KR100789274B1 - 코리네박테리움 글루타미쿰에서 유래한 신규한 프로모터핵산 분자, 그 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 그재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 그 숙주 세포를이용하여 유전자를 발현하는 방법 - Google Patents

코리네박테리움 글루타미쿰에서 유래한 신규한 프로모터핵산 분자, 그 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 그재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 그 숙주 세포를이용하여 유전자를 발현하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰에서 유래된 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 구성된 신규한 프로모터 핵산 분자, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포 및 상기 숙주 세포를 이용하여 유전자를 발현하는 방법에 관한 것이다.
프로모터, 코리네박테리움 글루타미쿰, 라이신

Description

코리네박테리움 글루타미쿰에서 유래한 신규한 프로모터 핵산 분자, 그 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 그 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 그 숙주 세포를 이용하여 유전자를 발현하는 방법{Novel promoter nucleic acid molecule derived from Corynebacterium glutamicum, recombinant vector comprising the promoter, host cell comprising the recombinant vector and method of expressing a gene using the host cell}
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 프로모터 탐색 벡터의 제작 방법을 나타낸 모식도이다.
본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에서 유래한 신규한 프로모터 핵산 분자, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포 및 상기 숙주 세포를 이용하여 목적 유전자를 발현하는 방법에 관한 것이다.
코리네형 세균은 L-라이신, L-쓰레오닌 및 각종 핵산을 포함한 사료, 의약품 및 식품 등의 분야에서 다양한 용도를 갖는 화학물질을 생산하는 산업용 미생물이 다. 이와 같은 코리네형 세균을 유전공학적, 대사공학적 기술을 이용하여 고역가 균주로 개발하기 위해서는 코리네형 세균 내에서 여러 가지 대사과정에 관련된 유전자의 발현을 선택적으로 조절할 수 있어야 하는데, 이를 위해서 유용한 프로모터 서열이 필수적이라 할 수 있다.
종래에 프로모터를 분리하기 위한 방법에는 (1) 게놈성 DNA 단편을 클로닝된 단편이 프로모터 활성을 포함하는 경우에만 발현되는 리포터 유전자의 전방에 무작위로 클로닝시키는 프로모터 프로브 벡터의 이용법, (2) 유전자 특이적 프로브에 기초한 혼성화를 이용하여 유전자 라이브러리로부터 유전자 및 이의 프로모터의 분리법, (3) 유도성 cDNA 프로브 및 비유도성 cDNA 프로브를 사용한 유전자 뱅크의 차별 하이브리드화법 등이 있었다.
코리네형 세균에서 유전자를 발현시키기 위해서는, 일반적으로 자체 유전자들이 원래 갖고 있던 프로모터를 사용하는 것이 일반적이었다(Vasicova, P., et al., J. Bacteriol., 181, 6188-6191, (1999) 등). 한편, 코리네형 세균에서의 유전자 발현을 위한 프로모터 서열은 대장균이나 고초균 등과 같은 다른 산업용 미생물과는 달리 일반적인 구조가 알려지지 않았다. 따라서, 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자의 프로모터 부분을 제거하고, 여기에 코리네형 세균으로부터 분리한 염색체 DNA를 적절한 제한효소로 절단하여 도입한 후, 이것으로 코리네형 세균을 형질전환시켜 얻은 균주의 항생제 내성을 측정함으로써 프로모터를 개발해왔다(Eikmanns, B.J., et al., Gene, 102, 93-98, (1991); Patek, M., et al., Microbiology, 142, 1297-1309, (1996)). 그러나, 기 존에 개발된 프로모터 서열들은 유전자 발현의 선택성 및 발현효율 등의 측면에서 여전히 개선의 여지를 안고 있었다.
이에 본 발명자는 라이신 생합성에 관여하는 아스파르테이트 키나아제를 코딩하는 lysC 유전자의 발현을 이용하여, 예상 프로모터 부분의 염기서열을 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 증폭하고 프로모터가 결핍된 lysC 유전자의 개시 부위에 도입하여 LysC 활성의 다양한 증감을 확인함으로써, 신규한 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 프로모터 핵산 분자를 제공할 수 있게 되어 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 코리네박테리움 글루타미쿰에서 유래한 신규한 프로모터 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 코리네박테리움 글루타미쿰에서 유래한 신규한 프로모터 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 코리네박테리움 글루타미쿰에서 유래한 신규한 프로모터 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 코리네박테리움 글루타미쿰에서 유래한 신규한 프로모터 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 사용하여 목적 유전자를 발현하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 프로모터 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에 따른 프로모터 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열은 최근의 여러 가지 연구기법, 예를 들어 방향성 진화법(directed evolution) 또는 부위-특이적 돌연변이 기술(site-directed mutagenesis) 등의 방법을 통해 일정 정도 변형이 가능하다. 본 기술분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 70% 이상의 상동성(homology)이 유지되는 뉴클레오티드 서열이 본 발명에서 목적하는 유전자 발현을 위한 프로모터 활성을 보유하는 한, 본 발명의 뉴클레오티드 서열로부터 유래된 프로모터와 균등한 것임을 쉽게 이해할 것이다.
