KR20100038639A

KR20100038639A - 변형된 ｐｕｒＣ 유전자를 가진 미생물 및 이를 이용한 이노신의 생산방법

Info

Publication number: KR20100038639A
Application number: KR1020080097683A
Authority: KR
Inventors: 김철하; 최종수; 김정환; 김형석; 권중근; 최혜진; 안태민; 백민지; 권나라; 김주정; 윤난영; 권창혁; 양영렬; 황수연
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2008-10-06
Filing date: 2008-10-06
Publication date: 2010-04-15

Abstract

본 발명은 포스포리보실아미노이미다졸석시노카보스아마이드 신타제 (Phosphoribosylaminoimidazole-succinocarboxamide synthase)를 암호화하는 유전자의 번역 효율(Translation efficiency)이 증가된 미생물 및 이를 이용한 이노신의 생산방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 포스포리보실아미노이미다졸석시노카보스아마이드 신타제를 암호화하는 유전자의 샤인-달가르노 서열(Shine-Dalgarno sequence) 혹은 개시 코돈 주변의 코돈 선호도(codon usage)에 변형을 가함으로써 상기 유전자의 아미노산으로의 번역이 효율적이고 안정적으로 이루어지게 한 이노신 고생산성 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용하여 이노신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

코리네박테리움 암모니아게네스, purC, 샤인-달가르노 서열, 코돈 선호도, 이노신

Description

변형된 ｐｕｒＣ 유전자를 가진 미생물 및 이를 이용한 이노신의 생산방법 {Microorganism comprising modified purC gene and process for production method of inosine using the same}

본 발명은 포스포리보실아미노이미다졸석시노카보스아마이드 신타제(Phosphoribosylimidazolesuccinocarboxamide synthase)를 코딩하는 유전자의 샤인-달가르노 서열(Shine-Dalgarno sequence) 혹은 개시코돈 주변의 코돈 선호도(codon usage)가 변형된 미생물 및 이를 이용한 이노신의 생산방법에 관한 것이다.

이노신은 정미성 조미료로 각광받고 있는 이노신산(5`-inosinic acid)의 화학적 합성 및 효소전이 반응에 의한 합성에 있어서 중요한 기질이며 식품, 의약품 및 각종 의료적 이용 등 다방면에서 이용되고 있다. 이러한 이노신을 생산하기 위하여 종래에는 바실러스(Agric. Biol. Chem., 46, 2347 (1982); 대한민국 등록특허 제27280호) 또는 코리네박테리움 암모니아게네스(Agric. Biol. Chem., 42, 399 (1978)) 등의 미생물을 이용한 직접 발효법이나 5'-이노신산의 열분해법(일본특허 공소 제43-3320호) 등을 이용하였다. 그러나 열분해법의 경우 5'-이노신산을 분해 하는데 대량의 열 소비가 요구되어 실용성이 문제되며, 유전자 재조합 대장균(Biosci Biotechnol Biochem. 2001 Mar;65(3):570-8)을 이용한 직접 발효에 의한 제조방법은 이노신 생산균주의 역가가 낮아 생산원가가 높은 단점이 있다. 또한 기존 이노신 연구는 대장균과 바실러스에 치중되어 있어 더 높은 수율과 농도를 위해 다른 미생물을 이용한 연구도 필요한 실정이다.

따라서 이노신을 고농도/고수율로 생산하기 위한 다양한 방법이 연구되고 있으며, 이들 방법 중의 하나로 배양액 중에 이노신을 고농도로 축적시킬 수 있는 형질 및 균주의 개발이 요구되고 있다.

균주 개발 중 초점을 맞추고 있는 효소 중 하나인 포스포리보실아미노이미다졸석시노카보스아마이드 신타제(Phosphoribosylaminoimidazolesuccinocarboxamide synthase)는 퓨린 뉴클레오타이드를 합성하는 퓨린 대사에서 8번째로 관여하는 효소로, 아데노신 트리포스페이트(adenosine triphosphate; ATP), 엘-아스파테이트(L-Aspartate)와 5-포스포리보실-4-카복시-5-아미노이미다졸((5'-phosphoribosyl)-4-carboxy-5-aminoimidazole; CAIR)가 반응하여 5- 포스포리보실-4-N-석시노카보스아마이드-5-아미노이미다졸((5'-phosphoribosyl)-4-(N-succinocarboxamide)-5-aminoimidazole; SAICAR)로 전환되는데 관여한다. 이 효소는 1959년 최초로 발견되었으며 (The Journal of Biological Chemistry Vol.234,No.7,July 1959) 이후 에세리키아 콜리(Escherichia coli) 에서 purC가 분리되어(Biochemistiry 1992. 31, 5022~5032) 단백질 구조 및 효소 특성에 관한 연 구가 활발히 이루어졌다. E. coli외 다른 일부 미생물에서도 purC 유전자의 서열 및 특성이 일부 보고된 바 있었으며, 본 발명자들에 의해 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)에서 purC 유전자를 재조합 벡터를 이용하여 도입시 5'-이노신산의 생산이 증가한다는 것이 밝혀졌다(한국특허 제10-2007-003766호).

