸取代的5'-肌苷酸脫氫酶的變異體可以包含選自由SEQ ID NO：6、7和8所組成群組中的至少任一者。5'-肌苷酸脫氫酶的變異體可由選自由SEQ ID NO：6、7和8所組成群組的至少任一者所組成。此外，5'-肌苷酸脫氫酶的變異體可以包含具有SEQ ID NO：6、7或8的胺基酸序列或與SEQ ID NO：6、7或8具有80%或更高同源性或同一性的胺基酸序列，但不限於此。具體地，本揭示內容的5'-肌苷酸脫氫酶的變異體可包含具有SEQ ID NO：6、7或8的多肽和與SEQ ID NO：6、7或8具有至少80%、85 %、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的同源性或同一性的多肽。此外，顯然除了在第377或499個位置的胺基酸外，具有刪除、修飾、取代或添加一些胺基酸的胺基酸序列的蛋白質也落入本發明的範疇，只要它具有同源性或同一性且展現對應於上述蛋白質所具者的功效即可。

換句話說，即使本揭示內容描述了‘具有由特定SEQ ID NO表示的胺基酸序列的蛋白質或多肽’，顯然具有刪除、改變、取代、保守取代或添加一些胺基酸的胺基酸序列的蛋白質也可用於本揭示內容中，只要其具有與具有相應SEQ ID NO的胺基酸序列的多肽所具者相同或對應的活性即可。例如，只要蛋白質具有與5'-肌苷酸脫氫酶變異體相同或對應的活性，就不排除在胺基酸序列前端或後端添加不改變蛋白質功能的序列、天然突變、沉默突變或其保守取代。顯然，具有此序列添加或突變的蛋白質也落入本發明的範疇。

“保守取代”是指經另一種具有相似結構及/或化學性質的胺基酸取代胺基酸。該胺基酸取代通常可以基於極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性及/或兩親性質的相似度來進行。例如，帶正電荷的(鹼性)胺基酸包括精胺酸，離胺酸和組胺酸；及帶負電的(酸性)胺基酸包括麩胺酸和天冬胺酸；芳香族胺基酸包括苯丙胺酸、色胺酸和酪胺酸；疏水性胺基酸包括丙胺酸、纈胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、蛋胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸和色胺酸。

因此，在本揭示內容中，“變異體”可以進一步包括對具有由特定‘SEQ ID NO表示的胺基酸序列的蛋白質或多肽’中的一個或多個胺基酸的保守取代及/或修飾。例如，某些變異體可包括其中已去除一個或多個部分(諸如，N-端前導序列或跨膜結構域)的變異體。其他變異體可包括其中一部分已從成熟蛋白質的N-端和/或C-端除去的變異體。變異體也可以包含對多肽的性質和二級結構具有最小影響的其他修飾，包含胺基酸的刪除或添加。例如，多肽可以與蛋白質的N-端的訊號(或前導)序列接合，該蛋白質的共轉譯或轉譯後導引蛋白質的轉移。多肽還可以與另一個序列或連接子接合，以便用於多肽的辨識、純化或合成。術語“變異體”可以與修飾、修飾的蛋白質、修飾的多狀、突變異體、突變蛋白、趨異者等互換使用，並且可以使用任何術語而沒有限制，只要其以被修飾的意義使用即可。

同源性和同一性意指兩個給定的胺基酸序列或核苷酸序列之間的相關程度，並且可以百分比表示。

術語“同源性和同一性”通常可彼此互換使用。

保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以藉由標準比對演算法確定，該標準比對演算法與要使用的程式建立的默認空位罰分(default gap penality)一起使用。實質上，同源或相同序列可以在中等或高度嚴格條件下沿著其整個序列或整個長度的至少約50%、約60%、約70%、約80%或約90%雜交。關於欲雜交的多核苷酸，還可以考慮包含簡併密碼子而不是密碼子的多核苷酸。

任何兩個多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性可以藉由例如已知的計算機演算法，例如“FASTA”程式，使用如Pearson et al.(1988)[Proc.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85]：2444的默認參數來確定，或者，可以藉由使用在EMBOSS程式集(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,Trends Genet.16：276-277)(5.0.0版本或更高)(包含GCG程式集(Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research 12：387(1984)),BLASTP,BLASTN,FASTA(Atschul,[S.][F.,][ET AL,J MOLEC BIOL 215]：403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,[ED.,]Academic Press,San Diego,1994以及[CARILLO ETA/.](1988)SIAM J Applied Math 48：1073)的Needle程式中實施的Needleman-Wunsch演算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48：443-453)來確定。例如，可以使用美國國家生物技術訊息中心(National Center for Biotechnology Information)的BLAST或ClustalW來確定同源性、相似性或同一性。

多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性可藉由使用如Smith and Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2：482中揭露的GAP電腦程式，諸如，Needleman et al.,(1970),J Mol Biol.48：443，而比較序列來確定。簡而言之，GAP程序將相似性定義為相似的比對符號(即，核苷酸或胺基酸)的數目除以兩個序列中較短者的符號的總數。GAP程式的默認參數可以包含：(1)如Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas Of Protein Sequence And Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)所述之Gribskov et al.(1986)Nucl.Acids Res.14：6745之一元比較矩陣(含有對於同一性給數值1，對於非同一性給數值0)和加權比較矩陣(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4版本的EMBOSS)取代矩陣)；(2)每個缺口罰分3.0，及每個缺口的每個符號額外罰0.10(或缺口開放分罰金10，缺口延長罰分0.5)；以及(3)對末端缺口差距不予罰分。因此，如本文所用，術語“同源性”或“同一性”表示序列之間的相關性。

