KR20130138773A

KR20130138773A - 코리네형 세균 형질 전환체 및 그것을 사용하는 페놀의 제조 방법

Info

Publication number: KR20130138773A
Application number: KR1020137008830A
Authority: KR
Inventors: 히데아키 유카와; 마사유키 이누이
Original assignee: 그린 페놀 고키노 페놀 주시 세이조 기쥬쓰 겐큐 구미아이
Priority date: 2010-11-18
Filing date: 2011-11-17
Publication date: 2013-12-19
Also published as: WO2012067174A1; JP5887277B2; US20130267000A1; EP2641964A4; CN103384721A; EP2641964B1; ES2754080T3; JPWO2012067174A1; EP2641964A1; KR101914464B1; US8846367B2; CN103384721B

Abstract

티로신 페놀-리아제(tyrosine phenol-lyase) 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가, 숙주의 코리네형 세균에 도입된, 페놀 생산능을 가지는 형질 전환체. 이 형질 전환체를, 환원 조건 하에서, 티로신, 그의 염, 또는 그의 에스테르를 함유하는 반응액 중 반응시키는 공정과, 반응 배지 중의 페놀을 회수하는 공정을 포함하는 페놀의 제조 방법.

Description

코리네형 세균 형질 전환체 및 그것을 사용하는 페놀의 제조 방법{CORYNEFORM BACTERIUM TRANSFORMANT AND METHOD FOR PRODUCING PHENOL USING SAME}

본 발명은, 페놀 생산 기술에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 페놀 생산 기능을 부여하기 위해 특정한 유전자 조작이 행해진 코리네형 세균의 형질 전환체, 및 이 형질 전환체를 사용한 효율적인 페놀의 제조 기술에 관한 것이다.

지구 온난화, 및 화석 자원고갈 문제를 배경으로 하여, 재생 가능 자원을 원료로 한 화학 제품의 제조는, 바이오 연료 제조와 더불어, 신산업 바이오 리파이너리(refinery)로서 저탄소 사회 실현의 중요한 방책인 것으로 인식되어 큰 주목을 끌고 있다.

그러나, 재생 가능 자원을 원료로 한 바이오 페놀 생산은, 락트산이나 에탄올의 생산과 비교하여, 원료로 되는 당류로부터 대사 반응까지의 단계수가 대단히 많으므로 생산성이 낮고, 또한 생산물인 페놀에 의해 균의 증식이 저해되거나 페놀에 의한 세포 독성이 있는 등의 이유로 인해, 지금까지 공업적 생산이 불가능한 것으로 여겨지고 있었다.

페놀의 중요한 용도로서, 페놀 수지를 예로 들 수 있다. 페놀 수지는, 페놀과 알데히드류와의 부가 축합 반응에 의해 생성되고, 플라스틱 중에서도 가장 오래된 역사를 가지는 수지이며, 그 우수한 내열성, 내구성 등의 장점이 있으므로, 현재에도 자동차용 금속 대체 재료, 반도체 봉지(封止) 재료, 회로 기판 등 다양한 용도에 사용되고 있다. 또한, 지금까지 페놀 수지는, 원료의 페놀과 알데히드류의 반응성이 극히 높고, 얻어지는 고분자가 복잡한 3차원 메쉬 구조가 되기 때문에, 폴리머의 정밀 구조 설계나 나노 소재(nanomaterial)로 전개하기 곤란하여, 고부가가 가치 용도로 이용하기 어려웠다. 그러나, 최근, 고분자의 물성 이론이나 시뮬레이션의 급속한 발전에 의해, 네트워크 구조를 정밀화하면 페놀 수지로부터 고기능성 재료의 제조가 가능해지고 있다. 이와 같은 배경 하에서 일본에서의 페놀 수지 생산량도 해마다 증가하고 있다.

페놀의 현재의 공업적 생산법(큐멘법)은, 석유 유래의 벤젠과 프로필렌을 원료로 하고, 다량의 용제류 및 다량의 열에너지를 필요로 하는, 전형적인 화학 공업의 고에너지 소비형 프로세스이다. 따라서, 지구 환경 보전이나 온실 효과 가스 삭감의 관점에서, 이산화탄소 배출이 적은 에너지 절약형이며, 재생 가능 자원으로부터 제조할 수 있고, 폐기물 배출이 적은 환경 조화형 프로세스의 개발, 즉 바이오 페놀 제조 기술 확립이 급선무가 되고 있다.

지금까지 자연계에 있어서 페놀 생산균에 대해서는 보고되어 있지 않다. 또한, 유전자 재조합균에 의한 페놀 생산 기술로서, 실용적으로 충분한 페놀 생산성을 얻을 수 있는 기술도 알려져 있지 않다.

이에, 티로신 페놀-리아제는, 페놀, 피루브산, 및 암모니아로부터 티로신을 합성하는 반응, 및 그 역반응을 촉매하는 효소이다(예를 들면, 특허 문헌 1). 예를 들면, 특허 문헌 2는, 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae)속 세균 유래의 티로신 페놀-리아제를 사용하여, 페놀, 피루브산, 및 암모니아로부터 티로신을 합성한 것에 대하여 기재하고 있다.

또한, 티로신 페놀-리아제를 효율적으로 생산시키기 위하여, 각종 생물 유래의 티로신 페놀-리아제 유전자로 대장균을 형질 전환하는 것에 대하여 알려져 있다(특허 문헌 3∼5).

일본 특허출원 공개번호 2006-320238 일본 특허출원 공개번호 평 8-154675 일본 특허출원 공개번호 2005-278453 WO90/04031 일본 특허출원 공개번호 평 4-218380

본 발명은, 티로신을 원료로 하여 효율적으로 페놀을 제조할 수 있는 미생물, 및 티로신을 원료로 하여 효율적으로 페놀을 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명자들은 연구를 거듭하여 이하의 지견을 얻었다.

(i) 코리네형 세균에 티로신 페놀-리아제(tyrosine phenol-lyase) 유전자를 도입한 형질 전환체는, 티로신으로부터 페놀을 효율적으로 생산한다.

(ii) 이 형질 전환체에 있어서, 숙주의 코리네형 세균의 염색체 상에 존재하는 페놀 2-모노옥시게나제(2-monooxygenase) 유전자(poxF)가 파괴되거나, 또는 결손되어 있을 때는, 한층 효율적으로 페놀을 생산할 수 있다.

(iii) 이 형질 전환체는, 환원 조건 하의 반응액 중 실질적으로 증식하지 않는 상태에서 반응시키는 경우, 페놀 생산 효율이 특히 높다.

본 발명은 상기 지견에 따라 완성된 것이며, 이하의 형질 전환체 및 페놀의 제조 방법을 제공한다.

항 1. 티로신 페놀-리아제(tyrosine phenol-lyase) 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가, 숙주의 코리네형 세균에 도입된, 페놀 생산능을 가지는 형질 전환체.

항 2. 티로신 페놀-리아제 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가, 판토에아 아글로메란스(Pantoea agglomerans) 유래의 유전자, 시트로박터 브라아키(Citrobacter braakii) 유래의 유전자, 데술피토박테리움 하프니엔스(Desulfitobacterium hafniense) 유래의 유전자, 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus) 유래의 유전자, 노스톡 펑티포르메(Nostoc punctiforme) 유래의 유전자, 또는 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) 유래의 유전자인 항 1에 기재된 형질 전환체.

항 3. 티로신 페놀-리아제 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가 하기 (a) 또는 (b)의 DNA인 항 1에 기재된 형질 전환체.

(a) 서열 번호 16의 염기 서열로 이루어지는 DNA, 서열 번호 23의 염기 서열로 이루어지는 DNA, 서열 번호 24의 염기 서열로 이루어지는 DNA, 서열 번호 25의 염기 서열로 이루어지는 DNA, 서열 번호 26의 염기 서열로 이루어지는 DNA, 또는 서열 번호 27의 염기 서열로 이루어지는 DNA

(b) (a) 중 어느 하나의 염기 서열과 상보적인(complementary) 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 또한 티로신 페놀-리아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.

항 4. 숙주의 코리네형 세균이, 그 염색체 상에 존재하는 페놀 2-모노옥시게나아제(phenol 2-monooxygenase) 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가 파괴되거나, 또는 결손된 것인, 항 1∼3 중 어느 하나에 기재된 형질 전환체.

항 5. 숙주의 코리네형 세균이 코리네박테리움 글루타미쿰인 항 1∼4 중 어느 하나에 기재된 형질 전환체.

항 6. 숙주의 코리네형 세균이, 코리네박테리움 글루미쿰 R(FERM P-18976), ATCC13032, 또는 ATCC13869인 항 1∼3 중 어느 하나에 기재된 형질 전환체.

항 7. 숙주의 코리네형 세균이, 코리네박테리움 글루미쿰 R(FERM P-18976), ATCC13032, 또는 ATCC13869의 염색체 상에 존재하는 페놀 2-모노옥시게나아제(phenol 2-monooxygenase) 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가 파괴되거나, 또는 결손된 것인, 항 1∼3 중 어느 하나에 기재된 형질 전환체.

항 8. 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE31(수탁 번호：NITE BP-999) 형질 전환체.

항 9. 항 1∼8 중 어느 하나에 기재된 형질 전환체를, 환원 조건 하에서, 티로신, 그의 염, 또는 그의 에스테르를 함유하는 반응액 중 반응시키는 공정과, 반응 배지 중의 페놀을 회수하는 공정을 포함하는 페놀의 제조 방법.

항 10. 반응 공정에 있어서, 형질 전환체가 실질적으로 증식하지 않는 항 9에 기재된 페놀의 제조 방법.

항 11. 환원 조건 하의 반응액의 산화 환원 전위가 -200∼-500 mV(밀리볼트)인 항 9 또는 10에 기재된 페놀의 제조 방법.

본 발명의 형질 전환체를 사용함으로써, 티로신으로부터 페놀을 고효율로 제조할 수 있다.

일반적으로 미생물은 페놀과 같은 용제의 세포 독성에 의해 생육이 저해되므로, 미생물을 사용하여 페놀을 제조하는 것은 곤란했지만, 본 발명 방법에 의하면, 미생물을 사용하여, 실용적으로 충분히 양호한 효율로 페놀을 제조할 수 있다.

도 1은 실시예에서 사용한 플라스미드의 구성을 나타낸 도면이다.
도 2는 각종 미생물의 호기 조건 하에 있어서의 증식에 미치는 페놀의 영향을 나타낸 도면이다.

이하에서, 본 발명을 상세하게 설명한다.

(I) 페놀 생산능을 가지는 형질 전환체

본 발명의 페놀 생산능을 가지는 형질 전환체는, 티로신 페놀-리아제 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가, 숙주의 코리네형 세균에 도입된 형질 전환체이다.

숙주

코리네형 세균이란, 버지즈·매뉴얼·디터미네이티브·박테리올로지[Bargeys Manual of Determinative Bacteriology, Vol. 8, 599(1974)]에 정의되어 있는 일군의 미생물이며, 통상의 호기적 조건에서 증식하는 것이라면 특별히 한정되는 것은 아니다. 구체예를 들면, 코리네박테리움속 균, 브레비박테리움속 균, 아스로박터속 균, 마이코박테리움속 균, 마이크로코쿠스속 균 등을 들 수 있다. 코리네형 세균 중에서는 코리네박테리움속 균이 바람직하다.

코리네박테리움속 균으로서는, 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerance), 코리네박테리움 알카놀리티쿰(Corynebacterium alkanolyticum) 등을 예로 들 수 있다.

그 중에서도, 안전하면서, 또한 페놀 생산성이 높은 점에서, 코리네박테리움 글루타미쿰이 바람직하다. 바람직한 균주로서 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) R주(FERM P-18976), ATCC13032주, ATCC13869주, ATCC13058주, ATCC13059주, ATCC13060주, ATCC13232주, ATCC13286주, ATCC13287주, ATCC13655주, ATCC13745주, ATCC13746주, ATCC13761주, ATCC14020주, ATCC31831주, MJ-233(FERM BP-1497), MJ-233 AB-41(FERM BP-1498) 등을 예로 들 수 있다. 그 중에서도, R주(FERM P-18976), ATCC13032주, ATCC13869주가 바람직하다.

