KR20090076614A

KR20090076614A - 이노신 생산능을 갖는 코리네박테리움속 미생물 및 이를이용한 이노신의 생산 방법

Info

Publication number: KR20090076614A
Application number: KR1020080002660A
Authority: KR
Inventors: 김철하; 최종수; 김정환; 김형석; 심재익; 최혜진; 백민지; 권나라; 황수연; 권중근; 안태민
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2008-01-09
Filing date: 2008-01-09
Publication date: 2009-07-13

Abstract

본 발명은 이노신 분해 경로가 차단되고, 아데닌 누출형 요구성 및 구아닌 누출형 요구성을 가지며, 티오구아닌에 대한 내성, 모노플루오로아세테이트에 대한 내성 및 테트라히드로폴레이트 유사체에 대한 내성을 갖는 것을 특징으로 하는 이노신 생산능이 증진된 코리네박테리움속 미생물 및 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 이노신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

이노신, 코리네박테리움 암모니아게네스, 리보뉴클레오시드 히드롤라아제, 퓨린 유도체, 티오구아닌, 모노플루오로아세테이트, 테트라히드로폴레이트.

Description

이노신 생산능을 갖는 코리네박테리움속 미생물 및 이를 이용한 이노신의 생산 방법{Inosine producing microorganism belonging to the genus Corynebacterium and process of producing inosine using the same}

본 발명은 이노신 생산능을 갖는 코리네박테리움속 미생물 및 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 이노신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

이노신은 정미성 조미료로 각광받고 있는 이노신산(5'-inosinic acid)의 화학적 합성 및 효소전이 반응에 의한 합성에 있어서 중요한 기질이다. 또한 이노신은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 의미를 가질 뿐 아니라 식품 및 의약품 등 여러 분야에서 널리 이용되고 있다.

이노신은 종래에는 주로 바실러스(Agric. Biol. Chem., 46, 2347 (1982); 대한민국 등록특허 제27280호) 또는 코리네박테리움 암모니아게네스(Agric. Biol. Chem., 42, 399 (1978)) 등의 미생물을 이용한 직접 발효법이나 5′-이노신산의 열분해법(일특공소 제43-3320호) 등을 이용하여 제조하였다. 그러나, 열분해법의 경우 5′-이노신산을 분해하기 위해 대량의 열 소비가 요구되어 실용성이 낮으며, 직접 발효법의 경우 대장균을 이용한 다양한 유전자형의 균주들이 개발되고 연구되었 으나(Biosci Biotechnol Biochem. 2001 Mar;65(3):570-8) 이노신 생산균주의 역가가 낮아 생산원가가 높다는 단점이 있다. 또한 기존의 이노신 연구는 대장균과 바실러스에 집중되어 있었다.