하지만 벡터를 이용한 증폭은 벡터의 안정성이 보장되지 않아 수세대가 지나면서 소멸되기도 한다. 이를 방지하기 위해 항생제의 투입을 요구되기도 하지만, 이는 균주에게는 외부 물질로 인식되어 균주 생존 전반에 영향을 미치기도 한다.

이에 본 발명자는 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 균주로부터 보다 안정적으로 이노신을 고농도로 생산할 수 있는 균주를 개발하던 중, 유전체 상에서 포스포리보실아미노이미다졸석시노카보스아마이드 신타제를 코딩하는 유전자 서열의 샤인-달가르노 서열(Shine-Dalgarno sequence) 혹은 개시코돈 주변 코돈의 코돈 선호도(codon usage)를 변형시켰을 때 이노신이 안정적으로 고농도로 생산된다는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 코리네박테리움(Corynebacterium ) 속 미생물의 포스포리보실아미노이미다졸석시노카보스아마이드 신타제(Phosphoribosylimidazolesuccinocarboxamide syntase)를 코딩하는 유전자의 샤인-달가르노 서열(Shine-Dalgarno sequence) 혹은 개시코돈 주변의 코돈 선호도(codon usage)가 변형된, 고농도로 이노신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 이용하여 이노신을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 하나의 양태로서 포스포리보실아미노이미다졸석시노카보스아마이드 신타제(Phosphoribosylimidazolesuccinocarboxamide syntase)를 코딩하는 유전자(이하 'pur C' 유전자라 함)의 샤인-달가르노 서열(Shine-Dalgarno sequence, 이하 'SD 서열'이라 함) 혹은 개시코돈 주변의 코돈 선호도(codon usage)가 변형된 미생물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 미생물은 이노신을 생산할 수 있는 것으로 알려진 미생물이며, 바람직하게는 코리네박테리움 속 미생물이고, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)로, purC 유전자의 SD 서열 혹은 개시 코돈 주변부의 코돈 선호도(codon usage)가 변형된 미생물이다.

본 발명에서 사용되는 상기 purC 유전자는 상기 효소를 생산하는 미생물로부터 얻을 수 있으며, 바람직하게는 코리네박테리움 암모니아게네스 속 미생물에서 얻을 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예에서는, 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872의 염색체 서열분석을 통하여, purC 유전자 개시코돈 주변부 서열을 확인하였다(서열번호 9).

본 발명의 SD 서열이란 일반적으로 개시코돈 AUG의 6-7 뉴클레오티드 상부(upstream)에 위치하여 리보솜(ribosome)에 mRNA를 도입하여 단백질 합성 개시를 도와주는 것으로, SD 서열을 변형하여 16S rRNA와 mRNA의 복합체 형성이 잘 이루어질 때 번역 개시 효율(Translation initiation efficiency)이 증가된다는 보고(Molecular Microbiology, 2006, 60(2), p.480-492)가 있으며, 이를 바탕으로 본 발명의 purC 유전자의 상단부에 위치한 SD 서열을 퓨린 계열의 뉴클레오타이드로 교체되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 purC 유전자의 상단부에 위치한 SD 서열인 -13~-23 부위(서열번호 1의 285~295 부위)가 GCGCATGCACT 에서 TTT CATG AAGG 으로 바뀐 737bp의 purC 유전자 상단부가 포함된 단편을 얻었다.

또한 개시코돈 주변부의 코돈 선호도(codon usage) 변형 시 mRNA의 2차 구조 변화가 유도되어 유전자의 번역(translation)이 안정적으로 이루어질 수 있다(GENE 2002, Vol.288, p1-8)는 정보를 이용하여, 본 발명의 코리네박테리움(Cornynebacterium) 속 균주의 유전체 상에서 포스포리보실아미노이미다졸석시노 카보스아마이드 신타제를 코딩하는 유전자 서열의 개시코돈 주변 코돈의 코돈 선호도(codon usage)를 변형시키는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 개시코돈 주변의 codon usage가 augCGCCCACAG에서 aug A GCCCACA A 으로 변형된 purC 유전자 상단부가 포함되는 DNA단편, 737bp을 얻었다.

