KR101376669B1

KR101376669B1 - 5’-크산틸산 생성 미생물 및 5’-크산틸산의 제조방법

Info

Publication number: KR101376669B1
Application number: KR1020110122263A
Authority: KR
Inventors: 조영일; 최태열; 한재춘; 박준현; 박동철
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2011-11-22
Filing date: 2011-11-22
Publication date: 2014-03-21
Also published as: KR20130056587A

Abstract

본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) 변이주로부터 5’-크산틸산을 제조하는 방법에 관한 것으로, 아자세린 및 5’-크산틸산 발효액에 대한 내성을 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) 변이주를 제공한다. 본 발명은 아자세린 및 5’-크산틸산 발효액에 대하여 내성을 갖는 균주를 분리함으로써, 5’-크산틸산을 고농도 및 고수율로 생산하는 균주를 제공할 수 있으며, 본 발명의 코리네박테리움 암모니아게네스 DA2011(Corynebacterium ammoniagenes DA2011)은 아자세린 및 5’-크산틸산 발효액에 대한 내성을 가지며, 고농도, 고수율의 5’-크산틸산 생성능을 가지므로, 상기 균주를 이용하여 5’-크산틸산을 제조할 경우 높은 수율로 제조할 수 있고 5’-크산틸산의 제조 원가를 크게 낮출 수 있다.

Description

5’-크산틸산 생성 미생물 및 5’-크산틸산의 제조방법{Microorganisms for Producing 5’-Xanthylic acid and Methods for Preparing 5’-Xanthylic acid}

본 발명은 5’-크산틸산 생성 미생물 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) 변이주 및 이를 이용한 5’-크산틸산 제조 방법에 관한 것이다.

크산틸산은 크산토신 인산에스테르의 뉴클레오티드로서, 이노신산의 NAD에 의한 탈수소에 의해 효소적으로 생성되며, 세균의 샐비지경로에서 크산틴으로부터 합성된다. 2'-, 3'-, 5'-의 3종의 이성체가 있는데 그 중 5'-이성질체(XMP로 약기)만이 푸린뉴클레오티드대사의 증강 생성물로 조직에 존재한다. 단순히 크산틸산이라고 하면 5'-이성질체를 가리킨다. 생체에서는 GMP 생성효소의 작용으로 ATP와 글루타민과 반응하여 GMP를 생성한다.

5’-크산틸산은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 의미를 가질 뿐 아니라 식품, 의약품 및 각종 의료적 용도로 다방면에서 이용되고 있으며, 특히 글루타민산 나트륨과 같이 사용하면 맛의 상승 효과가 커서 정미성 조미료로 각광을 받고 있는 핵산계 조미료 중의 하나이다.

5’-크산틸산은 퓨린 뉴클레오타이드(purine nucleotide) 생합성 대사계의 중간 생성물로 5’-구아닐산(5'-guanylic acid)의 제조 원료로써 중요한 물질이다. 정미성이 강하고 상품적 가치가 높은 5’-구아닐산의 제조방법에는 효모균체에서 추출한 RNA를 리보뉴클레아제 P1에 의하여 가수분해한 후에 필요한 5’-뉴클레오티드를 분리 정제하는 방법[Food Technol., 18, 287 (1964)], 구아노신을 화학적 인산화에 의하여 5’-구아닐산으로 변환시키는 방법[Bulletin of the Chemical Society of Japan, 42, 3505 (1969)], 바실러스 메가테륨(bacillus megaterium)의 변이주를 사용하여 5-아미노-4-이미다졸카르복시아미드리보시드(이하, AICAR로 약기함)를 발효법으로 생산하고, AICAR에서 화학적 합성법에 의하여 뉴클레오티드를 제조하는 방법[biotechnol. Bioeng., 9, 329, (1967), J. Org. Chem., 32, 1825 (1967)], 5’-크산틸산 생산성의 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)의 변이주를 배지에 배양하여 5’-크산틸산을 생성 축적시키고, 이어서 셀프 클로닝에 의하여 XMP(Xanthosine monophosphate) 아미나아제 활성을 강화시킨 대장균을 배양하여 효소원으로 하고, 5’-크산틸산에서 효소반응에 의하여 5’-구아닐산을 제조하는 방법[biosci. Biotech. Biochem., 61, 840 (1997) 일본 공개특허공보 233798/88] 등이 알려져 있다.

