KR100521319B1

KR100521319B1 - 5'-이노신산을 생산하는 미생물 및 이를 사용한 5'-이노신산의 생산 방법

Info

Publication number: KR100521319B1
Application number: KR10-2003-0091402A
Authority: KR
Inventors: 김현수; 최혜진; 곽영현; 이진호; 황수연; 이원식
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2003-12-15
Filing date: 2003-12-15
Publication date: 2005-10-14
Also published as: KR20050059688A

Abstract

본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100(KCCM-10330)의 변이주로서, 직접발효법에 의해 5'-이노신산을 고농도 및 고수율로 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHK25(KCCM-10520), 및 이러한 미생물을 이용하여 고농도 및 고수율로 배양액 중에 5'-이노신산을 직접 축적시켜 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 미생물은 CJHB100(KCCM-10330) 균주의 특성인 아데닌 요구성, 크산틴 및 구아닌 누출형, 우레아제 결손형, 라이소자임 고-감수성, 스트렙토마이신 내성, 프롤린 유사체 내성, 글루타민 유사체 내성, 발린, 루신 및 이소루신 유사체 내성, 테트라하이드로폴레이트 유사체 내성 뿐만 아니라, 히스티딘 유사체 내성을 추가로 갖는 것을 특징으로 한다.

Description

5'-이노신산을 생산하는 미생물 및 이를 사용한 5'-이노신산의 생산 방법{Microorganism producing 5'-inosinic acid and production method of 5'-inosinic acid using the same}

본 발명은 5'-이노신산(5'-inosinic acid)을 생산하는 미생물 및 이를 사용한 5'-이노신산의 생산 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) [종전 브레비박테리움 (Brevibacterium)] CJHB100(KCCM-10330)의 변이주로서, CJHB100 균주 보다 직접 발효법에 의해 보다 더 고농도 및 고수율로 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHK25(KCCM-10520) 및 이를 이용하여 5'-이노신산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

5'-이노신산은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 의미를 가질 뿐 아니라 식품, 의약품 및 각종 의료적 용도로 다방면에서 이용되고 있으며, 특히, 글루타민산 나트륨과 같이 사용하면 맛의 상승효과가 커서 정미성 조미료로 각광을 받고 있는 핵산계 조미료 중의 하나이다.

현재 직접발효법으로 5'-이노신산을 생산하는 방법들이 공지되어 있는데, 가장 중요한 사항은 경제적으로 고농도 및 고수율의 5'-이노신산을 생산하는데 있다.

본 출원인은 2001년 11월 26일자로 출원되어 2003년 6월 2일자로 공개된 대한민국 공개특허공보 특2003-0042972호에서 개시한 바와 같이, 발효 배지 첨가시, 퓨린 생합성계에 효과가 있는 발린, 루신 및 이소루신의 유사체인 발린 하이드록사메이트(valine hydroxamate), 노르발린(norvaline), 메틸발린(N-methyl-DL-valine), 티아이소루신(DL-thiaisoleucine), 이소루신 하이드록사메이트(isoleucine hydroxamate), 루신 하이드록사메이트(leucine hydroxamate) 및 루신 메틸 에스테르(leucine methyl ester)에 대한 내성을 부여함과 동시에, 퓨린 생합성계에서 일탄소 단위(one-carbon unit) 전달자로 알려진[Escherichia coli and Salmonella. P561-579 (1996)] 테트라하이드로폴레이트(THF, tetrahydrofolate)의 유사체인 트리메토프림(trimethoprim), 피리메타마인(pyrimethamine), 메토트렉세이트(methotrexate) 및 아미노프테린(aminopterin)에 대한 내성을 부여한 미생물 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100(KCCM-10330)이 기존의 미생물에 비해 5'-이노신산을 보다 고농도 및 고수율로 생산할 수 있음을 확인한 바 있었다.

