KR20100088906A

KR20100088906A - 향상된 이노신 생산성을 갖는 미생물 및 이를 이용한 이노신의 생산방법

Info

Publication number: KR20100088906A
Application number: KR1020090008048A
Authority: KR
Inventors: 황수연; 김정환; 권중근; 양영렬; 권창혁; 안태민; 백민지; 권나라; 김주정; 윤난영
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2009-02-02
Filing date: 2009-02-02
Publication date: 2010-08-11

Abstract

본 발명은 양기능성 포스포리보실아미노이미다졸카르복사미드 포르밀트랜스퍼라아제/이노신 모노포스페이트(IMP) 시클로히드롤라아제(bifunctional phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide formyltransferase/IMP cyclohydrolase)의 활성이 모균주보다 증가된, 향상된 이노신 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 이노신의 생산방법에 관한 것이다.

이노신, 양기능성 포스포리보실아미노이미다졸카르복사미드 포르밀트랜스퍼라아제/IMP 시클로히드롤라아제, purH

Description

향상된 이노신 생산성을 갖는 미생물 및 이를 이용한 이노신의 생산방법 {Microorganism having enhanced inosine productivity and process for producing inosine using the same}

본 발명은 양기능성 포스포리보실아미노이미다졸카르복사미드 포르밀트랜스퍼라아제/IMP 시클로히드롤라아제(bifunctional phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide formyltransferase/IMP cyclohydrolase)의 활성이 모균주보다 증가된, 향상된 이노신 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 이노신의 생산방법에 관한 것이다.

이노신은 정미성 조미료로 각광받고 있는 이노신산(5'-inosinic acid)의 화학적 합성 및 효소전이 반응에 의한 합성에 있어서 중요한 기질이다. 또한 이노신은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 의미를 가질 뿐 아니라 식품 및 의약품 등 여러 분야에서 널리 이용되고 있다.

이노신은 종래에는 주로 바실러스(Agric. Biol. Chem., 46, 2347 (1982); 대한민국 등록특허 제27280호) 또는 코리네박테리움 암모니아게네스(Agric. Biol. Chem., 42, 399 (1978)) 등의 미생물을 이용한 직접 발효법이나 5′-이노신산의 열 분해법(일특공소 제43-3320호) 등을 이용하여 제조하였다. 그러나, 열분해법의 경우 5′-이노신산을 분해하기 위해 대량의 열 소비가 요구되어 실용성이 낮으며, 직접 발효법의 경우 대장균을 이용한 다양한 유전자형의 균주들이 개발되고 연구되었으나(Biosci Biotechnol Biochem. 2001 Mar;65(3):570-8) 이노신 생산균주의 역가가 낮아 생산원가가 높다는 단점이 있다. 또한 기존의 이노신 연구는 대장균과 바실러스에 집중되어 있었다.

따라서, 이노신을 보다 고수율로 생산하여 고농도로 축적시킬 수 있는 균주 및 상기 균주를 이용한 이노신 생산방법의 개발이 여전히 요구되고 있다.

이에, 본 발명자는 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 균주로부터 보다 안정적으로 고농도의 이노신을 생산할 수 있는 균주를 개발하던 중, 양기능성 포스포리보실아미노이미다졸카르복사미드 포르밀트랜스퍼라아제/IMP 시클로히드롤라아제의 활성을 증가시키는 경우 이노신을 생산하는 미생물이 이노신을 고농도 및 고수율로 생산한다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 향상된 이노신 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 향상된 이노신 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 이용하여 이노신을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 양기능성 포스포리보실아미노이미다졸카르복사미드 포르밀트랜스퍼라아제/이노신 모노포스페이트(IMP) 시클로히드롤라아제(bifunctional phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide formyltransferase/Inosine monophosphate(IMP) cyclohydrolase)의 활성이 모균주보다 증가된, 향상된 이노신 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.