顯然，由於密碼子簡併性而被轉譯成具有選自由SEQ ID NO：6、7和8所組成群組的胺基酸序列的多肽，或也可包含與SEQ ID NO：6、7和8具有同源性或同一性的多肽。例如，多核苷酸可以具有選自由SEQ ID NO：3、4和5所組成群組的核苷酸序列。此外，藉由在嚴格條件下與由已知基因序列製備的探針雜交，例如，可以包含與全部或部分核苷酸序列互補的序列、編碼5'-肌苷酸脫氫酶變異體的多核苷酸序列，該5'-肌苷酸脫氫酶變異體包含在胺基酸序列中的第377個位置的胺基酸經蘇胺酸取代，或者在SEQ ID NO：2的胺基酸序列中的第499個位置的胺基酸經異亮胺酸取代，但不限於此。

本揭示內容的又一態樣提供了編碼5'-肌苷酸脫氫酶的變異體的多核苷酸或包含該多核苷酸的載體。

如本文所用，術語“多核苷酸”是指具有超過一定長度的DNA或RNA股作為藉由共價鍵連接的核苷酸單體長鏈的核苷酸聚合物，更具體地，是指編碼該多肽的多核苷酸片段。

編碼本揭示內容的5'-肌苷酸脫氫酶的變異體的多核苷酸可包含，但不限於，任何多核苷酸序列，只要其編碼具有本揭示內容的5'-肌苷酸脫氫酶活性的變異多肽即可。在本揭示內容中，編碼5'-肌苷酸脫氫酶的胺基酸序列的基因是guaB基因，具體地，該基因可以源自停滯棒狀桿菌，但不限於此。

具體地，由於密碼子簡併或藉由考慮其中能夠表現多肽的微生物的較佳密碼子，可以在不改變多肽的胺基酸序列的範疇內，對本揭示內容的多核苷酸的編碼區進行各種修飾。可包含任何多核苷酸序列而沒有限制，只要它編碼在SEQ ID NO：2的胺基酸序列中的第377個位置的胺基酸經另一個胺基酸取代、在第499個位置的胺基酸經另一個胺基酸取代、或在第377個位置的胺基酸經另一個胺基酸取代及在第499個位置的胺基酸經另一個胺基酸取代的5'-肌苷酸脫氫酶的變異體。例如，編碼本揭示內容的5'-肌苷酸脫氫酶的變異體可具有編碼選自SEQ ID NO：6、7和8所組成群組的胺基酸序列的多核苷酸序列，但不限於此。更具體地，多核苷酸可以具有選自由SEQ ID NO：3、4和5所組成群組的多核苷酸序列，但不限於此。

再者，藉由在嚴格條件下與由已知基因序列製備的探針雜交，例如，可以包含與全部或部分核苷酸序列互補的序列、編碼具有5'-肌苷酸脫氫酶的變異體的活性的蛋白質的序列，該5'-肌苷酸脫氫酶的變異體具有在SEQ ID NO：2的胺基酸序列中的第377個位置的胺基酸經另一個胺基酸取代、第499個位置的胺基酸經另一個胺基酸取代、第377個位置的胺基酸經另一個胺基酸取代及第499個位置的胺基酸經另一個胺基酸取代而沒有限制。“嚴格條件”是指允許多核苷酸之間雜交的條件。此等條件在文獻(例如，J.Sambrook et al.，與上述相同)中詳述。嚴格條件可包含具有高同源性或同一性的基因，例如，具有40%或更高，特別是90%或更高，更具體為95%或更高，更具體為97%或更高，特別具體為99%或更高的同源性或同一性的基因能夠彼此雜交的條件下、具有較低同源性或同一性的基因不能彼此雜交的條件下、或作為南方雜交的常見洗滌條件的條件，例如對應於60℃，1X SSC，0.1%SDS，特別為60℃， 0.1X SSC，0.1%SDS，更具體為68℃，0.1X SSC，0.1%SDS一次，具體為兩次或三次的鹽濃度和溫度。

雜交需要兩個核酸具有互補序列，儘管鹼基之間的錯配可能取決於雜交的嚴格性。術語“互補”用於描述能夠彼此雜交的核苷酸鹼基之間的關係。例如，就DNA而言，腺嘌呤與胸腺嘧啶互補，胞嘧啶與鳥嘌呤互補。因此，本揭示內容還可以包括與完整序列以及實質上相似的核酸序列互補的單離的核酸片段。

具體地，可以藉由包含T_m為55℃的雜交步驟的雜交條件及藉由利用上述條件，而偵測具有同源性或同一性的多核苷酸。此外，T_m值可為60℃、63℃或65℃，但不限於此，並且根據目的由發明所屬技術領域中的技術人員適當地控制。

用於雜交多核苷酸的適當嚴格性係取決於多核苷酸的長度和互補程度，並且變數是發明所屬技術領域中眾所周知者(參見Sambrook et al.，同上，9.50-9.51,11.7-11.8)。

在本揭示內容中，編碼5'-肌苷酸脫氫酶的變異體的胺基酸序列的基因是guaB基因，並且編碼該基因的多核苷酸與上述相同。

在本揭示內容中，編碼5'-肌苷酸脫氫酶的變異體的多核苷酸也與上述相同。

如本文所用，術語“載體”意指含有編碼所需多肽的多核苷酸的核苷酸序列的DNA構建體，其與合適的調節序列可操作地連接，使得所需多肽在合適的宿主中表現。調節序列可包含導引轉錄的啟動子、調節此轉錄的某些操縱基因序列、編碼mRNA上的合適核醣體結合位點的序列、以及調節轉錄和轉譯終止的序列。一旦轉形入合適的宿主中，載體可以獨立於宿主基因組複製或起作用，或者可以整合到基因組本身。