구체적으로, 본 발명에 따른 이노신을 고농도로 생산하는 형질 전환된 코리네박테리움속 미생물은 purC 유전자의 SD 서열 또는 개시코돈 주변의 코돈 선호도(codon usage)를 치환하기 위한 재조합 벡터를 이용하여 코리네박테리움 속 미생물에 형질전환시키는 단계를 포함하여 제조할 수 있다.

본 발명의 SD 서열을 치환하기 위해 이용할 수 있는 벡터는 이에 제한되는 것은 아니나 다음과 같이 제조될 수 있다. 서열번호3 및 서열번호 5를 한쌍으로 하고, 서열번호 4 및 서열번호 6을 한쌍으로 하여 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC6872의 염색체를 주형으로 중합효소 연쇄반응을 수행하여 2개의 PCR 단편을 얻었으며 이 2개의 단편을 섞어 주형으로 이용하고, 서열번호 3 및 서열번호4의 프라이머로 중합 효소 연쇄반응을 수행하여 SD 서열이 변형된 purC 유전자의 상단부 단편을 얻은 후 DNA 제한효소, 예를 들어 XbaI으로 절단하고, 동일한 DNA 제한효소로 절단한 벡터에 DNA T4 리가아제 등을 사용하여 삽입시켜 재조합 벡터를 제조할 수 있다. 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것은 아니며 공지된 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pDZ 벡터(Biotechnology letters vol 13, No.10, p.721-726(1991) 또는 대한민국 특허공고 제92-7401호)를 사용할 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 상기 pDZ 벡터에 SD 서열이 변형된 purC 유전자의 상단부를 삽입시켜 제조한 pDZ-purC-T1 벡터가 바람직하다. 또한 본 발명의 재조합 벡터는 약 310bp의 프로모터 부위와 포스포리보실아미노이미다졸석시노카보스아마이드 신타제를 코딩하는 유전자 일부를 포함할 수 있다.

개시코돈 주변 코돈의 코돈 선호도(codon usage) 변화를 위해 이용한 벡터는 이에 제한되는 것은 아니나 다음과 같이 제작될 수 있다. 서열번호3 및 서열번호7을 한쌍으로 하고 서열번호4 및 서열번호8을 한쌍으로 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC6872의 염색체를 주형으로 중합효소 연쇄반응을 수행하여 2개의 PCR 단편을 얻었으며 이 2개의 단편을 섞어 주형으로 이용하고, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머로 중합 효소 연쇄반응을 수행하여 개시코돈 주변의 서열이 변화된 purC 유전자 상단부 단편을 얻은 후 DNA 제한효소, 예를 들어 XbaI으로 절단하고, 동일한 DNA 제한효소로 절단한 벡터에 DNA T4 리가아제 등을 사용하여 삽입시켜 재조합 벡터를 제조할 수 있다. 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것은 아니며 공지된 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pDZ 벡터(Biotechnology letters vol 13, No.10, p.721-726(1991) 또는 대한민국 특허공고 제92-7401호)를 사용할 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 상기 pDZ 벡터에 개시코돈 주변 아미노산의 코돈 사용(codon usage)이 치환된 purC 유전자의 상단부를 삽입시켜 제조한 pDZ-purC-T2 벡터가 바람직하다. 또한 본 발명의 재조합 벡터는 약 310bp의 프로모터 부위와 포스포리보실아미노이미다졸석시노카보스아마이드 신타제를 코딩하는 유전자 일부를 포함할 수 있다.

상기 SD 서열을 치환하기 위해 이용한 벡터 또는 개시코돈 주변 코돈의 코돈 선호도(codon usage) 변화를 위해 이용한 벡터를 미생물 균주에 도입하는 과정은 당업계에 잘 알려져 있는 임의의 방법이 사용될 수 있다.

구체적 실시예에서, 상기 재조합 벡터, 예를 들어 pDZ-purC-T1 혹은 pDZ-purC-T2를 사용하여 원형 DNA단편을 통상적인 전기천공(electroporation) 방법을 이용하여 미생물 균주(예를 들어, 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) CN04-0027(KCCM-10905, 대한민국 출원공고 제 10-2008-001441 호)에 전달하고, 항생제 카나마이신(kanamycin)와 X-gal을 선별마커로 이용하여 재조합 균주를 선별하였다.

위의 결과로 제작된 SD 서열 변형 재조합 균주를 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CN04-00178로 명명하였으며, 개시코돈 주변부 아미노산의 코돈 사용(codon usage)을 변형시킨 재조합 균주를 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CN04-00179로 명명하였으며 이를 부다페스트 조약 하에 서울 서대문구 홍제1동 소재의 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2008년 9월 22일자로 수탁번호 KCCM-10963P(CN04-0178)호, KCCM-10964P(CN04-0179)호로 기탁하였다.