따라서, 이노신을 보다 고수율로 생산하여 고농도로 축적시킬 수 있는 균주 및 상기 균주를 이용한 이노신 생산방법의 개발이 여전히 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 미생물을 이용한 직접 발효법에 의해 이노신을 고농도/고수율로 생산하기 위하여 지속적인 연구를 수행하였으며, 그 결과 각종 퓨린(purine) 계열 유도체, 생체 대사 활동을 저해하는 것으로 널리 알려진 모노플로로아세테이트(MFA: monofluoroacetate) 및 퓨린 생합성계에서 일탄소 단위(one-carbon unit) 전달자로 알려진 (Escherichia coli and Salmonella, 1996, p561-579) 테트라히드로폴레이트(THF: tetrahydrofolate) 유사체에 대한 내성이 강화되어 이노신 생산능이 증진된 코리네박테리움속 미생물을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 이노신 생산능이 증진된 코리네박테리움속 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배양하여 고농도 및 고수율로 이노신을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 이노신 분해 경로가 차단되고, 아데닌 누출형 요구성 및 구아닌 누출형 요구성을 가지며, 티오구아닌(thioguanine)에 대한 내성을 갖는, 이노신 생산능이 증진된 코리네박테리움속 미생물을 제공한다. 본 발명의 미생물은 바람직하게는, 모노플루오로아세테이트(monofluoroacetate)에 대한 내성 및 테트라히드로폴레이트(tetrahydofolate) 유사체에 대한 내성을 더 가질 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 이노신을 생산하는 코리네박테리움속 미생물은 유전자 재조합에 의해 이노신 분해 경로가 차단되고, 즉 각각 리보뉴클레오시드 히드롤라아제(ribonucleoside hydrolase:rih) 1과 리보뉴클레오시드 히드롤라아제 2를 코딩하는 유전자가 염기의 삽입, 결실 또는 치환에 의한 서열 변이에 의해 불활성화되며, 동시에 인공변이에 의해 선별된 아데닌 누출형 요구성 및 구아닌 누출형 요구성을 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0027(KCCM-10905)의 변이주일 수 있다. 즉, 친주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0027로부터 변이되어 티오구아닌에 대한 내성을 가지며, 또한, 바람직하게는 모노플루오로아세테이트에 대한 내성 및 테트라히드로폴레이트 유사체에 대한 내성을 더 갖게 된 이노신 생산능이 증진된 코리네박테리움 암모니아게네스일 수 있다. 보다 바람직하게는 본 발명의 이노신을 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스는 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0055 또는 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0056(KCCM-10909)일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0055 또는 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0056(KCCM-10909)은 리보뉴클레오시드 히드롤라아제 1을 코딩하는 유전자 rih1과 리보뉴클레오시드 히드롤라아제 2를 코딩하는 유전자 rih2의 구조를 파괴하여 이노신 분해 경로가 차단되고, 아데닌 누출형 요구성 및 구아닌 누출형 요구성을 가지며, 티오구아닌에 대한 내성, 모노플루오로아세테이트에 대한 내성 및 테트라히드로폴레이트 유사체에 대한 내성을 가져서 이노신을 보다 고농도 및 고수율로 배양액 중에 직접 축적시킬 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 미생물은 이노신 분해 경로가 차단되고, 아데닌 누출형 요구성 및 구아닌 누출형 요구성 외에, 이노신을 생성하는 퓨린 생합성 경로의 주요 효소들에 대한 퓨린 유도체에 의한 억제가 해제되어 이노신을 고농도로 생산할 수 있도록 개량된 것일 수 있다. 이노신을 고농도로 생산할 수 있도록 하기 위해, 본 발명의 미생물은 퓨린 생합성 경로의 주요한 조절 인자 중 하나인 5'-구아닐산의 전구체인 구아닌의 유도체, 티오구아닌에 대한 내성이 강화된 것일 수 있다. 또한, 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 티오구아닌에 대한 내성 외에, 세포 내의 대사 활성을 억제하여 증식을 제어하는 항생제의 일종인 모노플루오로아세테이트에 대한 내성이 더 강화된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 티오구아닌에 대한 내성 및 모노플루오로아세테이트에 대한 내성 외에, 퓨린 생합성 경로에서 일탄소 단위의 전달자로 작용하는 테트라히드로폴레이트(THF) 유사체에 대한 내성이 강화되어, 퓨린 생합성 효율이 보다 증가된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 이노신을 생산하는 미생물은 테트라히드로폴레이 트 유사체에 대해 강화된 내성을 가져서 퓨린 생합성 효율이 증가되며, 상기 테트라히드로폴레이트 유사체는 피리메타민(pyrimethamine) 또는 트리메토프림(trimethoprim)일 수 있다.

본 발명의 상세한 설명 및 실시예에서 언급되는 바와 같이, 본 발명에서 미생물의 배양을 위해 사용되는 영양 배지, 최소 배지, 종 배지, 및 플라스크 발효 배지의 일 예는 각각 하기의 표 1에 표시된 조성으로 이루어진 배지일 수 있다. 그러나, 배지 조성은 표 1에 제시된 것으로 제한되지는 않으며, 코리네박테리움속 미생물의 배양에 적합한 모든 배양 배지를 사용할 수 있다.