따라서, 본 발명의 프로모터 핵산 분자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 70% 이상의 상동성을 가지고 프로모터로 사용될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "상동성”이라는 용어는 야생형 핵산 서열과의 유사한 정도를 의미하며, 본 발명은 본 발명에 의한 신규한 프로모터의 뉴클레오티드 서열과 바람직하게는 75%이상, 보다 바람직하게는　85% 이상, 더욱 바람직하게는 90%이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일할 수 있는 DNA 서열을 포함할 수 있다.　이와 같은 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다.　시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.
또한, 본 발명의 프로모터 핵산 분자는 상기한 뉴클레오티드 서열에 상보적인(complementary) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그룹 중에서 선택된 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 프로모터 핵산 분자를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "상보적인”이라는 용어는 뉴클레오티드 또는 핵산, 예를 들어 이중가닥 DNA 분자의 2개의 가닥 간 또는 올리고뉴클레오티드 프라이머와 서열분석되거나 증폭될 단일 가닥의 핵산 주형의 프라이머 결합 부위 간의 혼성화(hybridization) 또는 염기 쌍 형성(base pairing)이 가능함을 의미한다.
또한, 본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰에서 유래한 프로모터 핵산 분자는 상기한 코리네박테리움 글루타미쿰 프로모터 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 수행하는 이의 기능적 등가물을 포함한다. 상기한 기능적 등가물에는 작용성 단편을 포함하여, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이된 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰 프로모터 핵산 분자는 코리네형 세균(Coryneform bacterium) 유래의 프로모터로서, 바람직하게는 원핵세포, 특히 대장균 및 코리네형 세균에서의 유전자 발현을 위한 프로모터로 유용하다.
본 발명에서 사용되는 "프로모터”라는 용어는 유전자의 전사가 개시되기 위해 RNA 중합효소(RNA polymerase)가 결합하는 DNA상의 부위로서, mRNA 전사 개시 부위의 상류, 즉 5' 앞쪽에 위치한다.
바람직하게는, 본 발명의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 프로모터는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 약 3000개의 유전자의 전체 게놈 발현량을 통해 선별한 신규한 프로모터인 NCgl1504의 서열(서열번호 11)을 갖는 유전자 및 NCgl1305의 서열(서열번호 12)을 갖는 유전자의 프로모터일 수 있다.
본 발명에 있어서, 'NCgl1504의 서열을 갖는 유전자' 및 'NCgl1305의 서열을 갖는 유전자'는 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주 유래의 서열번호 11 및 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것뿐만 아니라, 코리네박테리움 속에 속하는 미생물에 존재하는 유전자로서 상기 NCgl1504 또는 NCgl1305의 유전자 산물과 실질적으로 동일한 산물을 발현하는 유전자를 의미한다. 본 발명에서 'NCgl1504 유전자' 및 'NCgl1305 유전자'라는 용어는 각각 'NCgl1504의 서열을 갖는 유전자' 및 'NCgl1305의 서열을 갖는 유전자'와 동일한 의미로 사용된다. 본 발명에 있어서, '실질적으로 동일'이란 각 유전자 산물과 동일한 종류의 활성 및 조절 기작을 갖는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 바람직하게는 NCgl1504의 서열을 갖는 유전자는 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자이고, NCgl1305의 서열을 갖는 유전자는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자이다.
본 발명의 프로모터 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 분리 또는 제조할 수 있다. 예를 들어, 적절한 프라이머 서열을 이용하여 PCR을 통해 분리할 수 있다. 또한, 자동화된 DNA 합성기를 이용하는 표준 합성 기술을 이용하여 제조할 수도 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 구성된 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 목적 유전자의 코딩서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 “벡터”라는 용어는 적합한 숙주 내에서 DNA의 발현을 수행할 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 구조물을 의미한다. 적합한 조절 서열은 전사를 수행하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 벡터가 적당한 숙주를 형질전환시키면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 일부 경우엔 게놈 그 자체에 삽입되어 통합될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 "작동 가능하게 연결된”이라는 용어는 발현이 필요한 유전자와 이의 조절 서열이 서로 기능적으로 결합되어 유전자 발현을 가능케 하는 방식으로 연결되는 것을 말한다.