또 다른 양태로서 본 발명은 상기 purC 유전자의 SD 서열 혹은 개시코돈 주변의 코돈 선호도(codon usage)가 변형된 미생물을 이용한 이노신의 생산방법에 관 한 것이다. 보다 구체적으로 포스포리보실아미노이미다졸석시노카보스아마이드 신타제의 SD 서열 혹은 개시코돈 주변 아미노산의 코돈 선호도(codon usage)가 변형된 코리네박테리움 속 미생물을 배양하고 배양물 중에 이노신을 고농도 및 고수율로 축적, 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양조건은 통상의 코리네박테리움 속 미생물의 배양에 사용되는 배지이면 어느 것이나 사용될 수 있으며, 배양방법도 당업계에 알려진 임의의 배양방법, 예를 들면 회분식, 연속식 및 유가식 배양방법 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 양태로서, 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0178(KCCM10963P), CN04-0179(KCCM10964P) 균주를 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양한다.

이때 탄소원으로는 글루코오스, 프록토오스, 수크로스, 말토스, 만니톨, 소르비톨 같은 탄수화물, 당 알콜, 글리세롤, 피루브산, 락트산 및 시트르산과 같은 알콜 및 유기산, 글루탐산, 메티오닌 및 리신과 같은 아미노산 등이 포함되며, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수찌기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이다. 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄과 같은 무기/유기 암모늄염, 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출 물, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 무기화합물로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양요구성 염기 등이 첨가될 수 있다.

배양은 호기적 조건 하에서, 예를 들면 진탕 배양 또는 통기 교반 배양에 의해, 바람직하게는 20 내지 40℃의 온도, 더욱 바람직하게는 28 내지 37℃의 온도에서 수행된다. 배지의 pH는 배양하는 동안 중성 근처에서 유지하는 것이 바람직하다. 배양은 5 내지 6일 동안 지속하였으며, 직접 발효에 의해 축적된 이노신을 HPLC를 이용하여 통상의 방법으로 분석할 수 있다.

본 발명에 따른 포스포리보실아미노이미다졸석시노카보스아마이드 신타제를 코딩하는 purC 유전자의 SD 서열 혹은 개시코돈 주변의 코돈 선호도(codon usage)가 변이된 미생물은 모균주보다 당 소모속도 및 이노신 생산성이 우수할 뿐만 아니라 발효시간이 단축되어 직접 발효법에 의해 경제적이면서도 높은 생산성으로 이노신을 생산할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 포스포리보실아미노이미다졸석시노카보스아마이드 신타제를 코딩하는 purC 유전자의 SD 서열 혹은 개시코돈 주변의 코돈 선호도(codon usage)가 변형된 미생물은 번역 효율(Translation efficiency)이 높고, 번역 개시 복합 체(Translation initiation complex) 형성이 안정적으로 이루어짐으로써 직접 발효법에 의해 경제적이며 높은 생산성으로 이노신을 생산할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명은 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. purC 유전자의 SD ( Shine - Dalgarno ) sequence 재조합 벡터 클로닝

코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872의 염색체 유전자를 분리하고, 이를 주형으로 하여 서열번호3와 서열번호 5를 한쌍으로 하고 서열번호 4과 서열번호 6을 한쌍으로 중합효소 연쇄반응을 수행하여 각각 약310bp, 약 450bp의 2개의 PCR 단편을 얻었으며 이 2개의 단편을 섞어 주형으로 이용하고 서열번호 3과 서열번호4의 프라이머로 중합 효소 연쇄반응을 수행하여 SD sequence 인 -13~-23 부위가 GCGCATGCACT 에서 TTT CATG AAGG 으로 바뀐 737bp의 purC 유전자 상단부가 포함된 단편을 얻었다. 확보된 DNA 단편은 DNA 제한효소인 XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)으로 절단하고, 동일한 DNA 제한효소로 절단한 후 Alkaline phosphatase, shrimp(Roche Applied Science, Mannheim, Germany) 처리된 pDZ에 DNA T4 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)을 사용하여 삽입시켜 재조합 벡터를 제조하였다. 제조된 벡터는 pDZ-purC-T1으로 명명하였다. 상기 클로닝 과정 및 클로닝된 pDZ-purC-T1 벡터는 도1과 같다.

SD sequence에 변이를 도입하기 위해 사용된 프라이머들의 서열은 각각 다음과 같다.