표 1. 배지 조성

배지 종류	배지 조성
영양 배지	펩톤 1%, 육즙 1%, 염화나트륨 0.25%, 효모 추출물 1%, 아데닌 100mg/L, 구아닌 100mg/L, 한천 2%, pH 7.2
최소 배지	포도당 2%, 황산나트륨 0.3%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.3%, 황산마그네슘 0.3%, 염화칼슘 10mg/L, 황산철 10mg/L, 황산아연 1mg/L, 염화망간 3.6mg/L, L-시스테인 20mg/L, 칼슘판토테네이트 10mg/L, 티아민염산염 5mg/L, 바이오틴 30㎍/L, 아데닌 20mg/L, 구아닌 20mg/L, 한천 2%, pH 7.2
종 배지	포도당 5%, 펩톤 0.5%, 육즙 0.5%, 염화나트륨 0.25%, 효모 추출물 1%, 아데닌 100mg/L, 구아닌 100mg/L, pH 7.2
플라스크 발효 배지	글루타민산나트륨 0.1%, 염화암모늄 1%, 황산마그네슘 1.2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20mg/L, 황산망간 20mg/L, 황산아연 20mg/L, 황산구리 5mg/L, L-시스테인 23mg/L, 알라닌 24mg/L, 니코틴산 8mg/L, 바이오틴 45ug/L, 티아민염산염 5mg/L, 아데닌 50mg/L, 구아닌 30mg/L, 인산(85%) 1.9%, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 6%가 되게 첨가하여 사용, pH 7.2

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 미생물은 이노신 분해 경로가 차단되고, 아데닌 누출형 요구성 및 구아닌 누출형 요구성을 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0027을 친주로 이용하여, 이노신 생산 효율 및 농도를 증가시키기 위해 티오구아닌, 모노플루오로아세테이트 및 테트라히드로폴레이트 유사체에 대한 내성이 강화된 변이주로서 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0027을 친주로 하여, X선, 자외선 또는 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanine), 디에틸설파이드(diethylsulfide), 에틸아민(ethylamine) 등의 화학적 변이 유발제를 처리하고, 상기 변이 유발제의 처리 후 균주를 상기 표 1의 조성을 갖는 최소 배지에 도말 후 티오구아닌의 농도가 100 내지 200㎍/ml까지 첨가된 배지에 적절히 희석하여 도말한 후, 콜로니를 수득하고, 티오구아닌 농도별로 수득된 각각의 콜로니를 상기 표 1에 표시된 조성을 갖는 영양 배지에서 배양하고, 뒤이어 종 배지에서 24시간 및 발효 배지에서 5 내지 6일간 배양하여 이노신 생산량이 가장 우수한 균주를 선별하여, 티오구아닌에 대한 내성이 강화된 변이 균주를 제조할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0027을 친주로 하여 선별된 티오구아닌에 대한 내성이 강화된 코리네박테리움 암모니아게네스를 친주로 하여, X선, 자외선 또는 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌, 디에틸설파이드, 에틸아민 등의 화학적 변이 유발제를 처리하고, 상기 변이 유발제의 처리 후 균주를 상기 표 1의 조성을 갖는 최소 배지에 모노플루오로아세테이트의 농도가 20 내지 100㎍/ml까지 첨가된 배지에 적절히 희석하여 도말한 후, 콜로니를 수득하고, 모노플루오로아세테이트 농도별로 수득된 각각의 콜로니를 상기 표 1에 표시된 조성을 갖는 영양 배지에서 배양하고, 뒤이어 종 배지에서 24시간 및 발효 배지에서 5 내지 6일간 배양하여 이노신 생산량이 가장 우수한 균주를 선별하여, 티오구아닌에 대한 내성 외에, 모노플루오로아세테이트에 대한 내성이 강화된 변이 균주를 제조할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0027을 친주로 하여 선별된 티오구아닌 및 모노플루오로아세테이트에 대한 내성이 강화된 코리네박테리움 암모니아게네스를 친주로 하여, X선, 자외선 또는 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌, 디에틸설파이드, 에틸아민 등의 화학적 변이 유발제를 처리하고, 상기 변이 유발제의 처리 후 균주를 상기 표 1의 조성을 갖는 최소 배지에 피리메타민의 농도가 100 내지 200㎍/ml까지, 또는 트리메토프림의 농도가 1 내지 5 ㎍/ml까지 첨가된 배지에 적절히 희석하여 도말한 후, 콜로니를 수득하고, 피리메타민 또는 트리메토프림의 각 농도별로 수득된 각각의 콜로니를 상기 표 1에 표시된 조성을 갖는 영양 배지에서 배양하고, 뒤이어 종 배지에서 24시간 및 발효 배지에서 5 내지 6일간 배양하여 이노신 생산량이 가장 우수한 균주를 선별하여, 티오구아닌 및 모노플루오로아세테이트에 대한 내성 외에, 피리메타민 또는 트리메토프림에 대한 내성이 강화된 변이 균주를 제조할 수 있다.