코리네박테리움 글루타미쿰 프로모터 핵산 분자를 포함하는 본 발명의 재조합 벡터는 목적 유전자를 재조합적으로 생산하기 위해 다양한 단백질을 코딩하는 유전자와 작동가능하게 연결될 수 있다. 본 발명의 벡터를 사용하여 발현시키기에 유리한 목적 유전자로는 아스파르테이트 키나아제를 코딩하는 lysC, 디히드로디피콜리네이트 리덕타아제를 코딩하는 dapB 등이 있으며, 반드시 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명에서, 목적 유전자는 아스파르테이트 키나아제를 코딩하는 lysC일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 아스파르테이트 키나아제를 코딩하는 lysC 유전자(Ikeda et al, Appl Microbiol Biotechnol. 2002 Feb;58(2):217-23 A novel methodology employing Corynebacterium glutamicum genome information to generate a new L-lysine-producing mutant)는 서열번호 13의 염기서열을 갖는다.
본 발명에서, 재조합 벡터는 목적 유전자인 lysC의 코딩 서열(서열번호 13)과 작동가능하게 연결된 서열번호 1의 프로모터를 포함하는 pDZ-NCgl1504-lysC일 수 있다. 또한, 본 발명에서 재조합 벡터는 목적 유전자인 lysC의 코딩 서열(서열번호 13)과 작동가능하게 연결된 서열번호 2의 프로모터를 포함하는 pDZ-NCgl1305-lysC일 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 구성된 프로모터를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명에 따른 형질전환된 숙주세포는 목적 단백질의 발현을 위해 상기한 바와 같은 코리네박테리움 글루타미쿰 프로모터 핵산 분자와 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 작동 가능하게 연결되도록 제작된 재조합 벡터로 숙주 세포, 예를 들어 원핵세포, 바람직하게는 대장균 및 코리네형 세균, 보다 바람직하게는 코리네형 세균을 형질전환시킨 것일 수 있다.
본 발명에서, "코리네형 세균”은 코리네박테리움(Corynebacterium) 또는 브레비박테리움(Brevibacterium) 속의 균주, 특히, 코리네박테리움 글루타미쿰, 보다 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032일 수 있다. 본 발명의 코리네형 세균은 예를 들면, 다른 코리네박테리움속 균주, 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869, 및 이들로부터 제조된 L-아미노산 생산 돌연변이체 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 10881, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 11001 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체로의 삽입에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.
본 발명에서 숙주세포는 서열번호 1의 뉴클레오티드로 구성된 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 lysC(서열번호 13)를 포함하는 재조합벡터로 형질전환된 코리네박테리움 속 세균일 수 있다. 바람직하게는, 상기 숙주세포는 코리네박테리움 글루타미쿰 (수탁번호 KCCM 10831)일 수 있다.
본 발명에서 숙주세포는 서열번호 2의 뉴클레오티드로 구성된 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 lysC(서열번호 13)를 포함하는 재조합벡터로 형질전환된 코리네박테리움 속 세균일 수 있다. 바람직하게는, 상기 숙주세포는 코리네박테리움 글루타미쿰 (수탁번호 KCCM 10830)일 수 있다.
본 발명은 또한 코리네박테리움 글루타미쿰에서 유래한 프로모터 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 목적 유전자를 발현하는 방법을 제공한다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 프로모터와 작동가능하게 연결된 목적 유전자는 라이신, 쓰레오닌 등과 같은 최종 산물의 생합성 경로에 관여되는 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있다. 본 발명에서, '목적 유전자를 발현한다'는 것은 상기 목적 유전자가 코딩하는 단백질이 관여되는 생합성 경로의 최종 산물을 생산하는 것을 의미할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 목적 유전자 를 발현하는 방법은 상기 목적 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하여 상기 목적 유전자가 코딩하는 단백질이 관여되는 생합성 경로의 최종 산물을 생산하는 방법일 수 있다.
본 발명에서 최종 물질은 라이신일 수 있다. 즉, 본 발명은 라이신의 생합성과 관련되는 단백질을 코딩하는 lysC 및 그 유전자와 작동가능하게 연결된 서열번호 1 또는 서열번호 2의 프로모터를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 라이신 생산 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 라이신 생산 방법에서 형질전환된 숙주 세포는 목적 유전자인 서열번호 13의 lysC와 작동가능하게 연결된 서열번호 1 또는 서열번호 2의 프로모터를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM 10831 또는 코리네박테리움 KCCM 10830일 수 있다.