이후, 본 발명자들은 추가로 5'-이노신산을 보다 고농도 및 고수율로 생산하는 미생물을 개발하고자 노력하였으며, 그 결과 직접발효법으로 보다 고농도 및 고수율의 5'-이노신산을 생산하는 미생물을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은 상기 언급된 미생물 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100(KCCM-10330)로부터의 변이주, 보다 구체적으로 퓨린 생합성계에서 발효배지에 각종 아미노산을 첨가하는 경우 특히, 저해 효과가 있는 것으로 나타난 히스티딘(histidine)에 대하여 그 유사체인 히스티딘 하이드록사메이트 (histidine hydroxamate)에 대한 내성을 부여한 미생물이 직접 발효발효법에 의해 5'-이미노산을 종래에 비해 보다 더 고농도 및 고수율로 생산할 수 있음을 발견하였으며, 이로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 직접발효법에 의해 5'-이노신산을 고농도 및 고수율로 생산하고, 히스티딘(Histidine)의 유사체에 대한 내성을 갖는 미생물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배양하여 5'-이노신산을 고농도 및 고수율로 배양액 중에 5'-이노신산을 직접 축적시켜 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 히스티딘(Histidine)의 유사체에 대한 내성을 갖고, 5'-이노신산을 고수율 및 고농도로 생산하는 미생물 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHK25(KCCM-10520)에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHK25(KCCM-10520)를 배양하고, 그 배양물 중에 고농도 및 고수율로 5'-이노신산을 직접 축적시켜 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명의 미생물 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHK25(KCCM-10520)은 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100(KCCM-10330) 의 변이주이다. 본 발명에서 친주(parent strain)로 사용된 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100(KCCM-10330)[대한민국 공개특허공보 특2003-0042972호 참조]은 브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC6872의 변이주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP009(KCCM-10226)[대한민국 등록특허공보 10-0397321호 참조]의 변이주이다.

따라서, 본 발명에 따른 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100(KCCM-10330)의 하기 주요 특성 및 효과를 공유한다. 즉,

i) 아데닌 요구성이며 크산틴 및 구아닌 비요구성이나, 크산틴 또는 구아닌의 첨가시 생육이 촉진되는 크산틴 및 구아닌 누출형 변이주(leaky mutant)의 특성;

ii) 우레아를 자화할 수 있는 우레아제(urease) 결손 특성;

iii) 세포벽 분해효소인 라이소자임(lysozyme)에 대해 높은 감수성을 갖고 있어, 세포내에서 생성된 다량의 5'-이노신산을 세포밖으로 잘 분비할 수 있도록 세포벽 합성 능력이 부분적으로 결손되어 있는 특성;

iv) 스트렙토마이신(streptomycin)에 대한 내성을 갖고 있어, 발효 과정 중에 발생하는 오염에 효과적으로 대응할 수 있는 특성;

v) 배양 배지 중 고농도의 포도당 및 그밖의 다양한 탄소원이나 배양 중 생산된 5'-이노신산의 배양액내 축적에 의해 야기된 균체 외부의 삼투압으로 인해 미생물의 정상적인 생리활성이 저해되어 균체 성장이 둔화되고 결과적으로 5'-이노신산 생산이 저하되는 현상을 방지하기 위하여, 삼투압 조절에 중요한 역할을 하여 삼투압 내성 형질을 부여할 수 있는 프롤린(L-proline)의 세포내 농도를 증가시키기 위하여, 프로린의 유사체들에 대한 내성을 부여하여 삼투압에 의한 영향을 받지 않는 특성;

vi) 퓨린 생합성계에 필수적으로 요구되는 글루타민의 유사체, 예를 들면, 아자세린 및 DON(6-디아조-5-옥소-L-노르루신)에 대한 내성을 갖는 특성;

vii) 발효 배지 첨가시, 퓨린 생합성을 촉진하는 것으로 알려진, 발린, 루신 및 이소루신의 유사체들, 예를 들면, 발린 하이드록사메이트, 노르발린, 메틸발린, 티아이소루신, 이소루신 하이드록사메이트, 루신 하이드록사메이트 및 루신 메틸 에스테르에 대한 내성을 갖는 특성;

viii) 퓨린 생합성계에서 일탄소 전달자로서 알려진 테트라하이드로폴레이트의 유사체들, 예를 들면, 트리메토프림, 피리메타마인, 메토트렉세이트 및 아미노프테린에 대한 내성을 갖는 특성을 갖고 있다.

