KR20100070218A

KR20100070218A - ５＇－구아닐산 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ５＇－구아닐산의 생산방법

Info

Publication number: KR20100070218A
Application number: KR1020080128846A
Authority: KR
Inventors: 조진만; 김혜원; 오윤석; 박장희
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2008-12-17
Filing date: 2008-12-17
Publication date: 2010-06-25
Also published as: ES2567278T3; EP2358865B1; WO2010071366A3; JP2012511924A; DK2358865T3; EP2358865A4; CN102300982B; US20110250651A1; CN102300982A; WO2010071366A2; JP5543488B2; KR101072720B1; US8530200B2; EP2358865A2

Abstract

본 발명은 ATP 생산능이 증가된 미생물을 이용하여 GMP를 고수율로 생산하는 방법에 관한 것으로서, 말레이트 디하이드로게나아제 활성이 내재적 활성보다 증가됨으로써 ATP 생산능이 향상된 코리네박테리아 속 유래의 미생물, 및 상기 형질전환된 미생물을 배양하는 단계; 상기 배양액으로부터 XMP를 생산하는 단계; 상기 XMP 생산 미생물을 포함하는 배양액에 XMP 아미나아제 활성 효소 또는 미생물을 첨가하는 단계; 및 상기 XMP 아미나아제 활성 효소 또는 미생물을 포함된 배양액으로부터 GMP를 수득하는 단계를 포함하는 GMP의 생산방법에 관한 것이다.

5'-구아닐산, 말레이트 디하이드로게나아제, 형질전환, 코리네박테리움

Description

５＇－구아닐산 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ５＇－구아닐산의 생산방법{A CORYNEBACTERIA HAVING ENHANCED 5'-GUANOSINE MONOPHOSPHATE PRODUCTIVITY AND A METHOD OF PRODUCING 5'-GUANOSINE MONOPHOSPHATE USING THE SAME}

본 발명은 말레이트 디하이드로게나아제 활성이 내재적 활성보다 증가됨으로써 ATP 생산능이 향상된 코리네박테리아 속 유래의 미생물, 및 상기 형질전환된 미생물을 배양하는 단계; 상기 배양액으로부터 XMP를 생산하는 단계; 상기 XMP 생산 미생물을 포함하는 배양액에 XMP 아미나아제 활성 효소 또는 미생물을 첨가하는 단계; 및 상기 XMP 아미나아제 활성 효소 또는 미생물을 포함된 배양액으로부터 GMP를 수득하는 단계를 포함하는 GMP의 생산방법에 관한 것이다.

5'-구아닐산(5'-guanosine monophosphate: 이하 GMP)는 IMP (inosine monophosphate)와 더불어 식품 조미 첨가제로 널리 이용되고 있는 물질이다. GMP는 자체로 버섯 맛을 내는 것으로 알려져 있으나, 주로 모노소디움 글루탐산(MSG)의 풍미를 강화하는 것으로 알려져 있다. 이러한 성질은 특히 IMP과 같이 쓰여졌을 때 강하게 나타난다.

지금까지 알려진 GMP의 제조방법은 (1) 효모세포로부터 추출한 리보핵산(RNA)를 효소학적으로 분해하는 방법, (2) 미생물 발효법으로 5'-GMP를 직접 발효하는 방법, (3) 미생물 발효법으로 생산한 구아노신을 화학적으로 인산화 시키는 방법, (4) 미생물 발효법으로 생산한 구아노신을 효소적 방법으로 인산화 시키는 방법, (5) 미생물 발효법으로 생산한 5’-크산틸산(xanthosine 5’-monophosphate; 이하 XMP라 칭한다)을 코리네형 미생물을 이용하여 GMP로 전환하는 방법, (6) 미생물 발효법으로 생산한 XMP를 XMP 아미네아제 활성을 갖는 에세리키아 콜리를 이용하여 GMP로 전환시키는 방법을 들 수 있다. 이중 (1)의 방법은 원료 수급 및 경제성에 문제가 있으며, (2)의 방법은 GMP의 세포막 투과성의 문제로 인하여 수율이 낮다는 단점이 있어 그 외의 방법이 공업적으로 주로 이용되고 있다.