하기의 표 2는 본 발명에 따른 퓨린 유사체에 대한 내성을 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스와 그의 친주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0027의 이노신 생합성 경로에 관여하는 효소에 대해 활성을 억제하기 위해 작용하는 여러 퓨린 유사체에 대한 내성 및 생화학적 특성을 비교한다.

표 2. 코리네박테리움 암모니아게네스의 영양 요구성 및 퓨린 유사체에 대한 내성

특 성	CN04-0027 (KCCM-10905)	CN04-0053	CN04-0054	CN04-0055	CN04-0056 (KCCM-10909)
아데닌	누출형	누출형	누출형	누출형	누출형
구아닌	누출형	누출형	누출형	누출형	누출형
바이오틴	요구성	요구성	요구성	요구성	요구성
티오구아닌 내성	125㎍/ml	150㎍/ml	150㎍/ml	150㎍/ml	150㎍/ml
모노플로오로아세테이트 내성	40㎍/ml	40㎍/ml	80㎍/ml	80㎍/ml	80㎍/ml
피리메타민 내성	100㎍/ml	100㎍/ml	100㎍/ml	140㎍/ml	100㎍/ml
트리메토프림 내성	1㎍/ml	1㎍/ml	1㎍/ml	1㎍/ml	3㎍/ml

본 발명은 또한, 이노신 분해 경로가 차단되고, 아데닌 누출형 요구성 및 구아닌 누출형 요구성을 가지며, 티오구아닌에 대한 내성, 모노플루오로아세테이트에 대한 내성 및 테트라히드로폴레이트 유사체에 대한 내성을 가지며, 이노신을 고수율 및 고농도로 생산하는 코리네박테리움속 미생물을 배양하여 상기 미생물 또는 배양액 중에 이노신을 생산하는 단계 및 상기 미생물 또는 배양액으로부터 이노신을 회수하는 단계를 포함하는, 이노신을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 따른 이노신을 생산하는 방법에서, 상기 코리네박테리움속 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0055 또는 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0056(KCCM-10909)일 수 있다.

본 발명에 따른 이노신을 생산하는 방법은 코리네박테리움속 미생물을 배양하여, 미생물 또는 배양액 중에 이노신을 생산하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 코리네박테리움속 미생물을 배양하는 단계는 균주를 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양한다.

이때 탄소원으로는 글루코오스, 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있고, 질소원으로는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄과 같은 각종 무기질소원 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 무기화합물로는 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양 요구성 염기 등이 첨가될 수 있다.