그리고, 분자 생물학적 분류에 의해, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum), 코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium) 등의 코리네형 세균도 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로 균명이 통일되어 있다[Liebl, W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297 T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int J Syst Bacteriol. 41: 255-260. (1991), 코마가타 카즈오 외, 코리네포룸 세균의 분류, 발효와 공업, 45:944-963 (1987)].

구분류의 브레비박테리움 락토퍼멘툼 ATCC13869주, 브레비박테리움 플라붐의 MJ-233주(FERM BP-1497), MJ-233 AB-41주(FERM BP-1498) 등도 바람직한 코리네박테리움 글루타미쿰이다.

브레비박테리움속 균으로서는, 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes)(예를 들면, ATCC6872주) 등을 예로 들 수 있다.

아스로박터속 균으로서는, 아스로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis)(예를 들면, ATCC8010주, ATCC4336주, ATCC21056주, ATCC31250주, ATCC31738주, ATCC35698주) 등을 예로 들 수 있다.

마이코박테리움속 균으로서는, 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)(예를 들면, ATCC19210주, ATCC27289주) 등을 예로 들 수 있다.

마이크로코쿠스속 균으로서는, 마이크로코쿠스 프로이덴라이히(Micrococcus freudenreichii)(예를 들면, No. 239주(FERM P-13221)), 마이크로코쿠스 루테우스(Micrococcus leuteus)(예를 들면, No. 240주(FERM P-13222)), 마이크로코쿠스 우레아에(Micrococcus ureae)(예를 들면, IAM1010주), 마이크로코쿠스 로제우스(Micrococcus roseus)(예를 들면, IFO3764주) 등을 예로 들 수 있다.

또한, 코리네형 세균은, 야생주 외에, 그 변이주나 인위적인 유전자 재조합체라도 된다. 예를 들면, 락테이트(락트산) 데히드로게나아제(lactate dehydrogenase：LDH), 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제(phosphoenolpyrvate carboxylase), 말레이트 데히드로게나아제(malate dehydrogenase) 등의 유전자의 파괴주가 있다. 이와 같은 유전자 파괴주를 숙주로서 사용함으로써, 페놀의 생산성을 향상시키거나, 부산물의 생성을 억제할 수 있다.

그 중에서도, 락테이트 데히드로게나아제 유전자의 파괴주가 바람직하다. 이 유전자 파괴주는, 락트산 데히드로게나아제 유전자가 파괴되어 있는 것에 의해, 피루브산으로부터 락트산으로의 대사 경로가 차단되어 있다. 그 중에서도, 코리네박테리움 글루타미쿰의, 특히 R(FERM P-18976) 주의 락테이트 데히드로게나아제 유전자의 파괴주가 바람직하다.

이와 같은 유전자 파괴주는, 유전자 공학적 방법에 의해 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, WO2005/010182 A1에, 락트산 데히드로게나아제 파괴주, 및 그 제조 방법에 대하여 기재되어 있다.

실시예 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은, 코리네형 세균이, 다른 세균에 비해, 페놀에 대한 내성이 극히 높은 것을 발견하였다. 이 점에서, 코리네형 세균은 본 발명의 방법에 의한 페놀 제조에 매우 적합하다.

또한, 코리네형 세균은, 다른 호기성 세균에 비해, 실질적으로 증식하지 않는 환원 조건 하에서 효율적으로 물질 생산을 행할 수 있다. 이 점에서도, 코리네형 세균은 본 발명의 방법에 의한 페놀 제조에 매우 적합하다.

티로신 페놀- 리아제 효소 유전자( tpl )

티로신 페놀-리아제는, 티로신으로부터 피루브산 및 암모니아를 이탈시켜 페놀을 생성하는 반응, 및 그 역반응을 촉매하는 효소이다. 또한, 티로신 페놀-리아제는, 카테콜과 피루브산으로부터 L-DOPA를 생성하는 반응도 촉매한다.

티로신 페놀-리아제 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자의 유래는 특별히 한정되지 않지만, 판토에아 아글로메란스(Pantoea agglomerans) 유래의 유전자, 시트로박터 브라아키(Citrobacter braakii) 유래의 유전자, 데술피토박테리움 하프니엔스(Desulfitobacterium hafniense) 유래의 유전자, 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus) 유래의 유전자, 노스톡 펑티포르메(Nostoc punctiforme) 유래의 유전자, 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) 유래의 유전자가 바람직하고, 판토에아 아글로메란스 유래의 유전자가 보다 바람직하다.

판토에아 아글로메란스(Pantoea agglomerans) 유래의 유전자로서는, 서열 번호 16의 염기 서열로 이루어지는 DNA를 예로 들 수 있고, 시트로박터 브라아키(Citrobacter braakii) 유래의 유전자 서열 번호 23의 염기 서열로 이루어지는 DNA를 예로 들 수 있으며, 데술피토박테리움 하프니엔스(Desulfitobacterium hafniense) 유래의 유전자 서열 번호 24의 염기 서열로 이루어지는 DNA를 예로 들 수 있고, 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus) 유래의 유전자 서열 번호 25의 염기 서열로 이루어지는 DNA를 예로 들 수 있고, 노스톡 펑티포르메(Nostoc punctiforme) 유래의 유전자 서열 번호 26의 염기 서열로 이루어지는 DNA를 예로 들 수 있고, 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) 유래의 유전자로서는, 서열 번호 27의 염기 서열로 이루어지는 DNA를 예로 들 수 있다.

또한, 본 발명에서는, 서열 번호 16, 23, 24, 25, 26, 또는 27의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 또한 티로신 페놀-리아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA도 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 「엄격한 조건」은, 일반적인 조건, 예를 들면, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, 1989, Vol2, p11.45에 기재된 조건을 지칭한다. 구체적으로는, 완전 하이브리드의 융해 온도(Tm)보다 5∼10 ℃ 낮은 온도에서 혼성화가 일어나는 경우를 지칭한다.

티로신 페놀-리아제 활성은, 「J. Biol. Chem., 245, 1767-1772 (1970)“Materials and Methods”」에 기재된 방법을 변형하여 측정할 수 있다. 간단하게 설명하면, 시험 용액에 피험 효소를 첨가하고, 50 mM 인산 칼륨 버퍼, pH 8.0, 2.5 mM L-Tyr, 0.1 mM 피리독살인산, 20% 글리세롤과 효소를 포함하는 반응액을 조제하고, 30℃, 30분간 반응시킨다(0, 5, 10, 20, 30 min). 반응 정지는 0.6 N 염산(최종 농도) 첨가에 의해 행하였다. 이것을 원심분리 후, 필터로 여과하여 생긴 페놀은 HPLC로 분석하여, 정량했다(Cosmosil C18 ARII, 이동상 20% MeOH, 0.07% 과염소산). 반응 처음 속도와 단백질 농도로부터 비활성을 산출하였다(1분당, 1 마이크로몰의 페놀을 생산할 수 있는 효소량을 1 unit으로 함).

또한, 본 발명에서는, 서열 번호 16, 23, 24, 25, 26, 또는 27의 염기 서열과 동일성이 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상의 염기 서열로 이루어지고, 또한 티로신 페놀-리아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA도 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 염기 서열의 동일성은, GENETYX ver.8(GENETYX 가부시키가이샤 제네틱스 제조)에 의해 산출한 값이다.

서열 번호 16, 23, 24, 25, 26, 또는 27의 염기 서열로 이루어지는 DNA의 상동체(homologue)는, 예를 들면, 이들 염기 서열에 따라 통상적인 방법에 따라 설계한 프라이머 또는 프로브를 사용한 PCR 또는 혼성화에 의해, 다른 생물종의 DNA 라리브러리로부터 선택할 수 있으며, 이로써, 높은 확률로 티로신 페놀-리아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 얻을 수 있다.

형질 전환을 위한 벡터의 구축

PCR로 증폭한 티로신 페놀-리아제 효소를 코딩하는 DNA는, 각각, 숙주에서 증폭할 수 있는 적절한 벡터에 클로닝하면 된다.

플라스미드 벡터로서는, 코리네형 세균 내에서 자율 복제(autonomous replication) 기능을 담당하는 유전자를 포함하는 것이면 된다. 그 구체예로서는, 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum) 2256 유래의 pAM330{[일본 특허출원 공개번호 소58-67699], [Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903(1984)]및 [Yamaguchi, R. et al., Determination of the complete nucleotide sequence of the Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and the analysis of its genetic information. Nucleic Acids Symp. Ser. 16: 265-267(1985)]}, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13058 유래의 pHM1519[Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48: 2901-2903(1984)]및 pCRY30[Kurusu, Y. et al., Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57:759-764 (1991)], 코리네박테리움 글루타미쿰 T250 유래의 pCG4{[일본 특허출원 공개번호 소57-183799], [Katsumata, R. et al., Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA. J. Bacteriol.,159: 306-311(1984)]}, pAG1, pAG3, pAG14, pAG50[일본 특허출원 공개번호 소62-166890], pEK0, pEC5, pEKEx1[Eikmanns, B.J. et al., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing. Gene, 102:93-98 (1991)] 등을 들 수 있다.

바람직한 프로모터로서는, 코리네박테리움 글루타미쿰 R 유래의 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나아제 A 유전자(gapA)의 프로모터 PgapA, 말레이트 데히드로게나아제 유전자(mdh)의 프로모터 Pmdh, 락테이트 데히드로게나아제 A유전자(ldhA)의 프로모터 PldhA 등을 예로 들 수 있고, 그 중에서도, PgapA가 바람직하다.

바람직한 터미네이터로서는, 대장균 rRNA 오페론의 rrnB T1T2 터미네이터, 대장균의 trpA 터미네이터, 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum)의 trp 터미네이터 등을 예로 들 수 있고, 그 중에서도, rrnB T1T2 터미네이터가 바람직하다.

형질 전환

형질 전환 방법은, 공지의 방법을 제한없이 사용할 수 있다. 이와 같은 공지의 방법으로서, 예를 들면, 염화 칼슘/염화 루비듐법, 인산 칼슘법, DEAE-덱스트란 개재 트랜스펙션, 전기 천공법 등이 있다. 그 중에서도, 코리네형 세균에는, 전기 펄스법이 매우 적합하고, 전기 펄스법은, 공지의 방법{[Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric. Biol. Chem. 54:443-447(1990)] 및 [Vertes A.A. et al., Presence of mrr-and mcr-like restriction systems in Coryneform bacteria. Res. Microbiol. 144:181-185(1993)]}에 의해 행할 수 있다.

형질 전환체는, 미생물의 배양에 통상 사용되는 배지를 사용하여 배양하면 된다. 이 배지로서는, 통상, 탄소원, 질소원, 무기염류 및 그 외의 영양 물질 등을 함유하는 천연 배지 또는 합성 배지 등을 사용할 수 있다.

탄소원으로서는, 글루코오스, 플룩토오스, 수크로오스, 만노오스, 말토오스, 만니톨, 크실로오스, 아라비노오스, 갈락토오스, 전분, 당밀, 소르비톨, 글리세린 등의 당질 또는 당 알코올；아세트산, 시트르산, 락트산, 푸마르산, 말레산 또는 글루콘산 등의 유기산；에탄올, 프로판올 등의 알코올 등을 예로 들 수 있다. 또한, 원하는 바에 따라 노말 파라핀 등의 탄화수소 등도 사용할 수 있다. 탄소원은, 1종을 단독으로 사용할 수도 있고, 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다. 배지 중의 이들 탄소원의 농도는, 통상, 약 0.1∼10(w/v%)로 하면 된다.