양기능성 포스포리보실아미노이미다졸카르복사미드 포르밀트랜스퍼라아제/IMP 시클로히드롤라아제는 퓨린 뉴클레오티드를 합성하는 경로 상의 효소로서, 하기에 기재된 바와 같은 10-포르밀테트라히드로폴레이트(10-Formyltetrahydrofolate: 10-formyl THF)와 1-(5'-포스포리보실)-5-아미노-4-이미다졸카르복사미드(1-(5'-Phosphoribosyl)-5-amino-4-imidazolecarboxamide: AICAR)가 반응하여 테트라히드로폴레이트(Tetrahydrofolate: THF)와 1-(5'-포스포리보실)-5-포름아미도-4-이미다졸카르복사미드(1-(5'-Phosphoribosyl)-5-formamido-4- imidazolecarboxamide: FAICAR)를 생성하는 반응과 IMP와 물(H₂O)이 반응하여 1-(5'-포스포리보실)-5-포름아미도-4-이미다졸카르복사미드(1-(5'-Phosphoribosyl)-5-formamido-4-imidazolecarboxamide)를 생성하는 반응에서 각각 포스포리보실아미노이미다졸카르복사미드 포르밀트랜스퍼라아제와 IMP 시클로히드롤라아제로서 작용한다:

10-포르밀-THF + AICAR ↔ THF + FAICAR

IMP + H₂O ↔ FAICAR

본 발명에서, 양기능성 포스포리보실아미노이미다졸카르복사미드 포르밀트랜스퍼라아제/IMP 시클로히드롤라아제의 활성의 증가는 모균주보다 상기 효소의 활성이 높다는 것을 의미하며, 모균주는 본 발명의 코리네박테리움 속 미생물의 기원이 되는 균주를 의미한다.

본 발명에서, 양기능성 포스포리보실아미노이미다졸카르복사미드 포르밀트랜스퍼라아제/IMP 시클로히드롤라아제의 활성의 증가는 상기 효소를 코딩하는 유전자(purH)의 발현량을 증가시키거나 또는 상기 효소를 코딩하는 유전자에 변이를 도입하여 효소의 비활성(specific activity) 자체가 증가된 경우를 모두 포함한다. purH 유전자의 발현량 증가는 상기 유전자가 외부로부터 추가적으로 균주에 도입되거나 또는 내재적 purH가 증폭되어 유전자의 양이 증가되거나 또는 전사 또는 번역 조절 서열에 도입된 변이에 의해 전사 효율 또는 번역 효율이 증가된 경우를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 원핵세포의 유전자 발현에서 유전자의 코 딩서열의 상류에 위치한 SD(Shine-Dalgarno) 서열을 변형하여 16S rRNA와 mRNA의 복합체 형성이 잘 이루어질 때 번역 개시 효율이 증가된다는 것이 알려져 있다(Molecular Microbiology, 2006, 60(2), p. 480-492).

본 발명의 일 구체예에서, 모균주는 이노신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물일 수 있으며, 바람직하게는 이노신을 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, purH 유전자는 양기능성 포스포리보실아미노이미다졸카르복사미드 포르밀트랜스퍼라아제/IMP 시클로히드롤라아제를 생산하는 미생물로부터 얻을 수 있으며, 바람직하게는 코리네박테리움 속 미생물, 보다 바람직하게는 코리네박테리움 암모니아게네스에서 얻을 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, purH 유전자는 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 향상된 이노신 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물에서 양기능성 포스포리보실아미노이미다졸카르복사미드 포르밀트랜스퍼라아제/IMP 시클로히드롤라아제의 활성 증가는 상기 효소를 코딩하는 유전자(purH)의 코딩 서열 상류에 위치한 SD(Shine-Dalgarno) 서열 내에 변이를 도입하여 번역 효율을 증가시키는 것에 의해 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 향상된 이노신 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물에서 purH 유전자는 SD 서열의 일부가 퓨린 계열의 뉴클레오티드로 교체된 것인 변이를 포함하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 구체 적으로, 서열번호 1의 서열은 야생형 코리네박테리움 속 미생물의 purH의 서열번호 6에서 -8 내지 -20에 해당하는 부위가 GGAAGGCAAGGCT에서 TTTC GG A AAGG AG 로 변형된 서열이다.