상기 서술한 방법 중 XMP를 생산하여 GMP로 전환시키는 (6)의 방법을 이용하여 GMP를 생산 할 경우, GMP의 생산과정 중에 조효소로 사용되는 ATP를 지속적으로 공급하는 것이 매우 중요하다. 조효소로 사용되는 ATP 생산의 대부분은 XMP를 생산하는 XMP 생산균주내에서 이루어지며, 전환반응은 세포의 ATP와 XMP에 대한 막투과성을 증가시키는 자이렌과 같은 물질을 배지중에 첨가하여 ATP와 XMP가 GMP 생산균주 내로 잘 유입되도록 한 다음, XMP를 GMP로 전환시킴으로서 수행될 수 있다. 따라서, GMP의 생산수율을 높이기 위해서는 ATP의 생산을 강화하는 전략이 필요하다.

XMP로부터 GMP로 전환하는 화학반응식은 다음과 같다.

XMP + ATP + NH₃ ---------------------> GMP + AMP + PPi

XMP 아미네아제

즉, 1차적으로 XMP를 생산하고, XMP 및 미생물을 포함하는 배양액에 XMP 아미나아제 활성을 가지는 효소 또는 미생물을 첨가하여 2차적으로 전환반응을 진행하여 GMP를 생산하는 공법의 핵심은 전환반응 과정중에 지속적으로 조효소인 ATP를 공급하는 것이며, 따라서 XMP 생산균주의 ATP 생성능을 강화시키는 것이 매우 중요하다고 할 수 있다. 전환반응의 결과로 생성된 AMP는 ATP 생성을 위한 기질로 다시 사용되며, 아데닌 (adenine)계의 핵산 뉴클레오티드는 전환반응계에서 지속적으로 ATP생성을 위해 재생된다.

따라서, 고수율의 GMP 생산을 위해서는 XMP 생산균주의 ATP 생산을 증대하는 것이 필요하고, ATP의 생산증대를 위하여서는 말레이트 디하이드로게나아제의 활성이 강화되어야 한다. 그러나, 상기 효소를 강화시켜 GMP 수율을 향상시킨 미생물에 관한 예 및 그를 이용하여 고수율의 GMP를 생산하는 방법은 개시된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 예의 노력한 결과, GMP 수율을 향상시키기 위하여는 상기 2차적인 전환반응 이전에 XMP를 생산하는 균주의 ATP 생산능을 증가시키는 것이 중요한바, 이를 증가시킬 있는 유전자를 밝히고, 상기 유전자를 포함하는 벡터를 디자인하였다. 또한 상기 벡터로 형질전환된코리네박테리아 속 미생물을 제조한 뒤, 상기 미생물에 전환반응을 부가함으로써 GMP를 고수율로 수득할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 말레이트 디하이드로게나아제 활성이 내재적 활성보다 증가됨으로써 ATP 생산능이 향상된 코리네박테리아 속 유래의 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환된 미생물을 배양하는 단계; 상기 배양액으로부터 XMP를 생산하는 단계; 상기 XMP 생산 미생물을 포함하는 배양액에 XMP 아미나아제 활성 효소 또는 미생물을 첨가하는 단계; 및 상기 XMP 아미나아제 활성 효소 또는 미생물을 포함된 배양액으로부터 GMP를 수득하는 단계를 포함하는 GMP의 생산방법을 제공하는 것이다.

따라서 하나의 양태로서 본 발명은 말레이트 디하이드로게나아제 활성이 내재적 활성보다 증가됨으로써 ATP 생산능이 향상된 코리네박테리아 속 유래의 미생물에 관한 것이다. 본 발명의 말레이트 디하드로게나아제 활성을 내재적 활성보다 증가시킴으로써 ATP 생산능이 향상된 코리네박테리아 속 미생물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "말레이트 디하이드로게나아제 (malate degydrogenase)"란 말산탈수소 효소라고도 하며, 말산 (malate) 에서 수소를 제거하여 옥살로아세트산 (oxaloacetate)을 생성하는 반응을 촉매하는 효소이다. 상기 효소는 자연계에 널리 분포하고 있고, 항상 락트산 탈수소효소에 수반하여 나타나 며 DPN, NAD를 조효소로 필요로 한다. 바람직하게 본 발명은 상기 말레이트 디하이드로게나아제 효소의 활성을 증가시킴으로써 5'-구아닐산의 생산능이 증대된 코리네박테리아 속 유래의 미생물을 수득할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "내재적 활성"이란 본래 미생물이 천연의 상태에서 가지고 있는 효소의 활성 상태를 의미하고, "내재적 활성이 증가"되어 있다는 의미는 천연 상태의 효소 활성과 비교할 때 활성이 더 향상된 것을 의미한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 코리네박테리아 속 미생물에 상기 말레이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 벡터를 사용하여 외부에서 도입함으로써 그 내재적 활성보다 현저히 증가된 형질전환된 미생물을 생산하였다.