本揭示內容中使用的載體可以沒有特別限制，只要該載體可在宿主細胞中複製，並且可以使用發明所屬技術領域中的已知的任何載體。常用載體的實例可包括天然或重組質體、黏質體、病毒和噬菌體。例如，作為噬菌體載體或黏質體載體，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等，並且作為質體載體，可使用彼等基於pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等者。具體地，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC載體等。

例如，可以將編碼所需多肽的多核苷酸插入染色體中。可以使用發明所屬技術領域中的任何已知方法，例如，藉由同源重組，而將多核苷酸插入染色體中，但不限於此。可以進一步包含用於確認載體插入染色體中的選擇性標記。選擇性標記係用於選擇經載體轉形的細胞，也就是說，為了確認是否已插入所需核酸分子，以及可使用能夠提供可選擇的表型(諸如，抗藥性、營養缺陷型、對細胞毒性劑的抗性以及可以表面多肽的表現)的標記。在處理選擇性試劑的情況下，只有能夠表現選擇性標記的細胞才能存活或表現其他表型性狀，因此可以容易地選擇轉形細胞。在本揭示內容的又一態樣中，本揭示內容係藉由包含5'-肌苷酸脫氫酶的變異體或編碼該變異體的多核苷酸，而提供產生5'-肌苷酸的微生物。具體地，包含5'-肌苷酸脫氫酶的變異體及/或編碼該變異體的多核苷酸的微生物可為藉由包含多核苷酸的載體轉形而製備的微生物，但不限於此。

如本文所用，術語“轉形”是指將包含編碼目標蛋白的多核苷酸的載體導入宿主細胞的過程，使得由多核苷酸編碼的蛋白質能夠在宿主細胞中表現。只要轉形的多核苷酸可以在宿主細胞中表現，轉形的多核苷酸是否插入宿主細胞的染色體並位於其上或位於染色體外是無關緊要的。此外，多核苷酸可包含編碼目標蛋白的DNA和RNA。可以以任何形式導入多核苷酸，只要可以將多核苷酸導入宿主細胞並在其中表現即可。例如，多核苷酸可以以表現盒的形式導入宿主細胞，該表現盒是包含其自主表現所需的所有元件的基因構建體。表現盒可包含可與多核苷酸可操作地連接的啟動子、轉錄終止信號、核醣體結合位點和轉譯終止信號。表現盒可以是表現載體的形式，進行自我複製。另外，可以將多核苷酸導入宿主細胞中，以與宿主細胞中表現所需的序列可操作地連接，但不限於此。

此外，術語“可操作地連接”是指基因序列和啟動子序列之間的功能性連接，其啟動和介導編碼本揭示內容的所需多肽的多核苷酸的轉錄。

如本文所用，術語“包括變異體多肽的微生物”或“包含5'-肌苷酸脫氫酶的變異體的微生物”是指藉由為具有生產IMP的天然弱能力的微生物或不具有產生IMP的能力的親代菌株提供產生IMP的能力，而製備的微生物。具體地，微生物可以是表現5'-肌苷酸脫氫酶的變異體的微生物，其具有包括SEQ ID NO：2的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸取代的多肽，其中該胺基酸取代可以是包括選自由從N-端算起第377 個位置的胺基酸經蘇胺酸取代及第499個位置的胺基酸經異亮胺酸取代。此外，微生物可以是表現變異多肽的微生物，其中該微生物具有藉由在SEQ ID NO：2的胺基酸序列中，用另一個胺基酸取代第377個位置的胺基酸，用另一個胺基酸取代第499個位置的胺基酸、或用另一個胺基酸取代第377個位置的胺基酸及用另一個胺基酸取代第499個位置的胺基酸的5'-肌苷酸脫氫酶活性，但不限於此。

微生物可以是細胞或微生物，其可以包含編碼5'-肌苷酸脫氫酶的變異體的多核苷酸，或者可以用包括編碼5'-肌苷酸脫氫酶的變異體的多核苷酸的載體轉形為表現5'-肌苷酸脫氫酶的變異體，並且就本揭示內容的目的而言，宿主細胞或微生物可以是任何微生物，只要其包含產生5'-肌苷酸的5'-肌苷酸脫氫酶的變異體即可。

在本揭示內容中，產生5'-肌苷酸的微生物(microorganism producing 5’-inosinic acid)可與5'-肌苷酸產生微生物(5’-inosinic acid-producing microorganism)或具有5'-肌苷酸生產力的微生物互換使用。

如本文所用，術語“產生5'-肌苷酸的微生物”可以是其中發生遺傳修飾或增強活性以產生所需5'-肌苷酸的微生物，包括所有野生型微生物或者天然或人工發生遺傳修飾的微生物，並且該微生物可為藉由插入外源基因或藉由增強或失活內源基因的活性，而削弱或增強特定機制的微生物。關於本揭示內容的目的，產生5'-肌苷酸的微生物的特徵可在於微生物包含5'-肌苷酸脫氫酶的變異體以具有所需5'-肌苷的增加生產力。特別地，微生物可以是棒狀桿菌屬微生物。具體地，在本揭示內容中，產生5'-肌苷酸的微生物或具有5'-肌苷酸生產力的微生物可以是其中涉及 5'-肌苷酸生物合成途徑的一部分基因增強或弱化的，或涉及5'-肌苷酸降解途徑的一部分基因增強或減弱的微生物。例如，微生物可以是其中編碼磷酸核糖基焦磷酸醯胺轉移酶的purF的表現增強或編碼腺苷酸琥珀酸鹽合成酶的purA的表現減弱的微生物，但不限於此。