또한, 본 발명에 따른 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHK25(KCCM-10520)는 상기 특성들 이외에, 발효배지에 첨가시 퓨린계 생합성을 저해하는 것으로 알려진 히스티딘에 대하여 그 유사체인 히스티딘 하이드록사메이트(histidine hydroxamate)에 대한 내성을 추가로 가짐으로써, 5'-이노신산을 보다 더 고농도 및 고수율로 배양액 중에 직접 축적시킬 수 있다.

본 발명의 상세한 설명 및 실시예에서 언급되는 바와 같이, 본 발명에서 미생물의 배양을 위해 사용되는 영양 배지('주 1'로 표시됨), 최소 배지('주 2'로 표시됨), 종 배지('주 3'으로 표시됨), 플라스크 발효 배지('주 4'로 표시됨), 발효조 종 배지('주 5'로 표시됨), 발효조 본 배지('주 6'으로 표시됨)는 각각 표 1에서 나타낸 바와 같은 조성으로 이루어진 배지를 의미한다. 그러나, 배지 조성은 표 1에 제시된 것으로 제한되지는 않으며, 코리네박테리움 암모니아게네스의 배양에 적합한 모든 배양 배지를 사용할 수 있다.

배지종류	배지 조성
주 1	펩톤 1%, 육즙 1%, 염화나트륨 0.25%, 효모추출물 1%, 한천 2% (pH 7.2)
주 2	포도당 2%, 황산나트륨 0.3%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.3%, 황산마그네슘 0.3%, 염화칼슘 10mg/ℓ, 황산철 10mg/ℓ, 황산아연 1mg/ℓ, 염화망간 3.6mg/ℓ, L-시스테인 20mg/ℓ, 칼슘판토테네이트 10mg/ℓ, 티아민염산염 5mg/ℓ, 바이오틴 30μg/ℓ, 아데닌 20mg/ℓ, 구아닌 20mg/ℓ, (pH 7.3)
주 3	포도당 5%, 펩톤 0.5%, 육즙 0.5%, 효모액기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 100mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ (pH 7.2)
주 4	글루타민산나트륨 0.1%, 암모늄클로라이드 1%, 황산마그네슘 1.2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20mg/ℓ, 황산망간 20mg/ℓ, 황산아연 20mg/ℓ, 황산구리 5mg/ℓ, L-시스테인 23mg/ℓ, 알라닌 24mg/ℓ, 니코틴산 8mg/ℓ, 바이오틴 45ug/ℓ, 티아민염산염 5mg/ℓ, 아데닌 30mg/ℓ, 인산(85%) 1.9%, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 8%가 되게 첨가하여 사용 (pH 7.2)
주 5	포도당 5.4%, 펩톤 1%, 효모추출물 2%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.1%, 황산암모늄 0.5%, 황산철 80mg/ℓ, 황산아연 40mg/ℓ, 황산망간 40mg/ℓ, L-시스테인 80mg/ℓ, 칼슘판토테네이트 60mg/ℓ, 티아민염산염 20mg/ℓ, 바이오틴 240μg/ℓ, 아데닌 1200mg/ℓ, 구아닌 1200mg/ℓ (pH 7.2)
주 6	염화칼슘 120mg/ℓ, 황산구리 8mg/ℓ, 황산마그네슘 1.5%, 황산철 24mg/ℓ, 황산아연 24mg/ℓ, 황산망간 mg/ℓ, L-시스테인 26.4mg/ℓ, 글루타민산 나트륨 0.12%, 티아민염산염 6mg/ℓ, 바이오틴 40μg/ℓ, 니코틴산 50mg/ℓ, 알라닌 145mg/ℓ, 아데닌 200mg/ℓ, 인산(85%) 4.3%, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 32%가 되게 첨가하여 사용 (pH 7.2)

본 발명에 따른 미생물을 수득하기 위해서, 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100(KCCM-10330)를 X-선, 자외선, 또는 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌, 디에틸설페이트, 에틸아민 등의 화학적 변이유도제로 처리하였다. 이후, 이를 최소 배지(주 2) 중에 1.7% 한천(agar), 및 히스티딘 유사체를 각각 농도별로 함유한 배지에 적절히 희석한 후 도말하여 콜로니(colony)를 수득하였다.