본 발명의 "코리네박테리아 속 미생물"은 당업계에서 사용되는 코리네박테리아 속 미생물이면 어느 것이나 제한 없이 사용될 수 있다. 바람직하게는 코리네박테리아 암모니아게네스, 코리에박테리움 글루타미쿰, 브레비박테리움 플라부므, 브레비박테리움 락토메르멘툼 등이 사용될 수 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용될 수 있는 코리네박테리아 속 미생물의 종류가 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 코리네박테리아 속 미생물에는, 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC6872, 코리네박테리움 써모아미노게네스 (thermoaminogenes) FERM BP-1539, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 (Corynebacterium glutamicum ATCC 13032), 코리네박테리움 글루타미쿰 R, 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼 (lactofermentum) ATCC 13869 및 이들로 부터 제조된 균주를 포함한다. 바람직하게는 코리네박테리아 암모니아게네스 KCCM-10530로부터 형질전환된 코리네박테리움 암모니아게네스 KCJ-1304일 수 있다.

본 발명의 ATP 생산능이 향상된 미생물을 제조하기 위하여, 바람직하게는 mqo 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "mqo 유전자"란 "malate:quinone oxidoreductase"의 약자로서 상기 유전자는 말레이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 말레이트 (malate)를 옥살로아세테이트 (oxaloacetate)로 산화시키는 효소이다.

본 발명에서 사용되는 재조합 벡터는 mqo 유전자를 포함할 수 있는 벡터라면 당업계에서 통상적으로 사용되는 벡터를 제한 없이 사용할 수 있는데, 바람직하게 상기 벡터는 pDZ-mqo일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 pDZ에 서열번호 7을 포함하는 mqo 유전자를 도입함으로서 pDZ-mqo 벡터를 제조하였다(도 1 참조).

본 발명에 의해 활성이 증가되는 효소인 말레이트 디하이드로게나아제는 코리네 박테리아의 mqo 유전자에 의해 암호화 될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화 될 수 있다. 상기 증가된 효소의 활성은 유전자 카피 수의 증가, 감소, 프로모터 교체 또는 변형 및 돌연변이에 의한 효소 활성의 증가 등 당업계에 알려진 방법이 제한 없이 사용된 결과에 의해 효소 활성이 증가될 수 있으며, 상기 예들에 의해 효소 활성 증가 방법이 제한되는 것은 아니다.

유전자 카피 수의 증가는, 외래 유전자의 도입에 의한 카피 수의 증가 뿐만 아니라, 내재적 유전자의 증폭에 의한 것도 포함된다. 내재적 유전자의 증폭은 당업계에 알려진 방법, 예를 들면 적당한 선택 압력 하에서 배양하는 방법 등에 의해 용이하게 이루어질 수 있으며, 상기 예에 의해 내재적 유전자 증폭 방법이 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 전달할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 숙주의 염색체 내로 재조합 가능하게 하도록 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 바람직하게 본 발명의 mqo 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 도 1의 개열지도를 포함하는 재조합 벡터일 수 있으며, 상기 도 1의 개열지도를 갖는 벡터는 코리네형 박테리아에 순차적으로 또는 동시에 도입된 것일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 형질전환의 방법으로 상기 벡터를 코리네박테리움 암모니아게네스 KCCM-10530에 도입한 후, 선택 배지에 배양하여 2 카피의 mqo 유전자를 내재적 유전자의 자리에 상동 재조합 방법에 의해 치환시킴으로써, 2 카피를 갖는 mqo 유전자가 염색체 내에 삽입되도록 제조하였다. 그 결과 코리네박테리움 암모니아게네스의 형질전환으로 암모니아게네스 KCJ-1304인 신규한 형질전환된 미생물을 수득하였으며, 이를 수탁번호 KCCM10972P로 기탁하였다.

또한 본 발명은 mqo 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 코리네박테리 아 속 유래의 형질전환된 미생물을 제공할 수 있다. 본 발명의 형질전환된 미생물은 코리네박테리아 유래의 mqo 유전자를 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 제한없이 사용하여, 형질전환된 미생물을 제조할 수 있다. mqo 유전자는 벡터에 클로닝 되어 세포에 형질전환되는 것이 바람직하다.

