KR20020057472A - 5'-크산틸산을 고수율로 생산하는 미생물 코리네박테리움암모니아게네스 씨제이엑스피002 및 그를 이용한5'-크산틸산 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 5'-크산틸산(XMP)을 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) KFCC-10743을 친주로 자외선 조사, N-메틸-N`-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 등의 변이 유발제로 통상적인 방법에 따라 처리하여 친주의 형질을 변형시켜 더욱더 삼투압내성을 강화하기 위한 목적으로 균체외부에 축적된 고농도 용질에 대하여 세포내부에서 농도가 증가되어 삼투압조절에 중요한 역할을 하는 프롤린(L-proline)에 대한 유사체인 아제티딘 카르복실산(L-azetidine-2-carboxylic acid) 내성주를 선별하여 보다 더 효율적으로 삼투압에 의한 영향을 배제시켜 5’-크산틸산을 고수율, 고농도로 배양액중에 직접 축적시키는 미생물에 관한 발명이다.

Description

5'-크산틸산을 고수율로 생산하는 미생물 코리네박테리움 암모니아게네스 씨제이엑스피002 및 그를 이용한 5'-크산틸산 생산방법{A microorganism Corynebacterium ammoniagenes CJXP002 being capable of producing 5'-xanthylic acid in higher yield and a producing method of 5'-xanthylic acid by using the same}

본 발명은 5'-크산틸산(5'-xanthylic acid, XMP)을 생산하는 미생물 및 그를 이용한 5'-크산틸산 생산방법에 관한 것으로, 좀더 구체적으로 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) KFCC-10743의 변이주로서 더욱더 삼투압 내성 형질을 강화하기위한 목적으로 균체외부에 축적된 고농도 용질에 대하여 세포내부에서 농도가 증가되어 삼투압조절에 중요한 역할을 하는 프롤린(L-proline)에 대한 유사체인 아제티딘 카르복실산(L-azetidine-2-carboxylic acid) 내성주를 선별하여 보다 더 효율적으로 삼투압에의한 영향을 배제시켜 5'-크산틸산을 고수율, 고농도로 배양액중에 직접 축적시키는 미생물 및 그를 이용한 5'-크산틸산 생산방법에 관한 것이다.

5'-크산틸산은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 의미를 가질뿐 아니라 식품, 의약품 및 각종 의료적 이용등 다방면에 이용되고 있으며, 본 발명은 당사에서 개발한 공지의 균주 KFCC-10743으로부터 프롤린 유사체인 아제티딘 카르복실산(L-azetidine-2-carboxylic acid) 내성주를 선별하여 공지의 기술보다 직접발효법으로 고농도, 고수율의 5'-크산틸산을 생산하는 균주를 개발하여 본 발명을 완성하였다.

5'-크산틸산은 퓨린 뉴클레오타이드(Purine nucleotide) 생합성 대사계의 중간 생성물로 5'-구아닐산(GMP)의 제조원료로서 중요한 물질이다. 정미성이 강하고 상품적 가치가 높은 5'-구아닐산의 제조방법으로서 현재 널리 이용되고 있는 방법은 미생물 발효법으로서, 5'-크산틸산을 생산하고 이를 효소학적으로 5'-구아닐산으로 전환시키는 과정이 가장 경제적이어서 5’-구아닐산의 수요만큼 5'-크산틸산도 필요하다. 종래 5'-크산틸산의 제조방법에는 화학합성법, 또는 효모중의 리보핵산을 분해하여 제조된 5'-구아닐산을 탈아미노화하는 제조법, 그리고 발효법으로는 발효배지내 전구물질로 크산틴(Xanthine)을 첨가하는 방법과 미생물 변이주에 의한 제조법, 항생물질 첨가에 의한 제조법(일본특허 소42-1477, 소 44-20390) 및 계면활성제 첨가에 의한 제조법(일본특허 소42-3825, 소42-3838) 등이 알려져 있다. 이 중에서도 미생물 변이주에 의한 5'-크산틸산의 직접적인 발효 제조 방법이 공업적으로 유리하므로 본 발명자들은 기존의 코리네박테리움 암모니아게네스 KFCC-10743이 소유하고 있는 형질을 개량하여 XMP가 최대로 생산될 수 있는 형질을 부여함으로써 XMP의 생산성이 월등히 증가한 변이주를 개발하였다.