수득된 각각의 콜로니를 영양 배지(주 1)에서 배양하고, 종 배지(주 3)에서 24시간 배양한 후 발효 배지(주 4)에서 5 내지 6일씩 배양한 결과, 발효배양액에 축적되는 5'-이노신산 생산량이 우수한 미생물을 각각의 유사체에 대해서 단계적으로 선별하였다. 이후, 최종 단계의 미생물 중에 발효배양액에 축적된 5'-이노신산 생산량이 가장 우수한 균주를 선별하였다.

이러한 균주를 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHK25로 명명하였으며, 이를 부다페스트 조약하에 서울 서대문구 홍제1동 소재의 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2003년 10월 17일자로 수탁번호 KCCM-10520호로 기탁하였다.

본 발명에 따라 선별된 신규한 변이주 CJHK25(KCCM-10520)의 대표적인 유사체들에 대한 생화학적 특성을 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC6872와 비교하여 표 2에 기재하였다.

특 성	ATCC6872	CJHK25(KCCM-10520)
아데닌	비요구성	요구성
구아닌(크산틴)	비요구성	누출형
라이소자임 감수성(최저생육억제농도)	80㎍/㎖	8㎍/㎖
3,4-디하이드로프롤린 내성	1000㎍/㎖	3500㎍/㎖
스트렙토마이신 내성	500㎍/㎖	2000㎍/㎖
아제티딘 카복실산 내성	5mg/㎖	30mg/㎖
티아 프롤린 내성	10㎍/㎖	100㎍/㎖
아자세린 내성	25㎍/㎖	100㎍/㎖
노르발린 내성	0.2mg/㎖	2mg/㎖
트리메토프림 내성	20㎍/㎖	100㎍/㎖
히스티딘 하이드록사메이트 내성	0.5mg/㎖	2mg/㎖
본 발명의 미생물 특성이 상기 특성들로만 국한되는 것은 아니다

본 발명에서 사용되는 5'-이노신산의 생산 방법은 다음과 같다.

즉, 본 발명에 따른 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHK25(KCCM-10520)를 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양한다.

탄소원으로서는 글루코오스, 프락토오스, 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있고, 질소원으로서는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄과 같은 각종 무기질소원 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크, 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다.

무기화합물로는 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양요구성 염기 등이 첨가될 수 있다.

배양은 호기적 조건 하에서 예를 들면, 진탕 배양 또는 통기 교반 배양에 의해, 바람직하게는 20 내지 40℃의 온도에서 수행된다. 배지의 pH는 배양하는 동안 중성 근처에서 유지하는 것이 바람직하며, 배양은 5 내지 6일 동안 지속하였으며, 직접발효법에 의해서 축적된 5'-이노신산을 상법에 따라 분석하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 어떤 형태로든 실시예에 의해 제한되는 것을 의미하지는 않는다.

<실시예>

실시예 1 : 발효 배지내 히스티딘 첨가에 의한 영향

본 발명에 따른 미생물의 친주(parent strain)인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100(KCCM-10330)을 영양 배지(주 1)에서 배양하고 종 배지(주 3)에서 24시간 동안 배양한 후, 발효 배지(주 4)에 히스티딘 0.5㎎/㎖을 첨가하고 3 내지 4일씩 배양한 결과, 발효배양액에 축적되는 5'-이노신산 생산량이 표 3에서 나타낸 바와 같이 저하되는 결과를 얻었다.

따라서, 히스티딘에 대한 내성이 있어 5'-이노신산의 생산성이 저하되지 않는 히스티딘의 유사체에 대한 내성주를 획득할 필요성이 있었다.

