JP2999005B2

JP2999005B2 - チロシンフェノ−ル・リア−ゼをコ−ドする遺伝子とその利用方法

Info

Publication number: JP2999005B2
Application number: JP6156091A
Authority: JP
Inventors: 森暁岩; 川利洋及; 野節生吉; 渡健一石
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 1990-03-31
Filing date: 1991-03-26
Publication date: 2000-01-17
Anticipated expiration: 2015-01-17
Also published as: JPH04218380A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、チロシンフェノ−ル・
リア−ゼ（tyrosine phenol-lyase）[EC4.1.99.2] の生
産に有用なチロシンフェノ−ル・リア−ゼ遺伝子、その
遺伝子を含む組換え体プラスミド、その組換え体プラス
ミドにより形質転換された大腸菌およびその大腸菌を用
いるチロシンフェノ−ル・リア−ゼの製造法に関するも
のである。

【０００２】チロシンフェノ−ル・リア−ゼは、いわゆ
る多機能酵素であり、L-チロシンやL-ド−パの合成など
種々の反応を触媒し(Yamada,H. and Kumagai,H.(1975)
Adv.Appl.Microbiol.,Vol.19,pp.249-288)、工業的にも
重要な酵素である。

【０００３】

【従来の技術】種々のバクテリアがチロシンフェノ−ル
・リア−ゼ活性を有することが知られている。特に、エ
ンテロバクテリアセェ(Enterobacteriaceae) に属する
エシェリヒア(Escherichia)属、シトロバクタ−(Citrob
acter)属、アエロバクタ−(Aerobacter)属、プロテウス
(Proteus)属、エルビニア(Erwinia)属などのバクテリア
が高いチロシンフェノ−ル・リア−ゼ活性を有すること
が知られている(Yamada,H. and Kumagai,H.(1975) Adv.
Appl.Microbiol.,Vol.19,pp.249-288)。

【０００４】また、エルビニア・ヘルビコ−ラ(Erwinia
herbicola)ATCC-21434株およびエシェリヒア・フロイ
ンディ(Escherichia freundii)AJ-2608株のチロシンフ
ェノ−ル・リア−ゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片が単離さ
れ、その遺伝子により形質転換された大腸菌がチロシン
フェノ−ル・リア−ゼ活性を有することが知られている
（特開昭６２−２５９５８９および特開昭６３−２２２
６８２）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの微生
物のチロシンフェノ−ル・リア−ゼ活性は、工業的に用
いるには十分でなく、更に、培養に際しは、誘導物質と
して培地にチロシン（Yamada,H. and Kumagai,H.(1975)
Adv.Appl.Microbiol.,Vol.19,pp.249-288、特開昭６２
−２５９５８９）、イソプロピル-β-チオガラクトシド
（特開昭６３−２２２６８２）を添加する必要があっ
た。培地へのチロシン添加は、ド−パなどの生産におい
ては、製品にチロシンが混入し、イソプロピル-β-チオ
ガラクトシド添加は、イソプロピル-β-チオガラクトシ
ドが、非常に高価であり、工業的に用いるには問題があ
った。

【０００６】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
微生物により、チロシンフェノ−ル・リア−ゼを生産す
る方法について鋭意研究した結果、エルビニア・ヘルビ
コ−ラ(Erwinia herbicola)由来のチロシンフェノ−ル
・リア−ゼを担うＤＮＡ断片を単離し、その遺伝子の構
造を明らかにすると共に、その構造解析を基に、チロシ
ンフェノ−ル・リア−ゼ構造遺伝子を tac プロモ−タ
−の下流に連結した新規な組換え体プラスミドおよびそ
れにより形質転換された新規な大腸菌を創製し、この大
腸菌が、培地への誘導物質添加なしに、著量のチロシン
フェノ−ル・リア−ゼを生産することを見い出し、本発
明を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明によれば、培地へ誘導物
質を添加せずにチロシンフェノ−ル・リア−ゼを生産す
るに有用な遺伝子、その遺伝子を有する組換え体プラス
ミド、その組換え体プラスミドにより形質転換された大
腸菌およびその大腸菌を用いるチロシンフェノ−ル・リ
ア−ゼの製造法が提供される。