如本文所用，術語“產生5'-肌苷酸的棒狀桿菌屬微生物”是指具有天然或藉由突變的5'-肌苷酸生產力的棒狀桿菌屬微生物。具體地，如本文所用，具有5'-肌苷酸生產力的棒狀桿菌屬微生物可以是藉由增強或削弱編碼5'-肌苷酸脫氫酶的guaB基因的活性而具有改善的5'-肌苷酸生產力的棒狀桿菌屬微生物。更具體地，如本文所用，具有5'-肌苷酸生產力的棒狀桿菌屬微生物可以是藉由包含5'-肌苷酸脫氫酶的變異體或編碼該變異體，或藉由用包含編碼5'-肌苷酸脫氫酶的變異體的多核苷酸的載體轉形，而具有改善的5'-肌苷酸生產力的棒狀桿菌屬微生物。‘具有改善的5'-肌苷酸生產力的棒狀桿菌屬微生物’是指與轉形前的親代菌株或未經修飾的微生物相比，具有改善的5'-肌苷酸生產力的微生物。‘未經修飾的微生物’是指野生型菌株本身，或不包含產生5'-肌苷酸的變異蛋白質的微生物，或不與包含編碼5'-肌苷酸脫氫酶的變異體的多核苷酸的載體轉形的微生物。

如本文所用，“棒狀桿菌屬微生物”可具體為麩胺酸狀棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，產胺棒狀桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳酸醱酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)，嗜熱產胺棒狀桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、有效棒狀桿菌(Corynebacterium efficiens)、停滯棒狀桿菌等，但不限於此。

本揭示內容的又一態樣提供了製備5'-肌苷酸的方法，其包含在培養基中培養產生5'-肌苷酸的棒狀桿菌屬微生物；從該微生物或該培養基回收5'-肌苷酸。

在該方法中，培養微生物的步驟可以藉由已知的批式培養、連續培養、補料批式培養等進行，但不特別限於此。在這方面，培養條件沒有特別限制，但是可以藉由使用鹼性化合物(例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀或胺)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)而調節最佳pH(例如，pH 5至pH 9，特別是pH 6至pH 8，並且最特別是pH 6.8)。好氧條件可藉由向培養物添加氧氣或含氧氣體混合物而維持。培養溫度可以保持在20℃至45℃，具體為25℃至40℃，並且培養可以進行約10小時至約160小時，但不限於此。藉由培養而產生的5'-肌苷酸可以分泌到培養基中或可以保留在細胞內。

此外，在欲使用的培養基中，作為碳源，糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、澱粉和纖維素)、油和脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸)、醇類(例如，甘油和乙醇)、有機酸(例如，乙酸)等可以單獨使用或者混合物，但碳源不限於此。作為氮源，含氮有機化合物(例如，蛋白腖、酵母提取物、肉提取物、麥芽提取物、玉米漿、大豆粉和尿素)或無機化合物(例如，硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨)等可以單獨使用或混合使用，但氮源不限於此。作為磷源，磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、與其對應的含鈉鹽等可以單獨使用或混合使用，但磷源不限於此。培養基還可包括必需的生長促進材料，諸如，其他金屬鹽(例如，硫酸鎂或硫酸鐵)、胺基酸和維生素。

回收在本發明的培養步驟中產生的5'-肌苷酸的方法是藉由根據培養方法使用發明所屬技術領域中已知的適當方法從而培養液採集5'-肌苷酸。例如，可以使用離心、過濾、陰離子交換層析術、結晶、HPLC等，並且可以藉由使用發明所屬技術領域中已知的適當方法從培養基或微生物中回收所需5'-肌醇酸。

此外，回收步驟可包含純化程序。純化過程可以藉由使用發明所屬技術領域中已知的適當方法而進行。因此，回收的5'-肌苷酸可以是純化形式或包含5'-肌苷酸的微生物醱酵液(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering,A.J.Nair.,2008)。

後文中，將參考實施例更詳細地描述本發明。然而，對於本揭示內容所屬技術領域的技術人員顯而易見的是，這些實施例僅用於闡釋目的，並且本發明的範疇不旨在受此等實施例的限制。

實施例1：產生野生型IMP的菌株的製備

棒狀桿菌屬的野生型菌株不能產生IMP或能夠產生非常少量的IMP。因此，產生IMP的菌株係基於停滯棒狀桿菌ATCC6872而製備。更具體地，產生IMP的菌株係藉由增強編碼作為嘌呤生物合成的第一種酶的磷酸核糖基焦磷酸醯胺轉移酶的PurF的活性，並且弱化編碼在5'-肌苷酸降解途徑中的腺苷酸琥珀酸鹽合成酶的PurA的活性而製備。

實施例1-1：增強purF的菌株的製備

為了製備其中purF的起始密碼子改變的菌株，首先製備含有purF的插入載體。為了將purF基因選殖到插入載體中，具體地，使用停滯棒狀桿菌ATCC6872的基因組DNA作為模板和SEQ ID NO：9和10以及SEQ ID NO：11和12的引子進行30個循環的PCR：在94℃變性30秒，在55℃黏合30秒，並在72℃延伸2分鐘。將藉由上述PCR獲得的兩個DNA片段用作模板和SEQ ID NO：9和12的引子進行30個循環的PCR：在94℃變性30秒，在55℃黏合30秒，並在72℃延伸2分鐘，以獲得DNA片段。將獲得的DNA片段用限制酶XbaI切割，並選殖到已用同一種酶切割的載體(pDZ(韓國專利第10-0924065號和國際專利公開案第2008-033001)中。將藉由上述方法製備的載體命名為pDZ-purF-g1a。