히스티딘 첨가농도	무첨가	0.5㎎/㎖
5'-이노신산 농도(g/ℓ)	19.1	15.4

실시예 2 : 히스티딘 하이드록사메이트 내성주 CJHK25의 선별

본 발명에 따른 변이주는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100(KCCM-10330)을 친주로 하여 포스페이트 완충액(pH 7.0) 혹은 시트레이트 완충액(pH 5.5)에 10⁷내지 10⁸세포/㎖로 현탁시키고 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌을 최종농도가 10 내지 50㎍/㎖가 되도록 첨가하고 실온 혹은 32℃에서 20 내지 40분 동안 처리하여 돌연변이를 유발시킨 후, 2회에 걸쳐서 0.85% 식염수로 세척하고 이후, 한천 1.7%를 함유된 최소배지(주 2)에 히스티딘 하이드록사메이트가 각각 1㎎/㎖, 2㎎/㎖ 함유한 배지에서 적절히 희석한 후, 도말하여 콜로니(colony)를 수득하였다. 각각의 콜로니를 영양 배지(주 1)에서 배양하고 종 배지(주 3)에서 24시간 배양한 후, 발효 배지(주 4)에서 3 내지 4일씩 배양한 결과 발효배양액에 축적되는 5'-이노신산 생산량이 가장 우수한 CJHK25를 선별할 수 있었다.

표 4는 본 발명에 따른 미생물 및 친주인 CJHB100(KCCM-10330)의 히스티딘 하이드록사메이트에 대한 내성농도를 표시하였다.

특성	CJHB100(KCCM-10330)	CJHK25
히스티딘하이드록사메이트내성 농도	0.5㎎/㎖	2㎎/㎖

실시예 3 : 삼각플라스크 발효역가 실험

사용균주: 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHK25

종 배지 : 표 1의 주 3 참조

플라스크 발효 배지: 표 1의 주 4 참조

발효 방법 : 상기 종 배지 3㎖을 지름 18㎜mm 시험관에 분주하고 상법에 따라 가압살균후 사용균주를 접종하고 30℃ 온도에서 24시간 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효 배지 27㎖를 500㎖ 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 120℃ 온도에서 10분간 가압살균하여 종배양액 3㎖을 접종한 다음 5 내지 6일 동안 배양하였다. 회전수는 분당 200회, 온도 32℃, Ph 7.2으로 조절하였다. 배양 결과, 배지내 5'-이노신산 축적량은 19.9g/ℓ 이었다. 이는 동일한 조건하에서 친주 CJHB100을 배양한 결과(19.7g/ℓ) 보다 더 우수하였다.

실시예 4 : 5-L 발효조에서의 발효역가 실험

사용균주 : CJHK25

종 배지 : 실시예3과 동일

발효조 종 배지: 표 1의 주 5 참조

발효조 본 배지: 표 1의 주 6 참조

발효 방법 : 상기 종 배지 50㎖를 500㎖ 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 상법에 따라 가압살균후 사용 균주를 접종하고 30℃에서 24시간 동안 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효조 종 배지 1000㎖를 2.5L-발효조에 넣고 온도 120℃에서 15분간 가압살균하여 종배양액 50㎖를 접종한 다음 1 내지 2일 동안 배양하였다. 회전수는 분당 900회, 온도 28 내지 34℃, pH 7.2로 조절하였다.

또한, 발효조 본 배지 1250㎖을 5L-발효조에 넣고 온도 120℃에서 15분간 가압살균하여 발효조 종배양액 250㎖을 접종한 다음, 배양하면서 배양액내에 환원당이 2%가 되었을 때 1차 및 2차, 3차, 4차 추가당을 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 최종 환원당으로 각각 32%가 되도록 첨가하여 5 내지 6일간 배양하였다. 회전수는 분당 900회, 온도 30℃, pH 7.2으로 조절하였다. 이때, 배지내 5'-이노신산 축적량은 73.9g/ℓ이었다. 이는 동일한 조건하에서 친주 CJHB100을 배양한 결과(71.9g/ℓ) 보다 더 우수하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHK25(KCCM-10520)을 이용하여 5'-이노신산을 생산하는 경우, 직접발효법에 의해 경제적으로 5'-이노신산을 보다 더 고농도 및 고수율로 생산할 수 있다.

Claims

히스티딘(histidine) 유사체에 대한 내성을 갖고, 5'-이노신산(5'-inosinic acid)을 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHK25(KCCM-10520).
제1항에 따른 미생물을 배양하고, 그 배양액으로부터 5'-이노신산을 생산하는 방법.