【０００８】本発明において、チロシンフェノ−ル・リ
ア−ゼの遺伝子を担うＤＮＡを採取する目的に用いられ
る微生物は、チロシンフェノ−ル・リア−ゼ活性を有す
るものであり、例えば、エルビニア・ヘルビコ−ラ(Erw
inia herbicola)MT-10509(FERM P-11385 ) がある。

【０００９】チロシンフェノ−ル・リア−ゼの遺伝子を
担うＤＮＡを採取する方法については、特に限定されな
いが、例えば、次のような方法を用いることが出来る。
チロシンフェノ−ル・リア−ゼ活性を有する微生物を培
養し、この菌体からフェノ−ル法（Saito,H. et al.(19
63) Biochim.Biophys.Acta, Vol.72,p.619-629 ）など
により染色体ＤＮＡを抽出、精製する。この染色体ＤＮ
Ａを適当な制限酵素で切断し、大腸菌内で増殖可能なプ
ラスミドベクタ−にＤＮＡリガ−ゼにより酵素的に接続
し、得られた組換えＤＮＡを用いてチロシンフェノ−ル
・リア−ゼ生産能の欠如した大腸菌を形質転換し、チロ
シンフェノ−ル・リア−ゼ生産能を獲得した菌株を選択
し、この菌株よりチロシンフェノ−ル・リア−ゼの遺伝
子を担うプラスミドＤＮＡを分離できる。

【００１０】本発明において、染色体ＤＮＡの切断に用
いる制限酵素は、酵素使用量や反応時間などを調節し
て、ＤＮＡの切断の程度を調節すれば、様々な種類のも
のが使用可能である。例えば、HpaＩＩ、AccＩ、Sau3A
Ｉ、HaeＩＩＩ、SmaＩなどを用いることができる。

【００１１】プラスミドベクタ−としては、大腸菌内で
増殖可能なものが用いられ、例えば、ColE1系の pBR32
2、pUC19、pKK223-3 などが好適に用いられる。

【００１２】プラスミドベクタ−は、染色体ＤＮＡを切
断した際に用いた制限酵素またはその制限酵素と同じ接
着末端を生じさせることの出来る制限酵素で切断したの
ち、染色体ＤＮＡ断片にＤＮＡリガ−ゼにより接続する
ことができる。

【００１３】ＤＮＡリガ−ゼとしては、Ｔ４ファ−ジ由
来のものが好適に用いられる。

【００１４】染色体ＤＮＡは、制限酵素で切断したの
ち、ショ糖密度勾配遠心、アガロ−ス電気泳動などによ
り特定の大きさのＤＮＡ断片だけを分画、回収してプラ
スミドベクタ−に接続してもよい。

【００１５】このようにして得られた染色体ＤＮＡ断片
とプラスミドベクタ−との組換えＤＮＡを大腸菌に導入
するには、塩化カルシウムで菌体を処理する方法（Mand
el,O. et al.(1970) J.Mol.Biol.,Vol.53,p.159-162）
などを用いることができる。

【００１６】チロシンフェノ−ル・リア−ゼ生産能の欠
如した大腸菌としては、例えば、E.coli MC-1061、JM-8
3 などを用いることができる。

【００１７】チロシンフェノ−ル・リア−ゼ生産能を獲
得した形質転換株の選択には、例えば、次のような方法
を用いることができる。チロシンを添加したＬ培地の寒
天平板上に形質転換株のコロニ−を形成させる。次い
で、この寒天平板に４−アミノアンチピリンを噴霧し、
コロニ−の周囲が赤色になる形質転換株を選べば良い。