현재 널리 이용되고 있는 방법은 미생물 발효법으로써 5’-크산틸산을 생산하고 이를 효소학적으로 5’-구아닐산으로 전환시키는 과정이 가장 경제적이어서 5’-구아닐산의 수요만큼 5’-크산틸산도 필요하다.

종래의 5’-크산틸산 제조 방법은 화학 합성법, 효모 중의 리보핵산을 분해하여 제조된 5’-구아닐산을 탈아미노화하는 제조법, 발효법으로는 발효 배지 내 전구물질로 크산틴(xanthine)을 첨가하는 방법, 미생물 변이주에 의한 제조법, 항생물질 첨가에 의한 제조법(일본특허 소42-1477, 소44-20390) 및 계면활성제 첨가에 의한 제조법(일본특허 소42-3825, 소42-3838) 등이 알려져 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 아자세린 및 5’-크산틸산 발효액에 대하여 내성이 향상되어 5’-크산틸산의 제조에 적합한 미생물 신균주를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 출원인이 보유하고 있는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) DS24를 개량하여 상술한 바람직한 특성을 가지며 5’-크산틸산 생산성이 증가한 변이주를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 아자세린 및 5’-크산틸산 발효액에 대한 내성을 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) 변이주를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 아자세린 및 5’-크산틸산 발효액에 대한 내성이 향상된 코리네박테리움 암모니아게네스 변이주의 제조 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 코리네박테리움 암모니아게네스 변이주를 포함하는 5’-크산틸산 생산용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 5’-크산틸산 제조 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 아자세린(azaserine) 및 5’-크산틸산(xanthylic acid) 발효액에 대한 내성이 향상된 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) 변이주 DA2011(기탁번호 KCTC 12029BP)를 제공한다.

본 발명자들은 아자세린 및 5’-크산틸산 발효액에 대하여 내성이 향상되어 5’-크산틸산의 제조에 적합한 미생물 신균주를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 출원인이 보유하고 있는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) DS24를 개량하여 상술한 바람직한 특성을 가지며 5’-크산틸산 생산성이 증가한 변이주를 개발하였다.

본 발명의 코리네박테리움 암모니아게네스 변이주는 종래의 코리네박테리움 암모니아게네스와 비교하여 아자세린 및 5’-크산틸산 발효액에 대한 내성을 가지며, 5’-크산틸산 생성능을 나타낸다.

본 발명의 코리네박테리움 암모니아게네스 변이주의 아자세린 및 5’-크산틸산 발효액에 대한 내성은 퓨린 계열의 핵산의 전구물질인 PRPP(5-phophoribosyl-α-1-phosphate)로부터 5’-크산틸산을 합성하는데 2분자의 글루타민이 요구됨으로 글루타민의 유사체로 작용하는 아자세린(azaserine)에 대한 내성을 부여하였으며, 미생물 발효법을 통해 5’-크산틸산을 생성할 경우, 발효 산물인 고농도의 5’-크산틸산 및 이온들로 인한 높은 삼투압의 존재로 5’-크산틸산 생성 저해 및 미생물의 생육속도 감소를 개선하기 위해 5’-크산틸산 발효액의 내성을 부여하였다.

본 발명의 명세서에서, 용어 ‘5’-크산틸산 발효액’은 5’-크산틸산 미생물 발효 종료액을 의미한다. 예컨대, 상기 5’-크산틸산 미생물 발효 종료액은 점도 4-7 CP, 비중 1.08-1.11 및 전기전도도 29-34 ms를 갖는 8-15 중량%의 5’-크산틸산을 포함하며, Cl^- 0.03-0.08%(w/v), PO₄ ^- 0.05-1.0%(w/v), SO₄ ² ^- 0.05-0.4%(w/v), Na⁺ 0.3-0.5%(w/v), K⁺ 0.6-0.9%(w/v), Mg² ⁺ 0.1-0.3%(w/v) 및 Ca²⁺ 0.01-0.1%(w/v)를 포함하는 미생물 발효 종료액을 의미한다. 상기 내성을 언급하면서 사용되는 용어 ‘5’-크산틸산 발효액’은 ‘5’-크산틸산’과 혼용될 수 있으며, 요컨대 5’-크산틸산 발효액에 대하여 내성을 갖는다는 의미는 5’-크산틸산에 대하여 내성을 갖는다는 의미와 동일한 의미를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) DA2011는 아자세린 0-100 ㎎/L에서 야생형과 비교하여 월등한 생존율을 나타내며, 80%(v/v) 5’-크산틸산 발효액을 첨가한 배지에서 20% 이상의 생존율 증가를 나타낸다(표 1 및 표 2).