배양은 호기적 조건 하에서, 예를 들면 진탕 배양 또는 통기 교반 배양에 의해, 바람직하게는 28 내지 36℃의 온도에서 수행된다. 배지의 pH는 배양하는 동안 중성 근처인 pH 6.0 내지 8.0으로 유지하는 것이 바람직하다. 배양은 5 내지 6일 동안 수행될 수 있으며, 직접 발효에 의해 축적된 이노신은 HPLC를 이용하여 통상의 방법으로 분석될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 어떤 형태로든 실시예에 의해 제한되는 것을 의미하지는 않는다.

본 발명에 따른 이노신 분해 경로가 차단되고, 아데닌 누출형 요구성 및 구아닌 누출형 요구성을 가지며, 티오구아닌에 대한 내성, 모노플루오로아세테이트에 대한 내성 및 테트라히드로폴레이트 유사체에 대한 내성을 갖는 것을 특징으로 하는 이노신 생산능을 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스 균주를 이용하여 이노신을 생산하는 경우, 직접 발효법에 의해 기존의 이노신 생산 균주보다 이노신을 보다 높은 농도 및 수율로 생산할 수 있다.

실시예 1: 티오구아닌 내성주 CN04 -0053의 선별

본 발명에 따른 변이주는 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0027 (KCCM-10905) 균주를 친주로 하여 개발되었다. 상기 코리네박테리움 암모니아게네스를 포스페이트 완충액(pH 7.0) 혹은 시트레이트 완충액(pH 5.5)에 10⁷내지 10⁸세포/ml로 현탁시키고 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌을 최종농도가 10 내지 50㎍/ml가 되도록 첨가하고 실온 혹은 30 내지 32℃에서 40 내지 90분 동안 처리하여 돌연변이를 유발시켰다. 그 후, 상기 돌연변이가 유발된 균주를 3회에 걸쳐서 0.85% 식염수로 세척하고, 티오구아닌이 각각 100㎍/ml, 125㎍/ml, 150㎍/ml, 175㎍/ml, 200㎍/ml 첨가된 배지에서 적절히 희석한 후 한천 2%가 함유된 상기 표 1에 표시된 조성을 갖는 최소 배지에 도말하여 온도 30 내지 34℃에서 4 내지 5일간 배양하여 티오구아닌에 대한 내성을 보이는 균주의 콜로니를 얻었다. 그 후, 티오구아닌에 대한 내성이 강화된 이노신 생산 균주를 선별하기 위해, 상기 표 1에 표시된 조성을 갖는 종 배지 3ml를 직경 18mm 시험관에 분주하고 120℃ 온도에서 10분간 가압살균 후 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0027(KCCM-10905) 균주와 티오구아닌 150㎍/ml가 첨가된 배지에서 생육한 상기의 티오구아닌 내성 균주 수백 개를 각각 접종하고 30℃의 온도에서 24시간 진탕 배양하여 종 배양액으로 사용하였다. 상기 표 1에 표시된 조성을 갖는 발효 배지 27ml를 500ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 120℃의 온도에서 10분간 가압살균 후 상기 종 배양액 3ml를 접종한 다음 4 내지 5일 동안 배양하였다. 진탕 배양기의 회전수는 분당 200회(rpm), 온도 32℃, pH 7.2 로 조절하였다. 배양 결과, 배지 내 이노신 축적량은 친주인 CN04-0027(KCCM-10905) 균주의 경우 5.2g/L 이었으며 티오구아닌 내성 균주 중 수십 종의 이노신 생산량이 친주보다 증가하였다. 친주보다 증가된 이노신 생산량을 보이는 균주들을 표 1에 표시된 조성을 갖는 영양 배지에서 배양한 후 적절한 농도로 희석하여 고체 배지에 도말하고 순수분리하여 단일 균체들을 얻은 후, 이중 수십 개의 콜로니들을 표 1에 표시된 조성을 갖는 종 배지에서 24시간 배양한 후 표 1에 표시된 조성을 갖는 발효 배지에서 4 내지 5일간 배양한 결과 발효 배양액에 축적되는 이노신 생산량이 가장 우수한, 5.5g/L 이노신을 생산하는 균주를 선별하였다. 결과적으로 이 균주는 친주 대비 5.8% 생산성 증가를 나타내었다. 상기와 같이 수득된 티오구아닌에 대한 내성을 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스를 CN04-0053으로 명명하였다. 본 실시예에서 CN04-0053 균주는 150㎍/ml 농도의 티오구아닌 첨가에서도 생육 가능한 균임을 알 수 있다. 표 3은 본 발명에 따른 미생물 친주인 CN04-0027(KCCM-10905) 균주와 그의 개량된 균주인 CN04-0053 균주의 티오구아닌에 대한 내성 정도를 표시한다.