본 발명의 구체예에서, 향상된 이노신 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물은 이노신을 생산할 수 있는 것으로 알려진 미생물이면 어느 것이나 상관없으나, 바람직하게는 코리네박테리움 암모니아게네스일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 향상된 이노신 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물은 발현 효율을 증가시키는 변이를 갖는 purH 유전자나 그의 일부를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 미생물일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 향상된 이노신 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물은 purH 유전자의 SD 서열에 번역 효율을 증가시키는 변이를 갖는 서열을 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 미생물일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 향상된 이노신 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물은 SD 서열에 번역 효율을 증가시키는 변이를 갖는 서열을 포함하는 재조합 백터에 의한 형질전환에 의해 수득된 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CN04-0198(KCCM-10979)일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, purH 유전자의 SD 서열에 변이를 갖는 서열을 포함하는 재조합 벡터는 하기와 같이 제조될 수 있다:

코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC6872의 염색체를 주형으로 서열번호 2와 서열번호 3의 프라이머 쌍 및 서열번호 4와 서열번호 5의 프라이머 쌍을 이용한 중 합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 수행하여 2개의 PCR 산물을 얻고, 이 2개의 산물의 혼합물을 주형으로 서열번호 2와 서열번호 5의 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 SD 서열이 변형된 purH 유전자의 상단부 단편을 수득한다. 수득된, SD 서열에 변이를 포함하는 purH 유전자 단편을 DNA 제한효소, 예를 들면, XbaI로 절단하고, 동일한 DNA 제한효소로 절단한 벡터에 DNA T4 리가아제 등을 사용하여 삽입시켜 재조합 벡터를 제조할 수 있다. 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것은 아니며 공지된 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pDZ 벡터(Biotechnology letters vol 13, No.10, p.721-726(1991); 대한민국 특허공고 제92-7401호)를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 재조합 벡터는 pDZ 벡터에 SD 서열에 변이를 갖는 purH 유전자의 상단부를 삽입시켜 제조한 pDZ-purH-T1 벡터일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 코리네박테리움 속 미생물의 형질전환을 위해 이용된 재조합 벡터는 약 550 bp의 프로모터 부위와 purH 유전자의 코딩 서열의 일부를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 형질전환된 코리네박테리움 속 미생물은 원하는 변이를 갖는 purH의 SD 서열을 포함하는 재조합 벡터, 예를 들면, pDZ-purH-T1를 이용하여 원형 DNA 단편을 통상적인 전기천공(electroporation)에 의해 모균주(예를 들어, 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) CN04-0027 (KCCM-10905, 대한민국 출원공고 제 10-2008-001441 호)에 전달하는 단계 및 항생제인 카나마이신(kanamycin)과 X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토 시드)을 선별마커로 이용하여 형질전환된 균주를 선별하는 단계에 의해 제조될 수 있다.

또한, 본 발명은 양기능성 포스포리보실아미노이미다졸카르복사미드 포르밀트랜스퍼라아제/IMP 시클로히드롤라아제의 활성이 모균주보다 증가된, 향상된 이노신 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 단계 및 상기 코리네박테리움 속 미생물의 배양액으로부터 이노신을 분리하는 단계를 포함하는, 이노신을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 이노신을 생산하는 방법에서 코리네박테리움 속 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 코리네박테리움 속 미생물의 배양에 사용되는 배지이면 어느 것이나 사용될 수 있다. 또한, 배양 방법도 당업계에 알려진 임의의 배양 방법, 예를 들면, 회분식, 연속식 및 유가식 배양 방법 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서, 향상된 이노신 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 향상된 이노신 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0198(KCCM-10979)일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 단계는 균주를 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양한다.

