KR20020074811A

KR20020074811A - 5'-이노신산을 생산하는 미생물

Info

Publication number: KR20020074811A
Application number: KR1020010014836A
Authority: KR
Inventors: 김현수; 정성오; 황수연; 이재철
Original assignee: 제일제당주식회사
Priority date: 2001-03-22
Filing date: 2001-03-22
Publication date: 2002-10-04

Abstract

본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872의 변이주로서 생육에 아데닌을 요구하고 구아닌 또는 크산틴 누출형 변이주이며, 우레아를 자화할 수 있는 우레아제가 결손되고, 세포벽 분해 효소인 라이소자임에 대한 감수성이 높으며, 항생제인 스트렙토마이신과 L-프롤린 유사체, 글루타민 유사체 및 설폰아마이드계 유사체에 내성을 가짐으로써 기존 균주에 비해 5'-이노신산을 배양액 중에 고수율, 고농도로 직접 축적시키는 미생물에 관한 것이다.

Description

5'-이노신산을 생산하는 미생물 {5'-Inosinic acid producing microorganism}

본 발명은 5'-이노신산(5'-inosinic acid)을 생산하는 미생물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)(종전 브레비박테리움) ATCC 6872의 변이주로서 생육에 아데닌을 요구하고 구아닌 또는 크산틴 누출형 변이주(leaky mutant)이며, 우레아를 자화할 수 있는 우레아제(urease)가 결손되고, 세포벽 분해 효소인 라이소자임(lysozyme)에 대한 감수성이 높으며, 항생제인 스트렙토마이신과 L-프롤린 유사체, 글루타민 유사체 및 설폰아마이드계 유사체에 내성을 가짐으로써 기존 균주에 비해 5'-이노신산의 생산능이 향상된 미생물에 관한 것이다.

5'-이노신산은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로서 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 의미를 가질 뿐만 아니라 식품, 및 의약품과 같은 각종 의료적 이용등 다방면에 이용되고 있으며, 특히 글루탐산나트륨과 같이 사용하면 맛의 상승효과가 커서 정미성 조미료로 각광받고 있는 핵산계 조미료 중 하나이다.

퓨린계 합성시스템에서 설폰아마이드의 세포내 기작은 5'-이노신산의 생합성및 일탄소 전이반응에 저해를 일으키는 p-아미노벤조산에 대한 경쟁적 저해제로 작용한다. 따라서, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에 설폰아마이드에 대한 내성을 부여하면 대사경로가 유전적으로 5'-이노신산 합성 쪽으로 변화되어 5'-이노신산 생합성 경로를 더욱 강화시킬 수 있음이 문헌[참조: Agri, Biol, Chem, Vol; 42(3), p637~641, 1978]에 기재되어 있다.

그외에도 직접 발효법으로 5'-이노신산을 생산하는 여러 방법들이 공지되어 있는데, 가장 중요한 사항은 경제적으로 고농도, 고수율의 5'-이노신산을 생산하는 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 기존의 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872의 형질을 개량함으로써 직접 발효법으로 고농도, 고수율의 5'-이노신산을 생산하는 변이주를 제공하는 데 있다.

본 발명 따른 5'-이노신산을 생산하는 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872의 변이주로서 생육에 아데닌을 요구하고 구아닌 또는 크산틴 누출형 변이주이며, 우레아를 자화할 수 있는 우레아제가 결손되고, 세포벽 분해 효소인 라이소자임에 대한 감수성이 높으며, 항생제인 스트렙토마이신과 L-프롤린 유사체, 글루타민 유사체 및 설폰아마이드계 유사체에 내성을 가짐으로써 기존 균주에 비해 5'-이노신산을 배양액 중에 고수율, 고농도로 직접 축적시키는 미생물이다.

이하 본 발명의 구체적인 실시예를 상세히 설명한다.