질소원으로서는, 염화 암모늄, 황산 암모늄, 질산 암모늄, 아세트산 암모늄 등의 무기 또는 유기 암모늄 화합물, 요소, 암모니아수, 질산 나트륨, 질산 칼륨 등을 들 수 있다. 또한, 콘스팁리커(corn steep liquor), 고기 엑기스, 펩톤, NZ-아민, 단백질 가수분해물, 아미노산 등의 질소 함유 유기 화합물 등도 사용할 수 있다. 질소원은, 1종을 단독으로 사용해도 되고, 또 2종 이상을 혼합하여 사용해도 된다. 배지 중의 질소원 농도는, 사용하는 질소 화합물에 따라 상이하지만, 통상, 약 0.1∼10(w/v%)로 하면 된다.

무기염류로서는, 예를 들면, 인산 제1 칼륨, 인산 제2 칼륨, 황산 마그네슘, 염화 나트륨, 질산 제1 철, 황산 망간, 황산 아연, 황산 코발트, 또는 탄산 칼슘 등이 있다. 이들 무기염은, 1종을 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 혼합하여 사용해도 된다. 배지 중의 무기염류 농도는, 사용하는 무기염에 따라 상이하지만, 통상, 약 0.01∼1(w/v%)로 하면 된다.

영양 물질로서는, 예를 들면, 고기 엑기스, 펩톤, 폴리 펩톤, 효모 엑기스, 건조 효모, 콘스팁리커, 탈지분유, 탈지 대두 염산 가수분해물, 또는 동식물 또는 미생물 균체의 엑기스나 이들의 분해물 등이 있다. 영양 물질의 배지 농도는, 사용하는 영양 물질에 따라 상이하지만, 통상, 약 0.1∼10(w/v%)로 하면 된다. 또한, 필요에 따라 비타민류를 첨가할 수도 있다. 비타민류로서는, 예를 들면, 비오틴, 티아민(비타민 B1), 피리독신(비타민 B6), 판토텐산, 이노시톨, 니코틴산 등이 있다.

배지의 pH는 약 5∼8이 바람직하다.

바람직한 미생물 배양 배지로서는, A 배지[Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196(2004)], BT 배지[Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103(2004)] 등을 들 수 있다.

배양 온도는 약 15∼45 ℃로 하면 되고, 배양 시간은 약 1∼7 일간으로 하면 된다.

숙주 염색체 유전자의 파괴 또는 결실

숙주의 코리네형 세균은, 그 염색체 상에 존재하는 페놀 2-모노옥시게나아제 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자(poxF)가 파괴되거나, 또는 결실되어 있는 것이 바람직하고, 이로써, 한층 양호한 효율로 페놀을 제조할 수 있다.

유전자의 부분 서열이 결실되어, 정상적으로 기능하는 효소 단백질을 생산하지 않도록 변형된 결실형 유전자를 제조하고, 상기 유전자를 포함하는 DNA로 세균을 형질 전환하여, 결실형 유전자와 염색체 상의 유전자 사이에 상동 재조합이 일어나게 함으로써, 염색체 상의 유전자를 결실형 또는 파괴형의 유전자로 치환할 수 있다. 결실형 또는 파괴형의 유전자에 의해 코딩되는 효소 단백질은, 생성되더라도, 야생형 효소 단백질과는 상이한 입체 구조를 가지고, 기능이 저하되거나 또는 소실되어 있다. 이와 같은 상동 재조합를 이용한 유전자 치환에 의한 유전자 결실 또는 파괴는 이미 확립되어 있으며, 온도 감수성 복제 기점을 포함하는 플라스미드, 접합 전달 가능한 플라스미드를 사용하는 방법, 숙주 내에서 복제 기점을 가지지 않는 자살 벡터(suicide vector)를 이용하는 방법 등이 있다(미국 특허 제6303383호, 일본 특허출원 공개번호 평05-007491호).

구체적으로는, 실시예 1의 항목에 기재된 방법에 의해, 페놀 2-모노옥시게나아제 유전자(poxF)가 파괴되거나, 또는 결실된 코리네형 세균을 얻을 수 있다.

( II ) 페놀의 제조 방법

전술한 본 발명의 형질 전환체를, 티로신을 함유하는 반응액 중 반응시키는 공정과, 반응액 중의 페놀을 회수하는 공정을 포함하는 방법에 의해 페놀을 제조할 수 있다.

미생물의 증식

반응에 앞서, 형질 전환체를 호기 조건 하에서, 온도 약 25∼38 ℃에서, 약 12∼48 시간 배양하여 증식시키는 것이 바람직하다.

배양용 배지

반응에 앞서, 형질 전환체의 호기적 배양에 사용하는 배지는, 탄소원, 질소원, 무기염류 및 그 외의 영양 물질 등을 함유하는 천연 배지 또는 합성 배지를 사용할 수 있다.

탄소원으로서, 당류(글루코오스, 플룩토오스, 만노오스, 크실로오스, 아라비노오스, 갈락토오스와 같은 단당；수크로오스, 말토오스, 락토스, 셀로비오스, 크실로비오스, 트레할로스와 같은 이당；전분과 같은 다당；당밀 등), 만니톨, 소르비톨, 크실리톨, 글리세린과 같은 당 알코올；아세트산, 시트르산, 락트산, 푸마르산, 말레산, 글루콘산과 같은 유기산；에탄올, 프로판올과 같은 알코올；노말 파라핀과 같은 탄화수소 등도 사용할 수 있다. 탄소원은, 1종을 단독으로 사용할 수도 있고, 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다.

질소원으로서는, 염화 암모늄, 황산 암모늄, 질산 암모늄, 아세트산 암모늄과 같은 무기 또는 유기 암모늄 화합물, 요소, 암모니아수, 질산 나트륨, 질산 칼륨 등을 사용할 수 있다. 또한, 콘스팁리커, 고기 엑기스, 펩톤, NZ-아민, 단백질 가수분해물, 아미노산 등의 질소 함유 유기 화합물 등도 사용할 수 있다. 질소원은, 1종을 단독으로 사용할 수도 있고, 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다. 질소원의 배지 중의 농도는, 사용하는 질소 화합물에 따라 상이하지만, 통상, 약 0.1∼10(w/v%)로 하면 된다.

무기염류로서는, 인산 제1 칼륨, 인산 제2 칼륨, 황산 마그네슘, 염화 나트륨, 질산 제1 철, 황산 망간, 황산 아연, 황산 코발트, 탄산칼슘 등을 예로 들 수 있다. 무기염은, 1종을 단독으로 사용할 수도 있고, 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다. 무기염류의 배지 중의 농도는, 사용하는 무기염에 따라 상이하지만, 통상, 약 0.01∼1(w/v%)로 하면 된다.

영양 물질로서는, 고기 엑기스, 펩톤, 폴리 펩톤, 효모 엑기스, 건조 효모, 콘스팁리커, 탈지분유, 탈지 대두 염산 가수분해물, 동식물 또는 미생물 균체의 엑기스나 이들 분해물 등을 예로 들 수 있다. 영양 물질의 배지 중의 농도는, 사용하는 영양 물질에 따라 상이하지만, 통상 약 0.1∼10(w/v%)로 하면 된다.

또한, 필요에 따라 비타민류를 첨가할 수도 있다. 비타민류로서는, 비오틴, 티아민(비타민 B1), 피리독신(비타민 B6), 판토텐산, 이노시톨, 니코틴산 등을 예로 들 수 있다.

배지의 pH는 약 6∼8이 바람직하다.

바람직한 코리네형 세균용 배지의 구체예로서는, A 배지[Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196(2004)], BT 배지[Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103(2004)] 등을 들 수 있다. 이들 배지에 있어서, 당류 농도를 전술한 범위로 하여 이용하면 된다.

반응액

반응액은, 페놀 전구체(페놀 원료)를 함유하는 물, 완충액, 무기염 배지 등을 사용할 수 있다.

전구체로서는, 티로신(L-티로신, D-티로신, 또는 이들의 혼합물), 그 염, 또는 그 에스테르를 사용할 수 있다. 그 중에서도, L-티로신, 그 염, 또는 그 에스테르가 바람직하다. 염으로서는, 나트륨염, 칼륨염, 염산염 등을 예로 들 수 있다. 또한, 에스테르로서는, 탄소수 1∼4의 알코올과의 에스테르 등을 예로 들 수 있다. 티로신은, 물에 용해되기 어려우므로, 티로신염을 사용하는 것이 바람직하고, 나트륨염이 보다 바람직하다. 전구체는, 1종을 단독으로 사용할 수도 있고, 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다.

반응액 중의 티로신, 그 염, 또는 그 에스테르의 농도는, 약 0.5∼10(w/v%)가 바람직하고, 약 1∼7(w/v%)가 보다 바람직하고, 약 2∼5(w/v%)가 더욱 바람직하다. 전술한 범위에 있으면, 양호한 효율로, 페놀을 제조할 수 있다.

완충액으로서는, 인산 버퍼, 트리스 버퍼, 탄산 버퍼 등을 예로 들 수 있다. 완충액의 농도는, 약 10∼150 mM이 바람직하다.

무기염 배지로서는, 인산 제1 칼륨, 인산 제2 칼륨, 황산 마그네슘, 염화 나트륨, 질산 제1 철, 황산 망간, 황산 아연, 황산 코발트, 탄산칼슘 등의 무기염의 1종 또는 2종 이상을 포함하는 배지를 예로 들 수 있다. 그 중에서도, 황산 마그네슘을 포함하는 배지가 바람직하다. 무기염 배지로서 구체적으로는, BT 배지[Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8: 91-103(2004)] 등을 예로 들 수 있다. 무기염류의 배지 중의 농도는, 사용하는 무기염에 따라 상이하지만, 통상, 약 0.01∼1(w/v%)로 하면 된다.

반응액의 pH는 약 6∼8이 바람직하다. 반응 중에는, 암모니아수 용액, 수산화 나트륨 수용액 등을 사용하여, pH 컨트롤러(예를 들면, 에이블가부시키가이샤 제조, 모델형：DT-1023)에 의해, 반응액의 pH를 중성 부근, 특히 약 7로 컨트롤하면서 반응시키는 것이 바람직하다.

반응 조건

반응 온도, 즉 반응 중의 형질 전환체의 생존 온도는, 약 20∼50 ℃가 바람직하고, 약 25∼47 ℃가 보다 바람직하다. 전술한 온도 범위에서, 양호한 효율로 페놀을 제조할 수 있다.

또한, 반응 시간은, 약 1∼7 일간이 바람직하고, 약 1∼3 일간이 보다 바람직하다.

배양은, 배치식(batch type), 유가식(fed-batch type), 연속식(continuous type)의 어는 방식으로 행해도 된다. 그 중에서도, 배치식이 바람직하다.

＜환원 조건＞

반응은, 호기적 조건에서 행해도 되고, 환원 조건에서 행해도 되지만, 환원 조건에서 행하는 것이 바람직하다. 환원 조건에서는, 코리네형 세균은 실질적으로 증식하지 않고, 한층 효율적으로 페놀을 생산시킬 수 있다.

환원 조건은, 반응액의 산화 환원 전위로 규정된다. 반응액의 산화 환원 전위는, 약-200 mV∼-500 mV가 바람직하고, 약-250 mV∼-500 mV가 보다 바람직하다.

반응액의 환원 상태는 레사주린(resazurin) 지시약(환원 상태이면, 청색으로부터 무색으로 탈색함)으로 간편하게 추정할 수 있으며, 산화 환원 전위차계(예를 들면, BROADLEYJAMES사 제조, ORP Electrodes)를 사용하여 정확하게 측정할 수 있다.