대부분의 세균은 균체외부의 삼투압하에서 삼투적 탈수현상을 막기위해 균체내부의 삼투압을 증가시키는 방법으로 칼륨이온과 오스몰라이트(osmolytes)라고 하는 유기성 용질을 축적시킨다. 이러한 오스몰라이트에는 프롤린(L-proline)을 축적시킴을 브레비박테리움 락토퍼맨텀(Brevibacterium lactofermentum)을 통해 보고[Agr, Bio, Chem., Vol; 53(9), p2475-2479, 1989]하였다. 이외에 대장균(Escherichia coli), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마tm센스(Serratia marcescens)등에서도 균체내부에 프롤린(L-proline)이 축적되며 이는 외부 삼투압에 의하여 조절됨을 보고[J, Bacteriol., Vol; 163, p296. 1985]하였다. 따라서 고농도, 고수율의 5'-크산틸산을 생산하는 균주를 개발하기 위해서는 프롤린(L-proline) 합성능력을 증가시킴으로서 삼투압 내성형질을 강화하고 또한 균체내부의 프롤린(L-proline) 합성증가에 따른 생육과 생화학적 대사과정의 저해를 방지하기 위해 프롤린 유사체 저항성 균주를 획득하는 것이 중요하다고 사료된다.

본 발명자들은 여러 가지 프롤린 유사체(L-proline analogue)에 대한 내성주를 선별하여 실험한 결과 아제티딘 카르복실산(L-azetidine-2-carboxylic acid) 내성을 부여한 균주가 직접발효법에의해 5'-크산틸산을 기존에 비해서 고농도, 고수율로 생산할수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

다음에서 본 발명의 미생물분리 및 획득방법을 좀더 구체적으로 설명한다.

본 발명의 미생물 CJXP002는 코리네박테리움암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) KFCC-10743을 친주로하여 자외선조사, N-메틸-N`-니트로-N-니트로소구아니딘 (NTG)등의 변이 유발제로 통상적인 방법에 따라 처리한 후 아제티딘 카르복실산(L-azetidine-2-carboxylic acid)이 농도별로 첨가된 (주 3)배지에서 생육할 수 있는 변이주들 중에서 선별된 것이다. 이때 실험에 사용된 배지중의 아제티딘 카르복실산의 농도는 50mg/ml까지 사용하였으며, 아제티딘 카르복실산 농도 30mg/l에서 생육하는 5'-크산틸산 농도가 향상된 균주를 선별하여, 이 균주를 CJXP002라 명명하여 제 3자에게 일반분양될 수 있도록 서울시 서대문구 홍제동 소재의 한국종균협회에 2000년 12월 21일자로 수탁번호 제 KFCC-11250호로 기탁하였다.

(주 1) 영양배지 : 포도당 20g/l, 펩톤 10g/l, 효모엑기스 10g/l, 염화나트륨 2.5g/l, 우레아 3g/l, 아데닌 150mg/l, 구아닌 150mg/l, pH 7.2.

(주 2) 최소배지; 포도당 20g/l, 인산제1칼륨 1g/l, 인산제2칼륨 1g/l, 우레아 2g/l, 황산암모늄 3g/l, 황산마그네슘 1g/l, 염화칼슘 100mg/l, 황산철 20mg/l, 황산망간 10mg/l, 황산아연 10mg/l, 비오틴 30μg/l, 티아민산염 0.1mg/l, 황산구리 0.8mg/l, 아데닌 20mg/l, 구아닌 20mg/l, pH 7.2.