重組載體pDZ-purF-g1a係藉由電穿孔而轉形入棒狀桿菌ATCC6872中，然後在含有25mg/L的卡那黴素的培養基上選擇藉由同源重組而將載體插入基因組DNA的菌株。對如此選擇的原菌株進行二次互換，然後對選擇的菌株進行測序，從而選擇導入突變的所需菌株，並將該菌株命名為ATCC6872：：purF(g1a)菌株。

實施例1-2：弱化purA菌株的製備

為了製備其中purA的起始密碼子改變的菌株，首先製備含有purA的插入載體。為了將purA基因選殖入插入載體中，具體地，使用停滯棒狀桿菌ATCC6872的基因組DNA作為模板和SEQ ID NO： 13和14以及SEQ ID NOS：15和16的引子進行PCR。PCR產物之選殖係如實施例1-1中進行，並將由此製備的載體命名為pDZ-purA-a1t。

重組載體pDZ-purA-a1t係藉由電穿孔而轉形入實施例1-1中製備的ATCC6872：：purF(g1a)菌株中，然後，然後在含有25mg/L的卡那黴素的培養基上選擇藉由同源重組而將載體插入基因組DNA的菌株。對如此選擇的原菌株進行二次互換，然後對選擇的菌株進行測序，從而選擇導入突變的所需菌株。

將最終選擇的基於野生型停滯棒狀桿菌菌株ATCC6872的產生IMP的菌株命名為CJI2331。

實施例1-3：CJI2331的醱酵滴度測試

將2mL菌種培養基分配到直徑為18mm的試管中，並在壓力下高壓滅菌。將ATCC6872和CJI2331各接種，並在30℃振盪培養24小時以用作菌種培養物。將29mL的醱酵培養基分配到250mL的振動錐形瓶中，並在121℃在壓力下高壓滅菌15分鐘，以及接種2mL菌種培養物並培養3天。將培養條件調節成轉速為170rpm，溫度為30℃，和pH為7.5。

培養完成後，藉由HPLC(SHIMAZDU LC20A)測量產生的IMP量，而且培養結果如下表3所示。以下結果表示增強purF和弱化purA的菌株具有IMP生產力。

-菌種培養基：1%葡萄糖、1%蛋白腖、1%肉提取物、1%酵母提取物、0.25%氯化鈉、100mg/L腺嘌呤、100mg/L鳥嘌呤、pH 7.5

-醱酵培養基：0.1%麩胺酸鈉、1%氯化銨、1.2%硫酸鎂、0.01%氯化鈣、20mg/L硫酸鐵、20mg/L硫酸錳、20mg/L硫酸鋅、5mg/L硫酸銅、23mg/L L-半胱胺酸、24mg/L丙胺酸、8mg/L菸酸、45μg/L生物素、5mg/L鹽酸硫胺素、30mg/L腺嘌呤、1.9%磷酸(85%)、2.55%葡萄糖、1.45%果糖

實施例2：弱化5'-肌醇酸脫氫酶的變異體的製備

為了辨別改善IMP生產力的5'-肌苷酸脫氫酶突變，製備了編碼5'-肌苷酸脫氫酶的基因guaB的突變異體庫。

實施例2-1：含guaB的載體的製備

為了製備guaB突變異體庫，首先製備含有guaB的重組載體。將停滯棒狀桿菌ATCC6872的基因組DNA用作模板和SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的引子進行PCR，並使用TOPO選殖套組(Invitrogen)將PCR產物選殖入大腸桿菌載體pCR2.1以獲得pCR-guaB。

實施例2-2：guaB突變異體庫的製備

guaB突變異體庫係基於實施例2-1中製備的載體而製備。該庫係藉由使用易錯PCR套組(clontechDiversify®PCRRandom Mutagenesis Kit)而製備。在可能發生突變的條件下，使用SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的引子進行PCR。具體地，在每1000個鹼基對可以發生0至3個突變的條件下，在94℃進行預熱30秒，然後進行25個循環：在94℃維持30秒和在68℃維持1分30秒。將如此獲得的PCR產物用大引子(500ng至125ng)進行PCR，進行25個循環：在95℃維持50秒，在60℃維持50秒和在68℃維持12分鐘，然後用DpnI處理，並轉形入大腸桿菌DH5α中並鋪在含有卡那黴素(25mg/L)的LB固體培養基上。選擇20個轉形菌落，然後獲得質體，然後進行測序分析。結果證實，突變以2個突變/kb的頻率在不同位點導入。取約20,000個轉形的大腸桿菌菌落並提取質體，並命名為pTOPO-guaB-庫。

實施例2-3：製備的庫的評估和菌株的選擇

將實施例2-2中製備的pTOPO-guaB庫藉由電穿孔而轉形入實施例1中製備的CJI2331菌株中，然後鋪在含有25mg/L卡那黴素的營養培養基上，以得到其中插入突變基因的10,000個菌落。將每個菌落命名為CJI2331_pTOPO_guaB(mt)1至CJI2331_pTOPO_guaB(mt)10000。