상기 코리네박테리움 암모니아게네스 DS24 균주로부터 변이된 215 주의 변이주 중 야생형과 비교하여 아자세린 및 5’-크산틸산 발효액에 대한 내성이 향상된 DA2011 주를 선별하였다.

상기 코리네박테리움 암모니아게네스 DA2011를 기탁기관 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2011년 10월 5일자로 기탁하고, 기탁번호 KCTC 12029BP를 부여받았다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 아자세린 및 5’-크산틸산 발효액에 대한 내성이 향상된 코리네박테리움 암모니아게네스 변이주의 제조 방법을 제공한다:

(a) NTG(N-methyl-N-nitro-N-nitroguanidine)를 코리네박테리움 암모니아게네스 균주에 처리하여 돌연변이를 유도하는 단계; 및

(b) 상기 돌연변이 균주를 아자세린 및 5’-크산틸산 발효액이 함유된 배지에서 배양하여 야생형보다 아자세린 및 5’-크산틸산 발효액에 대한 내성이 향상된 변이주를 선별하는 단계.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 종래의 코리네박테리움 암모니아게네스에 NTG(N-methyl-N-nitro-N-nitroguanidine)를 처리하여 돌연변이를 유발시키고, 100 ㎎/L 아자세린 및 80%(v/v) 5’-크산틸산 발효액을 포함하는 배양 평판배지에서 코리네박테리움 암모니아게네스 변이주의 단일 군락을 선별함으로써 실시하였다.

바람직하게는, 상기 코리네박테리움 암모니아게네스 변이주는 야생형과 비교하여 아자세린 및 5’-크산틸산 발효액에 대한 내성을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 NTG로 변이 처리된 균주 배지로부터 아자세린 및 5’-크산틸산 발효액에 대한 내성을 갖는 균주를 선별하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 선별된 215 주의 코리네박테리움 암모니아게네스 변이주를 종배지에 진탕배양 하여 종균 배양액을 제조하고, 이를 발효배지로 계대하여 진탕배양 후, 배양액의 5’-크산틸산 농도를 측정하여 가장 높은 5’-크산틸산 생성량을 나타내는 균주를 선별하였다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명자들은 아자세린 및 5’-크산틸산 발효액에 대해 내성을 갖는 5’-크산틸산 생산 코리네박테리움 암모니아게네스 변이주 DA2011의 5’-크산틸산 생산능을 확인하고자 직접 발효법에 의해 50 L 발효조에서 발효 역가 실험을 진행한 결과, 기존의 코리네박테리움 암모니아게네스에 비해 코리네박테리움 암모니아게네스 변이주 DA2011는 약 31% 증가된 5’-크산틸산 생산능을 확인하였다(표 3).

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 코리네박테리움 암모니아게네스 변이주를 포함하는 5’-크산틸산 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 5’-크산틸산 제조 방법을 제공한다:

(a) 상기 본 발명의 코리네박테리움 암모니아게네스 변이주를 탄소원, 에너지원 및 질소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및

(b) 상기 배지에서 5’-크산틸산을 회수하는 단계.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 단계 (a)에서 이용되는 배지는 탄소원 및 질소원을 포함하며, 상기 탄소원은 총 배지에 대하여 5-40 %(w/v)이고, 상기 질소원은 총 배지에 대하여 0.1-10 %(w/v)일 수 있다.