[서열번호 3] 프라이머 purC-AU

5'-gct cta gag cgg cgg gga aca aga cct act gga-3

[서열번호 4] 프라이머 purC-BL

5'-gct cta gag ctg gct ggg gtg aaa att ggc tct g-3

[서열번호 5] 프라이머 purC-AL-T1

5'-ttc ctt cat gaa acc aca gcg tcc cgc tag-3

[서열번호 6] 프라이머 purC-BU-T1

5'-gtt tca tga agg aac att tag tgc atg-3

실시예 2. purC 유전자의 codon usage 변이 도입용 재조합 벡터 클로닝

코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872의 염색체 유전자를 분리하고, 이를 주형으로 하여 서열번호3과 서열번호 7를 한쌍으로 하고 서열번호 4과 서열번호 8을 한쌍으로 중합효소 연쇄반응을 수행하여 각각 약320bp, 약 430bp의 2개의 PCR 단편을 얻었으며 이 2개의 단편을 섞어 주형으로 이용하고 서열번호 3과 서열번호4의 프라이머로 중합 효소 연쇄반응을 수행하여 개시코돈 주변의 codon usage가 augCGCCCACAG에서 aug A GCCCACA A 으로 변형된 purC 유전자 상단부가 포함되는 DNA단편, 737bp을 얻었다. 확보된 DNA 단편은 DNA 제한효소인 XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)으로 절단하고, 동일한 DNA 제한효소 로 절단한 후 Alkaline phosphatase, shrimp(Roche Applied Science, Mannheim, Germany) 처리된 pDZ에 DNA T4 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)을 사용하여 삽입시켜 재조합 벡터를 제조하였다. 제조된 벡터는 pDZ-purC-T2으로 명명하였다. 상기 클로닝 과정 및 클로닝된 pDZ-purC-T2 벡터는 도2과 같다.

codon usage 변화를 위해 사용된 프라이머들의 서열은 각각 다음과 같다.

[서열번호 3] 프라이머 purC-AU

5'-gct cta gag cgg cgg gga aca aga cct act gga-3

[서열번호 4] 프라이머 purC-BL

5'-gct cta gag ctg gct ggg gtg aaa att ggc tct g-3

[서열번호 7] 프라이머 purC-AL-T2

5'-agt tgt ggg ctc atg cac taa atg tta gtg cat g-3

[서열번호 8] 프라이머 purC-BU-T2

5'-tga gcc cac aac ttt ctg att atc agc-3

실시예3 . 재조합 균주 제작

purC의 상단부 서열 치환을 위해 제작한 pDZ-purC-T1, pDZ-purC-T2를 각각 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0027(KCCM-10905)에 일렉트로포레이션법으로 형질전환한 후 (Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545에 의한 형질전환법 이용), 카나마이신 (kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별 배지에서 염색체상의 동 유전자와 상동성에 의해 삽입된 균주를 선별하였다. 벡터의 성공적인 염색체 삽입 은 X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)을 포함한 고체배지에서 푸른색을 나타내는가 여부를 확인함으로써 가능하였다. 1차 염색체 삽입된 균주를 영양 배지에서 진탕배양 (37, 8시간)한 후, 각각 10^-4부터 10^-10까지의 배수로 희석하여, X-gal을 포함하고 있는 고체배지에 도말하였다. 대부분의 콜로니가 푸른색을 띄는데 반해 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선별함으로써, 2차 교차 (crossover)에 의해 삽입된 염색체상의 벡터 서열이 제거된 균주를 선별하였다. 위의 방법으로 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0027(KCCM10905) 균주의 염색체 상의 purC 유전자의 SD sequence 부위가 서열번호 1과 같이 변형된 균주인 CN04-0178과 purC유전자의 2번째 코돈과 4번째 코돈이 각각 CGC에서 AGC로 CAG에서 CAA로 서열번호 2와 같이 치환된 균주인 CN04-0179을 선별하였다. 이상과 같이 선별된 균주는 최종적으로 항생제 카나마이신에 대한 감수성 여부를 확인 및 PCR을 통한 유전자 서열 분석을 통해 확인하였다.(서열번호 1 및 2)

실시예 4. 삼각 플라스크 발효역가 시험

종배지 3ml를 지름18mm 시험관에 분주하고 가압 살균한 후, 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CN04-0178 (KCCM10963P)과 CN04-0179(KCCM10964P)을 각각 접종하고 37℃ 온도에서 24시간 진탕 배양하여 종 배양액으로 사용하였다. 발효배지 27ml를 250ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 120℃ 온도에서 10분간 가압 살균한 후, 종배양액 1ml을 접종하여 5 내지 6일간 배양하였 다. 상기 종배지 및 발효배지의 조성은 다음과 같다.