본 발명 따른 5'-이노신산을 생산하는 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스(종전 브레비박테리움) ATCC 6872의 변이주로서 종래 5'-이노신산을 생산하는 아데닌 누출형 변이주[참고문헌:Agr, Bio, Chem., Vol; 47(5) ,p1035-1041, 1983, (KY13102, KY13171, KY13184등)] 또는 아데닌, 크산틴 또는 구아닌 동시 요구성 미생물과는 달리 아데닌을 요구하는 반면 크산틴 또는 구아닌을 요구하지 않으나 첨가함으로써 생육이 촉진되며, 우레아를 자화할 수 있는 우레아제가 결손되고, 세포내에 생성된 다량의 5'-이노신산을 세포밖으로 잘 분비할 수 있도록 세포벽 합성능력이 부분적으로 결손된 것으로 여겨지는 세포벽 분해효소인 라이소자임에 대한 감수성이 높아서 라이소자임에 의한 최저 생육 억제농도가 8㎍/ml이며, 발효과정 중에 발생하는 오염에 효과적으로 대응하기 위하여 항생제인 스트렙토마이신에 대한 내성을 부여하며, 배양과정에서 첨가된 고농도의 포도당 및 여러 탄소원과 배양 후반에 배양액 내에 축적된 5'-이노신산에 의해 균체 외부의 삼투압이 증가하여 5'-이노신산 생산 미생물의 정상적인 생리활성이 저해되어 균체 성장이 둔화되고 5'-이노신산 생성이 저하되는 것을 방지할 수 있는 삼투압 내성 형질을 강화하기 위한 목적으로 균체 외부에 축적된 고농도 용질에 대한 삼투압 조절에 중요한 역할을 하는 L-프롤린의 세포내 농도를 증가시키기 위하여 그 유사체들인 3,4-디하이드로프롤린, L-아제티딘-2-카복실산, 티아프롤린(L-티아졸리딘-4-카복실산), (S)-2,2-디메틸-4-옥사졸리디카복실산, (S)-5,5-디메틸-4-티아졸리디카복실산, (4S,2RS)-2-에틸-4-티아졸리딘-카복실산, (2S,4S)-4-하이드록시-2-피롤린-카복실산, 2-피페리딘카복실산 및 2,5-피롤리딘디온에 내성을 부여하여 보다 더 효율적으로 삼투압에 의한 영향을 배제시키며, 퓨린계 합성시스템에서 필수적으로 요구되는 글루타민의 유사체들인 아자세린 및 DON(6-디아조-5-옥소-L-노르류신)에 대한 내성 형질을 부여하고, 퓨린합성계에서 5'-이노신산 합성계 쪽으로 유전적인 대사경로를 변화시키는 것으로 알려진 설폰아마이드계의 유사체들인 설파구아니딘(sulfaguanidine), 설파티아졸(sulfathiazole), 설파메타진 (sulfamethazine), 설파메트롤(sulfametrole), 설파목솔(sulfamoxole), 설파록실산(sulfaloxic acid), 설파메라진 (sulfamerazine), 설파미터(sulfameter), 설파메티졸(sulfamethizole), 설파메토미딘(sulfamethomidine), 설파메톡사졸 (sulfamethoxazole), 설파메톡시피리다진 (sulfamethoxypyridazine) 및 설파메톡시티아졸(sulfamethoxythiazole)에 대한 내성을 부여하여 5'-이노신산을 고수율, 고농도로 배양액 중에 직접 축적시키는 미생물이다.

본 발명의 변이주는 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872로부터 생육에 아데닌을 요구하는 반면 크산틴 또는 구아닌을 요구하지 않으나 첨가함으로써 생육이 촉진되며, 우레아를 자화할 수 있는 우레아제가 결손되고, 세포벽 분해 효소인 라이소자임에 대한 감수성이 높으며, 항생제인 스트렙토마이신과 L-프롤린 유사체 및 글루타민 유사체들에 대한 내성 형질이 부여된 미생물 CJIP009(KFCC-10226)을 친주로 하여 X-선, 자외선 또는 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌, 디에틸 설페이드 및 에틸아민 등의 화학변이 유기제로 처리한 후 최소배지(주2)에 아가(agar)를 1.7% 함유하고 각각의 설폰아마이드계 유사체들을 농도별로 함유한 배지에 적절히 희석한 후 도말하여 콜로니를 얻었다. 각각의 콜로니를 영양배지(주1)에서 배양하고 종배지(주3)에서 24시간 배양한 후, 발효배지(주4)에서 5 내지 6 일씩 배양한 결과, 발효배양액에 축적되는 5'-이노신산 생성량이 우수한 미생물을 각각의 유사체들에 대하여 단계적으로 선별하였다. 이후, 최종단계의 미생물 중에 발효배양액에 축적되는 5'-이노신산 생성량이 가장 우수한 CJKS 1006 (KFCC-11254)을 선별하였다.

