KR100785248B1

KR100785248B1 - ｐｕｒＣ 유전자가 과발현된 미생물 및 이를 이용한5'-이노신산의 생산방법

Info

Publication number: KR100785248B1
Application number: KR1020070003766A
Authority: KR
Inventors: 박영훈; 조광명; 백민지; 홍국기; 이진남
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2007-01-12
Filing date: 2007-01-12
Publication date: 2007-12-12

Abstract

본 발명은 포스포리보실아미노이미다졸썩시노카보스아마이드 신세타제(Phosphoribosylimidazolesuccinocarboxamide synthetase)를 코딩하는 유전자가 과발현된 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의 생산방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 포스포리보실아미노이미다졸썩시노카보스아마이드 신세타제를 코딩하는 purC 유전자를 과발현시켜 5'-이노신산 고생산성 코리네박테리움 속 미생물을 제조하는 방법, 이러한 방법에 따라 제조된 미생물, 및 이를 이용하여 5'-이노신산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

코리네박테리움 암모니아게네스, 5'-이노신산, 포스포리보실아미노이미다졸썩시노카보스아마이드 신세타제, purC

Description

ｐｕｒＣ 유전자가 과발현된 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의 생산방법{MICROORGANISM OVEREXPRESSED PURC GENE AND THE PROCESS FOR PRODUCTION METHOD OF 5'-INOSINIC ACID USING THE SAME}

도 1은 포스포리보실아미노이미다졸썩시노카보스아마이드 신세타제를 코딩하는 유전자(purC)의 클로닝 과정 및 클로닝된 pECCG117-purC 벡터를 나타낸다.

본 발명은 포스포리보실아미노이미다졸썩시노카보스아마이드 신세타제(Phosphoribosylimidazolesuccinocarboxamide synthetase)를 코딩하는 유전자(이하 purC 유전자라 함)가 과발현된 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의 생산방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 공지의 5'-이노신산 생산 변이주인 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) [종전 브레비박테리움(Brevibacterium)] CJIP2401(KCCM-10610)를 purC 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환시킴으로써 5'-이노신산 고생산성 코리네박테리움 속 미생물을 제조하는 방법, 이러한 방법에 따라 형질전환된 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0021(KCCM-10825P), 및 상기 형질전환된 미생물에 의한 직접 발효법으로 배양액 중 에 5'-이노신산을 축적시켜 생산하는 방법에 관한 것이다.

5'-이노신산(5'-inosinic acid)은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로서, 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 역할을 수행할 뿐 아니라, 식품, 의약품 및 각종 의료적 이용 등 다방면에 이용되고 있으며, 특히 글루타민산 나트륨과 같이 사용하면 맛의 상승효과가 커서 정미성 조미료로 각광을 받고 있는 핵산계 조미료 중 하나이다.

5'-이노신산을 제조하는 방법으로, 효모 세포로부터 추출한 리보핵산을 효소적으로 분해하는 방법(일본 특허공고 제1614/1957호 등), 발효에 의해 생산된 이노신을 화학적으로 인산화하는 방법 (Agri. Biol. Chem., 36, 1511(1972) 등) 및 5'-이노신산을 생산할 수 있는 미생물을 배양하고 배지에 축적된 5'-이노신산을 회수하는 방법이 있다. 이러한 방법 중에서 현재 가장 많이 사용되고 있는 방법이 미생물을 이용하여 5'-이노신산을 생산하는 방법이다. 5'-이노신산을 생산하는데 이용하는 미생물 중 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 균주, 예를 들어 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)를 발효시킴으로써 제조하는 방법(대한민국 특허공개 제2003-42972호 등) 등이 공지되어 있다.

포스포리보실아미노이미다졸썩시노카보스아마이드 신세타제 (Phosphoribosylimidazolesuccinocarboxamide synthetase)는 퓨린 뉴클레오타이드를 합성하는 퓨린 대사(purine pathway)에서 8번째로 관여 하는 효소이다.

이 효소는 아데노신 트리포스페이트(adenosine triphosphate; ATP), 엘-아스파테이트(L-Aspartate)와 5-아미노이미다졸-4-카복실리보뉴클레오타이드(5'- phosphoribosyl)-4-carboxy-5-aminoimidazole; CAIR)가 반응하여 5- 아미노이미다졸-4-(N-썩시닐카보스아마이드) 리보뉴클레오티드(5'-phosphoribosyl)-4-(N-succinocarboxamide)-5-aminoimidazole; SAICAR)로 전환되는데 관여 한다.