형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. "형질전환"이란 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 일반적으로 형질전환방법에는 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 방법에 DMSO (dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다. 본 발명의 pDZ-mqp를 형질전환 시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 방법이 제한없이 사용될 수 있다.

코리네박테리움 암모니아게네스에 도 1의 개열지도를 갖는 벡터 pDZ-mqo가 도입된 수탁번호 KCCM10972P 균주는, 이를 선택 배지에 배양함으로써 2개 카피의 mqo 유전자가 내재적 유전자를 상동 재조합에 의해 치환됨으로써 2 카피의 mqo 유 전자가 염색체 내에 삽입되어 있는 균주이다.

또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 말레이트 디하이드로게나아제 활성이 내재적 활성보다 증가됨으로써 ATP 생산능이 향상된, XMP를 GMP로 전환시키는 코리네박테리아 속 유래의 미생물을 배양하는 단계; 상기 배양액으로부터 XMP를 생산하는 단계; 상기 XMP 생산 미생물을 포함하는 배양액에 XMP 아미나아제 활성 효소 또는 미생물을 첨가하는 단계; 및 상기 XMP 아미나아제 활성 효소 또는 미생물을 포함된 배양액으로부터 GMP를 수득하는 단계를 포함하는 GMP의 생산방법에 에 관한 것이다. 본 발명은 상기 기술된 형질전환된 미생물을 이용하여 XMP를 생산하는 한편, 생산된 XMP를 포함하는 미생물에 XMP 아미나아제 활성 효소 또는 미생물을 부가함으로써 2차적인 전환반응을 진행시켜 고수율로 5'-구아닐산 (5'-xanthosine monophosphate, 5'-GMP)을 수득할 수 있다. 바람직하게 상기 말레이트 디하이드로게나아제 활성이 내재적 활성보다 증가된 코리네박테이라 속 유래의 미생물은 상기 서술된 형질전환된 미생물일 수 있다.

본 발명에서 XMP 배양에 사용되는 배지는, 당업계에서 통상적으로 사용되는 배지가 제한없이 사용될 수 있다. 바람직하게 배지는 포도당을 탄소원으로 사용하고, 그 외의 적정량의 탄소원은 다양하게 이용될 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리아 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있는데 (예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한 배양 중에 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체 의 주입 없이 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 원하는 5'-구아닐산의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성할 수 있다.

본 발명에서 XMP 아미네아제 활성을 갖는 에세리키아 콜리 (Escherichia Coli, E.coli)를 배양하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 E.coli의 배양방법을 제한 없이 사용할 수 있다. 바람직하게 상기 배양에 사용되는 탄소원으로는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄과 같은 각종 무기질소원 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크, 또는 그의 분해생성물등 유기질소원이 사용될 수 있다. 무기화합물로는 인산 1수소칼륨, 인산2수소칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양요구성 염기등이 첨가될 수 있다. 배양은 호기적 조건하에서 예를 들면, 진탕배양 또는 통기교반 배양에 의해, 바람직하게는 30 ~ 40℃의 온도에서 수행될 수 있다. 배지의 pH는 배양하는 동안 중성 근처에서 유지하는 것이 바람직하며, 배양은 1 ~ 2일 동안 수행할 수 있으며, 상기 배양에 의하여 배지중에 XMP 아미나아제의 활성이 포함된 배양물이 축적될 수 있다.

본 발명에 있어서, GMP는 상기 배양에 의해 XMP가 생산된 배양액을 XMP 아미 나아제 활성을 갖는 에세리키아 콜리 배양액에 첨가하여 XMP를 GMP로 전환시킴으로서 제조될 수 있다. GMP로의 전환과정은 자이렌과 같은 세포의 XMP에 대한 막투과성을 증가시키는 물질을 배지중에 첨가하여 XMP가 GMP 생산균주 내로 잘 유입되도록 한 다음, XMP를 GMP로 전환시킴으로서 수행될 수 있다. 상기 막투과성을 증가시키는 물질은 당업계에 잘 알려져 있으며, 바람직하게는 자이렌과 같은 소수성 물질 (예, 톨루엔, 벤젠, 에틸 아세테이트), 계면활성제 (예, 폴리옥시에틸렌스테아릴아민, 세틸트리메틸암모니움 브로마이드, Cation FB, Cation F2-40E 등의 양이온성 계면활성제, 나트륨 올레일아미드 황산, 뉴레크스 TAB 및 라비졸80등의 음이온성 계면활성제), 금속이온 (예, 칼슘, 마그네슘 이온)등이 이용될 수 있으나 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기한 세포막의 투과성을 증진시키는 물질의 사용량은 선택되는 물질에 따라 달라질 수 있으며, 당업자라면 적절하게 조절하여 사용할 수 있다.