【００１８】組換え体プラスミドを有する大腸菌から組
換え体プラスミドを単離するには、アルカリ抽出法（Br
inboim,H. et al.(1979) Nucleic Acids Res.,Vol.7,p1
513-1523）などを用いることが出来る。

【００１９】単離された組換え体プラスミドは、塩化カ
ルシウムで菌体を処理する方法（Mandel,O. et al.(197
0) J.Mol.Biol.,Vol.53,p.159-162）などにより、再び
大腸菌に導入することができる。

【００２０】以上のようにして得られたエルビニア・ヘ
ルビコ−ラ(Erwinia herbicola) 由来のチロシンフェノ
−ル・リア−ゼの遺伝子を担うＤＮＡをプラスミドベク
タ−に連結した組換え体プラスミドの例として、pEH2
がある。

【００２１】pEH2 上のチロシンフェノ−ル・リア−ゼ
遺伝子の発現効率を高めるには、pEH2 からチロシンフ
ェノ−ル・リア−ゼ遺伝子部分を切り出し、それを強力
なプロモ−タ−を有するベクタ−のプロモ−タ−の下流
に接続することが有効である。プロモ−タ−の例として
は、trp、lacUV5、tac、λPL などがある。更に、チロ
シンフェノ−ル・リア−ゼ遺伝子の下流にタ−ミネ−タ
−を接続するのが有効なこともある。このような組換え
体プラスミドの例として、pEH21 及び pCE26 がある。

【００２２】pEH21 及び pCE26 を保持する大腸菌とし
て次の株が微生物工業技術研究所に寄託されている。

【００２３】エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)
MT-10516(MC1061/pEH21)(FERM P-11386 )、エッシェリ
ヒア・コリ(Escherichia coli)MT-10519(MC1061/pCE26)
(FERMBP-3287 )。

【００２４】本発明において、チロシンフェノ−ル・リ
ア−ゼを製造するには、エルビニア・ヘルビコ−ラ(Erw
inia herbicola) 由来のチロシンフェノ−ル・リア−ゼ
の遺伝子を担うＤＮＡをプラスミドベクタ−に連結した
組換え体プラスミドで形質転換された大腸菌を培養し、
培養物中にチロシンフェノ−ル・リア−ゼを生成させれ
ばよい。

【００２５】大腸菌の培養は、常法により行うことがで
きる。すなわち、培地として、炭素源、窒素源、無機イ
オン更に必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどを含むも
のを用い、好気的に培養すればよい。

【００２６】このようにして得られた培養物は、そのま
まチロシンフェノ−ル・リア−ゼの酵素源として使用で
きるが、粗酵素抽出液、精製酵素、分離生菌体、分離菌
体の処理物なども酵素源として使用できる。チロシン
フェノ−ル・リア−ゼの精製法としては、通常の酵素精
製法を用いることが出来る。

【００２７】

【実施例】以下に実施例で本発明を詳細に説明する。実施例１ (a)エルビニア・ヘルビコ−ラ(Erwinia herbicola) の
染色体ＤＮＡの分離。

【００２８】エルビニア・ヘルビコ−ラ(Erwinia herbi
cola)MT-10509(FERM P-11385) を 1lのＬ培地（バクト
・トリプトン 10 g／l、酵母エキス 5 g／l、塩化ナト
リウム 5 g／l、pH 7.2に調整）に植菌し、30 ℃で15
時間振とう培養した後、遠心分離により集菌した。

【００２９】菌体を 160 mlの 0.15M NaCl-50mM EDTA
(pH 8.0)溶液に懸濁し、160 mg のリゾチ−ムを加えて
37 ℃で 20 分間、ゆるやかにかくはんした。ついで、2
0 % SDS 溶液 4 mlを加え、65 ℃で20 分間放置した。
更に、8 mg のプロテイナ−ゼＫ（Proteinase K, Boehr
inger Mannheim 社製）を加え、37 ℃で 1 時間放置し
た。