(주 3) 아제티딘 카르복실산 첨가배지 : (주2) 최소배지에 아제티딘 카르복실산 5-50mg/ml 첨가한 배지.

본 발명에서 분리한 신규의 변이주 CJXP002의 생화학적 특성은 표 1의 기재와 같으며 이들 내용에 의하면 본 발명의 미생물은 30mg/ml 농도의 아제티딘 카르복실산 첨가배지에서도 생육 가능한 균주임을 알 수 있다.

본 발명 미생물의 특성은 다음의 표에 기재된 바와 같다.

아제티딘 카르복실산에 대한 내성 비교

	아제티딘 카르복실산 농도(mg/ml)
	0	5	10	20	30	40	50
KFCC-10743	+++	+	-	-	-	-	-
CJXP002	+++	+++	+++	++	+	-	-

(주) +: 생육, -: 생육치 못함, 30℃에서 5일 배양

실시예 1

사용 균주: 본 발명의 미생물 CJXP002, KFCC-10743

종배지: 포도당 30g/l, 펩톤 15g/l, 효모엑기스 15g/l, 염화나트륨 2.5g/l, 우레아 3g/l, 아데닌 150mg/l, 구아닌 150mg/l, pH 7.2

발효배지:

① 본배지: 포도당 60g/l, 황산마그네슘 10g/l, 황산철 20mg/l, 황산아연 10mg/l, 황산망간 10mg/l, 아데닌 30mg/l, 구아닌 30mg/l, 비오틴 100μg/l, 황산구리 1mg/l, 티아민염산염 5mg/l, 염화칼슘 10mg/l, pH 7.2

② 별살배지: 인산제1칼륨 10g/l, 인산제2칼륨 10g/l, 우레아 7g/l, 황산암모늄 5g/l.

발효방법

상기 종배지 5ml을 지름 18mm 시험관에 분주하고 상법에 따라 가압 살균한 후 사용 균주를 접종하고 180rpm으로 30℃에서 18시간 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 중 본배지와 별살배지를 각각 상법에 따라 가압 살균하여 미리 가압 살균한 500ml 용량의 진탕용 삼각 플라스크에 29ml과 10ml 씩 분주하고 종배양액 1ml을 식균한 다음 90시간 배양하였다. 회전수는 200rpm, 온도 30℃로 조절하였다. 배양 완료 후 5'-크산틸산의 배지내 축적량은 기존 균주 KFCC-10743이 22.1g/l 이며, 본 발명변이주 CJXP002균주는 11% 향상된 24.9g/l 이었다(5'-크산틸산의 축적농도는 5'-크산틸산 나트륨·7H₂O로 표시하였다).

실시예 2

사용균주: 실시예 1과 동일.

1차 종배지: 실시예 1의 1차 종배지와 동일.

2차 종배지: 포도당 60g/l, 인산제1칼륨 2g/l, 인산제2칼륨 2g/l, 황산마그네슘 1g/l, 황산철 22mg/l, 황산아연 15mg/l, 황산망간 10mg/l, 황산구리 1mg/l, 염화칼슘 100mg/l, 비오틴 150ug/l, 아데닌 150mg/l, 구아닌 150mg/l, 티아민산염 5mg/l, 소포제 0.6ml/l, pH 7.2.

발효배지 : 포도당 151g/l, 인산 32g/l, 수산화칼륨 25g/l, 아데닌 198mg/l, 구아닌 119mg/l, 황산철 60mg/l, 황산아연 42mg/l, 황산망간 15mg/l, 황산구리 2.4mg/l, 알라닌염 22mg/l, NCA 7.5mg/l, 비오틴 0.4mg/l, 황산마그네슘 15g/l, 시스틴염 30mg/l, 히스티딘염 30mg/l, 염화칼슘 149mg/l, 티아민염 15mg/l, 소포제 0.7ml/l, CSL 27ml/l, 참치엑기스 6g/l, pH 7.3.