-營養培養基：1%蛋白腖、1%肉提取物、0.25%氯化鈉、1%酵母提取物、2%瓊脂、pH 7.2

將獲得的10,000個菌落中的每一者接種於200μL的在壓力下高壓滅菌的菌種培養基中，並藉由在96深孔板中使用微孔板振盪器(TAITEC)在30℃，1200rpm振盪下培養24小時，然後用作菌種培養物。將290μL的在壓力下高壓滅菌的醱酵培養基分配到96深孔板中，並將20μL的各菌種培養物接種到其上，然後在與上述相同的條件下振盪培養72小時。

為了分析培養基中5'-肌苷酸的產生，在培養完成後，將3μL的培養上清液轉移到96孔UV板中，各孔含有197μL的蒸餾水。接下來，使用微孔盤讀取儀進行振盪30秒，並使用分光光度計測量25℃，270nm處的光密度，並與CJI2331菌株的光密度進行比較，以選擇顯示10%或更高的光密度增加的50個突變菌株菌落。與調節相比，其他菌落顯示出相似或降低的光密度。

以與上述相同的方式測量50種所選菌株的光密度，以重複檢查5'-肌苷酸的產生量。選擇與CJI2331菌株相比，顯示出顯著改善的5'-肌苷酸生產力的三種菌株CJI2331_pTOPO_guaB(mt)133、CJI2331_pTOPO_guaB(mt)1209和CJI2331_pTOPO_guaB(mt)8927。

實施例2-4：藉由測序而識別突變

為了識別突變菌株的基因突變，使用SEQ ID NO：21和22的引子對CJI2331_pTOPO_guaB(mt)133、 CJI2331_pTOPO_guaB(mt)1209和CJI2331_pTOPO_guaB(mt)8927中的每一者進行PCR，然後進行測序。將CJI2331_pTOPO_guaB(mt)133、CJI2331_pTOPO_guaB(mt)1209和CJI2331_pTOPO_guaB(mt)8927的guaB基因與野生型菌株ATCC6872和CJI2331的基因進行比較。

結果，發現所有三種菌株在不同位點都包含guaB基因突變。

具體地，證實了CJI2331_pTOPO_guaB(mt)133菌株具有在第499個位置的蘇胺酸經異亮胺酸取代的取代突變，CJI2331_pTOPO_guaB(mt)1209菌株在第377個位置的丙胺酸經蘇胺酸取代的取代突變，以及CJI2331_pTOPO_guaB(mt)8927菌株具有在第377個位置的丙胺酸經蘇胺酸取代的取代突變，並且在SEQ ID NO：2所示的GuaB基因的胺基酸序列中具有在第499個位置的蘇胺酸經異亮胺酸取代的取代突變。因此，在如下實施例3和4中，檢驗上述每個突變是否影響棒狀桿菌屬微生物產生的IMP量。

實施例3：CJI2331中IMP生產力的檢驗

將實施例2中識別的突變導入CJI2331(其係源自ATCC6872的產生IMP的菌株)，並檢驗IMP生產力。

實施例3-1：突變誘導的菌株的製備

為了導入實施例2中識別的突變，含有目標突變的反義寡核苷酸分別設計為75個鹼基的長度。

具體地，藉由電脈衝方法(Appl.Microbiol.Biothcenol.,1999,52：541-545)，將30μg的SEQ ID NO：23或24的寡核苷酸轉形到CJI2331菌株中，並且在其中加入1mL的複合培養液，然後在30℃和160rpm振盪下培養30分鐘。此後，將培養物在冰中培養10分鐘，並在4℃和4000rpm下離心10分鐘，棄去上清液，得到細胞沉澱物。然後，在其中加入1mL的10%甘油溶液，然後混合。將混合物在4℃和4000rpm下離心10分鐘。棄去上清液，洗滌細胞沉澱物。再次洗滌細胞沉澱物，並在其中加入0.1mL的10%甘油溶液(4℃)以製備用於隨後轉形的細胞。此後，藉由上述電脈衝方法而用SEQ ID NO：23或24的寡核苷酸轉形細胞，並重複該過程十次。將細胞鋪在複合瓊脂平板上以獲得菌落(Nat.Protoc.,2014 Oct；9(10)：2301-16)。

對獲得的菌落進行測序分析。結果，發現目標突變被導入菌株中。將在由guaB基因編碼的蛋白質中導入的A377T突變的菌株命名為CJI2331_guaB_m1，並且將在相同蛋白質中導入T499I突變的菌株命名為CJI2331_guaB_m2。

此外，為了製備均包含A377T和T499I突變的突變菌株，將30μg的SEQ ID NO：24的寡核苷酸轉形到CJI2331_guaB_m1菌株中，並以與上述相同的方式獲得菌落(Nat.Protoc.,2014 Oct；9(10)：2301-16)。對獲得的菌落進行測序分析，選擇在由guaB基因編碼的蛋白質中導入A377T和T499I突變的菌株，並命名為CJI2331_guaB_m1m2。

實施例3-2：在導入突變的菌株中檢驗IMP生產力

將2mL的菌種培養基分配到直徑為18mm的試管中，並在壓力下高壓滅菌。將ATCC6872和CJI2331中的每一者接種，並在30℃振盪培養24小時以用作菌種培養物。將29mL的醱酵培養基分配到250mL的振盪錐形瓶中，並在121℃在壓力下高壓滅菌15分鐘，接種2mL的菌種培養物並培養3天。將培養條件調整成轉速為170rpm，溫度為30℃，及pH為7.5。