5'-구아닐산은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다. 본 발명의 5'-구아닐산을 생산하는 방법은, 세포 또는 배양 배지로부터 5'-구아닐산을 회수하는 단계를 포함한다. 세포 또는 배양 배지로부터 5'-구아닐산을 회수하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 상기 5'-구아닐산 회수 방법에는, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어 "5'-구아닐산"이란 구아노신과 인산이 결합한 뉴클레오티드의 하나로서 핵산을 구성하며 그 위치에 따라 5'-체, 3'-체 및 2'-체의 3 종류로 나뉜다. 본 발명에서 생산되는 5'-구아닐산은 무색의 침상결정으로, 생체 내에 유리상태로 존재한다. 분자식은 C₁₀H₁₄N₅O₈P이며, 나트륨염에는 표고의 맛이 있어 화학 조미료로 사용되는 물질이다. GMP는 송이버섯 맛을 내며, 정미성 조미료로 각광을 받고 있는, 핵산계 조미료 중의 하나이다. 바람직하게 본 발명은 형질전환된 미생물을 이용하여 이러한 5'-구아닐산을 고수율로 얻을 수 있는 방법을 밝혀내었으며, 종전의 미생물을 이용한 방법보다 GMP의 농도가 약 8.5%가 증가됨을 확인하였다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 코리네박테리아 속 유래의 형질전환된 미생물을 이용하면, 말레이트 디하이드로게나아제의 증대된 활성으로 인하여 ATP 생산능이 증가하고, 이를 바탕으로 GMP 전환반응을 실시하는 경우, 기존의 5'-구아닐산 생산 미생물에 비해 현저하게 높은 수득률로 5'-구아닐산을 생산할 수 있다. 따라서 본 발명의 미생물을 사용하면 고효율로 5'-구아닐산을 수득할 수 있다.

실시예 1: XMP 생산균주 코리네박테리움 암모니아게네스 KCCM-10530 유래 mqo 클로닝 및 염색체 삽입용 재조합벡터 (pDZ-mqo) 제작

본 실시예에서는 NIH GenBank를 근거로 하여 mqo 유전자의 염기서열 정보 (NCBI ID _ 3345228)를 확보하고, 이에 근거하여 두 쌍의 프라이머 (서열번호 1 내지 4)를 합성하였다.

코리네박테리움 KCCM-10530 를 주형으로 하고, 상기 서열번호 1 내지 4의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra™ 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (stratagene)이고, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 68℃, 2분을 25회 반복하였다. 그 결과 2.1kb의 mqo 유전자 두쌍 (mqo-A, mqo-B)을 얻었다. mqo-A는 서열번호 1과 2를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, mqo-B는 서열번호 3과 4를 프라이머로 하여 증폭된 것이다.

서열 번호 1 gctctagaATCGGTCATTCCATGAACCC

서열 번호 2 cgcggatccCATCGATATCGCCAACTCCA

서열 번호 3 cgcggatccATCGGTCATTCCATGAACCC

서열 번호 4 gctctagaCATCGATATCGCCAACTCCA

상기 증폭산물 mqo-A, mqo-B의 각 말단에 포함된 제한효소 (mqo-A: XbaI + BamHI, mqo-B: BamHI + XbaI)를 처리하고, 다음으로 제한효소 XbaI과 shrimp alkaline phosphotase가 처리된 pDZ 벡터(특허출원 제 10-2007-94433호에 기술된 삽입방법 참고)에 3조각 접합을 통하여, 최종적으로 mqo 2 카피가 연속적으로 클로닝된 pDZ-mqo 재조합 벡터를 얻었다. 도 1은 코리네박테리움 염색체 삽입용 pDZ-mqo를 나타내는 도면이다.