배지종류	배지 조성
주1 영양배지	펩톤 1%, 육즙 1%, 염화나트륨 0.25%, 효모 추출물 1%, 아데닌 100mg/L, 구아닌 100mg/L, 한천 2%, pH 7.2
주2 종배지	포도당 5%, 펩톤 0.5%, 육즙 0.5%, 염화나트륨 0.25%, 효모 추출물 1%, 아데닌 100mg/L, 구아닌 100mg/L, pH 7.2
주3 플라스크 발효배지	글루타민산나트륨 0.1%, 암모늄클로라이드 1%, 황산마그네슘 1.2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20mg/L, 황산망간 20mg/L, 황산아연 20mg/L, 황산구리 5mg/L, L-시스테인 23mg/L, 알라닌 24mg/L, 니코틴산 8mg/L, 바이오틴 45ug/L, 티아민염산염 5mg/L, 아데닌 30mg/L, 인산(85%) 1.9%, 포도당 6%, pH 7.2

배양 조건은 회전 수 분당 220회, 온도37℃, pH7.2으로 조절하였다. 이때 배지 내 이노신 축적량을 모균주인 CN04-0027(KCCM10905)과 비교한 결과는 하기 표2과 같으며, 이는 CN04-0178(KCCM10963P), CN04-0179(KCCM10964P) 균주가 동일한 조건하에서 모균주 CN04-0027(KCCM10905) 대비 균체의 당소모 속도가 우수하고, 이노신의 생산성이 더 우수함을 나타낸다.

균주명	당소모량(g/l) (배양 4일후)	Inosine 농도(%) (배양 4일후)
대조군(KCCM-10905)	60	100
CN04-0178(KCCM10963P)	66	109
CN04-0179(KCCM10964P)	60.67	108.3

실시예 5. 30L 발효조에서의 발효역가 실험

실시예 4의 종배지(주2) 100ml를 500ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 가압살균 후, 사용 균주를 접종하고 37에서 18시간 동안 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다. 30L-발효조 종 배지(주4) 12L를 30L 발효조에 넣고 온도 123℃에서 25분간 가압살균하여 종배양액 100ml를 접종한 다음 1일 동안 배양하였다. 회전수는 분당 450회, 온도 28 내지 37℃, pH 7.2로 조절하였다.

또한 발효조 본 배지(주5) 7.3L을 30L 발효조에 넣고 온도 124℃에서 25분간 가압살균하여 발효조 종배양액 1.7L을 접종한 다음, 배양하면서 배양액내에 포도당이 1%가 되었을 때 8차례에 걸쳐 추가당을 최종 당으로 37%가 되도록 첨가하여 5 내지 6일간 배양하였다. 회전수는 분당 450회, 온도 30 내지 35℃, pH 7.2으로 조절하였다. 상기 30L 발효조 종배지의 조성은 다음과 같다.

배지종류	배지 조성
주4 30L 종배지	포도당 6.3%, 효모추출물 1.5%, 인산 0.1%, 수산화칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.1%, 황산암모늄 0.5%, 황산철 20mg/l, 황산아연 10mg/l, 황산망간 10mg/l, L-시스테인 20mg/l, 칼슘판토테네이트 15mg/l, 티아민염산염 5mg/l, 바이오틴 60μg/l, 아데닌 400mg/l, 구아닌 250mg/l (pH 7.2)
주5 30L 발효배지	염화칼슘 100mg/l, 황산구리 6.4mg/l, 황산마그네슘 1.0%, 황산철 20mg/l, 황산아연 20mg/l, 황산망간 60mg/l, L-시스테인 22mg/l, 글루타민산 나트륨 0.1%, 티아민염산염 12.8mg/l, 바이오틴 90μg/l, 니코틴산 12.8mg/l, 알라닌 37.8mg/l, 효모 추출물 0.1%,아데닌 210mg/l, 인산(85%) 1.9%, 수산화칼륨 0.8%, 포도당 37% (pH 7.2)

이때 배지 내 이노신산 축적량을 모균주인 CN04-0027(KCCM-10905)과 비교한 결과는 하기 표4와 같으며, 본 발명에 따른 균주의 경우, 동일한 조건 하에서 발효 시간이 단축되며 이노신 농도가 모균주 대비 우수함을 나타내었다.

균주명	발효 시간 (hr)	이노신 농도(%)
대조군(KCCM10905)	110	100
CN04-0178 (KCCM10963P)	96	128
CN04-0179 (KCCM10964P)	92.5	125

도 1은 포스포리보실아미노이미다졸석시노카보스아마이드 신타제의 샤인-달가르노 서열(Shine-Dargarno sequence)을 치환하는 벡터의 클로닝 과정 및 클로닝된 pDZ-purC-T1 벡터를 나타낸다.