(주1) 영양배지: 펩톤 1%, 육즙 1%, 염화나트륨 0.25%, 효모엑기스 1%, 한천 2%, 증류수 잔량, pH7.2

(주2) 최소배지: 포도당 2%, 황산나트륨 0.3%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.3%, 황산마그네슘 0.3%, 염화칼슘 10mg/l, 황산철 10mg/l, 황산아연 1mg/l, 염화망간 3.6mg/l, L-시스테인 20mg/l, 칼슘판토테네이트 10mg/l, 티아민염산염 5mg/l, 비오틴 30㎍/l, 아데닌 20mg/l, 구아닌 20mg/l, pH7.3

(주3) 종배지: 포도당 5%, 펩톤 0.5%, 육즙 0.5%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 100mg/l, 구아닌 100mg/l, pH7.2

(주4) 플라스크 발효배지: 글루탐산나트륨 0.1%, 암모늄클로라이드 1%, 황산마그네슘 1.2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20mg/l, 황산망간 20mg/l, 황산아연 20mg/l, 황산구리 5mg/l, L-시스테인 23mg/l, 알라닌 24mg/l, 니코틴산 8mg/l, 비오틴 45ug/l, 티아민염산 5mg/l, 아데닌 30mg/l, 인산(85%) 1.9%, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 8% 되게 첨가하여 사용 (pH7.2)

(주5) 발효조 종배지: 포도당 5.4%, 펩톤 1%, 효모엑기스 2%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.1%, 황산암모늄 0.5%, 황산철 80mg/l, 황산아연 40mg/l, 황산망간 40mg/l, L-시스테인 80mg/l, 칼슘판토테네이트 60mg/l, 티아민염산염 20mg/l, 비오틴 240㎍/l, 아데닌 1200mg/l, 구아닌 1200mg/l (pH7.2)

(주6) 발효조 본배지: 염화칼슘 120mg/l, 황산구리 8mg/l, 황산마그네슘 1.5%, 황산철 24mg/l, 황산아연 24mg/l, 황산망간 40mg/l, L-시스테인 26.4mg/l, 글루탐산나트륨 0.12%, 티아민염산염 6mg/l, 비오틴 40㎍/l, 니코틴산 50mg/l, 알라닌 145mg/l, 아데닌 200mg/l, 인산(85%) 4.3%, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 32%되게 첨가하여 사용 (pH7.2)

본 발명에서 선별하여 신규한 변이주 CJKS 1006 (KFCC-11254)의 대표적인 유사체들에 대한 생화학적 특성은 표 1의 기재와 같다. 단, 본 발명이 표 1의 특성에만 국한되는 것은 아니다.

특 성	ATCC 6872	CJKS 1006 (KFCC-11254)
아데닌	비요구성	요구성
구아닌(크산틴)	비요구성	누출형
라이소자임 감수성(최저 생육 억제농도)	80㎍/ml	8㎍/ml
3,4-디하이드로프롤린내성	1000㎍/ml	3500㎍/ml
스트렙토마이신	500㎍/ml	2000㎍/ml
아제티딘 카아복실산	5mg/ml	30mg/ml
티아프롤린	10㎍/ml	100㎍/ml
아자세린	25㎍/ml	100㎍/ml
설파구아니딘	50㎍/ml	200㎍/ml

본 발명에서 사용되는 5'-이노신산 배양방법은 하기와 같다.

즉, 코리네박테리움속에 속하며, 5'-이노신산을 생산할 수 있는 미생물들을 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지내에서 호기성 조건하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양한다.