실시예 2: mqo 삽입 균주 개발

제작된 pDZ-mqo벡터를 KCCM-10530 균주에 형질 전환하고, 실시예 1에서 기술한 것과 같이 2차 재조합 과정을 거쳐 염색체 상에서 mqo 유전자의 바로 옆에 1 카피의 mqo 유전자를 추가로 삽입하여 카피 수를 2개로 증가시킨 XMP 생산균주 코리네박테리움 암모니아게네스 KCJ-1304를 얻었다. 연속적으로 삽입된 mqo 유전자는 2 카피의 mqo의 upstream과 downstream 염기서열 부위를 증폭할 수 있는 프라이머 (서열 5, 6)을 이용한 PCR로 최종 확인하였다.

서열 번호 5 CTTTTCGATGACGCCCAA

서열 번호 6 CCACTTTATCGGGTGAGACCA

실시예 3: mqo 삽입균주의 말레이트 디하이드로게나아제 활성

실시예 2에서 최종적으로 제작된 XMP 생산균주인 코리네박테리아 암모니아게 네스 KCJ-1304의 말레이트 디하이드로게나이제 활성 확인을 위해 아래와 같은 방법으로 효소활성을 측정하였다. 박토펩톤 10g/ℓ, 박토 쇠고기 추출물 (beef extract) 5g/ℓ, 박토 효모 추출물 (yeast extract) 5g/ℓ, NaCl 2.5g/ℓ, 아데닌 50 ㎎/ℓ, 구아닌 50 ㎎/ℓ 배지에 균주를 접종하고, 30℃에서 12시간 동안 OD 10이 되도록 배양하였다. 배양 후 10 ㎖의 세포를 배양액에서 회수하여 50mM Hepes, 10mM 아세트산 칼륨 (potassium acetate), 10mM CaCl₂, 10mM MgCl₂ 버퍼에 2번 세척하여 동일한 버퍼 1ml에 풀어주었다. 세포 분쇄기(sonicator)를 이용하여 세포를 파괴한 후, 원심분리기를 이용하여 상등액을 분리하였다. 분리된 상등액을 다시 원심분리하여 펠렛 (pellet)만을 취하여 100 ㎕ 버퍼에 녹였다. 이 중 10 ㎕를 효소액으로 사용하였다. 반응액은 50mM Hepes, 10mM 아세트산 칼륨 (potassium acetate), 50 μM 2,6-디클로로인돌페놀 (2,6-dichloroindolphenol, Cl₂Ind)의 혼합물 (mixture)를 만든다. Cl₂Ind는 얼려두었다가 반응 직전에 섞어주었다. 만들어 놓은 반응 mixture 980 ㎕에 기질 (substrate)인 100mM 말레이트 (malate) 10 ㎕, 효소액 10 ㎕를 첨가하여 30℃에서 15분 동안 섞어(shaking) 반응시켰다. 반응 후 효소의 활성은 환원된 Cl₂Ind의 농도로 확인할 수 있다. Cl₂Ind의 600nm에서 흡수 계수 (absorption coefficient)는 22 cm^-1mM^-1이다.

균주명	KCCM-10530	KCJ-1304
환원된 CL2Ind (μM)	15.45	20.17

상기 표 1 에서 나타낸 바와 같이, KCJ-1304는 모균주 KCCM-10530에 비하여 말레이트 디하이드로게나아제 효소활성이 30.6% 증가 되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 4: mqo 삽입 균주의 ATP 농도측정

실시예 2에서 최종적으로 제작된 XMP 생산 균주인 코리네박테리아 암모니아게네스 KCJ-1304의 세포내 ATP 농도측정을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다.

하기 종 배지 3ml을 함유하는 14ml tube에 코리네박테리움 암모니아게네스 모균주 KCCM-10530와 변이주 KCJ-1304를 접종하고 30℃에서 20시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 종 배지 25ml을 포함하고 있는 250 ml 코너-바플 플라스크에 0.4 ml의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 20 시간 동안 230 rpm으로 진탕 배양하였으며, 배양이 완료된 후에 배양액의 최종 세포 OD와 세포내 ATP 농도를 측정하였다. 상기 실험 수행의 결과, 모균주인 KCCM-10530에 비하여 본 발명의 변이주인 KCJ-1304가 단위 OD당 생성된 ATP 농도가 높음을 확인 할 수 있었으며, 이는 결과적으로 기존 균주 대비 GMP 생성 수율이 높아질 가능성을 시사한다. 결과는 표 2에 나타내었다.