본 발명의 방법에서 이용되는 탄소원은 다양한 탄수화물이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 글루코스, 수크로스, 프럭토스, 갈락토스, 아라비노스 및 락토스이며, 가장 바람직하게는 글루코스이다. 본 발명의 방법에서 이용되는 질소원은 유기 질소원이 이용되며, 바람직하게는 효모 추출물 및 펩톤이며, 가장 바람직하게는 효모 추출물이다.

배양은 탄소원의 일부를 포함하는 배지(제1배지)에서 배양하고, 이어 제1배지 중의 당(탄소원) 함량이 1.0-1.5 중량% 이하로 감소하는 시점에서 나머지 함량의 탄소원을 포함하는 배지(제2배지)를 첨가하여 배양함으로써 수행될 수 있다. 또한, 상기 배양은 아데닌 10-500 ㎎/L, 구아닌 10-500 ㎎/L 또는 아데닌 및 구아닌의 혼합물로 이루어진 첨가배지를 불연속 첨가 또는 연속 첨가 방법으로 제공하는 과정을 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 아자세린 및 5’-크산틸산 발효액에 대하여 내성을 갖는 균주를 분리함으로써, 5’-크산틸산을 고농도 및 고수율로 생산하는 균주를 제공할 수 있다.

(b) 본 발명의 코리네박테리움 암모니아게네스 DA2011(Corynebacterium ammoniagenes DA2011)(KCTC 12029BP)은 아자세린 및 5’-크산틸산 발효액에 대한 내성을 가지며, 고농도, 고수율의 5’-크산틸산 생성능을 가지므로, 상기 균주를 이용하여 5’-크산틸산을 제조할 경우 높은 수율로 제조할 수 있고 5’-크산틸산의 제조 원가를 크게 낮출 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1: 아자세린(azaserine) 및 5’-크산틸산 발효액 내성 균주의 선별

기존 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 DS24(Corynebacterium ammoniagenes DS24)를 24시간 배양한 배양액을 13000× g로 원심분리한 후, 0.05 M TM 완충용액(0.2 M 트리즈마 염기(Trizma base), 0.2 M 말레산(Maleic acid) 및 0.2 M NaOH, pH 6.0)을 동일 부피로 첨가하여 2회 세척하였다. 상기 완충액으로 균체 농도가 10⁶-10⁸균/㎖ 되도록 희석한 후, 200 ㎍/㎖ NTG(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine, Aldrich12,994-1) 용액을 30℃에서 20분 동안 처리하였다. 처리된 균체를 생리 식염수로 2회 수세한 후, 아자세린 100 ㎎/L 및 5’-크산틸산 발효액 80%(v/v)이 첨가된 평판배지(박토트립톤 10 g/L, 효모추출물 5 g/L, 염화나트륨 10 g/L 및 한천 20 g/L)에 도말하여 30℃에서 3일 동안 정치 배양하였다. 단일 군락을 형성하는 균주들을 다시 아자세린 100 ㎎/L 및 5’-크산틸산 발효액 80%(v/v)이 첨가된 평판배지에서 2차례 계대하였다. 상기와 동일하게 처리하여 총 215개의 아자세린 및 5’-크산틸산 발효액 내성을 가진 변이주를 수득하였다. 각각의 변이주를 5’-크산틸산 생산 배양 하였다.