이 효소는 1959년 Lukens 과 Buchanan에 의해 최초로 발견되었으며 [The Journal of Biological Chemistry Vol.234,No.7,July 1959] 이후 그람 네가티브 박테리아인 에세리키아 콜리(Escherichia coli) 에서 purC가 분리되어( Biochemistiry 1992. 31, 5022~5032) 단백질 구조 및 효소 특성에 관한 연구가 활발히 이루어졌다. 대장균 외 다른 일부 미생물에서도 purC 유전자의 서열 및 특성이 일부 보고된 바 있으나, 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)에서의 purC 유전자에 대해 보고된 바는 아직 없다.

이에, 본 발명자는 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 균주로부터 5'-이노신산을 고농도로 생산할 수 있는 균주를 개발하고자, 퓨린 대사를 강화하는 연구를 하던 중, 포스포리보실아미노이미다졸썩시노카보스아마이드 신세타제를 코딩하는 유전자 서열을 포함하는 벡터로 형질전환시켰을 때 5'-이노신산이 고농도로 생산된다는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 purC 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물을 형질전환시키는 단계를 포함하여 이루어진, 고농도로 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 방법으로 제조된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 균주를 이용하여 5'-이노신산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 purC 유전자를 포함한 재조합 벡터로 형질전환시켜 이를 과발현시킴으로써, 5'-이노신산을 고농도로 생산하는 형질전환된 코리네박테리움 암모니아게네스를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 코리네박테리움 속 미생물은 5'-이노신산을 생산할 수 있는 것으로 알려진 미생물이며, 바람직하게는 코리네박테리움 암모니아게네스이다.

본 발명의 purC 유전자는 상기 효소를 생산하는 미생물로부터 얻을 수 있으며, 바람직하게는 코리네박테리움 암모니아게네스 속 미생물에서 얻을 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예에서는, 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872의 염색체 서열분석을 통하여, purC 유전자가 약 900bp 크기로 존재함을 확인하였다.

본 발명의 재조합 벡터는 중합효소 연쇄반응을 통하여 얻은 포스포리보실아미노이미다졸썩시노카보스아마이드 신세타제를 코딩하는 유전자를 DNA 제한효소, 예를 들어SalI 및 BamHI 등으로 절단하고, 동일한 DNA 제한효소로 절단한 벡터에 DNA T4 리가아제 등을 사용하여 삽입시켜 제조할 수 있다. 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것은 아니며 공지된 발현벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pECCG117 벡터(Biotechnology letters vol 13, No.10, p.721-726(1991) 또는 대한 민국 특허공고 제92-7401호)를 사용할 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 상기 pECCG117 벡터에 포스포리보실아미노이미다졸썩시노카보스아마이드 신세타제를 코딩하는 유전자를 삽입시켜 제조한 pECCG117-purC 벡터가 바람직하다. 또한 본 발명의 재조합 벡터는 약 300bp의 프로모터, 포스포리보실아미노이미다졸썩시노카보스아마이드 신세타제를 코딩하는 유전자, 및 약 200bp의 터미네이터를 포함하고 있다.

구체적 실시예에서, 상기 재조합 벡터, 예를 들어 pECCG117-purC를 사용하여 선형 DNA단편을 통상적인 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 미생물 균주(예를 들어, 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) KCCM-10610, 대한민국 특허공고 제10-2006-0060404호)에 전달하고, 선별마커인 항생제 카나마이신(kanamycin)을 포함하는 배지에서 배양하여 선별할 수 있다. 선별된 변이주 내의 pECCG117-purC 벡터의 삽입은 PCR을 통하여 확인할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 포스포리보실아미노이미다졸썩시노카보스아마이드 신세타제를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환시킨 코리네박테리움 속 미생물에 관한 것이다.

본 발명의 형질전환된 코리네박테리움 속 포스포리보실아미노이미다졸썩시노카보스아마이드 신세타제를 과발현시키고 5'-이노신산을 고농도로 생산하는 미생물을 의미한다. 형질전환된 코리네박테리움 속 포스포리보실아미노이미다졸썩시노카보스아마이드 신세타제 과발현에 의한 5'-이노신산을 고농도로 생산하는 미생물을 개발하였다.