이때 탄소원으로는 글루코오스, 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있고, 질소원으로는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄과 같은 각종 무기질소원 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 무기화합물로는 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양요구성 염기 등이 첨가될 수 있다.

배양은 호기적 조건 하에서, 예를 들면 진탕 배양 또는 통기 교반 배양에 의해, 바람직하게는 28 내지 36℃의 온도에서 수행된다. 배지의 pH는 배양하는 동안 pH 6 내지 8의 범위에서 유지하는 것이 바람직하다. 배양은 5 내지 6일 동안 수행될 수 있으며, 직접 발효에 의해 축적된 이노신은 HPLC를 이용하여 통상의 방법으로 분석될 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되지 않는다.

본 발명에 따른 양기능성 포스포리보실아미노이미다졸카르복사미드 포르밀트랜스퍼라아제/IMP 시클로히드롤라아제의 활성을 증가시켜 향상된 이노신 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 이용하여 이노신을 보다 고농도 및 고수율로 생산할 수 있으며 당 소비량 및 발효 시간의 감소에 따라 생산 비용이 절감되는 효과를 누릴 수 있다.

실시예 1. pur H 유전자의 SD (Shine-Dalgarno) 서열 재조합 벡터 클로닝

이노신 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제조하기 위해, purH 유전자의 SD 서열에 변이를 포함하는 재조합 벡터를 클로닝하였다.

코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC6872의 염색체 DNA를 분리하고, 이를 주형으로 서열번호 2와 서열번호 3의 프라이머 쌍 및 서열번호 4와 서열번호 5의 프라이머 쌍을 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 각각 약 560 bp와 약 540 bp의 2개의 PCR 산물을 수득했다. 상기 2개의 PCR 산물의 혼합물을 주형으로 서열번호 2와 서열번호 5의 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 SD 서열인 -8 내지 -20 부위가 GGAAGGCAAGGCT에서 TTTC GG A AAGG AG 으로 바뀐 1055 bp의 purH 유전자 상단부가 포함된 단편을 얻었다. 상기 DNA 단편을 DNA 제한효소인 XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)으로 절단하고, 동일한 DNA 제한효소로 절단한 후 새우 유래 알칼리 포스파타아제(Alkaline phosphatase, shrimp: Roche Applied Science, Mannheim, Germany)로 처리한 pDZ에 DNA T4 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 사용하여 삽입시켜 재조합 벡터 pDZ-purH-T1를 제조하였다. 도 1은 재조합 벡터 pDZ-purH-T1의 제조방법 및 그 구조를 개략적으로 보여준다.

실시예 2. 재조합 균주 제작

purH의 상단부 서열 치환을 위해 제작한 pDZ-purH-T1을 코리네박테리움 암모 니아게네스 CN04-0027(KCCM-10905)에 전기 천공법으로 형질전환한 후(Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545에 의한 형질 전환법 이용), 카나마이신 (kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별 배지에서 실시예 1에서 제조된 SD 서열에 변이를 갖는 purH의 상단부 서열이 상동성 재조합에 의해 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0027의 염색체에 삽입된 형질전환 균주를 선별하였다.