표 3. 티오구아닌에 대한 내성 (㎍/ml)

농도 균주	0	100	125	150	175	200
CN04-0027	+++	++	-	-	-	-
CN04-0053	+++	+++	++	+	-	-

㈜+: 생육, -: 생육하지 못함.

실시예 2: 모노플루오로아세테이트 내성주 CN04 -0054 선별

본 실시예에 따른 변이주는 상기 실시예 1에서 수득된 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0053 균주를 친주로 하여 개발되었다. 상기 코리네박테리움 암모니아게네스를 포스페이트 완충액(pH 7.0) 혹은 시트레이트 완충액(pH 5.5)에 10⁷내지 10⁸세포/ml로 현탁시키고 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌을 최종농도가 10 내지 50㎍/ml가 되도록 첨가하고 실온 혹은 30 내지 32℃에서 40 내지 90분 동안 처리하여 돌연변이를 유발시켰다. 그 후, 상기 돌연변이가 유발된 균주를 3회에 걸쳐서 0.85% 식염수로 세척하고, 모노플루오로아세테이트가 각각 20㎍/ml, 40㎍/ml, 60㎍/ml, 80㎍/ml, 100㎍/ml 첨가된 배지에서 적절히 희석한 후 한천 2%가 함유된 상기 표 1에 표시된 조성을 갖는 최소 배지에 도말하여 온도 30 내지 34℃에서 4 내지 5일간 배양하여 내성 콜로니를 얻었다. 그 후, 모노플루오로아세테이트에 대한 내성이 강화된 이노신 생산 균주를 선별하기 위해, 상기 표 1에 표시된 조성을 갖는 종 배지 3ml를 직경 18mm 시험관에 분주하고 120℃ 온도에서 10분간 가압살균 후 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0053 균주와 상기에서 수득된 모노플루오로아세테이트 60 내지 80㎍/ml가 첨가된 배지에서 생육한 모노플루오로아세테이트 내성 균주 수백 개를 각각 접종하고 30℃의 온도에서 24시간 진탕 배양하여 종 배양액으로 사용하였다. 상기 표 1에 표시된 조성을 갖는 발효 배지 27ml를 500ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 120℃의 온도에서 10분간 가압살균 후 종 배양액 3ml를 접종한 다음 4 내지 5일 동안 배양하였다. 진탕 배양기의 회전수는 분당 200회(rpm), 온도 32℃, pH 7.2 로 조절하였다. 배양 결과, 배지 내 이노신 축적량은 친주인 CN04-0053 균주의 경우 5.5g/L 이었으며 내성 균주 중 수십 종의 이노신 생산량이 친주보다 증가하였다. 친주보다 증가된 이노신 생산량을 보이는 균주들을 상기 표 1에 표시된 조성을 갖는 영양 배지에서 배양한 후 적절한 농도로 희석하여 고체배지에 도말하고 순수분리하여 단일 균체들을 얻은 후, 이중 수십 개의 콜로니들을 상기 표 1에 표시된 조성을 갖는 종 배지에서 24시간 배양한 후 상기 표 1에 표시된 조성을 갖는 발효 배지에서 4 내지 5일간 배양한 결과 발효 배양액에 축적되는 이노신 생산량이 가장 우수한, 5.7g/L 이노신을 생산하는 균주를 선별할 수 있었다. 결과적으로 이 균주는 친주 대비 3.6% 생산성 증가를 나타내었다. 상기와 같이 수득된 모노플루오로아세테이트에 대한 내성을 더 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스를 CN04-0054로 명명하였다. 본 실시예에서 CN04-0054 균주는 80㎍/ml 농도의 모노플루오로아세테이트 첨가에서도 생육 가능한 균임을 알 수 있다. 표 4는 본 발명에 따른 미생물 친주인 CN04-0053 균주와 그의 개량 균주인 CN04-0054 균주의 모노플루오로아세테이트에 대한 내성 정도를 표시한다.