탄소원으로서는 글루코오스, 프락토오스, 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있고, 질소원으로서는 암모니아, 염화암모늄 및 황산암모늄과 같은 각종 무기질소원 및 펩톤, NZ-아민, 육류추출물, 효모추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물등 유기질소원이 사용될 수 있다. 무기화합물로는 인산1수소칼륨, 인산2수소칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘등이 사용될 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양요구성 염기 등이 첨가될 수 있다. 배양은 호기적 조건하에서 예를 들면, 진탕배양 또는 통기교반배양에 의해, 바람직하게는 20 내지 40 ℃의 온도에서 수행된다. 배지의 pH는 배양하는 동안 중성 근처에서 유지하는 것이 바람직하며, 배양은 5 내지 6 일간 하였으며 직접 발효법에 의해서 축적된 5'-이노신산을 상법에 따라 분석하였다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예들이 기술되어질 것이다.

이하의 실시예들은 본 발명을 예증하기 위한 것으로서 본 발명의 범위를 국한시키는 것으로 이해되어져서는 안될 것이다.

실시예 1: 설파구아니딘 내성주 CJKS 1006의 선별

본 발명의 변이주는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP009(KFCC-10226)를 친주로 하여 포스페이트 완충액(pH7.0) 혹은 사이트레이트 완충액(pH 5.5)에 10⁷내지 10⁸세포/ml로 현탁시키고 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌을 최종농도가 10-50㎍/ml가 되도록 첨가하고 실온 혹은 32℃에서 20 내지 40 분간 처리하여 돌연변이를 유발시킨 후, 2회에 걸처서 0.85% 식염수로 세척한 다음, 아가를 1.7% 함유한 최소배지(주2)에 설파구아니딘을 각각 100㎍/ml, 150㎍/ml, 200㎍/ml 함유한 배지에서 적절히 희석한 후, 도말하여 콜로니를 얻었다. 각각의 콜로니를 영양배지(주1)에서 배양하고 종배지(주3)에서 24시간 배양한 후, 발효배지(주4)에서 3 내지 4 일씩 배양한 결과 발효배양액에 축적되는 5'-이노신산 생성량이 가장 우수한 CJKS 1006 (KFCC-11254)를 선별하였다. 표 2에 본 미생물의 설파구아니딘 내성농도를 표시하였다.

특 성	CJIP009(KFCC-10226)	CJKS 1006 (KFCC-11254)
설파구아니딘 내성농도	50㎍/ml	200㎍/ml

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 미생물 CJKS 1006은 종래의 균주에 비하여 설폰아마이드계 유사체인 설파구아니딘에 대한 내성이 강한 균주임을 알 수 있다.

실시예 2: 삼각플라스크 발효역가 실험

사용균주: CJKS 1006

종배지: 포도당 5%, 펩톤 0.5%, 육즙 0.5%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 100mg/l, 구아닌 100mg/l, pH7.2

플라스크 발효배지: 글루탐산나트륨 0.1%, 암모늄클로라이드 1%, 황산마그네슘 1.2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20mg/l, 황산망간 20mg/l, 황산아연 20mg/l, 황산구리 5mg/l, L-시스테인 23mg/l, 알라닌 24mg/l, 니코틴산 8mg/l, 비오틴 45ug/l, 티아민염산 5mg/l, 아데닌 30mg/l, 인산(85%) 1.9%, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 8% 되게 첨가하여 사용

발효방법: 상기 종배지 3ml을 지름 18mm 시험관에 분주하고 상법에 따라 가압살균한 후 사용균주를 접종하고 30℃의 온도에서 24시간 진탕배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 27ml를 500ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 120℃ 온도에서 10분간 가압살균하여 종배양액 3ml을 접종한 다음 5-6일간 배양하였다. 회전수는 분당 200회, 온도 30℃, pH7.2로 조절하였다.

배지내 5'-이노신산 축적량은 19.3g/l였다.