도2는 포스포리보실아미노이미다졸석시노카보스아마이드 신타제의 개시코돈 주변부 코돈 사용(codon usage)를 치환하는 벡터의 클로닝 과정 및 클로닝된 pDZ-purC-T2 벡터를 나타낸다.

<110> CJ cooperation <120> Microorganism containing modified purC gene and process for production method of inosine using the same <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1195 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> purC ORF containing modified SD sequence(Target 1) <400> 1 cggcggggaa caagacctac tggagcgcct tgctgccgat gagcgcctgc ccatgagcaa 60 ggaacagctc gaagaagcac tcgctgacaa gcacgcgttt atcggcgctg ctgaatccca 120 ggtagatgca gttcttagac gcattaagga actcgcggac cagcatccga aggcggccgc 180 ctacacccca ggcgaaatct tgtaaaagac ttcgcggtaa gagtccagaa gaatttcccg 240 aaagcgacgg gagatttctc ccagacacta gcgggacgct gtggtttcat gaaggaacat 300 ttagtgcatg cgcccacagc tttctgatta tcagcacgta tcctccggca aagtccgcga 360 tatctacgaa gtagatgaca acactttgct catggtggtc accgaccgca tctccgccta 420 tgacttcgca ctagagccag ccatccccga taaaggccgg gttcttaccg caaccaccat 480 gttcttcttc gacgccatcg atttcccgaa ccatttggca ggacccatcg atgatgcgcg 540 gattccagaa gaagtattgg gccgagcgat catcgttaag aagctcaaca tgctgccctt 600 tgagtgcgtt gcccgcggtt acctcaccgg ttccggcttg aaggaataca acgctaacgg 660 caccgtgtgc ggcatcgagc tgccagaagg cttggttgag gcgtcgcgtc tgccagagcc 720 aattttcacc ccagccacca aggcagagca gggcgaccac gatgaaaacg tcagcttcga 780 gcgcgtggtg caggaccttg gccaagagcg cgcagagcag cttcgcgatg aaaccctgcg 840 catctactcc gccgccgcca agattgccga agaaaagggc atcatcttgg ctgatacgaa 900 gtttgaattc ggccttgatt ccgaaggcaa tctggtcttg ggcgatgaag tacttacgcc 960 tgattcctcc cggtactggc cagcagacac ctacgcggaa ggcattgtgc agcccagctt 1020 tgacaagcag tacgtgcgca actggttgac ctcggaggaa tccggctggg atgtggagtc 1080 ggaaacccag ccgccagtgc ttcccgatga catcgtcgcc gccacccgcc tgcgctacat 1140 cgaggcttat gagcgcttgt ccggcaagcg tttcatcgac ttcattggcg gttaa 1195 <210> 2 <211> 1195 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> purC ORF containing modified codon usage(Target 2) <400> 2 cggcggggaa caagacctac tggagcgcct tgctgccgat gagcgcctgc ccatgagcaa 60 ggaacagctc gaagaagcac tcgctgacaa gcacgcgttt atcggcgctg ctgaatccca 120 ggtagatgca gttcttagac gcattaagga actcgcggac cagcatccga aggcggccgc 180 ctacacccca ggcgaaatct tgtaaaagac ttcgcggtaa gagtccagaa gaatttcccg 240 aaagcgacgg gagatttctc ccagacacta gcgggacgct gtgggcgcat gcactaacat 300 ttagtgcatg agcccacaac tttctgatta tcagcacgta tcctccggca aagtccgcga 360 tatctacgaa gtagatgaca acactttgct catggtggtc accgaccgca tctccgccta 420 tgacttcgca ctagagccag ccatccccga taaaggccgg gttcttaccg caaccaccat 480 gttcttcttc gacgccatcg atttcccgaa ccatttggca ggacccatcg atgatgcgcg 540 gattccagaa gaagtattgg gccgagcgat catcgttaag aagctcaaca tgctgccctt 600 tgagtgcgtt gcccgcggtt acctcaccgg ttccggcttg aaggaataca acgctaacgg 660 caccgtgtgc ggcatcgagc tgccagaagg cttggttgag gcgtcgcgtc tgccagagcc 720 aattttcacc ccagccacca aggcagagca gggcgaccac gatgaaaacg tcagcttcga 780 gcgcgtggtg caggaccttg gccaagagcg cgcagagcag cttcgcgatg aaaccctgcg 840 catctactcc gccgccgcca agattgccga agaaaagggc atcatcttgg ctgatacgaa 900 gtttgaattc ggccttgatt ccgaaggcaa tctggtcttg ggcgatgaag tacttacgcc 960 tgattcctcc cggtactggc cagcagacac ctacgcggaa ggcattgtgc agcccagctt 1020 tgacaagcag tacgtgcgca