플라스크 종배지(포도당 40 g/L, 참치엑기스 10 g/L, 인산제1칼륨 0.5 g/L, 인산제2칼륨 1 g/L, 황산마그네슘 1 g/L, 요소 1.25 g/L, 황산망간 5 ㎎/L, 황산철 5 ㎎/L, 황산아연 1 ㎎/L, NCA 15 ㎎/L, 티아민염 5 ㎎/L, 바이오틴 50 ㎍/L, 베타알라닌 10 ㎎/L, 시스테인 15 ㎎/L, 염화칼슘 1 g/L, 아데닌 200 ㎎/L 및 구아닌 200 ㎎/L, pH 7.4) 10 ㎖을 100 ㎖ 엘렌마이어(Erlenmeye) 플라스크에 분주하여 각 균주를 접종하고 30℃에서 160 rpm으로 24시간 진탕배양 하여 종균 배양액으로 하였다. 플라스크 발효 배지(포도당 100 g/L, 인산 14 g/L, 수산화칼륨 7.1 g/L, 바이오틴 186 ㎍/L, 시스테인 35 ㎎/L, 베타알라닌 28 ㎎/L, NCA 5 ㎎/L, 티아민염 5 ㎎/L, 히스티딘 10 ㎎/L, 염화칼슘 1 g/L, 황산마그네슘 6 g/L, 황산망간 20 ㎎/L, 황산아연 10 ㎎/L, 황산철 20 ㎎/L, 황산구리 0.7 ㎎/L, 요소 2 g/L, 황산암모늄 2.5g/L, 아데닌 140 ㎎/L 및 구아닌 47 ㎎/L, pH 7.4) 9 ㎖을 100 ㎖ 엘렌마이어 플라스크에 분주하고 미리 준비한 종균 배양액 1 ㎖을 접종하여 30℃에서 180 rpm으로 48시간 동안 진탕 배양하였다. 각 플라스크 배양액의 5’-크산틸산 농도를 측정하여 가장 높은 5’-크산틸산 생성량을 보인 균주를 분리하였으며, 이를 코리네박테리움 암모니아게네스 DA2011 (Corynebacterium ammoniagenes DA2011)로 명명하였다.

실시예 2: 아자세린에 대한 내성도 비교

영양배지(박토트립톤 10 g/L, 효모추출물 5 g/L, 염화나트륨 10 g/L) 10 ㎖을 100 ㎖ 엘렌마이어 플라스크에 분주하여 균주를 접종하고 30℃에서 160 rpm으로 24시간 동안 진탕 배양하여 종균 배양액으로 하였다. 영양배지 50 ㎖에 아자세린을 각각 0, 50, 75 100 ㎎/L 되도록 첨가하여 500 ㎖ 엘렌마이어 플라스크에 분주하고 미리 준비한 종균 배양액 5 ㎖을 접종하여 30℃에서 160 rpm으로 24시간 진탕 배양하였다. 아자세린이 첨가되지 않은 배양액의 생육을 100으로 하여 아자세린이 첨가된 배양액의 생육을 상대 생육도로 나타낸 결과, 코리네박테리움 암모니아게네스 DA2011(KCTC 12029BP)은 기존 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 DS24(Corynebacterium ammoniagenes DS24)에 비해 아자세린에 대한 내성이 현저하게 증가하였다(표 1).

코리네박테리움 암모니아게네스 DA2011를 기탁기관 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2011년 10월 5일자로 기탁하고, 기탁번호 KCTC 12029BP을 부여받았다.

아자세린 (㎎/L)	상대 생육도(%)
아자세린 (㎎/L)	DS24	DA2011
0	100	100
50	40	70
75	15	40
100	2	30

실시예 3: 5’- 크산틸산 발효액에 대한 내성도 비교

영양배지(박토트립톤 10 g/L, 효모추출물 5 g/L, 염화나트륨 10 g/L) 10 ㎖을 100 ㎖ 엘렌마이어 플라스크에 분주하여 균주를 접종하고 30℃에서 160 rpm으로 24시간 동안 진탕배양하여 종균 배양액으로 하였다. 5’-크산틸산 발효액이 0, 80%(v/v) 되도록 첨가한 영양배지 50 ㎖을 각각 500 ㎖ 엘렌마이어 플라스크에 분주하고 미리 준비한 종균 배양액 5 ㎖을 접종하여 30℃에서 160 rpm으로 24시간 동안 진탕 배양하였다. 5’-크산틸산 발효액이 첨가되지 않은 배양액의 생육을 100으로 하고 5’-크산틸산 발효액이 첨가된 배양액의 생육을 상대 생육도로 나타낸 결과, 코리네박테리움 암모니아게네스 DA2011(KCTC 12029BP)은 기존 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 DS24에 비해 5’-크산틸산 발효액에 대한 내성이 증가하였다(표 2).