培養完成後，藉由HPLC(SHIMAZDU LC20A)測量產生的IMP量，結果如下表7所示。如下結果所示，與調節性CJI2331菌株相比，具有在guaB基因編碼的蛋白質中的A377T突變或T499I突變的CJI2331_guaB_m1或CJI2331_guaB_m2菌株顯示分別提高0.42g/L(40%)或0.21g/L(20%)的IMP濃度。此外，具有A377T和T499I突變的 CJI2331_guaB_m1m2菌株顯示最大改善為0.58g/L(50%)的IMP濃度，暗示當包含兩種突變時，可以獲得最有效改善的IMP濃度。

實施例4：衍生自ATCC6872的產生IMP的菌株中的IMP生產力的檢驗 實施例4-1：衍生自ATCC6872的產生IMP的菌株的選擇

為了製備衍生自ATCC6872的產生IMP的菌株，將ATCC6872以10⁷個細胞/mL至10⁸個細胞/mL的密度懸浮於磷酸鹽緩衝液(pH7.0)或檸檬酸鹽緩衝液(pH5.5)中，然後用在室溫或32℃以紫外線照射20分鐘至40分鐘以誘發突變。將菌株用0.85%鹽水溶液洗滌兩次，並鋪在含有1.7%瓊脂的基本培養基上，該瓊脂補充有適當濃度的用於提供抗性的物質，從而獲得菌落。將每個菌落在營養培養基中培養，並在菌種培養基中培養24小時，然後在醱酵培養基中培養3至4天。結果，選擇了顯示出在培養基中積累的最優異的IMP產生的菌落。為了製備產生高濃度IMP的菌株，通過上述步驟順序提供腺嘌呤-營養缺陷型、鳥嘌呤- 洩漏型、溶菌酶敏感性、3,4-脫氫脯胺酸抗性、鏈黴素抗性、氮雜環丁烷羧酸抗性、硫脯胺酸抗性、偶氮絲胺酸抗性、磺胺胍抗性、正纈胺酸抗性以及甲氧芐啶(trimethoprim)抗性的菌株。最終選擇具有上述抗性並具有優異IMP生產力的CJI2335。比較CJI2335相對於ATCC6872的抗性，並顯示在下表8中。

-基本培養基：2%葡萄糖、0.3%硫酸鈉、0.1%磷酸二氫鉀、0.3%磷酸氫二鉀、0.3%硫酸鎂、10mg/L氯化鈣、10mg/L硫酸鐵、1mg/L硫酸鋅、3.6mg/L氯化錳、20mg/L L-半胱胺酸、10mg/L泛酸鈣、5 mg/L鹽酸硫胺素、30μg/L生物素、20mg/L腺嘌呤、20mg/L鳥嘌呤，調整為pH 7.3。

實施例4-2：CJI2335的醱酵滴度測試

將2mL菌種培養基分配到直徑為18mm的試管中，並在壓力下高壓滅菌。將ATCC6872和CJI2335中的每一個接種，並在30℃振盪培養24小時以用作菌種培養物。將29mL醱酵培養基分配到250mL的振盪錐形瓶中，並在121℃在壓力下高壓滅菌15分鐘，接種2mL菌種培養物並培養3天。將培養條件調整成轉速為170rpm，溫度為30℃，pH為7.5。

培養完成後，藉由HPLC(SHIMAZDU LC20A)測量產生的IMP量，結果如下表9所示。

實施例4-3：含有guaB突變的插入載體的製備

為了導入具有實施例3中選擇的突變的菌株，製備插入載體。如下製備用於引入guaB突變的載體。將用作模板的CJI2331_pTOPO_guaB(mt)1209菌株的guaB(A377T)基因和實施例2中選擇的CJI2331_pTOPO_guaB(mt)133菌株的guaB(T499I)基因和SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的引子進行PCR。PCR係藉由在94℃變性5分鐘，然後進行20個循環：在94℃維持30秒，在55℃維持30秒，和在72℃維持1分鐘，接著在72℃聚合5分鐘。所得的基因片段各自經XbaI切割。將已被限制酶XbaI切割的每個基因片段用T4連接酶選殖到線性pDZ載體中，從而製備pDZ-guaB(A377T)和pDZ-guaB(T499I)。

實施例4-4：將突變異體導入CJI2335菌株並評估

為了確認實施例4-1中選擇的CJI2335菌株的guaB基因的核苷酸序列，藉由PCR擴增CJI2335的基因組DNA。具體地，首先將用作模板的CJI2335的染色體DNA和SEQ ID NO：21和22的引子進行PCR，進行28個用Taq DNA聚合酶的聚合循環：在94℃維持1分鐘，在58℃維持30秒，和在72℃維持2分鐘，以擴增約2.1kb的guaB。將相同的引子用於進行CJI2335的基因組DNA的測序，結果，其序列與野生型ATCC6872的guaB基因的序列相同，表示guaB基因沒有突變。

將實施例4-3中製備的pDZ-guaB(A377T)和pDZ-guaB(T499I)載體用於轉形CJI2335，並在含有25mg/L的卡那黴素的培養基上選擇藉由同源重組而將載體插入基因組DNA的菌株。如此選擇的原菌株進行二次互換，以選擇導入目標基因突變的菌株。基因突變導入所需的轉形菌株係藉由使用SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的引子之PCR檢驗，然後進行測序以確認將突變導入菌株中。具體地，將導入由guaB基因編碼的蛋白質中的A377T突變的菌株命名為CJI2335_guaB_m1，以及將導入由guaB基因編碼的蛋白質中的T499I突變的菌株命名為CJI2335_guaB_m2。此外，為了製備同時具有A377T和T499I突變的突變菌株，用pDZ-guaB(T499I)載體轉形CJI2335_guaB_m1菌株，並以與上述相同的方式獲得菌落。對於所得菌落的測序分析，選擇在guaB基因編碼的蛋白質中同時導入了A377T和T499I突變的菌株，並命名為CJI2335_guaB_m1m2。