actggttgac ctcggaggaa tccggctggg atgtggagtc 1080 ggaaacccag ccgccagtgc ttcccgatga catcgtcgcc gccacccgcc tgcgctacat 1140 cgaggcttat gagcgcttgt ccggcaagcg tttcatcgac ttcattggcg gttaa 1195 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer purC-AU <400> 3 gctctagagc ggcggggaac aagacctact gga 33 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer purC-BL <400> 4 gctctagagc tggctggggt gaaaattggc tctg 34 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer purC-AL-T1 <400> 5 ttccttcatg aaaccacagc gtcccgctag 30 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer purC-BU-T1 <400> 6 gtttcatgaa ggaacattta gtgcatg 27 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer purC-AL-T2 <400> 7 agttgtgggc tcatgcacta aatgttagtg catg 34 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer purC-BU-T2 <400> 8 tgagcccaca actttctgat tatcagc 27 <210> 9 <211> 1195 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <220> <221> gene <222> (1)..(1195) <223> purC gene coding phosphoribosylaminoimidazole-succinocarboxamide synthase <400> 9 cggcggggaa caagacctac tggagcgcct tgctgccgat gagcgcctgc ccatgagcaa 60 ggaacagctc gaagaagcac tcgctgacaa gcacgcgttt atcggcgctg ctgaatccca 120 ggtagatgca gttcttagac gcattaagga actcgcggac cagcatccga aggcggccgc 180 ctacacccca ggcgaaatct tgtaaaagac ttcgcggtaa gagtccagaa gaatttcccg 240 aaagcgacgg gagatttctc ccagacacta gcgggacgct gtgggcgcat gcactaacat 300 ttagtgcatg cgcccacagc tttctgatta tcagcacgta tcctccggca aagtccgcga 360 tatctacgaa gtagatgaca acactttgct catggtggtc accgaccgca tctccgccta 420 tgacttcgca ctagagccag ccatccccga taaaggccgg gttcttaccg caaccaccat 480 gttcttcttc gacgccatcg atttcccgaa ccatttggca ggacccatcg atgatgcgcg 540 gattccagaa gaagtattgg gccgagcgat catcgttaag aagctcaaca tgctgccctt 600 tgagtgcgtt gcccgcggtt acctcaccgg ttccggcttg aaggaataca acgctaacgg 660 caccgtgtgc ggcatcgagc tgccagaagg cttggttgag gcgtcgcgtc tgccagagcc 720 aattttcacc ccagccacca aggcagagca gggcgaccac gatgaaaacg tcagcttcga 780 gcgcgtggtg caggaccttg gccaagagcg cgcagagcag cttcgcgatg aaaccctgcg 840 catctactcc gccgccgcca agattgccga agaaaagggc atcatcttgg ctgatacgaa 900 gtttgaattc ggccttgatt ccgaaggcaa tctggtcttg ggcgatgaag tacttacgcc 960 tgattcctcc cggtactggc cagcagacac ctacgcggaa ggcattgtgc agcccagctt 1020 tgacaagcag tacgtgcgca actggttgac ctcggaggaa tccggctggg atgtggagtc 1080 ggaaacccag ccgccagtgc ttcccgatga catcgtcgcc gccacccgcc tgcgctacat 1140 cgaggcttat gagcgcttgt ccggcaagcg tttcatcgac ttcattggcg gttaa 1195

Claims

포스포리보실아미노이미다졸석시노카보스아마이드 신타제를 암호화하는 purC 유전자의 샤인-달가르노 서열(Shine-Dalgarno sequence) 또는 개시코돈 주변 코돈 선호도(codon usage)가 변형된 코리네박테리움 속 미생물.
제 1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스인 것인 미생물.
제 1항에 있어서, 상기 purC 유전자는 서열번호 9의 서열로 정의되는 것인 미생물.
제 1항에 있어서, 상기 변형된 purC 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열로 정의되는 것인 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0178 (KCCM10963P) 또는 CN04-0179(KCCM10964P)인 것인 코리네박테리움 속 미생물.
purC 유전자의 샤인-달가르노 서열(Shine-Dalgarno Sequence) 또는 개시코돈 주변 코돈 선호도(codon usage)가 변형된 벡터를 이노신을 생산하는 코리네박테리 움 속 미생물에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 제조하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하고, 그 배양액으로부터 이노신을 생산하는 방법.