환원 조건에 있는 반응액의 조정 방법은, 공지의 방법을 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들면, 반응액 조제용 액체 매체로서, 증류수 등을 대신하여 반응액용 수용액을 사용해도 되고, 반응액용 수용액의 조정 방법은, 예를 들면, 황산 환원 미생물 등의 절대 혐기성 미생물용의 배양액 조정 방법(Pfennig, N. et al.(1981)：The dissimilatory sulfate-reducing bacteria, In The Prokaryotes, A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria, Ed. By Starr, M.P. et al. p926-940, Berlin, Springer Verlag.)이나 「농예화학 실험서 제3권, 쿄토 대학 농학부 농예화학 교실편, 1990년 제26쇄, 산업 도서 가부시키가이샤 출판」등을 참고하여, 원하는 환원 조건 하의 수용액을 얻을 수 있다.

구체적으로는, 증류수 등을 가열 처리나 감압 처리하여 용해 가스를 제거함으로써, 환원 조건의 반응액용 수용액을 얻을 수 있다. 이 경우에, 약 10 mmHg 이하, 바람직하게는 약 5 mmHg 이하, 보다 바람직하게는 약 3 mmHg 이하의 감압 하에서, 약 1∼60 분 정도, 바람직하게는 약 5∼40 분 정도, 증류수 등을 처리함으로써, 용해 가스, 특히 용해 산소를 제거하여 환원 조건 하의 반응액용 수용액을 제조할 수 있다.

또한, 적절한 환원제(예를 들면, 티오글리콜산, 아스코르브산, 시스테인 염산염, 머캅토아세트산, 티올아세트산, 글루타티온, 황화 소다 등)를 첨가하여 환원 조건의 반응액용 수용액을 조정할 수도 있다. 이들 방법을 적절하게 조합하는 것도 유효한 환원 조건의 반응액용 수용액의 조정 방법이다.

반응 중에도 반응액을 환원 조건으로 유지하는 것이 바람직하다. 반응 도중에 환원 조건을 유지하기 위하여, 반응계 외부로부터의 산소의 혼입을 가능한 한 방지하는 것이 바람직하고, 구체적으로는, 반응계를 질소 가스 등의 불활성 가스나 탄산 가스 등으로 봉입(封入)하는 방법을 예로 들 수 있다. 산소 혼입을 보다 효과적으로 방지하는 방법으로서는, 반응 도중에 본 발명의 호기성 세균의 균체 내의 대사 기능을 효율적으로 기능시키기 위하여, 반응계의 pH 유지 조정액의 첨가나 각종 영양소 용해액을 적절하게 첨가할 필요도 있지만, 이와 같은 경우에는 첨가 용액으로부터 산소를 사전에 제거하여 두는 것이 유효하다.

페놀의 회수

전술한 바와 같이 배양함으로써, 반응액 중에 페놀이 생산된다. 반응액을 회수함으로써 페놀을 회수할 수 있지만, 또한 공지의 방법으로 페놀을 반응액으로부터 분리할 수도 있다. 이와 같은 공지의 방법으로서, 증류법, 막투과법, 유기용매 추출법 등을 예로 들 수 있다.

[실시예]

이하에서, 본 발명을 실시예에 의해 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 페놀 생산 유전자의 클로닝과 발현

(1) 미생물로부터의 염색체 DNA 의 추출

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) R (FERM P-18976)로부터의 염색체 DNA 추출은, A 배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄.7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄.7H₂O + 0.042%(w/v) MnSO₄.2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml, yeast extract 2g, vitamin assay casamino acid 7g을 증류수 1L에 용해시킴]에, 탄소원으로서 최종 농도 4%로 되도록 50%(w/v) 글루코오스 용액을 첨가하고, 백금이(platinum loop)를 사용하여 식균한 후, 지수 증식기까지 33℃에서 진탕 배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아마샴사 제조)를 사용하여, 취급 설명서에 따라 집균한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

판토에아 아글로메란스(Pantoea agglomerans) NBRC 12686으로부터의 염색체 DNA 추출은, NBRC Medium No.802 배지[polypeptone 10g, yeast extract 2g, MgSO₄·7H₂O 1g을 증류수 1L에 용해시킴]에, 백금이를 사용하여 식균한 후, 지수 증식기까지 30℃에서 진탕 배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아마샴사 제조)를 사용하여, 취급 설명서에 따라 집균한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

(2) 클로닝 벡터의 구축

클로닝 벡터 pCRB22 의 구축

코리네박테리움 카제이 JCM12072 유래의 플라스미드 pCASE1의 DNA 복제 기점(이후, pCASE1-ori라고 함) 서열, 및 클로닝 벡터 pHSG298(다카라 바이오 가부시키가이샤 제조)을 각각 포함하는 DNA 단편을 이하의 PCR법에 의해 증폭했다.

PCR을 행할 때, pCASE1-ori 서열, 클로닝 벡터 pHSG298을 각각 클론화할 수 있도록, 서열 번호 1(pCASE1-ori 서열), 서열 번호 2(클로닝 벡터-pHSG298)를 바탕으로, 각각 하기 한쌍의 프라이머를 합성하여, 사용하였다.

pCASE1-ori 서열 증폭용 프라이머

(a-1)；5'-AT AGATCT AGAACGTCCGTAGGAGC-3' (서열 번호 3)

(b-1)；5'-AT AGATCT GACTTGGTTACGATGGAC-3' (서열 번호 4)

그리고, 프라이머 (a-1) 및 (b-1)에는, BglII 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

클로닝 벡터 pHSG298 증폭용 프라이머

(a-2)；5'-AT AGATCT AGGTTTCCCGACTGGAAAG-3' (서열 번호 5)

(b-2)；5'-AT AGATCT CGTGCCAGCTGCATTAATGA-3' (서열 번호 6)

그리고, 프라이머 (a-2) 및 (b-2)에는, BglII 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

주형 DNA는, Japan. Collection of Microorganisms(JCM)로부터 입수한 코리네박테리움 카제이 JCM12072로부터 추출한 전체 DNA 및 클로닝 벡터 pHSG298(다카라 바이오 가부시키가이샤 제조)을 사용하였다.

실제 PCR은, 서멀 사이클러(thermal cycler) GeneAmp PCR System 9700(어플라이드·바이오시스템즈사 제조)을 사용하고, 반응 시약으로서 TaKaRa LA Taq(다카라 바이오 가부시키가이샤 제조)를 사용하여 하기 조건에서 행하였다.

이상을 혼합하여, 이 50㎕의 반응액을 PCR에 제공하였다.

*) pCASE1-ori 서열을 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-1)과 (b-1)을 조합하여 행하였고, 클로닝 벡터 pHSG298을 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-2)와 (b-2)를 조합하여 행하였다.

이상을 1 사이클로 하여, 30 사이클 행하였다.

상기에서 생성된 반응액 10㎕를 0.8% 아가로스겔에 의해 전기 영동을 행하여, pCASE1-ori 서열의 경우 약 1.4-kb의 DNA 단편을, 클로닝 벡터 pHSG298의 경우, 약 2.7-kb의 DNA 단편을 검출할 수 있었다.

상기 PCR에 의해 증폭된 코리네박테리움 카제이주 유래의 플라스미드 pCASE1-ori 서열을 포함하는 약 1.4-kb의 DNA 단편 10㎕ 및 클로닝 벡터 pHSG298을 포함하는 약 2.7-kb의 DNA 단편 10㎕를 각각 제한 효소 BglII로 절단하고, 70℃에서 10분 처리시킴으로써 제한 효소를 실활시킨 후, 양 측을 혼합하고, 여기에 T4 DNA 리가아제 10×완충액 1㎕, T4 DNA 리가아제(다카라 바이오 가부시키가이샤 제조) 1 unit의 각 성분을 첨가하고, 멸균 증류수로 10㎕로 만들고, 15℃에서 3시간 반응시켜, 결합시켰다. 이것을 라이게이션 A액으로 하였다.

얻어진 라이게이션 A액을, 염화 칼슘법[Journal of Molecular Biology, 53, 159(1970)]에 의해 에쉐리키아 콜라이 JM109를 형질 전환하고, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 LB 한천 배지[1% 폴리 펩톤, 0.5% 효모 엑기스, 0.5% 염화 나트륨, 및 1.5% 한천]에 도포했다.

배지 상의 생육주를 통상적인 방법에 의해 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 상기 플라스미드를 제한 효소 BglII로 각각 절단하여, 삽입 단편을 확인하였다. 그 결과, 클로닝 벡터 pHSG298 약 2.7-kb의 DNA 단편뿐만 아니라, pCASE-ori 서열의 약 1.4-kb의 DNA 단편이 확인되었다.

pCASE1-ori 서열을 포함하는 클로닝 벡터를 pCRB22로 명명했다.

클로닝 벡터 pCRB207 의 구축

코리네박테리움 글루타미쿰 R 유래의 글리세르알데히드 3인산 데히드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 gapA 유전자의 프로모터 서열(이후, PgapA라고 함)을 포함하는 DNA 단편, 및 클로닝 벡터 pKK223-3(파마시아사 제조) 유래 rrnBT1T2 양방향 터미네이터 서열(이후, 터미네이터 서열 라고 함)을 포함하는 DNA 단편을 이하의 방법에 의해 증폭했다.

PCR을 행할 때, PgapA 서열 및 터미네이터 서열을 각각 클론화할 수 있도록, 서열 번호 7(PgapA 서열), 서열 번호 8(터미네이터 서열)을 바탕으로, 각각 하기 한쌍의 프라이머를 합성하여, 사용하였다.

PgapA 서열 증폭용 프라이머

(a-3)；5'-CTCT GTCGAC CCGAAGATCTGAAGATTCCTG-3' (서열 번호 9)

(b-3)；5'-CTCT GTCGAC GGATCC CCATGG TGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG-3'

(서열 번호 10)

그리고, 프라이머 (a-3)에는, SalI 제한 효소 부위가, 프라이머 (b-3)에는, SalI, BamHI 및 NcoI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

터미네이터 서열 증폭용 프라이머

(a-4)；5'-CTCT GCATGC CCATGG CTGTTTTGGCGGATGAGAGA-3' (서열 번호 11)

(b-4)；5'-CTCT GCATGC TCATGA AAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG-3

(서열 번호 12)

그리고, 프라이머 (a-4)에는, SphI 및 NcoI 제한 효소 부위가, 프라이머 (b-4)에는, SphI 및 BspHI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

주형 DNA는, 코리네박테리움 글루타미쿰 R(FERM P-18976)로부터 추출한 염색체 DNA 및 pKK223-3 플라스미드(파마시아사 제조)를 사용하였다.

실제 PCR은, 서멀 사이클러 GeneAmp PCR System 9700(어플라이드·바이오시스템즈사 제조)을 사용하고, 반응 시약으로서 TaKaRa LA Taq(다카라 바이오 가부시키가이샤 제조)를 사용하여 하기 조건에서 행하였다.

이상을 혼합하여, 이 50㎕의 반응액을 PCR에 제공하였다.

*) PgapA 서열을 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-3)과 (b-3)을 조합하여 행하였고, 터미네이터 서열을 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-4)와 (b-4)를 조합하여 행하였다.

이상을 1 사이클로 하여, 30 사이클 행하였다.

상기에서 생성된 반응액 10㎕를 0.8% 아가로스겔에 의해 전기 영동을 행하여, PgapA 서열의 경우 약 0.6-kb의 DNA 단편을, 터미네이터 서열의 경우 약 0.4-kb의 DNA 단편을 검출할 수 있었다.

상기 PCR에 의해 증폭된 코리네박테리움 글루타미쿰 R 유래 PgapA 서열을 포함하는 약 0.6-kb의 DNA 단편 10㎕와 클로닝 벡터 pCRB22 약 4.1-kb를 각각 제한 효소 SalI로 절단하고, 70℃에서 10분 처리시킴으로써 제한 효소를 실활시킨 후, 양 측을 혼합하고, 여기에 T4 DNA 리가아제 10×완충액 1㎕, T4 DNA 리가아제(다카라 바이오 가부시키가이샤 제조) 1 unit의 각 성분을 첨가하고, 멸균 증류수로 10㎕로 만들고, 15℃에서 3시간 반응시켜, 결합시켰다. 이것을 라이게이션 B액으로 하였다.