상기한 바와 같은 형질전환된 숙주세포(형질전환체)의 배양은 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 통상적인 방법에 따라 실시될 수 있다. 이들 공지된 배양 방법은 문헌[Chmiel, (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991);및 Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))에 기술되어 있다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리아 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원도 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 원하는 표적 물질의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 신규한 프로모터 서열을 함유하는 재조합 벡터의 제작
1. 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 신규한 프로모터 대상 유전자의 선정
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032을 5리터 발효조에서 배양한 후 균체를 수집하였다. 상기 균체를 대상으로 게놈 DNA 칩(지노믹트리(주), cDNA 칩)을 통해 약 3000개의 유전자의 mRNA 발현도를 조사하였다. 전체 유전자들 중에서 총 게놈 발현량의 0.88%, 0.43%를 차지하고 있는 NCgl1504 및 NCgl1305 유전자를 본원 발명의 신규한 프로모터를 위한 대상 유전자로 선정하였다.
2. 예상 프로모터 부위 DNA 단편 증폭
코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 유전자의 염기서열은 이미 명백하게 밝혀져 있으며 공개되어 있다(Appl. Microbiol. Biotechnol., 62(2-3), 99-109(2003): GenBank Accession No. NC_003450). 미국국립보건원 유전자은행(NIH GenBank)로부터 단백질들의 유전자정보(NCgl1504, NCgl1305)를 확보하였다. 각 단백질 오픈 리딩 프레임(ORF)의 상류에 위치한 예상 프로모터(서열번호 1: NCgl1504의 프로모터, 서열번호 2: NCgl1305의 프로모터)를 증폭하기 위해 보고된 염기서열에 근거하여 아래 표 1에서 기재된 제한효소 EcoRV/BamHI와 NdeI 절단부위를 포함하는 프라이머들을 합성하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 각각 프라이머 1과 2(서열번호 3과 4)및 프라이머 3과 4(서열번호 5와 6)를 이용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories](PCR 조건: 변성=94℃, 1분/어닐링=55℃, 1분/중합=72℃, 30초, 30회)에 의해 NCgl1504 유전자 및 NCgl1305 유전자의 예상 프로모터 부위를 증폭하여 준비하였다.
3. 프로모터 활성 측정을 위한 염색체 삽입용 재조합 벡터의 제작
상기에서 준비된 NCgl1504 및 NCgl1305의 예상 프로모터 부위의 활성을 코리네박테리움의 염색체상에서 측정하기 위해, 대장균 클로닝용 벡터 pACYC177 (New England Biolab, GenBank accetion # X06402)를 기본 벡터로 사용하여 당사에서 제작한 (대한민국 출원번호 1-2006-089672) 염색체 삽입용 벡터 pDZ를 이용하였다. 코리네박테리움의 염색체로 여분의 유전자를 삽입하기 위하여, 대상이 되는 유전자인 lysC의 시작 부위 앞에 서열번호 1 및 서열번호 2의 신규 프로모터를 각각 삽입하여 pDZ-Ncgl1504-lysC 와 pDZ-Ncgl1305-lysC 벡터를 각각 얻었다.
NCgl1504 및 NCgl1305의 예상 프로모터 부위를 lysC 유전자에 삽입한 재조합 벡터를 제작하기 위하여 다음과 같은 과정을 거쳤다. 우선 서열번호 13의 lysC를 증폭하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고 프라이머 5와 6(서열번호 7과 8) 및 프라이머 7과 8(서열번호 9와 10) 을 사용하여 PCR(변성= 94℃, 1분/어닐링= 55℃, 1분/중합 = 72℃, 30초: 30회 수행)을 수행하였다. TOPO Cloning Kit(Invitrogen)를 이용하여 증폭된 lysC 단편들을 제한효소 EcoRV와 클레나우로 처리하고 평활말단화한 두 단편을 라이게이션하여 pCR2.1-lysC을 클로닝하였다. 그 후, 제한효소 EcoRV와 lysC 유전자 증폭시 사용한 프라이머에 존재하는 NdeI로 pCR.2.1-lysC 및 NCgl1504 또는 NCgl1305의 프로모터 부위를 절단한 후, DNA 리가아제를 이용하여 상기 절단부위에 신규한 서열번호 1 또는 서열번호 2의 프로모터를 각각 클로닝하였다. 이와 같이 클로닝된 단편을 다시 pDZ 벡터에 옮겨 도 1에 도시된 바와 같이 pDZ-Ncgl1504-lysC 와 pDZ - Ncgl1305-lysC 벡터를 제작하였다.