5’-크산틸산 발효액 %(v/v)	상대 생육도(%)
5’-크산틸산 발효액 %(v/v)	DS24	DA2011
0	100	100
80	72	93

실시예 4: 삼각 플라스크 발효 역가 실험

플라스크 종배지 50 ㎖을 500 ㎖ 엘렌마이어 플라스크에 분주하여 각 균주를 접종하고 30℃에서 160 rpm으로 24시간 동안 진탕배양하여 종균 배양액으로 하였다. 플라스크 발효배지 50 ㎖을 500 ㎖ 엘렌마이어 플라스크에 분주하고 미리 준비한 종균 배양액 5 ㎖을 접종하여 30℃에서 180 rpm으로 72시간 동안 진탕배양 하였다. 배양 완료 후 5’-크산틸산의 배지내 축적량은 기존 균주 코리네박테리움 암모니아게네스 DS24 (Corynebacterium ammoniagenes DS24)이 19.5g/L, 본 발명의 변이주 코리네박테리움 암모니아게네스 DA2011 (Corynebacterium ammoniagenes DA2011)(KCTC 12029BP)가 29% 향상된 25.1 g/L 이었다.

실시예 5: 5 ℓ 발효조에서의 발효 역가 실험

1차 종배지(포도당 40 g/L, 펩톤 10 g/L, 효모추출물 15 g/L, 인산제1칼륨 1 g/L, 인산제2칼륨 1 g/L, 염화나트륨 2.5 g/L, 요소 2 g/L, 아데닌 150 ㎎/L 및 구아닌 150 ㎎/L, pH 7.2) 50 ㎖을 500 ㎖ 엘렌마이어 플라스크에 분주하여 각 균주를 접종하고 30℃에서 160 rpm으로 24시간 동안 진탕배양 하여 1차 종균 배양액으로 하였다. 2차 종배지(포도당 40 g/L, 참치엑기스 10 g/L, 인산제1칼륨 0.5 g/L, 인산제2칼륨 1 g/L, 황산마그네슘 1 g/L, 요소 1.25 g/L, 황산망간 5 ㎎/L, 황산철 5 ㎎/L, 황산아연 1 ㎎/L, NCA 15 ㎎/L, 티아민염 5mg/L, 바이오틴 50 ㎍/L, 베타알라닌 10 ㎎/L, 시스테인 15 ㎎/L, 염화칼슘 1 g/L, 아데닌 200 ㎎/L 및 구아닌 200 ㎎/L, pH 7.4) 200 ㎖를 2 ℓ 플라스크에 넣고 미리 준비한 1차 종균 배양액 4 ㎖을 접종하여 30℃, 160 rpm으로 24시간 배양하여 2차 종균 배양액으로 하였다. 발효조 발효배지(포도당 150 g/L, 인산 14 g/L, 수산화칼륨 7.1 g/L, 바이오틴 186 ㎍/L, 시스테인 35 ㎎/L, 베타알라닌 28 ㎎/L, NCA 5 ㎎/L, 티아민염 5 ㎎/L, 히스티딘 10 ㎎/L, 염화칼슘 1 g/L, 황산마그네슘 6 g/L, 황산망간 20 ㎎/L, 황산아연 10 ㎎/L, 황산철 20 ㎎/L, 황산구리 0.7 ㎎/L, 아데닌 180 ㎎/L, 구아닌 90 ㎎/L, 효모엑기스 1 g/L 및 CSL 9.5g/L, pH 7.4) 1.4ℓ를 5 ℓ 발효조에 넣고 미리 준비한 2차 종균 배양액 140 ㎖을 접종하였다. 교반속도 700 rpm, 온도 33℃ 및 통기량 1.0 vvm의 조건으로 배양하였다. 배지 중 포도당이 10 g/ℓ의 농도로 잔존되는 상태에서 추가배지 1(아데닌 75 ㎎/L 및 구아닌 75 ㎎/L) 100 ㎖를 펌프를 사용하여 2.5 ㎖/hr의 속도로 연속 첨가하고 추가배지 2(포도당 592.2 g/ℓ, 인산 35.7 g/L 및 수산화칼륨 20.5 g/L) 118㎖를 5회 첨가하였으며, 그 결과는 표 3과 같다.