표 4. 모노플루오로아세테이트에 대한 내성(㎍/ml)

농도 균주	0	20	40	60	80	100
CN04-0053	+++	++	-	-	-	-
CN04-0054	+++	+++	++	++	-	-

㈜+: 생육, -: 생육하지 못함.

실시예 3: 피리메타민 내성주 CN04 -0055 와 트리메토프림 내성주 CN04 -0056(KCCM-10909) 선별

본 실시예에 따른 변이주는 상기 실시예 2에서 수득된 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0054 균주를 친주로 하여 개발되었다. 상기 코리네박테리움 암모니아게네스를 포스페이트 완충액(pH 7.0) 혹은 시트레이트 완충액(pH 5.5)에 10⁷내지 10⁸세포/ml로 현탁시키고 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌을 최종농도가 10 내지 50㎍/ml가 되도록 첨가하고 실온 혹은 30 내지 32℃에서 40 내지 90분 동안 처리하여 돌연변이를 유발시켰다. 그 후, 상기 돌연변이가 유발된 균주를 3회에 걸쳐서 0.85% 식염수로 세척하고, 피리메타민이 각각 100㎍/ml, 120㎍/ml, 140㎍/ml, 160㎍/ml, 180㎍/ml, 200㎍/ml 첨가된 배지에서 적절히 희석한 후 한천 2%가 함유된 상기 표 1에 표시된 조성을 갖는 최소 배지에 도말하여 온도 30 내지 34℃에서 4 내지 5일간 배양하여 내성 콜로니를 얻었다. 또한 상기에서 수득된 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0054 균주로부터 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌 처리로 수득된 돌연변이 균주를 트리메토프림이 각각 1㎍/ml, 2㎍/ml, 3㎍/ml, 4㎍/ml, 5㎍/ml 첨가된 배지에서 적절히 희석한 후 한천 2%가 함유된 상기 표 1에 표시된 조성을 갖는 최소 배지에 도말하여 온도 30 내지 34℃에서 4 내지 5일간 배양하여 내성 콜로니를 얻었다. 각각 피리메타민 및 트리메토프림에 대한 내성이 강화된 균주를 선별하기 위해, 먼저, 상기 표 1에 표시된 조성을 갖는 종 배지 3ml를 직경 18mm 시험관에 분주하고 120℃ 온도에서 10분간 가압살균 후 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0054 균주와 상기에서 수득된 피리메타민 120 내지 140㎍/ml가 첨가된 배지에서 생육한 피리메타민 내성 균주 수백 개 및 트리메토프림 2 내지 3 ㎍ /ml가 첨가된 배지에서 생육한 트리메토프림 내성 균주 수백 개를 각각 접종하고 30℃ 온도에서 24시간 진탕 배양하여 종 배양액으로 사용하였다. 상기 표 1에 표시된 조성을 갖는 발효 배지 27ml를 500ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 120℃ 온도에서 10분간 가압살균 후 종 배양액 3ml를 접종한 다음 4 내지 5일 동안 배양하였다. 진탕 배양기의 회전수는 분당 200회(rpm), 온도 32℃, pH 7.2 로 조절하였다. 배양 결과, 배지 내 이노신 축적량은 친주인 CN04-0054 균주의 경우 5.8g/L 이었으며 내성 균주 중 수십 종의 이노신 생산량이 친주보다 증가하였다. 친주보다 증가된 이노신 생산량을 보이는 피리메타민 및 트리메토프림에 대한 각각의 내성 균주들을 표 1에 표시된 조성을 갖는 영양 배지에서 배양한 후 적절한 농도로 희석하여 고체 배지에 도말하고 순수분리하여 단일 균체들을 얻은 후, 이중 수십 개의 콜로니들을 상기 표 1에 표시된 조성을 갖는 종 배지에서 24시간 배양한 후 상기 표 1에 표시된 발효 배지에서 4 내지 5일간 배양한 결과 발효 배양액에 축적되는 이노신 생산량이 가장 우수한, 6.3 g/L 이노신을 생산하는 피리메타민 내성 균주와 6.5 g/L 이노신을 생산하는 트리메토프림 내성 균주를 선별할 수 있었다. 결과적으로 이 균주들은 친주 대비 각각 8.6%와 12%의 생산성 증가를 나타내었다. 상기와 같이 수득된 피리메타민에 대한 내성을 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스 및 트리메토프림에 대한 내성을 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스를 각각 CN04-0055 및 CN04-0056으로 명명하였다. 본 실시예에서 CN04-0055 균주는 140㎍/ml 농도의 피리메타민 첨가에서도 생육 가능한 균이며, CN04-0056 균주는 3㎍/ml 농도의 트리메토프림 첨가에서도 생육 가능한 균임을 알 수 있다. 표 5는 본 발명에 따른 미생 물 친주인 CN04-0054 균주와 그의 개량 균주인 CN04-0055 및 CN04-0056(KCCM-10909) 균주의 피리메타민과 트리메토프림에 대한 내성 정도를 표시한다.