얻어진 라이게이션 B액을, 염화 칼슘법[Journal of Molecular Biology, 53, 159(1970)]에 의해 에쉐리키아 콜라이 JM109를 형질 전환하고, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 LB 한천 배지[1% 폴리 펩톤, 0.5% 효모 엑기스, 0.5% 염화 나트륨, 및 1.5% 한천]에 도포했다.

배지 상의 생육주를 통상적인 방법에 의해 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 상기 플라스미드를 제한 효소 SalI로 각각 절단하여, 삽입 단편을 확인하였다. 그 결과, 클로닝 벡터 pCRB22 약 4.1-kb의 DNA 단편뿐만 아니라, PgapA 서열)의 약 0.6-kb의 DNA 단편이 확인되었다.

PgapA 서열을 포함하는 클로닝 벡터를 pCRB206으로 명명했다.

상기 PCR에 의해 증폭된 pKK223-3 플라스미드 유래 터미네이터 서열을 포함하는 약 0.4-kb의 DNA 단편 10㎕를 제한 효소 NcoI 및 BspHI로 절단하고, 전술한 클로닝 벡터 pCRB2062㎕를 제한 효소 NcoI로 절단하고, 70℃에서 10분 처리시킴으로써 제한 효소를 실활시킨 후, 양 측을 혼합하고, 여기에 T4 DNA 리가아제 10×완충액 1㎕, T4 DNA 리가아제(다카라 바이오 가부시키가이샤 제조) 1 unit의 각 성분을 첨가하고, 멸균 증류수로 10㎕로 만들고, 15℃에서 3시간 반응시켜, 결합시켰다. 이것을 라이게이션 C액으로 하였다.

얻어진 라이게이션 C액을, 염화 칼슘법[Journal of Molecular Biology, 53, 159(1970)]에 의해 에쉐리키아 콜라이 JM109를 형질 전환하고, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 LB 한천 배지[1% 폴리 펩톤, 0.5% 효모 엑기스, 0.5% 염화 나트륨, 및 1.5% 한천]에 도포했다.

배지 상의 생육주를 통상적인 방법에 의해 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 상기 플라스미드를 제한 효소로 절단하여, 삽입 단편을 확인하였다. 그 결과, 클로닝 벡터 pCRB206 약 4.7-kb의 DNA 단편뿐만 아니라, 터미네이터 서열의 약 0.4-kb의 DNA 단편이 확인되었다.

rrnBT1T2 터미네이터 서열을 포함하는 클로닝 벡터를 pCRB207로 명명했다.

클로닝 벡터 pCRB209 의 구축

코리네박테리움 글루타미쿰 R 유래의 gapA(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase A) 유전자의 프로모터(이후, PgapA라고 함) 서열을 포함하는 DNA 단편을 이하의 방법에 의해 증폭했다.

PCR을 행할 때, pCRB207 서열을 클론화할 수 있도록, 서열 번호 13(pCRB207)을 바탕으로, 각각 하기 한쌍의 프라이머를 합성하여, 사용하였다.

pCRB207 서열 증폭용 프라이머

(a-5)；5'-CTCT CATATG CTGTTTTGGCGGATGAGAG-3' (서열 번호 14)

(b-5)；5'-CTCT CATATG GTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG-3'

(서열 번호 15)

그리고, 프라이머 (a-5) 및 (b-5)에는 NdeI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

주형 DNA는, gapA 프로모터 및 rrnBT1T2 터미네이터 서열을 함유하는 클로닝 벡터 pCRB207를 사용하였다.

실제 PCR은, 서멀 사이클러 GeneAmp PCR System 9700(어플라이드·바이오시스템즈사 제조)을 사용하고, 반응 시약으로서 TaKaRa LA Taq(타카라주조 가부시키가이샤 제조)를 사용하여 하기 조건에서 행하였다.

이상을 혼합하여, 이 50㎕의 반응액을 PCR에 제공하였다.

*) pCRB207 서열을 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-5)와 (b-5)를 조합하여 행하였다.

이상을 1 사이클로 하여, 30 사이클 행하였다.

상기에서 생성된 반응액 10㎕를 0.8% 아가로스겔에 의해 전기 영동을 행하여, 클로닝 벡터 pCRB207 서열을 포함하는 약 5.1-kb의 DNA 단편을 검출하였다.

상기 PCR에 의해 증폭된 pCRB207 유래 유전자를 포함하는 약 5.1-kb의 DNA 단편 10㎕를 제한 효소 NdeI로 절단하고, 70℃에서 10분 처리시킴으로써 제한 효소를 실활시킨 후, 여기에 T4 DNA 리가아제 10×완충액 1㎕, T4 DNA 리가아제(타카라주조 가부시키가이샤 제조) 1 unit의 각 성분을 첨가하고, 멸균 증류수로 10㎕로 만들고, 15℃에서 3시간 반응시켜, 결합시켰다. 이것을 라이게이션 D액으로 하였다.

얻어진 라이게이션 D액을, 염화 칼슘법[Journal of Molecular Biology, 53, 159(1970)]에 의해 에쉐리키아 콜라이 JM109를 형질 전환하고, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 LB 한천 배지[1% 폴리 펩톤, 0.5% 효모 엑기스, 0.5% 염화 나트륨, 및 1.5% 한천]에 도포했다.

이 배지 상의 생육주를 통상적인 방법에 의해 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 상기 플라스미드를 제한 효소 NdeI로 절단하고, 제한 효소 사이트의 삽입을 확인하였다.

PgapA 서열 및 rrnBT1T2 터미네이터 서열을 포함하는 클로닝 벡터를 pCRB209로 명명했다.

(3) 페놀 생산 유전자의 클로닝

판토에아 아글로메란스 유래의 페놀 생산 유전자의 클로닝

판토에아 아글로메란스 유래의 티로신 페놀-리아제 활성을 가지는 유전자를 코딩하는 tpl 유전자를 포함하는 DNA 단편을 이하의 PCR법에 의해 증폭했다.

PCR을 행할 때, tpl 유전자를 클론화할 수 있도록, 서열 번호 16(판토에아 아글로메란스 tpl 유전자)을 바탕으로, 각각 하기 한쌍의 프라이머를, 어플라이드·바이오시스템즈(Applied Biosystems)사에서 제조한 「394 DNA/RNA 합성기(synthesizer)」를 사용하여 합성하여, 사용하였다.

tpl 유전자 증폭용 프라이머

(a-6)；5'-CTCT CATATG AACTATCCTGCCGAGC-3' (서열 번호 17)

(b-6)；5'-CTCT CATATG TTAAATAAAGTCAAAACGCGCAGTAAAG-3'

(서열 번호 18)

그리고, 프라이머 (a-6) 및 (b-6)에는, NdeI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

주형 DNA는, 판토에아 아글로메란스는, NITE Biological Resource Center(NBRC)로부터 입수한 판토에아 아글로메란스 NBRC 12686으로부터 추출한 염색체 DNA를 사용하였다.

이상을 혼합하여, 이 50㎕의 반응액을 PCR에 제공하였다.

*) 판토에아 아글로메란스 tpl 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-6)과 (b-6)을 조합하여 행하였다.

이상을 1 사이클로 하여, 30 사이클 행하였다.

상기에서 생성된 반응액 10㎕를 0.8% 아가로스겔에 의해 전기 영동을 행하여, 판토에아 아글로메란스 tpl 유전자의 경우 약 1.4-kb의 DNA 단편을 검출하였다.

(4) 페놀 생산 유전자 발현 플라스미드의 구축

페놀 생산 유전자의 pCRB209 로의 클로닝

상기 항 (3)에 나타낸 PCR에 의해 증폭된 판토에아 아글로메란스주 유래 tpl 유전자를 포함하는 약 1.4-kb의 DNA 단편 10㎕ 및 PgapA 프로모터를 함유하는 클로닝 벡터 pCRB209 2㎕를 각각 제한 효소 NdeI로 절단하고, 70℃에서 10분 처리시킴으로써 제한 효소를 실활시킨 후, 양 측을 혼합하고, 여기에 T4 DNA 리가아제 10×완충액 1㎕, T4 DNA 리가아제(다카라 바이오 가부시키가이샤 제조) 1 unit의 각 성분을 첨가하고, 멸균 증류수로 10㎕로 만들고, 15℃에서 3시간 반응시켜, 결합시켰다. 이것을 라이게이션 E액으로 하였다.

얻어진 라이게이션 E액을, 염화 칼슘법[Journal of Molecular Biology, 53, 159(1970)]에 의해 에쉐리키아 콜라이 JM109를 형질 전환하고, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 LB 한천 배지[1% 폴리 펩톤, 0.5% 효모 엑기스, 0.5% 염화 나트륨, 및 1.5% 한천]에 도포했다.

각각 배지 상의 생육주를 통상적인 방법에 의해 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 상기 플라스미드를 제한 효소로 각각 절단하여, 삽입 단편을 확인하였다. 그 결과, 플라스미드 pCRB209 약 5.1-kb의 DNA 단편뿐만 아니라, 판토에아 아글로메란스주 유래 tpl 유전자(라이게이션 E액)의 경우, 길이 약 1.4-kb의 삽입 단편이 확인되었다.

판토에아 아글로메란스주 유래 tpl 유전자를 포함하는 플라스미드를 pCRB209-tpl/PA로 명명했다(도 1).

(5) 코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체 유전자 파괴용 플라스미드의 구축

코리네박테리움 글루타미쿰주 poxF 유전자 파괴용 플라스미드의 구축

코리네박테리움 글루타미쿰주의 염색체 상 poxF 유전자의 마커리스(markerless) 파괴용 플라스미드를 구축하기 위해 필요한 DNA 단편을 이하의 PCR법에 의해 증폭했다.

PCR을 행할 때 코리네박테리움 글루타미쿰 R의 서열을 바탕으로, 각각 하기 한쌍의 프라이머를, 어플라이드·바이오시스템즈(Applied Biosystems)사에서 제조한 「394 DNA/RNA 합성기(synthesizer)」를 사용하여 합성하여, 사용하였다.

poxF-1 영역 증폭용 프라이머

(a-7)；5'-CTCT TCTAGA TACGTCCTAAACACCCGAC-3' (서열 번호 19)

(b-7)；5'-GACCAACCATTGCTGACTTGCGTATCCATAGTCAGGCTTC-3'

(서열 번호 20)

그리고, 프라이머 (a-7)에는, XbaI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

poxF-2 영역 증폭용 프라이머

(a-8)；5'-CAAGTCAGCAATGGTTGGTC-3' (서열 번호 21)

(b-8)；5'-CTCT TCTAGA TGATCAGTACCAAGGGTGAG-3'

(서열 번호 22)

그리고, 프라이머 (b-8)에는, XbaI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

주형 DNA는, 코리네박테리움 글루타미쿰 R로부터 추출한 염색체 DNA를 사용하였다.

이상을 혼합하고, 이 50㎕의 반응액을 PCR에 제공하였다.

*) poxF-1 영역을 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-7)과 (b-7)을 조합하여, poxF-2 영역을 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-8)과 (b-8)을 조합하여 행하였다.

이상을 1 사이클로 하여, 30 사이클 행하였다.

상기에서 생성된 반응액 10㎕를 0.8% 아가로스겔에 의해 전기 영동을 행하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 poxF-1 영역의 경우 약 0.8-kb의 DNA 단편을, poxF-2 영역의 경우 약 0.8-kb의 DNA 단편을 검출할 수 있었다.

다음으로, 상기 PCR에 의해 증폭된 poxF-1 영역 단편과 poxF-2 영역 단편을 1㎕씩 혼합하고, PCR에 의해 2종의 단편의 결합 반응을 행하였다.

이상을 혼합하고, 이 50㎕의 반응액을 PCR에 제공하였다.