실시예 2. 신규한 프로모터 서열을 포함하는 재조합 균주에 의한 형질전환
L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 10881을 전기펄스법에 의해 상기에서 제작된 재조합 벡터 pDZ-NCgl1504-lysC 또는 pDZ-NCgl1305-lysC로 형질전환시킨 후(Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545에 의한 형질전환법 이용), 카나마이신 (kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별 배지(육즙 추출물(beef extract) 10g/L, 펩톤 10g/L, 효모 추출물 5g/L, 염화나트륨 5g/L, BHI(Brain Heart Infusion) 3.7g/L, 솔비톨 9.1g/L)에서 염색체상의 동 유전자와 상동성에 의해 삽입된 균주를 선별하였다. 벡터의 성공적인 염색체 삽입은 X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)을 포함한 고체배지에서 청색을 나타내는가 여부로 확인하였다. 1차 염색체 삽입된 균주를 영양 배지에서 진탕배양 (30℃, 8시간)한 후, 각각 10-4으로부터 10-10까지 희석하여, X-gal을 포함하고 있는 고체배지에 도말하였다. 대부분의 콜로니가 청색을 나타내는데 반해 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선별함으로써, 2차 교차(crossover)에 의해 삽입된 염색체상의 벡터 서열이 제거된 균주를 선별하였다. 이상과 같이 선별된 균주는 최종적으로 항생제 카나마이신에 대한 감수성 여부의 확인을 통하여 유전자 구조 확인과정을 거쳐 최종 선정하였다. lysC 유전자의 프로모터가 Ncgl1504로 교체된 균주는 CA01-0037, lysC 유전자의 프로모터가 Ncgl1305로 교체된 균주는 CA01-0036으로 명명하고, 2006년 12월 28일에 한국 미생물 보존센터에 기탁하여 각각 KCCM 10831 및 KCCM 10830을 수탁번호로 부여받았다.
실시예 3: 코리네박테리움에서 프로모터 서열의 발현 활성
획득된 형질전환 균주들은 프로모터 서열의 활성측정을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다.
배지[포도당 20 g, 황산암모늄 5 g, 효모 추출물 5g,요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7 H2O 0.5 g, 바이오틴 150 ㎍, 티아민 염산염 1.5 mg, 칼슘 판토테인산 3mg, 니코틴아마이드 3mg (증류수 1 리터 기준),pH 7.2] 25 ml가 담긴 250 ml 코너-바플 플라스크에 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주들을 20분의 1 비율로 각각 접종하고 30℃에서 배양 중기(OD600=10)까지 진탕 배양(200 rpm) 하였다. 배양 종료 후 원심분리에 의해 균체를 회수하여 100 mM Tris -Hcl 버퍼(pH 7.0)에 현탁한 뒤 초음파파쇄법으로 세포를 파괴하고 다시 고속원심분리하여 상등액을 얻었다. 상기 방법으로 얻어진 상등액에서 단백질 1mg씩 취하여 lysC 효소 활성을 측정하였다(Black & Wright (1955b)). 그 결과, 표 2에 표시된 바와 같이 NCgl1504 및 NCgl1305의 프로모터로 각각 프로모터가 교체된 균주에서 lysC의 활성이 증가하거나 감소하고 있음을 확인하였다.
표 2. 라이신 첨가에 따른 프로모터 활성 비교
균주 프로모터의 상대적 발현 강도
KFCC 10881 1
CA01-0036(KCCM 10830) 0.74
CA01-0037(KCCM 10831) 1.67
본 발명에 따라 코리네박테리움 글루타미쿰 특정 유전자의 발현을 유도하는 신규한 프로모터 핵산 서열을 제공함으로써, 목적 단백질의 유전자를 고발현이나 저발현으로 그 발현 강도를 조절할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 프로모터 핵산 분자.
  2. 목적 유전자의 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 제1항의 프로모터를 포함하는 재조합 벡터.
  3. 제2항에 따른 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  4. 제3항에 있어서, 코리네박테리움 속 세균인 숙주세포.
  5. 제4항에 있어서, lysC 유전자의 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 서열번호 1의 프로모터를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM 10831인 숙주세포.
  6. 제4항에 있어서, lysC 유전자의 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 서열번호 2의 프로모터를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM 10830인 숙주세포.
  7. 제3항 내지 제6항 어느 한 항에 따른 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인 목적 유전자를 발현하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 목적 유전자는 lysC 유전자인 것인 방법.
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