벡터의 성공적인 염색체 삽입은 X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)을 포함한 고체배지에서 콜리니의 색을 확인하는 것에 의해 확인하였다. 1차 염색체 삽입된 균주를 하기 표 1에 표시된 조성을 갖는 영양 배지에서 진탕배양 (37℃, 8시간)한 후, 10^-4 내지 10^-10까지 희석하여, X-gal을 포함하고 있는 고체배지에 도말 하였다. 대부분의 콜로니가 청색을 띄는데 반해 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선별함으로써, 2차 교차(crossover)에 의해 삽입된 염색체상의 벡터 서열이 제거된 균주를 선별하였다. 이에 의해, 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0027(KCCM-10905) 균주의 염색체 상의 purH 유전자의 SD 서열 부위가 서열번호 1로 치환된 균주를 선별하였다. 상기 선별된 균주를 항생제 카나마이신에 대한 감수성 여부 및 PCR을 통한 유전자 서열 분석을 통해 최종적으로 확인하였다. 본 실시예에서 선별된, SD 서열에 발현을 증가시키기 위한 변이를 갖는 purH 유전자를 포함하는 코리네박테리움 암모니아게네스를 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0198로 명명하였다.

실시예 3. 삼각 플라스크 발효역가 시험

실시예 2에서 선별된 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0198의 이노신 생산성을 평가하기 위해 삼각 플라스크에서 배양하여 발효 역가를 측정하였다. 대조군은 상기 형질전환된 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0198의 모균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0027(KCCM-10905)였다.

하기 표 1에 표시된 조성을 갖는 종배지 3 ml를 지름 18 mm의 시험관에 분주하고 가압 살균한 후, 각각 코리네박테리움 암모니아게네스 코리네박테리움 CN04-0027(KCCM-10905) 및 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0198을 접종하고 37℃에서 24시간 동안 진탕 배양하여 종 배양액으로 사용하였다. 하기 표 1에 표시된 조성을 갖는 발효배지 27 ml를 250 ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 120℃ 온도에서 10분간 가압 살균한 후, 상기 종배양액 1 ml을 접종하여 5 내지 6일간 배양하였다.

[표 1]

배지종류	배지 조성
영양배지	펩톤 1%, 육즙 1%, 염화나트륨 0.25%, 효모 추출물 1%, 아데닌 100mg/L, 구아닌 100mg/L, 한천 2%, pH 7.2
종배지	포도당 5%, 펩톤 0.5%, 육즙 0.5%, 염화나트륨 0.25%, 효모 추출물 1%, 아데닌 100mg/L, 구아닌 100mg/L, pH 7.2
발효배지	글루타민산나트륨 0.1%, 암모늄클로라이드 1%, 황산마그네슘 1.2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20mg/L, 황산망간 20mg/L, 황산아연 20mg/L, 황산구리 5mg/L, L-시스테인 23mg/L, 알라닌 24mg/L, 니코틴산 8mg/L, 바이오틴 45ug/L, 티아민염산염 5mg/L, 아데닌 30mg/L, 인산(85%) 1.9%, 포도당 6%, pH 7.2

배양 조건은 진탕 속도 220 rpm, 온도 37℃, pH 7.2로 조절하였다. 하기의 표 2는 각각 대조군인 모균주 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0027(KCCM-10905)와 실시예 2에서 선별된 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0198의 배양 후 배지 내의 이노신 축적량을 표시한다. 이 결과는 코리네박테리움 CN04-0198 균주가 동일한 조건하에서 모균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0027(KCCM-10905) 대비 이노신의 생산성이 더 우수함을 나타낸다.

[표 2]

균주명	당 소모량(g/l) (배양 4일후)	이노신 농도(%) (배양 4일후)
대조군 (KCCM-10905)	66	100
CN04-0198	66	108

본 실시예에서 모균주 대비 이노신 생산성이 향상된 것으로 확인된, 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0198을 부다페스트 조약 하에 서울 서대문구 홍제1동 소재의 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2009년 1월 8일자로 수탁번호 KCCM-10979로 기탁하였다.

실시예 4. 30 L 발효조에서의 발효역가 실험

실시예 3에서 향상된 이노신 생산성을 갖는 것으로 확인된 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0198의 발효 역가를 30 L 발효조에서 평가하였다.

상기 표 1에 표시된 조성을 갖는 종배지 100 ml를 500 ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 가압살균 후, 각각 대조군인 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0027(KCCM-10905)과 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0198(KCCM-10979)를 접종하고 37℃에서 18시간 동안 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다.