*) poxF-1 영역 단편과 poxF-2 영영 단편으로 행하였다.

이상을 1 사이클로 하여, 30 사이클 행하였다.

또한, 얻어진 poxF-1 및 poxF-2의 결합 단편을 주형으로 하여, PCR에 의해 poxF 결실 단편의 증폭을 행하였다.

이상을 혼합하고, 이 50㎕의 반응액을 PCR에 제공하였다.

*) poxF 결실 단편을 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-7)과 (b-8)을 조합하여 행하였다.

이상을 1 사이클로 하여, 30 사이클 행하였다.

상기에서 생성된 반응액 10㎕를 0.8% 아가로스겔에 의해 전기 영동을 행하여, poxF 결실 단편 약 1.6-kb를 검출할 수 있었다.

상기 PCR에 의해 증폭된 코리네박테리움 글루타미쿰 R 유래 poxF 결실 서열 약 1.7-kb의 DNA 단편 10㎕와 약 4.4-kb의 마커리스 염색체 유전자 도입용 플라스미드 pCRA725[J. Mol. Microbiol. Biotechnol., Vol. 8,243-254(2004), (일본 특허출원 공개번호 2006-124440] 2㎕를 각각 제한 효소 XbaI로 절단하고, 70℃에서 10분 처리시킴으로써 제한 효소를 실활시킨 후, 양 측을 혼합하고, 여기에 T4 DNA 리가아제 10×완충액 1㎕, T4 DNA 리가아제(다카라 바이오 가부시키가이샤 제조) 1 unit의 각 성분을 첨가하고, 멸균 증류수로 10㎕로 만들고, 15℃에서 3시간 반응시켜, 결합시켰다. 이것을 라이게이션 F액으로 하였다.

얻어진 라이게이션 F액을, 염화 칼슘법[Journal of Molecular Biology, 53, 159(1970)]에 의해 에쉐리키아 콜라이 JM109를 형질 전환하고, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 LB 한천 배지[1% 폴리 펩톤, 0.5% 효모 엑기스, 0.5% 염화 나트륨, 및 1.5% 한천]에 도포했다.

배지 상의 생육주를 통상적인 방법에 의해 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 상기 플라스미드를 제한 효소 XbaI로 각각 절단하여, 삽입 단편을 확인하였다. 그 결과, 플라스미드 pCRA725 약 4.4-kb의 DNA 단편뿐만 아니라, 코리네박테리움 글루타미쿰주 유래 poxF 결실 유전자(라이게이션 F액)의 경우, 길이 약 1.7-kb의 삽입 단편이 확인되었다.

코리네박테리움 글루타미쿰주 유래 poxF 결실 유전자를 포함하는 플라스미드를 pCRA725-poxF/CG로 명명했다.

(6) 페놀 분해와 관련된 유전자 파괴주의 구축

마커리스 염색체 유전자 도입용 벡터 pCRA725는, 코리네박테리움 글루타미쿰 R 내에서 복제 불가능한 플라스미드이다. pCRA725-poxF/CG를 사용하여, 전기 펄스법[Agric. Biol. Chem., Vol. 54,443-447(1990) 및 Res. Microbiol., Vol. 144,181-185(1993)]에 의해, 코리네박테리움 글루타미쿰 R을 형질 전환하고, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 A 한천 배지[A 액체 배지, 및 1.5% 한천]에 도포했다.상기 배지에서 얻어진 단일 교차주를, 10%(W/V) 수크로오스 함유 BT 한천 배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄.7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄.7H₂O + 0.042%(w/v) MnSO₄.2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml를 증류수 1L에 용해, 및 1.5% 한천]에 도포했다.

플라스미드 pCRA725-poxF/CG가 염색체 상의 상동 영역과의 단일 교차주인 경우, pCRA725-poxF/CG 상의 카나마이신 내성 유전자의 발현에 의한 카나마이신 내성과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 sacR-sacB 유전자의 발현에 의한 수크로오스 함유 배지에서의 치사성을 나타내는 데 비해, 이중 교차주의 경우, pCRA725-poxF/CG 상의 카나마이신 내성 유전자의 탈락에 의한 카나마이신 감수성과 sacR-sacB 유전자의 탈락에 의한 수크로오스 함유 배지에서의 생육성을 나타낸다. 따라서, 마커리스 염색체 유전자 파괴주는, 카나마이신 감수성 및 수크로오스 함유 배지 생육성을 나타낸다.

이에, 카나마이신 감수성 및 수크로오스 함유 배지 생육성을 나타낸 주를 선택하였다. 이 코리네박테리움 글루타미쿰 R주 poxF 유전자 마커리스 파괴주를 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)ΔpoxF로 명명했다.

(7) 페놀 생산 유전자 도입주의 구축

전술한 플라스미드 pCRB209-tpl/PA를 사용하여, 전기 펄스법[Agric. Biol. Chem., Vol. 54,443-447(1990) 및 Res. Microbiol., Vol. 144,181-185(1993)]에 의해, 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔpoxF주를 형질 전환하고, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 A 한천 배지에 도포했다.

이 배지 상의 생육주를 통상적인 방법에 의해 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 상기 플라스미드를 제한 효소로 절단하고, 삽입 플라스미드를 확인하였다. 그 결과, 상기에서 제조된 플라스미드 pCRB209-tpl/PA의 도입이 확인되었다.

얻어진 주를 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) PHE31로 명명했다.

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) PHE31은, 일본국 지바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8(우편 번호 292-0818)의 독립 행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 생물 기탁 센터에 기탁했다(수탁일：2010년 11월 2일, 수탁 번호：NITE BP-999).

실시예 2 코리네박테리움 글루타미쿰페놀 생산 유전자 도입주 및 부산물 경로 파괴주의 페놀 생성 실험

실시예 1에서 제조한 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE31주(페놀 생산 유전자 발현 플라스미드 pCRB209-tpl/PA를 도입한 poxF 염색체 유전자 마커리스 파괴주)를, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 A 한천 배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄.7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄.7H₂O + 0.042%(w/v) MnSO₄.2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml, yeast extract 2g, vitamin assay casamino acid 7g, glucose 40g, 한천 15g을 증류수 1L에 현탁시킴]에 도포하고, 28℃에서, 20시간 암소(暗所)에 정치(靜置)했다.

상기 플레이트에서 생육한 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE31주를, 카나마이신 50μg/ml를 함유한 A 액체 배지 10ml가 들어간 시험관에 일백금이 식균하고, 28℃에서 15시간, 호기적으로 진탕 배양을 행하였다.

상기 조건에서 생육한 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE31주를, 카나마이신 50μg/ml를 함유한 A 액체 배지 500ml가 들어간 용량 2L의 삼각 플라스크에 식균하고, 28℃에서 15시간, 호기적으로 진탕 배양을 행하였다.

이와 같이 하여 배양 증식된 각각의 균체는, 원심분리(4℃, 5,000×g, 15분)에 의해 균체를 회수했다. 얻어진 균체를, 최종 균체 농도 10%가 되도록 BT(-요소) 액체 배지[0.7% 황산 암모늄, 0.05% 인산 이수소칼륨, 0.05% 인산 수소 2칼륨, 0.05% 황산 마그네슘·7수화물, 0.0006% 황산 철·7수화물, 0.00042% 황산 망간 수화물, 0.00002% 비오틴, 0.00002% 티아민 염산염]에 50ml 현탁시켰다. 이 균체 현탁액을 용량 100ml의 배지병(medium bottle)에 넣어 환원 조건 하(산화 환원 전위；-450 mV)에서, 반응 개시로부터 각각 0, 1, 3, 10 시간 후에, 기질로서 40 mM의 L-티로신 2나트륨염을 축차적으로 첨가하고, 33℃로 유지한 수욕 중에 교반하면서 반응시켰다.

샘플링한 반응액을 원심분리(4℃, 15,000×g, 10분)하여, 얻어진 상청액을 사용하여 페놀의 정량을 행하였다.

그 결과, 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE31주는, 환원 조건 하의 반응에 있어서, 24시간 후에 34 mM의 페놀을 생성하였다.

실시예 3 페놀 생산용 숙주로서의 적성 시험

페놀에 의한 호기 증식에 대한 영향

코리네박테리움 글루타미쿰, 에쉐리키아 콜라이 및 슈도모나스 푸티다에 대하여, 호기 배양에 있어서의 페놀의 생육 저해 시험을 행하였다. 그리고, 본 시험에 사용한 슈도모나스 푸티다 S12는, 용매 내성균으로서 보고되어 있으며, 지금까지 페놀 생산의 유일한 숙주로서 이용된 기술에 대하여 개시되어 있다.

코리네박테리움 글루타미쿰 R을 A 한천 배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄.7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄.7H₂O + 0.042%(w/v) MnSO₄.2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml, yeast extract 2g, vitamin assay casamino acid 7g, glucose 40g, 한천 15g을 증류수 1L에 현탁시킴]에 도포하고, 33℃에서, 15시간 암소에 정치했다.

상기 플레이트에서 생육한 코리네박테리움 글루타미쿰 R을, A 액체 배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄.7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄.7H₂O + 0.042%(w/v) MnSO₄.2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml, yeast extract 2g, vitamin assay casamino acid 7g, glucose 40g을 증류수 1L에 용해시킴] 10ml가 들어간 시험관에 일백금이 식균하고, 33℃에서 13시간, 호기적으로 진탕 배양을 행하였다.

상기 조건에서 생육한 코리네박테리움 글루타미쿰 R을, A 액체 배지 100ml에 초기 균체 농도 OD₆₁₀=0.05가 되도록 식균하고, 동시에 페놀이 최종 농도 0, 0.16, 0.2, 0.24, 0.32 mM가 되도록 첨가하고, 33℃에서 호기적으로 진탕 배양을 행하였다. 균체의 생육은 OD₆₁₀의 흡광도를 측정함으로써 행하였다.

에쉐리키아 콜라이 JM109를 LB 한천 배지[1% 폴리 펩톤, 0.5% 효모 엑기스, 0.5% 염화 나트륨, 및 1.5% 한천]에 도포하고, 37℃에서, 15시간 암소에 정치했다.

상기 플레이트에서 생육한 에쉐리키아 콜라이 JM109를, LB 액체 배지[1% 폴리 펩톤, 0.5% 효모 엑기스 및 0.5% 염화 나트륨] 10ml가 들어간 시험관에 일백금이 식균하고, 37℃에서 13시간, 호기적으로 진탕 배양을 행하였다.

상기 조건에서 생육한 에쉐리키아 콜라이 JM109를 LB액체 배지 100ml에 초기 균체 농도 OD₆₁₀=0.05가 되도록 식균하고, 동시에 페놀 농도가 최종 농도 0, 0.16, 0.20 mM이 되도록 첨가하고, 37℃에서 호기적으로 진탕 배양을 행하였다. 균체의 생육은 OD₆₁₀의 흡광도를 측정함으로써 행하였다.

슈도모나스 푸티다 F1 및 S12를 LB 한천 배지[1% 폴리 펩톤, 0.5% 효모 엑기스, 0.5% 염화 나트륨, 및 1.5% 한천]에 도포하고, 30℃에서, 15시간 암소에 정치했다.

상기 플레이트에서 생육한 슈도모나스 푸티다 F1 및 S12를, LB(+글루코오스) 액체 배지[1% 폴리 펩톤, 0.5% 효모 엑기스, 0.5% 염화 나트륨 및 0.4% 글루코오스] 10ml가 들어간 시험관에 일백금이 식균하고, 30℃에서 13시간, 호기적으로 진탕 배양을 행하였다.

상기 조건에서 생육한 슈도모나스 푸티다 F1 및 S12주를 LB(+글루코오스) 액체 배지 100ml에 초기 균체 농도 OD₆₁₀=0.05가 되도록 식균하고, 동시에 페놀 농도가 최종 농도 0, 0.10, 0.20 mM이 되도록 첨가하고, 30℃에서 호기적으로 진탕 배양을 행하였다. 균체의 생육은 OD₆₁₀의 흡광도를 측정함으로써 행하였다.