如表12所示，相較於調節性CJI2335菌株，在由guaB基因編碼的蛋白質中具有A377T突變或T499I突變的CJI2335_guaB_m1或CJI2335_guaB_m2菌株分別顯示IMP濃度為2.2g/L(40%)或1.0 g/L(18.5%)，表示有改善。此外，同時具有A377T和T499I突變的CJI2331_guaB_m1m2菌株顯示IMP濃度改善為2.7g/L(50%)，表示當包括兩個突變時，可以獲得IMP濃度的最有效的改善。

這些結果支持當將本揭示內容的5'-肌苷酸脫氫酶的變異體導入具有IMP生產力的各種棒狀桿菌屬微生物時，可以大幅改善5'-肌苷酸的生產力。

CJI2335係根據布達佩斯條約的規定，於2018年6月22日寄存在韓國微生物保存中心，寄存號為KCCM12278P。此外，製備的CJI2335_guaB_m1m2菌株，也稱為CJI2347，係於2018年6月22日根據布達佩斯條約的規定寄存在韓國微生物保存中心，寄存號為KCCM12279P。

基於以上描述，發明所屬領域的技術人員將理解，本揭示內容可以不同的特定形式實現，而不改變其技術精神或必要特徵。因此，應該理解，上述具體實施例不是限制性，而是在所有態樣皆為闡釋性。本揭示內容的範疇係由所附申請專利範圍所限定，而不是由該等申請專利範圍之前的描述限定，因此，落入申請專利範圍的範圍和界限內的所有變化和修改，或者此等範圍和界限的等效物因此旨在被涵蓋在該等申請專利範圍。

寄存機構名稱：韓國微生物保存中心(國外)

寄存登錄號：KCCM12278P

寄存日期：20180622

寄存機構名稱：韓國微生物保存中心(國外)

寄存號：KCCM12279P

寄存日期：20180622

本發明的功效

當本揭示內容的5'-肌苷酸脫氫酶的變異體用於培養產生5'-肌醇酸的棒狀桿菌屬微生物時，可以生產高產率的5'-肌醇酸。

<110> CJ第一製糖股份有限公司(CJ CHEILJEDANG CORPORATION)

<120> 新穎的5’-肌苷酸脫氫酶及使用該脫氫酶製備5’-肌苷酸的方法

<150> 10-2018-0087597

<151> 2018-07-27

<160> 26

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 1521

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> guaB NT

<400> 1

<210> 2

<211> 506

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> guaB AA

<400> 2

<210> 3

<211> 1521

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> guaB NT(A377T)

<400> 3

<210> 4

<211> 1521

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> guaB NT(T499I)

<400> 4

<210> 5

<211> 1521

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> guaB NT(A377T,T499I)

<4.00> 5

<210> 6

<211> 506

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> GuaB(A377T)-AA

<400> 6

<210> 7

<211> 506

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> GuaB(T499I)-AA

<400> 7

<210> 8

<211> 506

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> GuaB(A377T,T499I)-AA

<400> 8

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pDZ-purF(g1a)-1

<400> 9

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pDZ-purF(g1a)-2

<400> 10

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pDZ-purF(g1a)-3

<400> 11

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pDZ-purF(g1a)-4

<400> 12

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pDZ-purA(a1t)-1

<400> 13

<210> 14

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pDZ-purA(a1t)-2

<400> 14

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pDZ-purA(a1t)-3

<400> 15

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pDZ-purA(a1t)-4

<400> 16

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCR-guaB-F

<400> 17

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCR-guaB-R

<400> 18

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pTOPO-guaB-library-F

<400> 19

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pTOPT-guaB-library-R

<400> 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> guaB seq F

<400> 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> guaB seq R

<400> 22

<210> 23

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mage A337T

<400> 23

<210> 24

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mage T499I

<400> 24

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pDZ-guaB-F

<400> 25

<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pDZ-guaB-R

<400> 26

Claims

一種5'-肌苷酸脫氫酶之變異體，其具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列中，i)第377個位置之胺基酸經蘇胺酸取代，ii)第499個位置之胺基酸經異亮胺酸取代，或iii)第377個位置之胺基酸經蘇胺酸取代和第499個位置之胺基酸經異亮胺酸取代。
一種多核苷酸，其編碼如申請專利範圍第1項所述之5'-肌苷酸脫氫酶之變異體。
一種載體，包括如申請專利範圍第2項所述之多核苷酸。
一種產生5'-肌苷酸之棒狀桿菌屬微生物，該棒狀桿菌屬微生物包括如申請專利範圍第1項所述之5'-肌苷酸脫氫酶之變異體、如申請專利範圍第2項所述之多核苷酸、或如申請專利範圍第3項所述之載體。
如申請專利範圍第4項所述之棒狀桿菌屬微生物，其中，該棒狀桿菌屬微生物是停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)。
一種製備5'-肌苷酸之方法，包括：在培養基中培養如申請專利範圍第4項所述之棒狀桿菌屬微生物；以及從該棒狀桿菌屬微生物或該培養基回收5'-肌苷酸。
如申請專利範圍第6項所述之方法，其中，該棒狀桿菌屬微生物是停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)。