표 5. 피리메타민에 대한 내성(㎍/ml)

농도 균주	0	100	120	140	160	180	200
CN04-0054	+++	+	-	-	-	-	-
CN04-0055	+++	+++	++	-	-	-	-

트리메토프림에 대한 내성(㎍/ml)

농도 균주	0	1	2	3	4	5
CN04-0054	+++	+++	-	-	-	-
CN04-0056	+++	+++	+++	++	-	-

㈜+: 생육, -: 생육하지 못함.

본 실시예에서 수득된 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0056을 2007년 12월 20일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganism)에 기탁하여 KCCM-10909의 수탁번호를 부여받았다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 본 명세서에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.　　

Claims

이노신 분해 경로가 차단되고, 아데닌 누출형 요구성 및 구아닌 누출형 요구성을 가지며, 티오구아닌에 대한 내성을 갖는 것을 특징으로 하는 이노신 생산능이증진된 코리네박테리움 암모니아게네스.
제1항에 있어서, 모노플루오로아세테이트(monofluoroacetate)에 대한 내성을 더 갖는 것을 특징으로 하는 이노신 생산능이 증진된 코리네박테리움 암모니아게네스.
제2항에 있어서, 테트라히드로폴레이트(tetrahydrofolate) 유사체에 대한 내성을 더 갖는 것을 특징으로 하는 이노신 생산능이 증진된 코리네박테리움 암모니아게네스.
제3항에 있어서, 상기 테트라히드로폴레이트 유사체가 피리메타민(pyrimethamine)인 것을 특징으로 하는 이노신 생산능이 증진된 코리네박테리움 암모니아게네스.
제3항에 있어서, 상기 테트라히드로폴레이트 유사체가 트리메토프림(trimethoprim)인 것을 특징으로 하는 이노신 생산능이 증진된 코리네박테리움 암모니아게네스.
제5항에 있어서, 상기 코리네박테리움 암모니아게네스는 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0056(KCCM-10909)인 것인 이노신 생산능이 증진된 코리네박테리움 암모니아게네스.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하여 상기 미생물 또는 배양액 중에 이노신을 생산하는 단계; 및 상기 미생물 또는 배양액으로부터 이노신을 회수하는 단계를 포함하는, 이노신을 생산하는 방법.