1차 종배양: 상기 1차 종배양 배지 50ml을 500ml 진탕용 삼각 플라스크에 분주하고 121℃에서 20분간 가압 살균하여 냉각한 후 사용균주를 접종하고 30℃에서 180rpm으로 24시간 진탕 배양하였다.

2차 종배양: 2차 종배지를 5리터 용량의 실험용 발효조에 2리터씩 분주하고 121℃에서 10분간 가압 살균한 후 냉각하여 1차 종배양액의 배양완료액 50ml을 접종한 후 공기를 0.5vvm으로 공급하면서 900rpm, 31℃에서 24시간 배양하였다. 배양 중 pH는 암모니아수로 7.3로 조절하였다.

발효방법

상기 발효배지를 30리터 용량의 실험용 발효조에 8리터씩 분주하고 121℃에서 20분간 가압살균한 뒤 냉각하여 2차 종배양액을 1.5리터씩 접종한 후 공기를 1vvm으로 공급하면서 400rpm, 33℃에서 배양하되 배양중 잔존 당농도가 1% 이하가 되면 살균된 포도당을 공급하여 발효배지에 첨가된 총당의 합계가 30%로 조절하였다. 배양 중 pH는 암모니아수로 7.3로 조절하여 90시간 배양하였다. 배양완료 후 5'-크산틸산의 배지내 축적량은 종래균주 KFCC-10743 균주는 123.5g/l이고 본 발명의 변이주 CJXP002는 종래균주에 비해 약 13% 향상된 139.5g/l 이었다(5'-크산틸산의 축적농도는 5'-크산틸산 나트륨·7H₂O로 표시하였다).

본 발명은 5'-크산틸산(5'-xanthylic acid, XMP)을 생산하는 미생물 및 그를 이용한 5'-크산틸산 생산방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) KFCC-10743의 변이주로서 더욱더 삼투압 내성 형질을 강화하기위한 목적으로 균체외부에 축적된 고농도 용질에 대하여 세포내부에서 농도가 증가되어 삼투압조절에 중요한 역할을 하는 프롤린(L-proline)에 대한 유사체인 아제티딘 카르복실산(L-azetidine-2-carboxylic acid) 내성주를 선별하여 보다 더 효율적으로 삼투압에의한 영향을 배제시켜 5'-크산틸산을 고수율, 고농도로 배양액중에 직접 축적시키는 미생물 및 그를 이용한 5'-크산틸산 생산방법에 관한 것으로, 기존의 코리네박테리움 암모니아게네스 KFCC-10743이 소유하고 있는 형질을 개량하여 XMP가 최대로 생산될 수 있는 형질을 부여함으로써 XMP의 생산성이 월등히 증가한 변이주를 개발하였다.

Claims (3)

1. 5'-크산틸산(XMP)을 생산하고, 아제티딘 카르복실산에 내성을 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스 변이주 CJXP002(KFCC-11250).
2. 제 1항에 있어서, 극미량 내지 30mg/ml의 아제티딘 카르복실산 존재하에서 생육가능한 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 암모니아게네스 변이주 CJXP002(KFCC-11250).
3. 제 1항에 따른 미생물 코리네박테리움 암모니아게네스 변이주 CJXP002(KFCC-11250)를 1차 종배지에서 30℃, 180rpm, pH 7.3에서 24시간 진탕배양한 후, 2차 종배지에서 31℃, 900rpm, pH 7.3에서 24시간 진탕배양하여 활성화시킨 후, 발효배지에서 33℃, 400rpm에서 90시간동안 진탕배양하면서, 배양액내 잔존 당농도가 1%이하이면 포도당이 첨가된 추가당을 배양액내 총당함량이 30%가 되도록 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 5'-크산틸산의 생산방법.