하기 표 3에 표시된 30 L-발효조 종배지 12 L를 30 L 발효조에 넣고 123℃에서 25분간 가압살균하여 상기에서 준비된 종배양액 100 ml를 접종한 후 1일 동안 배양하였다. 배양조건은 진탕속도 450 rpm, 온도 28 내지 37℃, 및 pH 7.2로 조절하였다.

그 후, 하기 표 3에 표시된 발효배지 7.3 L을 30 L 발효조에 넣고 온도 124℃에서 25분간 가압살균하고 상기에서 준비된 30 L 발효조 종배양액 1.7 L을 접종한 다음, 배양하면서 배양액 내에 포도당이 1%가 되었을 때 8차례에 걸쳐 배양액 내의 포도당의 양이 37%가 되도록 포도당을 첨가하면서 5 내지 6일간 배양하였다. 배양조건은 진탕속도 450 rpm, 온도 30 내지 35℃, 및 pH 7.2으로 조절하였다.

[표 3]

배지종류	배지 조성
30L 종배지	포도당 6.3%, 효모추출물 1.5%, 인산 0.1%, 수산화칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.1%, 황산암모늄 0.5%, 황산철 20mg/l, 황산아연 10mg/l, 황산망간 10mg/l, L-시스테인 20mg/l, 칼슘판토테네이트 15mg/l, 티아민염산염 5mg/l, 바이오틴 60μg/l, 아데닌 400mg/l, 구아닌 250mg/l (pH 7.2)
30L 발효배지	염화칼슘 100mg/l, 황산구리 6.4mg/l, 황산마그네슘 1.0%, 황산철 20mg/l, 황산아연 20mg/l, 황산망간 60mg/l, L-시스테인 22mg/l, 글루타민산 나트륨 0.1%, 티아민염산염 12.8mg/l, 바이오틴 90μg/l, 니코틴산 12.8mg/l, 알라닌 37.8mg/l, 효모 추출물 0.1%,아데닌 210mg/l, 인산(85%) 1.9%, 수산화칼륨 0.8%, 포도당 37% (pH 7.2)

하기의 표 4는 각각 대조군인 모균주 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0027(KCCM-10905)와 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0198의 배양 후 배지 내의 이노신 축적량을 표시한다. 이 결과는 코리네박테리움 CN04-0198 균주가 동일한 조건 하에서 모균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0027(KCCM-10905) 대비 발효 시간이 단축되며 발효 배지 내의 이노신 농도가 더 높아서, 향상된 이노신 생산성을 갖는다는 것을 나타낸다.

[표 4]

균주명	발효 시간 (hr)	이노신 농도(%)
대조군 (KCCM-10905)	110	100
CN04-0198 (KCCM-10979)	95	112

도 1은 purH 유전자의 SD(Shine-Dalgarno) 서열에 변이를 도입하기 위한 재조합 벡터 pDZ-purH-T1 및 그 제작 방법을 개략적으로 도시한다. 도면에 기재된 *는 모균주의 purH 서열 대비 변이를 포함하는 부위를 표시한다.