-	5'-크산틸산 농도 (%)
균주	사입당	1차 feeding	2차 feeding	3차 feeding	4차 feeding	5차 feeding
DS24	3.5	4.6	5.7	6.7	7.8	9.1
DA2011	5.1	6.6	7.9	9.0	10.1	11.4

표 3의 결과로부터, 코리네박테리움 암모니아게네스 DA2011(KCTC 12029BP)가 기존 균주 코리네박테리움 암모니아게네스 DS24에 비해 최종적으로 약 25%가 증가된 5’-크산틸산 농도를 보였다.

실시예 6: 50 ℓ 발효조에서의 발효 역가 실험

1차 종배지 50 ㎖을 500 ㎖ 엘렌마이어 플라스크에 분주하여 각 균주를 접종하고 30℃에서 160 rpm으로 24시간 진탕배양 하여 1차 종균 배양액으로 하였다. 2차 종배지 2 ℓ를 5ℓ 발효조에 넣고 미리 준비한 1차 종균 배양액 50 ㎖을 접종하여 온도 30℃,교반속도 600 rpm 및 통기량 1.0 vvm의 조건으로 20시간 동안 배양하여 2차 종균 배양액으로 하였다. 발효조 발효 배지 13 ℓ를 50 ℓ 발효조에 넣고 미리 준비한 2차 종균 배양액 1.3 ℓ를 접종하였다. 교반속도 350 rpm, 33℃, 1.0 vvm의 조건으로 배양하였다. 배지 중 포도당이 10 g/ℓ의 농도로 잔존되는 상태에서 추가배지1(아데닌 75 ㎎/L 및 구아닌 75 ㎎/L) 1 ℓ를 펌프를 사용하여 25 ㎖/hr의 속도로 연속 첨가하고 추가배지 2(포도당 626 g/ℓ, 인산 35.7 g/L, 수산화칼륨 20.5 g/L) 1.18ℓ를 9회 첨가하였으며, 그 결과는 표 4과 같다.

-	5'-크산틸산 농도 (%)
균주	사입당	1차 첨가	2차 첨가	3차 첨가	4차 첨가	5차 첨가	6차 첨가	7차 첨가	8차 첨가	9차 첨가
DS24	3.7	4.9	6.1	7.2	8.3	9.7	10.5	11.2	11.8	12.2
DA2011	5.5	7.1	8.7	10.1	11.4	12.7	13.8	14.9	15.8	16.6

표 4의 결과로부터, 코리네박테리움 암모니아게네스 DA2011(KCTC 12029BP)가 기존 균주 코리네박테리움 암모니아게네스 DS24에 비해 최종적으로 약 36%가 증가된 5’-크산틸산 농도를 보였다

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC12029BP

20111005

Claims

아자세린 및 5’-크산틸산에 대한 내성을 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) 변이주 DA2011(기탁번호 KCTC 12029BP).
다음의 단계를 포함하는 아자세린 및 5’-크산틸산에 대한 내성이 향상된 코리네박테리움 암모니아게네스 변이주의 제조 방법:
(a) NTG(N-methyl-N-nitro-N-nitroguanidine)를 야생형 코리네박테리움 암모니아게네스 균주에 처리하여 돌연변이를 유도하는 단계; 및
(b) 상기 돌연변이 균주를 아자세린 및 5’-크산틸산이 함유된 배지에서 배양하여 야생형보다 아자세린 및 5’-크산틸산에 대한 내성이 향상된 변이주를 선별하는 단계에서, 6.4-12 중량% 5’-크산틸산에서 상기 야생형 코리네박테리움 암모니아게네스와 비교하여 생존율이 20% 이상 증가하는 변이주를 상기 5’-크산틸산에 대한 내성이 향상된 변이주로 선별한다.
상기 제 1 항의 코리네박테리움 암모니아게네스 변이주 DA2011(기탁번호 KCTC 12029BP)를 포함하는 5’-크산틸산 생산용 조성물.
다음의 단계를 포함하는 5’-크산틸산 제조 방법:
(a) 상기 제 1 항의 코리네박테리움 암모니아게네스 변이주 DA2011(기탁번호 KCTC 12029BP)를 탄소원, 에너지원 및 질소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배지에서 5’-크산틸산을 회수하는 단계.