본 발명의 구체적 실시예에서 포스포리보실아미노이미다졸썩시노카보스아마이드 신세타제를 과발현하며 5'-이노신산을 고농도로 생산하도록 형질전환된 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0021(수탁번호: KCCM-10825P)일 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기의 형질전환된 코리네박테리움 속 미생물을 배양하여 그 배양액으로부터 5'-이노신산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

상기의 형질전환된 코리네박테리움 속 미생물은 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

탄소원으로는 글루코오스가 사용될 수 있고, 질소원으로는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄과 같은 각종 무기질소원 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크, 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 무기화합물로는 인산1수소칼륨, 인산2수소칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양요구성 염기 등이 첨가될 수 있다.

배양은 호기적 조건 하에서 예를 들면, 진탕배양 또는 통기 교반 배양에 의해, 바람직하게는 20 내지 40℃의 온도에서 수행될 수 있다. 배지의 pH는 배양하는 동안 중성근처에서 유지하는 것이 바람직하다. 배양은 5 내지 6일 동안 수행할 수 있으며, 직접 발효에 의해 축적된 5`-이노신산을 통상의 방법으로 회수할 수 있다. 구체적 실시예에서, 본 발명에 의하여 형질전환된 코리네박테리움 속 미생물은 형질전환하지 않은 코리네박테리움 속 미생물에 비하여 높은 수율로 5'-이노신산을 생산하였다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. purC 유전자의 클로닝

코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872의 염색체 유전자를 분리하고, 이를 주형으로 하여 서열번호 2와 서열번호3의 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 통하여 포스포리보실아미노이미다졸썩시노카보스아마이드 신세타제 유전자를 코딩하는 유전자(purC 유전자; 서열번호1)를 얻었다. 얻어진 purC 유전자의 단편을 제한효소 SalI (New England Biolabs, Beverly, MA)과 BamHI (New England Biolabs, Beverly, MA)으로 절단하였다. 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여, 상기 유전자 단편을 SalI 와BamHI 제한효소로 절단시킨 선상의 pECCG117 벡터에 접합하였다. 제조된 벡터를 pECCG117-purC로 명명하였다. 상기 pECCG117-purC벡터를 코리네박테리움 암모니아게네스(KCCM-10330)에 일렉트로포레이션 (electroporation)을 통하여 형질전환하고, 1리터 당 카나마이신 (kanamycin) 10 ㎎을 포함하는 CM 고체배지 (육즙 10g/L, 효모 엑기스 10g/L, 박토펩톤 10g/L, 염화나트륨 2.5g/L, 박토아가 1.7%, pH 7.0)에서 배양하여 단일 콜로니들을 회수하였다. 회수된 콜로니들을 동일한 항생제가 첨가된 CM 액체배지에서 키운 다음, 플라스미드를 분리하여 그 크기를 일차로 확인하고, 2차로 pECCG117의 다중클로닝 부위의 양끝단을 포함하는 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR을 수행함으로써, 삽입된 DNA의 크기를 통해 형질전환 여부를 확인하였다. 상기 클로닝 과정 및 클로닝된 pECCG117- purC 벡터는 도1과 같다.

purC 유전자를 증폭하기 위하여 사용된 프라이머들의 서열은 각각 다음과 같다.

프라이머 purC-F (서열번호 2):

5'-AAC CGT CGA CCG CAG TGG CTG TTG CGC TG -3'

프라이머 purC -B (서열번호 3):

5'-AAC CGG ATC CCA TAT CGG TTT GCT TCA CGC G -3'

이 과정을 통해 선별된 purC 유전자를 포함하는 균주를 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) CN01-0021로 명명하였고, 그를 2006년 12월 15일자로 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제 1동 361-221번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 수탁번호에 수탁번호 KCCM-10825P로 기탁하였다.

실시예 2. 삼각 플라스크 발효역가 시험

종배지 3ml를 지름18mm 시험관에 분주하고 가압 살균한 후, 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) CN01-0021 (KCCM-10825P)를 접종하고 30℃ 온도에서 24시간 진탕 배양하여 종 배양액으로 사용하였다. 발효배지 27ml를 500ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 120℃ 온도에서 10분간 가압 살균한 후, 종배양액 3ml을 접종하여 5 내지 6일간 배양하였다. 배양 조건은 회전 수 분당 20회, 온도32℃, pH7.2으로 조절하였다. 이때 배지 내 5'-이노신산 축적량을 모균주인 KCCM-10610 과 비교한 결과는 하기 표1과 같으며, 이는 CN01-0021(KCCM-10825P) 균주가 동일한 조건하에서 모균주 KCCM-10610 대비 균체의 성장속도가 우수하고, 단위 시간당 생산하는 5'-이노신산의 생산성이 더 우수함을 나타낸다.