<110> CJ Corporation <120> Microorganism having enhanced inosine productivity and process for producing inosine usingi the same <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1660 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <220> <221> gene <222> (1)..(1660) <223> purH with modified SD sequence <400> 1 cgtgcaggtc ttacgcgcag cgaatgttca agaccagcag cttattattg agatttaaac 60 cagatttccc acagtcattt cggaaaggag ttcatccatg agtgatgacc gcaagcagat 120 caagcgtgca ctaattagcg tttatgacaa gacagggctc gaagagctcg ctcgcacgct 180 tgacagcgca ggcgtagaga ttgtgtccac cggctccacc gccgccaaga ttgctgatct 240 tggtattaac gtcactccgg ttgaatctct caccggattc ccagagtgcc tcgaaggccg 300 cgttaagacc ttgcacccac gcgtgcatgc gggcattttg gctgataccc gcaagccgga 360 tcaccttaat cagctggaag agcttgagat tgagccattc cagttggtcg tggttaacct 420 gtacccattt aaagagactg tagcttctgg cgcagacttc gatggttgcg tcgagcagat 480 tgatatcggc ggtccatcca tggtccgtgc tgctgccaag aaccacccat cggtggcggt 540 tgttgtagac ccagcgcgtt acggcgacat cgctgaggct gtcgctcagg gcggattcga 600 tctggcgcag cgtcgtcagc tggccgcgac tgcgtttaag cacacggcag attatgatgt 660 tgcagtttct ggctggtttg cccagcagct tgccgatgac tctgttgcct ctgctgagct 720 tgaaggcgac gcgctgcgtt atggtgagaa ccctcaccag caggcttcca tcgttcgtga 780 aggcacgacc ggtgttgcta atgcgaagca gctgcacggt aaggaaatga gctacaacaa 840 ctaccaggac gcggatgccg catggcgcgc ggcttgggat catgaacgtc catgtgtagc 900 aattattaag cacgctaacc cttgcggtat cgctgtttct gatgagtcca tcgcagcagc 960 acacgcagcg gcacacgcct gtgacccaat gtccgctttc ggtggcgtta ttgcggtcaa 1020 ccgcgaagtc accaaggaaa tggcaaccca ggttgctgac atcttcaccg aggtcatcat 1080 cgcaccgtcc tacgaagatg gagccgtcga gattttgcag ggcaagaaga atattcgcat 1140 ccttgttgct gagcatgaag taccagcagt agaggtcaaa gaaatctctg gtggccgtct 1200 gctgcaggaa gcagacgttt accaggctga gggcgataag gcttcgagtt ggactttggc 1260 tgccggcgaa gctgcatccg aggaaaagct cgcggagctg gaattcgctt ggcgcgcagt 1320 acgctcggta aagtccaacg ccatcttgtt ggcgcatgaa ggtgcaaccg ttggcgtggg 1380 tatgggccag gtcaaccgcg ttgattcggc gaagttggct gttgaccgcg cgaatacttt 1440 ggctgattcc gcagagcgtg ctcgcggttc cgtcgcagca tcggatgcgt tcttcccatt 1500 cgccgatggc ttgcaggtgc ttatcgatgc cggcgtttcc gccgttgtcc agcccggcgg 1560 ctccatccgc gatgaagaag ttattgctgc cgctgaagca gccggtatca ccatgtactt 1620 cactggcacc cgccacttcg cgcactaaag ctttcctccg 1660 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer purH AU <400> 2 ggtctagacg acaaccaaga tgac 24 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer purH AL <400> 3 ctcatggatg aactcctttc cgaaatgact gtgggaa 37 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer purH BU <400> 4 ttcccacagt catttcggaa aggagttcat ccatgag 37 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer purH BL <400> 5 ggtctagaga tcgaatccgc cctg 24 <210> 6 <211> 1660 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <220> <221> gene <222> (1)..(1660) <223> purH <400> 6 cgtgcaggtc ttacgcgcag cgaatgttca agaccagcag cttattattg agatttaaac 60 cagatttccc acagtcagga aggcaaggct ttcatccatg agtgatgacc gcaagcagat 120 caagcgtgca ctaattagcg tttatgacaa gacagggctc gaagagctcg ctcgcacgct 180 tgacagcgca ggcgtagaga ttgtgtccac cggctccacc gccgccaaga ttgctgatct 240 tggtattaac gtcactccgg ttgaatctct caccggattc ccagagtgcc tcgaaggccg 300 cgttaagacc ttgcacccac gcgtgcatgc gggcattttg gctgataccc gcaagccgga 360 tcaccttaat cagctggaag agcttgagat tgagccattc cagttggtcg tggttaacct 420 gtacccattt aaagagactg tagcttctgg cgcagacttc gatggttgcg tcgagcagat 480 tgatatcggc ggtccatcca tggtccgtgc tgctgccaag aaccacccat cggtggcggt 540 tgttgtagac ccagcgcgtt acggcgacat cgctgaggct gtcgctcagg gcggattcga 600 tctggcgcag cgtcgtcagc tggccgcgac tgcgtttaag cacacggcag attatgatgt 660 tgcagtttct ggctggtttg cccagcagct tgccgatgac tctgttgcct ctgctgagct 720 tgaaggcgac gcgctgcgtt atggtgagaa ccctcaccag caggcttcca tcgttcgtga 780 aggcacgacc ggtgttgcta atgcgaagca gctgcacggt aaggaaatga gctacaacaa 840 ctaccaggac gcggatgccg catggcgcgc ggcttgggat catgaacgtc catgtgtagc 900 aattattaag cacgctaacc cttgcggtat cgctgtttct gatgagtcca tcgcagcagc 960 acacgcagcg gcacacgcct gtgacccaat gtccgctttc ggtggcgtta ttgcggtcaa 1020 ccgcgaagtc accaaggaaa tggcaaccca ggttgctgac atcttcaccg aggtcatcat 1080 cgcaccgtcc tacgaagatg gagccgtcga gattttgcag ggcaagaaga atattcgcat 1140 ccttgttgct gagcatgaag taccagcagt agaggtcaaa gaaatctctg gtggccgtct 1200 gctgcaggaa gcagacgttt accaggctga gggcgataag gcttcgagtt ggactttggc 1260 tgccggcgaa gctgcatccg aggaaaagct cgcggagctg gaattcgctt ggcgcgcagt 1320 acgctcggta aagtccaacg ccatcttgtt ggcgcatgaa ggtgcaaccg ttggcgtggg 1380 tatgggccag gtcaaccgcg ttgattcggc gaagttggct gttgaccgcg cgaatacttt 1440 ggctgattcc gcagagcgtg ctcgcggttc cgtcgcagca tcggatgcgt tcttcccatt 1500 cgccgatggc ttgcaggtgc ttatcgatgc cggcgtttcc gccgttgtcc agcccggcgg 1560 ctccatccgc gatgaagaag ttattgctgc cgctgaagca gccggtatca ccatgtactt 1620 cactggcacc cgccacttcg cgcactaaag ctttcctccg 1660