균주명	OD (A562)	ATP 농도 (μM)	단위OD당 ATP 생성 (ATP 농도/OD)
KCCM-10530	20.76	32.92	1.59
KCJ-1304	21.44	69.74	3.25

상기 표 2 에서 나타낸 바와 같이, KCJ-1304는 모균주 KCCM-10530에 비하여 단위 OD당 생성된 ATP 농도가 약 104% 증가 되었음을 확인 할 수 있었다.

실시예 5: mqo 삽입 균주의 XMP 발효 및 GMP 생산

실시예 2에서 최종적으로 제작된 XMP 생산균주인 코리네박테리아 암모니아게네스 KCJ-1304를 GMP 생산을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다.

하기 종 배지 3ml을 함유하는 14ml tube에 코리네박테리움 암모니아게네스 모균주 KCCM-10530와 변이주 KCJ-1304를 접종하고 30℃에서 20시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 생산배지 32 ml (본배지 24ml + 별살배지 8ml)을 포함하고 있는 250 ml 코너-바플 플라스크에 0.4 ml의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 96 시간

동안 230 rpm으로 진탕 배양하였다. 생성된 XMP를 GMP전환 반응을 수행하기 위하여 삼각플라스크 발효액에 하기의 전환 반응 첨가물과 대장균의 XMP aminase를 첨가하여 40℃ 에서 4시간 동안 전환반응을 수행하였다. 상기 실험 수행의 결과, 모균주인 KCCM-10530에 비하여 본 발명의 변이주인 KCJ-1304가 XMP 소모량 대비 GMP의 생성 량을 의미하는 전환율이 향상된 것을 확인 할 수 있었다. 결과적으로 기존 균주 대비 GMP생성 수율이 높아진 균주를 획득할 수 있었다. 결과는 표 3에 나타내었다.

균주명	농도 (g/ℓ)		전환율 (%) (GMP생성량/XMP소모량)
균주명	XMP	GMP	전환율 (%) (GMP생성량/XMP소모량)
KCCM-10530	28.6	21.2	74.1
KCJ-1304	30.3	23.0	75.9

상기 표 3 에서 나타낸 바와 같이, KCJ-1304는 모균주 KCCM-10530에 비하여 전환율이 2.4 %, GMP 농도가 8.5% 증가 되었음을 확인 할 수 있었다.

종배지: 포도당 30g/ℓ, 펩톤 15g/ℓ, 효모엑기스 15g/ℓ, 염화나트륨 2.5g/ℓ, 우레아 3g/ℓ, 아데닌 150 ㎎/ℓ, 구아닌 150 ㎎/ℓ, pH 7.2

생산배지 (본배지): 포도당 80g/ℓ, 황산마그네슘 10g/ℓ, 황산철 20 ㎎/ℓ, 황산아연 10 ㎎/ℓ, 황산망간 10 ㎎/ℓ, 아데닌 30 ㎎/ℓ, 구아닌 30 ㎎/ℓ, 비오틴 100 ㎍/ℓ, 황산구리 1 ㎎/ℓ, 티아민염산염 5 ㎎/ℓ, 염화칼슘 10 ㎎/ℓ, pH 7.2

생산배지 (별살배지): 인산제1칼륨 10g/ℓ, 인산제2칼륨 10g/ℓ, 우레아 7g/ℓ, 황산암모늄 5g/ℓ

전환반응 첨가물: 피틱산(phytic acid) 1.8g/ℓ, MgSO4 4.8g/ℓ, 니민(nymeen) 3㎖/ℓ, 자이렌(xylene) 2%, 아데닌 100mg/ℓ, Na2HPO4 7.7g/ℓ, 글루코스 46g/ℓ.

도 1은 pDZ 벡터에 mqo 유전자를 클로닝한 pDZ-mqo 벡터 구조를 나타낸다.