배지 중으로의 페놀 첨가에 의한 호기 증식에 대한 영향을 해석한 결과를 도 2에 나타내었다.

에쉐리키아 콜라이는, 0.16% 페놀 존재 하에서 증식이 현저하게 저해되었고 0.20% 페놀에서는 증식이 완전히 저해되었다.

슈도모나스 푸티다 F1 및 용제 내성균으로서 보고되고 있는 슈도모나스 푸티다 S12는, 대략 동일한 경향을 나타내고, 0.10% 페놀 존재 하에서 증식이 현저하게 저해되었고 0.20% 페놀에서는 증식이 완전히 저해되었다.

이에 비해, 코리네박테리움 글루타미쿰은, 에쉐리키아 콜라이가 현저한 증식 저해를 받은 0.16%의 페놀 존재 하에서도 증식에 대한 영향은 거의 없으며, 에쉐리키아 콜라이나 슈도모나스 푸티다에서는 완전하게 증식이 저해된 0.20%의 페놀 존재 하에서도 양호한 생육을 나타낸다. 또한, 0.24%의 페놀 존재 하에서 증식이 가능했다.

이와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰은 에쉐리키아 콜라이 및 슈도모나스 푸티다에 비해, 페놀에 대하여 높은 내성을 가지고, 페놀 생산의 숙주로서 높은 적성을 가지는 것으로 나타났다.

[산업상 이용가능성]

본 발명의 방법에 의하면, 미생물을 사용하여 실용적인 효율로 티로신으로부터 페놀을 제조할 수 있다.

독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터

NITEBP-999

20101102

SEQUENCE LISTING <110> Green Phenol Technology Research Association <120> Transformant of coryneform group of bacteria and method of producing phenol using thereof <130> C01F3971 <150> JP2010-258089 <151> 2010-11-18 <160> 27 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1195 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> pCASE1-ori <400> 1 atgaaaaccg accgtgcacg ctcgtgtgag aaagtcagct acatgagacc aactacccgc 60 cctgagggac gctttgagca gctgtggctg ccgctgtggc cattggcaag cgatgacctc 120 cgtgagggca tttaccgcac ctcacggaag aacgcgctgg ataagcgcta cgtcgaagcc 180 aatcccgacg cgctctctaa cctcctggtc gttgacatcg accaggagga cgcgcttttg 240 cgctctttgt gggacaggga ggactggaga cctaacgcgg tggttgaaaa ccccttaaac 300 gggcacgcac acgctgtctg ggcgctcgcg gagccattta cccgcaccga atacgccaaa 360 cgcaagcctt tggcctatgc cgcggctgtc accgaaggcc tacggcgctc tgtcgatggc 420 gatagcggat actccgggct gatcaccaaa aaccccgagc acactgcatg ggatagtcac 480 tggatcaccg ataagctgta tacgctcgat gagctgcgct tttggctcga agaaaccggc 540 tttatgccgc ctgcgtcctg gaggaaaacg cggcggttct cgccagttgg tctaggtcgt 600 aattgcgcac tctttgaaag cgcacgtacg tgggcatatc gggaggtcag aaagcatttt 660 ggagacgctg acggcctagg ccgcgcaatc caaaccaccg cgcaagcact taaccaagag 720 ctgtttgatg aaccactacc tgtggccgaa gttgactgta ttgccaggtc aatccataaa 780 tggatcatca ccaagtcacg catgtggaca gacggcgccg ccgtctacga cgccacattc 840 accgcaatgc aatccgcacg cgggaagaaa ggctggcaac gaagcgctga ggtgcgtcgt 900 gaggctggac atactctttg gaggaacatt ggctaaggtt tatgcacgtt atccacgcaa 960 cggaaaaaca gcccgcgagc tggcagaacg tgccggtatg tcggtgagaa cagctcaacg 1020 atggacttcc gaaccgcgtg aagtgttcat taaacgtgcc aacgagaagc gtgctcgcgt 1080 ccaggagctg cgcgccaaag gtctgtccat gcgcgctatc gcggcagaga ttggttgctc 1140 ggtgggcacg gttcaccgct acgtcaaaga agttgaagag aagaaaaccg cgtaa 1195 <210> 2 <211> 2675 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> pHSG298 <400> 2 gaggtctgcc tcgtgaagaa ggtgttgctg actcatacca ggcctgaatc gccccatcat 60 ccagccagaa agtgagggag ccacggttga tgagagcttt gttgtaggtg gaccagttgg 120 tgattttgaa cttttgcttt gccacggaac 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ataccaggat cttgccatcc 1020 tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa acggcttttt caaaaatatg 1080 gtattgataa tcctgatatg aataaattgc agtttcattt gatgctcgat gagtttttct 1140 aatcagaatt ggttaattgg ttgtaacact ggcagagcat tacgctgact tgacgggacg 1200 gcggctttgt tgaataaatc gcattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga 1260 tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga 1320 ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgcc 1380 aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ggatccccgg gtaccgagct cgaattcgta 1440 atcatgtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata 1500 cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta 1560 attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa 1620 tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg gcgaactttt gctgagttga 1680 aggatcagat cacgcatctt cccgacaacg cagaccgttc cgtggcaaag caaaagttca 1740 aaatcagtaa ccgtcagtgc cgataagttc aaagttaaac ctggtgttga taccaacatt 1800 gaaacgctga tcgaaaacgc gctgaaaaac gctgctgaat 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tgtgtttgta tgattttgaa 540 tccgctgcaa aatctttgtt tccccgctaa agttggggac aggttgacac ggagttgact 600 cgacgaatta tccaatgtga gtaggtttgg tgcgtgagtt ggaaaatttc gccatactcg 660 cccttgggtt ctgtcagctc aagaattctt gagtgaccga tgctctgatt gacctaactg 720 cttgacacat tgcatttcct acaatcttta gaggagacac accatggctg ttttggcgga 780 tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg tctgataaaa 840 cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg accccatgcc gaactcagaa 900 gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg gggtctcccc atgcgagagt agggaactgc 960 caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg 1020 tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttgc 1080 gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca taaactgcca ggcatcaaat 1140 taagcagaag gccatcctga cggatggcct ttttgcgttt ctacaaactc tttcatgggg 1200 atccgtcgac ctgcaggcat gcaagcttgg cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact 1260 gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct 1320 ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc 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gttagagagc 4740 gcgtcgggat tggcttcgac gtagcgctta tccagcgcgt tcttccgtga ggtgcggtaa 4800 atgccctcac ggaggtcatc gcttgccaat ggccacagcg gcagccacag ctgctcaaag 4860 cgtccctcag ggcgggtagt tggtctcatg tagctgactt tctcacacga gcgtgcacgg 4920 tcggttttca ttcataatac gacatttaac caagtcagat gtttccccgg tttccggggg 4980 ttcccctgaa gaacccttcc agtgcgagcg aagcgagctc ctttggccgg cgcccctcag 5040 gtagccctct aaggctccca gggctccgcc cctccctgag gttggctcaa gcctcctggt 5100 ggctcctacg gacgttct 5118 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 14 ctctcatatg ctgttttggc ggatgagag 29 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 15 ctctcatatg gtgtctcctc taaagattgt agg 33 <210> 16 <211> 1371 <212> DNA <213> Pantoea agglomerans <400> 16 atgaactatc ctgccgagcc tttccgcatt aaaagtgttg aaaccgtatc aatgatctca 60 cgcgatgagc gtgttaaaaa aatgcaagaa gcgggctata acacgttttt actgaattca 120 aaggatatct acatcgatct gctgacagac agcggtacaa atgccatgag tgacaagcag 180 tgggcaggga 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tgatgctcgt cgtttctgtc cacacctgac gcaggatcag 1080 ttccctgcgc agagcctggc agccagcatc tatatggaaa ccggcgtgcg aagtatggaa 1140 cgtggaattg tttccgccgg tcgtagcaag gaaacggggg agaaccatag ccccaaactg 1200 gagacggtac gtctcactat tccacgccgt gtttacactt acgcgcacat ggatgttatt 1260 gccgatggca tcattaaact gtaccagcat aaagaagata ttcgtggtct gacgtttgtt 1320 tacgaaccta aacaacttcg cttctttact gcgcgttttg actttattta a 1371 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 17 ctctcatatg aactatcctg ccgagc 26 <210> 18 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 18 ctctcatatg ttaaataaag tcaaaacgcg cagtaaag 38 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 19 ctcttctaga tacgtcctaa acacccgac 29 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 20 gaccaaccat tgctgacttg cgtatccata gtcaggcttc 40 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 21 caagtcagca atggttggtc 20 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 22 ctcttctaga tgatcagtac caagggtgag 30 <210> 23 <211> 1371 <212> DNA <213> Citrobacter braakii <400> 23 atgaattatc cggcagaacc cttccgtatt aaaagcgttg aaactgtatc tatgatcccg 60 cgtgatgaac gccttaagaa aatgcaggaa gcgggataca atactttcct gttaaattcg 120 aaagatattt atattgacct gctgacagac agtggcacca acgcaatgag tgacaagcag 180 tgggccggca tgatgatggg tgatgaagcc tacgcgggca gcgaaaactt ctatcatctg 240 gaaagaaccg tgcaggaact gttcggcttt aaacatattg ttcctactca ccaggggcgc 300 ggcgcagaaa acctgttatc gcagctggca attaaaccgg ggcaatatgt tgccgggaat 360 atgtatttca ctaccacccg ttatcaccag gaaaaaaatg gtgcggtgtt tgtcgatatc 420 gttcgtgatg aagcgcacga tgccggtctg aatattgctt ttaaaggtga tatcgatctt 480 aaaaaattac aaaagctgat tgatgaaaaa ggcgccgaga atattgccta tatttgcctg 540 gcagtcacgg ttaacctcgc aggcgggcag ccggtctcca tggctaacat gcgcgcggtg 600 cgtgaactga ctgcagcaca tggcattaaa gtgttctacg acgctacccg ctgcgtagaa 660 aacgcctact ttatcaaaga gcaagagcag ggctttgaga acaagagcat cgcagagatc 720 gtgcatgaga tgttcagcta cgccgacggt tgtaccatga gtggtaaaaa agactgtctg 780 gtgaatatcg gcggcttcct gtgcatgaac gatgacgaaa tgttctcttc tgccaaagag 840 ttagtcgttg tttacgaagg tatgccatct tacggcggcc tggccggacg cgacatggaa 900 gccatggcga ttggtctgcg cgaagccatg cagtatgagt acatcgagca ccgcgtgaag 960 caggttcgct atctgggcga caagctgaaa gccgctggtg taccgattgt tgaaccggtg 1020 ggcggtcatg cggtattcct cgatgcgcgt cgcttctgtg agcatctgac gcaggacgag 1080 ttcccggcgc aaagcctggc tgccagtatc tatgtggaaa ccggcgtacg tagtatggag 1140 cgcggaatta tctctgcggg ccgtaataac gtgaccggtg aacaccacag gccgaaactg 1200 gaaaccgtgc gtctgactat tccacgccgc gtttatactt acgcgcatat ggatgtggtg 1260 gctgacggta ttattaaact ttaccagcac aaagaagata ttcgcgggct gaagtttatt 1320 tacgagccga agcagctccg tttctttact gcacgctttg actatatcta a 1371 <210> 24 <211> 1374 <212> DNA <213> Desulfitobacterium hafniense <400> 24 atgaaaacct atcctgcaga accttttaga attaaagtcg tggaacccgt tcggtcgatg 60 aagcgggcag aacgtgaagc ggccatgaaa gaagcaggct acaacacttt tttgctgaag 120 agtgaggatg tctatattga tctgctcaca gattccggca ctactgccat gagcgataaa 180 caatgggccg gtatgatgat cggtgatgaa gcctatgccg ggagcaggaa tttcctgcac 240 ctggatcggg tggttaaaga atattatggc ttcaagcaca tggtccctac tcatcaagga 300 cggggggcgg aaaacctgct ctcccggctg atgattaaac ccggggatta tgtgcccggc 360 aatatgtatt ttaccaccac aagataccat caggaagcca acggagctac cttcagagat 420 attatcattg atgaagccca tgactcagcc aaccggcatc ctttcaaagg aaatatcgat 480 ctcaggaaac tccagacctt aatcgatgaa gtaggcgcgg agaagattcc ttacatctgc 540 cttgccgtta ctgtcaatct ggccggagga cagcccgttt ctctggaaaa catgaaggcg 600 gtccatgagc ttgcccacaa acacggcatc aaggtgtttt ttgacgctac ccgctgtgtg 660 gagaacgctt acttcatcaa gaagcgggaa gcagactacc aggacaagac catcaaagaa 720 attctcttgg agatgatgag ctatgccgac ggagccacca tgtcgggtaa aaaagattgt 780 atggtcaata tcggcggttt tctggccatg aatgatgatg aattgttcct cagggttaaa 840 gaactggtgg tggtctttga aggaatgcct tcttacggcg gcatggccgg ccgggacatg 900 gaagccatgg ccatcgggat tacggaatcg gtggattatg cttatattga acaccgtgtg 960 gagcaggtgg cctatcttgc cgatcagctt ttagcggcgg gggttcccat tgtggaaccg 1020 gtgggcggcc atgccgtctt ccttgatgcc agacggtttt tgccccacct tgagcaggac 1080 cacttcccgg cacaggctct ggccgcccaa ttatatatag aatccggggt acgctctatg 1140 gaaagaggaa tcatctccgc cggacgtgat cttaaaacag gggaaaaccg ccatcctaaa 1200 ctggagctgg taaggctgac gattccccgc cgggtttata cttacgctca tatggacatc 1260 gtggccagag cggttattga gctttaccag caaagggaga ccatcaaagg gcttaaattt 1320 gtttacgaac cggaaatgct tcgtttcttc accgccagat ttgaacacat ttga 1374 <210> 25 <211> 1419 <212> DNA <213> Chloroflexus aurantiacus <400> 25 atgcaggaac aagactaccc ccgtacaatg gggcaacaat tcggtcggcg gtcgtgggcc 60 gagccgtgga agatcaagat ggttgagccg ctgcgcgtga ccagccgggc cgaacgcgag 120 gcggcgctga aggctgccgg ttacaacacg tttctgctgc gttctgaaga tgtctatatc 180 gatctgctta ccgatagtgg taccaatgcc atgagcgacc ggcaatgggc agccctgatg 240 atgggcgacg aggcatacgc cgggagccgc agtttttatc gcctggaagc aactgtccaa 300 caggtgtatg gctaccgcca cattattccc acccatcagg ggcggggcgc cgagcatctg 360 atcagtcagg tcgctatccg ccgtgggcag tatgttcccg gcaatatgta tttcacaacc 420 acccgcctgc accaggagct ggccggtggc atctttgttg atgtgattat tgacgaagcg 480 cacgatcccc aaagccagta tccgtttaaa ggcaacgtcg atctcgacaa actacaggcg 540 ctgattgata aggttggccc gcaacagatt gcctatatca gtctggccgg taccgtcaac 600 atggctggtg ggcagccggt cagtatggct aacgtccgtg ccttacgcgc attatgtgat 660 cggtacgggt tgcgcatctt tctcgattcc acacgcttgg ttgagaatgc ctttttcatc 720 aaagaacgtg aacccggcta tgccgaacaa agaatcgccg cgattgtccg cgagttttgc 780 agttacaccg atggcgcatg gatgagcgca aagaaggacg cgctggtgaa catcggtggc 840 tggttagcgc tcaacgatga tcaactcgcc gatgaagccc gcaatctggt ggtggtgtac 900 gaagggttgc acacctacgg cggcatggcc gggcgtgata tggaggcgct ggcggtcggg 960 attgaggagt cgctgcaaga ggattacatc cgtgcccgca tcggtcaggt gcgctacctc 1020 ggcgaactgc tcctcgactg ggacatcccc atcgtagttc cgattggcgg tcacgcgatc 1080 tttctggatg cacgccggtt ctatccgcac ctgccgcaag acctcttccc tgcccagacc 1140 ctggccgccg agttgtacct cgattcaggg gtgcgggcta tggaacgcgg tattgccagc 1200 gccggacgcg atcccaagac cgggcagaac tactatccca aactggaatt aacccggctg 1260 accatcccgc gccgtgttta tactcaggcc cacatggatg ttgtggccga gtcggtgaag 1320 gcagtgtacg atcaacgtca tcaggcccgt ggcctgcgga tggtctacga accacggtac 1380 ctccgcttct tccaggcccg gtttgaaccg gtggaatga 1419 <210> 26 <211> 1404 <212> DNA <213> Nostoc punctiforme <400> 26 atgaccgatg ccaagcaaac ttctccgcgc cgccgtcgct cttgggcaga gccatataaa 60 attaaggtgg ttgagccatt aaaaattact actcgcgctg aacgcgaaca ggcgatcgca 120 caagcgggtt acaatacttt tctactacgt tctgaagatg tctatattga tttgctcact 180 gatagcggca cttcagccat gagcgattat cagtgggcag ggatgatgct gggtgatgaa 240 gcttatgccg gcagcaaaaa tttttacaat ttagaagcaa gtatccaaaa gtattacggc 300 tatcgccata ttgtacctac tcaccaaggg cgtggtgcag aaaatattct ttctcaaata 360 ctgatcaaac caggagacta catacctggc aatatgtatt tcaccacaac caggttgcat 420 caggagttag ctggcggcac ttttgtcgat gtgattattg atgaagccca cgatgcccaa 480 tcactgcatc catttaaggg taatgtagac ttacaaaagc ttacagacct aattgagcga 540 gttggggcag aacgtattcc ctatattagc gttgccggaa ccgtgaatat ggctggcgga 600 cagccgattt ctatggctaa cctgcgggcg gtacatcagt tagcccaaac ctacggtatc 660 cgcattattc ttgatgccac ccgcgctgtg gaaaacgctc actttatcca acagcgagag 720 gaggattatt ccagccaagc gatcgctacc atcttacgcg aattttgctc ctataccgac 780 ggttgcacca tgagcggtaa gaaggatgca ctggttaaca tcggcggttg gctggctctt 840 aatgactata atctttacga agaagcacgt aacttaatag taatttatga aggtctacat 900 acttacggtg gtatggctgg ccgggacatg gaagctatgg cacgaggtat agaagaatca 960 gttcaagacg atcatattcg tgcccgtgtc ggtcaggttg agtatcttgg acaaaagctt 1020 ttagattggg gtattccaat tgttgtgccg attggcggtc atgccattta tttagatgcc 1080 aaacgctttt taccacaaat tccccaagac caatttccgg cacaacgtct agcagcagaa 1140 ctgtatctag aggcaggcat tcgggcaatg gaacggggca tcgtttccgc agggcgcaat 1200 aaagaaacag gcgataatta ttatccagag ttagaattag tccgtttaac tattccacgc 1260 cgtgtttaca ctcaggctca catggatctg actgctgaag cagttgaaga agtttatcat 1320 aatcgcgatc gcctacgcgg actcaaaatg atttatgagc cgaagtatct ccgtttcttt 1380 caagcaagat ttgaattgca gtaa 1404 <210> 27 <211> 1380 <212> DNA <213> Treponema denticola <400> 27 atggatatta aaaattatcc tgcggaacct tttagaatta aggttgtaga aactgttaag 60 atgatcgata aggatcaaag agcaaaggtt gccaaagaag ccggttataa taccttcctt 120 attaattcgg aagatgttta tatcgacctt cttaccgact ccggaacaaa cgccatgagc 180 gataaacaat gggccggaat gatgatagga gatgaagcct atgccggaag ccgcaacttt 240 catcacttgg aagaaacggt tcaagagatt ttcggcttta agcatcttgt gccgacccat 300 caaggccgcg gtgccgaaaa ccttctttca aggatagcca ttaaacccgg tcaatatgta 360 cccggcaaca tgtattttac cactaccaga taccatcagg aagcaaacgg cggtatcttc 420 gtggatatca taaacgatga tgctcatgat gcaggcaaaa atgttccttt taaaggcgac 480 atcgacttga acaagcttga aaagcttata aaagaaaagg gagccgaaaa tatagcctat 540 gtatgtttgg ctgttacggt aaaccttgca ggcggtcagc ccgtttctat gaagaacatg 600 aaggccgtcc gtgagcttac aaaaaagcac ggcatcaagg tattctacga tgcaacccgc 660 tgtgtagaaa acgcctactt tatcaaagaa caagaagccg gttatgccga caagtctatc 720 aaagaaatcg taagagaaat gttcagctat gcagacggat gtaccatgag cggtaaaaaa 780 gactgtatcg taaacatcgg aggcttcctc tgtatgaacg 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Claims