실시예 3: 5-L 발효조에서의 발효역가 실험

사용균주: CJKS 1006

종배지: 실시예 2와 동일

발효조 종배지: 포도당 5.4%, 펩톤 1%, 효모엑기스 2%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.1%, 황산암모늄 0.5%, 황산철 80mg/l, 황산아연 40mg/l, 황산망간 40mg/l, L-시스테인 80mg/l, 칼슘판토테네이트 60mg/l, 티아민염산염 20mg/l, 비오틴 240㎍/l, 아데닌 1200mg/l, 구아닌 1200mg/l (pH7.2)

발효조 본배지: 염화칼슘 120mg/l, 황산구리 8mg/l, 황산마그네슘 1.5%, 황산철 24mg/l, 황산아연 24mg/l, 황산망간 40mg/l, L-시스테인 26.4mg/l, 글루탐산나트륨 0.12%, 티아민염산염 6mg/l, 비오틴 40㎍/l, 니코틴산 50mg/l, 알라닌 145mg/l, 아데닌 200mg/l, 인산(85%) 4.3%, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 32% 되게 첨가하여 사용 (pH7.2)

발효방법: 상기 종배지 50ml를 500ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 상법에 따라 가압살균한 후 사용 균주를 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효조 종배지 1000ml를 2.5L-발효조에 넣고 120℃의 온도에서 15분간 가압살균하여 종배양액 50ml를 접종한 다음 1 내지 2 일간 배양하였다. 회전수는 분당 900회, 온도 28 내지 34 ℃, pH7.2로 조절하였다. 또한, 발효조 본배지 1250ml을 5L-발효조에 넣고 120℃의 온도에서 15분간 가압살균하여 발효조 종배지액 250ml을 접종한 다음, 배양하면서 배양액내에 환원당이 2%가 되었을때 1차 및 2차, 3차, 4차 추가당을 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 최종 환원당으로 각각 32%가 되도록 첨가하여 5 내지 6 일간 배양하였다. 회전수는 분당 900회, 온도 30℃, pH7.2로 조절하였다.

배지내 5'-이노신산 축적량은 70.6g/l였다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 변이주 CJKS 1006은 5'-이노신산의 생산에 있어서 높은 생산성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명에 의하면 직접 발효법으로 고농도, 고수율의 5'-이노신산을 생산하는 미생물을 제공하는 효과가 있다.

이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims

코리네박테리움 암모니아게네스의 변이주로서 고농도의 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJKS 1006 (KFCC-11254).
제 1 항에 있어서,

상기 미생물이 설폰아마이드계의 유사체들인 설파구아니딘, 설파티아졸, 설파메타진, 설파메트롤, 설파목솔, 설파록실산, 설파메라진, 설파미터, 설파메티졸, 설파메토미딘, 설파메톡사졸, 설파메톡시피리다진 및 설파메톡시티아졸에 내성을 가지는 것을 특징으로 하는 미생물.
제 1 항에 있어서,

생육에 아데닌을 요구하고 구아닌 또는 크산틴 누출형 변이주이며, 세포벽 분해 효소인 라이소자임에 의한 최저 생육 억제농도가 8㎍/ml이며, 항생제인 스트렙토마이신에 내성을 가지며, L-프롤린 유사체들인 3,4-디하이드로프롤린, L-아제티딘-2-카복실산, 티아프롤린(L-티아졸리딘-4-카복실산), (S)-2,2-디메틸-4-옥사졸리디카복실산, (S)-5,5-디메틸-4-티아졸리디카복실산, (4S,2RS)-2-에틸-4-티아졸리딘-카복실산, (2S,4S)-4-하이드록시-2-피롤린-카복실산, 2-피페리딘카복실산 및 2,5-피롤리딘디온에 내성을 가지며, 글루타민 유사체들인 아자세린 및 DON(6-디아조-5-옥소-L-노르류신)에 내성을 가지며, 설폰아마이드계의 유사체들인 설파구아니딘, 설파티아졸, 설파메타진, 설파메트롤, 설파목솔, 설파록실산, 설파메라진, 설파미터, 설파메티졸, 설파메토미딘, 설파메톡사졸, 설파메톡시피리다진 및 설파메톡시티아졸에 내성을 가지는 것을 특징으로 하는 미생물.
제 1 항의, 코리네박테리움 암모니아게네스의 변이주로서 고농도의 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJKS 1006 (KFCC-11254)을 이용하여 5'-이노신산을 생산하는 방법.