<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION <120> A CORYNEBACTERIA HAVING ENHANCED 5'-GUANOSINE MONOPHOSPHATE PRODUCTIVITY AND A METHOD OF PRODUCING 5'-GUANOSINE MONOPHOSPHATE USING THE SAME <130> PA080570/KR <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for mqo-A <400> 1 gctctagaat cggtcattcc atgaaccc 28 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for mqo-A <400> 2 cgcggatccc atcgatatcg ccaactcca 29 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for mqo-B <400> 3 cgcggatcca tcggtcattc catgaaccc 29 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for mqo-B <400> 4 gctctagaca tcgatatcgc caactcca 28 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for detecting mqo <400> 5 cttttcgatg acgcccaa 18 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for detecting mqo <400> 6 ccactttatc gggtgagacc a 21 <210> 7 <211> 1503 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 7 atgtcagatt ccccgaagaa cgcaccgagg attaccgatg aggcagatgt agttctcatt 60 ggtgccggta tcatgagctc cacgctgggt gcaatgctgc gtcagctgga gccaagctgg 120 actcagatcg tcttcgagcg tttggatgga ccggcacaag agtcgtcctc cccgtggaac 180 aatgcaggaa ccggccactc tgctctatgc gagctgaact acaccccaga ggttaagggc 240 aaggttgaaa ttgccaaggc tgtaggaatc aacgagaagt tccaggtttc ccgtcagttc 300 tggtctcacc tcgttgaaga gggagtgctg tctgatccta aggaattcat caaccctgtt 360 cctcacgtat ctttcggcca gggcgcagat caggttgcat acatcaaggc tcgctacgaa 420 gctttgaagg atcacccact cttccagggc atgacctacg ctgacgatga agctaccttc 480 accgagaagc tgcctttgat ggcaaagggc cgtgacttct ctgatccagt agcaatctct 540 tggatcgatg aaggcaccga catcaactac ggtgctcaga ccaagcagta cctggatgca 600 gctgaagttg aaggcactga aatccgctat ggccacgaag tcaagagcat caaggctgat 660 ggcgcaaagt ggatcgtgac cgtcaagaac gtacacactg gcgacaccaa gaccatcaag 720 gcaaacttcg tgttcgtcgg cgcaggcgga tacgcactgg atctgcttcg cagcgcaggc 780 atcccacagg tcaagggctt cgctggattc ccagtatccg gcctgtggct tcgttgcacc 840 aacgaggaac tgatcgagca gcacgcagcc aaggtatatg gcaaggcatc tgttggcgct 900 cctccaatgt ctgttcctca ccttgacacc cgcgttatcg agggtgaaaa gggtctgctc 960 tttggacctt acggtggctg gacccctaag ttcttgaagg aaggctccta cctggacctg 1020 ttcaagtcca tccgcccaga caacattcct tcctaccttg gcgttgctgc tcaggaattt 1080 gatctgacca agtaccttgt cactgaagtt ctcaaggacc aggacaagcg tatggatgct 1140 cttcgcgagt acatgccaga ggcacaaaac ggcgattggg agaccatcgt tgccggacag 1200 cgtgttcagg ttattaagcc tgcaggattc cctaagttcg gttccctgga attcggcacc 1260 accttgatca acaactccga aggcaccatc gccggattgc tcggtgcttc ccctggagca 1320 tccatcgcac cttccgcaat gatcgagctg cttgagcgtt gcttcggtga ccgcatgatc 1380 gagtggggcg acaagctgaa ggacatgatc ccttcctacg gcaagaagct tgcttccgag 1440 ccagcactgt ttgagcagca gtgggcacgc acccagaaga ccctgaagct tgaggaagcc 1500 taa 1503

Claims

말레이트 디하이드로게나아제 활성이 내재적 활성보다 증가됨으로써 ATP 생산능이 향상된, XMP를 GMP로 전환시키는 코리네박테리아 속 유래의 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네형 박테리아의 mqo 유전자의 발현량 증가에 의해 말레이트 디하이드로게나아제의 활성이 증가된 것을 특징으로 하는 코리네박테리아 속 유래의 미생물.
제2항의 mqo 유전자의 발현량 증가는 도 1의 개열지도로 표현되는 벡터가 숙주 세포에 도입됨으로써 증가된 것을 특징으로하는 코리네박테리아 속 유래의 형질전환된 미생물.
제3항에 있어서, 상기 형질전환된 미생물은 수탁번호 제KCCM10972P호인 코리네박테리아 속 유래의 형질전환된 미생물.
제1항의 코리네박테리아 속 유래의 미생물을 배양하는 단계;

상기 배양액으로부터 XMP를 생산하는 단계;

상기 XMP 생산 미생물을 포함하는 배양액에 XMP 아미나아제 활성 효소 또는 미생물을 첨가하는 단계; 및

상기 XMP 아미나아제 활성 효소 또는 미생물을 포함된 배양액으로부터 GMP를 수득하는 단계를 포함하는 GMP의 생산방법.