티로신 페놀-리아제(tyrosine phenol-lyase) 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가, 숙주의 코리네형 세균에 도입된, 페놀 생산능을 가지는 형질 전환체.
제1항에 있어서,
티로신 페놀-리아제 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가, 판토에아 아글로메란스(Pantoea agglomerans) 유래의 유전자, 시트로박터 브라아키(Citrobacter braakii) 유래의 유전자, 데술피토박테리움 하프니엔스(Desulfitobacterium hafniense) 유래의 유전자, 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus) 유래의 유전자, 노스톡 펑티포르메(Nostoc punctiforme) 유래의 유전자, 또는 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) 유래의 유전자인, 형질 전환체.
제1항에 있어서,
티로신 페놀-리아제 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가 하기 (a) 또는 (b)의 DNA인, 형질 전환체:
(a) 서열 번호 16의 염기 서열로 이루어지는 DNA, 서열 번호 23의 염기 서열로 이루어지는 DNA, 서열 번호 24의 염기 서열로 이루어지는 DNA, 서열 번호 25의 염기 서열로 이루어지는 DNA, 서열 번호 26의 염기 서열로 이루어지는 DNA, 또는 서열 번호 27의 염기 서열로 이루어지는 DNA,
(b) 상기 (a) 중 어느 하나의 염기 서열과 상보적인(complementary) 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 또한 티로신 페놀-리아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
숙주의 코리네형 세균이, 그 염색체 상에 존재하는 페놀 2-모노옥시게나아제(phenol 2-monooxygenase) 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가 파괴되거나, 또는 결손된 것인, 형질 전환체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
숙주의 코리네형 세균이 코리네박테리움 글루타미쿰인, 형질 전환체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
숙주의 코리네형 세균이, 코리네박테리움 글루미쿰 R(FERM P-18976), ATCC13032, 또는 ATCC13869인, 형질 전환체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
숙주의 코리네형 세균이, 코리네박테리움 글루미쿰 R(FERM P-18976), ATCC13032, 또는 ATCC13869의 염색체 상에 존재하는 페놀 2-모노옥시게나아제(phenol 2-monooxygenase) 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가 파괴되거나, 또는 결손된 것인, 형질 전환체.
코리네박테리움 글루타미쿰 PHE31(수탁 번호：NITE BP-999) 형질 전환체.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 형질 전환체를, 환원 조건 하에서, 티로신, 그의 염, 또는 그의 에스테르를 함유하는 반응액 중 반응시키는 반응 공정과, 반응 배지중의 페놀을 회수하는 공정을 포함하는 페놀의 제조 방법.
제9항에 있어서,
상기 반응 공정에 있어서, 형질 전환체가 실질적으로 증식하지 않는, 페놀의 제조 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서,
환원 조건 하의 반응액의 산화 환원 전위가 -200∼-500 mV(밀리볼트)인, 페놀의 제조 방법.