상기 종배지 및 발효배지의 조성은 다음과 같다.

종배지 : 포도당 1%, 펩톤1%, 육즙 1%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 100mg/l, 구아닌100mg/l, pH7.2

플라스크 발효배지 : 글루타민산 나트륨 0.1%, 암모늄클로라이드 1%, 황산마그네슘1 .2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20mg/l, 황산망간 20mg/l, 황산아연 20mg/l, 황산구리 5mg/l, L-시스테인 23mg/l, 알라닌 24mg/l, 니코틴산 8mg/l, 비오틴 45㎍/l, 티아민염산 5mg/l, 아데닌 30mg/l, 인산(85%) 1.9%, 포도당 6.5% 되게 첨가하여 사용

균주명	Cell OD (배양 5일후)	생산성(g/l/hr) (배양 5일후)
대조군(KCCM-10610)	37.1	0.112
CN01-0021(KCCM-10825P)	40.4	0.122

실시예 3. 5L 발효조에서의 발효역가 실험

실시예 2의 종배지 50ml를 500ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 상법에 따라 가압살균 후, 사용 균주를 접종하고 30℃에서 24시간 동안 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다.

발효조 종 배지 1000ml를 2.5L-발효조에 넣고 온도 120℃에서 15분간 가압살균하여 종배양액 50ml를 접종한 다음 1 내지 2일 동안 배양하였다. 회전수는 분당 900회, 온도 28 내지 34℃, pH 7.2로 조절하였다.

발효조 종배지의 조성은 다음과 같다.

발효조 종 배지 : 포도당 5%, 펩톤 1%, 효모추출물 2%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.1%, 황산암모늄 0.5%, 황산철 80mg/l, 황산아연 40mg/l, 황산망간 40mg/l, L-시스테인 80mg/l, 칼슘판토테네이트 60mg/l, 티아민염산염 20mg/l, 바이오틴 240μg/l, 아데닌 1200mg/l, 구아닌 1200mg/l (pH 7.2)

또한, 발효조 본 배지 1250ml을 5L-발효조에 넣고 온도 120℃에서 15분간 가압살균하여 발효조 종배양액 250ml을 접종한 다음, 배양하면서 배양액내에 환원당이 2%가 되었을 때 1차 및 2차, 3차, 4차 추가당을 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 최종 환원당으로 각각 32%가 되도록 첨가하여 5 내지 6일간 배양하였다. 회전수는 분당 900회, 온도 30℃, pH 7.2으로 조절하였다.

발효조 본배지의 조성은 다음과 같다.

발효조 본 배지 : 염화칼슘 120mg/l, 황산구리 8mg/l, 황산마그네슘 1.5%, 황산철 24mg/l, 황산아연 24mg/l, 황산망간 mg/l, L-시스테인 26.4mg/l, 글루타민산 나트륨 0.12%, 티아민염산염 6mg/l, 바이오틴 40μg/l, 니코틴산 50mg/l, 알라닌 145mg/l, 아데닌 200mg/l, 인산(85%) 4.3%, 과당, 포도당 35.2% (pH 7.2)

이때 배지 내 5'-이노신산 축적량을 모균주인 KCCM-10610 과 비교한 결과는 하기 표2와 같으며, 본 발명에 따른 균주의 경우, 동일한 조건 하에서 생산성이 모균주 KCCM-10610 대비 우수함을 나타내었다.

균주명	Cell. OD	발효 시간 (hr)	생산성(g/l/hr)
대조군(KCCM-10610)	200	103.5	0.64
CN01-0021 (KCCM-10825P)	202	104.8	0.69

이상에서 상세히 설명하였듯이, 포스포리보실아미노이미다졸썩시노카보스아마이드 신세타제를 코딩하는 purC 유전자가 과발현된 재조합 코리네박테리움 속 미생물을 이용하여 5'-이노신산을 생산하는 경우에, 직접 발효법에 의해 경제적으로 보다 높은 생산성으로 5'-이노신산을 생산할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

포스포리보실아미노이미다졸썩시노카보스아마이드 신세타제를 코딩하는 purC 유전자를 과발현 시킴으로써 5'-이노신산 생산능이 향상된 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
제1항에 있어서,

상기 purC 유전자의 과발현이 서열번호 1의 서열을 포함하는 벡터에 의한 코리네박테리움 속 미생물의 형질전환에 의한 것임을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
제1항에 있어서,

상기 미생물이 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0021 (KCCM-10825P)임을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하고, 그 배양액으로부터 5'-이노신산을 생산하는 방법.