Claims

양기능성 포스포리보실아미노이미다졸카르복사미드 포르밀트랜스퍼라아제/이노신 모노포스페이트(IMP) 시클로히드롤라아제의 활성이 모균주보다 증가된, 향상된 이노신 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물.
제1항에 있어서, 상기 양기능성 포스포리보실아미노이미다졸카르복사미드 포르밀트랜스퍼라아제/이노신 모노포스페이트(IMP) 시클로히드롤라아제의 활성 증가는 상기 효소를 코딩하는 purH 유전자의 SD(Shine-Dalgarno) 서열 내에 도입된 변이에 의해 증가된 번역 효율로부터 기인되는 것인 코리네박테리움 속 미생물.
　　　제2항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물에서 상기 양기능성 포스포리보실아미노이미다졸카르복사미드 포르밀트랜스퍼라아제/이노신 모노포스페이트(IMP) 시클로히드롤라아제는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 purH 유전자에 의해 코딩되는 것인 코리네박테리움 속 미생물.
제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스인 것인 코리네박테리움 속 미생물.
　　　　제4항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 암모니 아게네스 CN04-0198 (KCCM-10979)인 것인 코리네박테리움 속 미생물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 단계 및 상기 코리네박테리움 속 미생물의 배양액으로부터 이노신을 분리하는 단계를 포함하는, 이노신을 생산하는 방법.