【００３０】0.15M NaCl-50mM EDTA (pH 8.0)溶液で飽
和したフェノ−ル 160 mlを加え、ゆるやかにかくはん
した後、遠心分離（10,000 rpm, 15 min）し、上層を回
収する。

【００３１】この溶液に、２倍量の冷エタノ−ルを加
え、ガラス棒により繊維状の沈澱を巻取り、70 %, 80
%, 90% のエタノ−ルに順次、数分づつ浸漬した後、乾
燥し、0.1M NaCl-0.15M クエン酸ナトリウム(pH 7.0)溶
液 40 mlに溶解した。

【００３２】この粗ＤＮＡ溶液に、6 mg／mlのリボヌク
レア−ゼＡ（Riboinulease A, Boehringer Mannheim 社
製）を 200 μl加え、37 ℃で 1.5 時間放置した。

【００３３】この溶液に、0.15M NaCl-50mM EDTA (pH
8.0) 溶液で飽和したフェノ−ル 40 mlを加え、ゆるや
かにかくはんした後、遠心分離（10,000 rpm, 15 min）
し、上層を回収した。

【００３４】２倍量の冷エタノ−ルを加え、ガラス棒に
より繊維状の沈澱を巻取り、70 %, 80 %, 90% のエタノ
−ルに順次、数分づつ浸漬した後、乾燥し、10mM Tris-
HCl(pH8.0)-1mM EDTA 溶液（以下、TE 緩衝液と記
す。）20 mlに溶解した。

【００３５】このＤＮＡ溶液を、2 lの TE 緩衝液に対
して透析し、2 mg の染色体ＤＮＡを含む TE 緩衝液を
10 ml得た。 (b)染色体ＤＮＡ断片の調製。

【００３６】(a)で調製した染色体ＤＮＡを含む TE 緩
衝液の内、450 μl（DNA 90μg を含む）に制限酵素 Ha
eIII（Boehringer Mannheim 社製）を 10 Units 加え、
10mM Tris-HCl(pH7.5)、7mM MgCl2、60mM NaCl、7mM 2-
メルカプトエタノ−ルを含む反応液 500 μl中で、37
℃で1 時間放置して、染色体ＤＮＡを部分的に切断し
た。

【００３７】この溶液に、TE 緩衝液で飽和したフェノ
−ル・クロロホルム（フェノ−ル：クロロホルム＝１：
１）を等量加え、ゆるやかにかくはんした後、遠心分
離（15,000 rpm, 5 min）し、上層を回収した。

【００３８】回収した上層に２倍量の冷エタノ−ルを加
え、生じた沈澱を乾燥後、TE 緩衝液 100 μlに溶解し
た。このＤＮＡ溶液を 10-40 % ショ糖密度勾配遠心（2
0 ℃, 26,000 rpm, 24 hr）にかけ、およそ 2-5 Kbp と
5-10 Kbp の２つの画分を回収した。それぞれの画分を
TE 緩衝液に対して透析した後、エタノ−ル沈澱により
ＤＮＡを回収し、 TE 緩衝液に溶解した。 (c)染色体ＤＮＡ断片とプラスミドベクタ−の結合。 p
UC 19（宝酒造製）10 μg を、制限酵素 SmaＩ（ニッポ
ンジ−ン社製）で完全消化後、アルカリフォスファタ
−ゼ処理した。このプラスミドベクタ− 0.25 μg づつ
と、(b) で調製した染色体ＤＮＡ断片の各画分をそれぞ
れ混合し、それぞれ、5mM MgCl2、10mM ジチオスレイト
−ル、1mM ATP 、66mM Tris-HCl 緩衝液（pH 7.5）の反
応液 0.4ml中で、5 Units の T4 DNA リガ−ゼ（Boehri
nger Mannheim 社製）により、16 ℃、16 hr 反応させ
た。

【００３９】大腸菌の形質転換には、この反応液をその
まま用いた。 (d)チロシンフェノ−ル・リア−ゼの遺伝子のクロ−ニ
ング。

【００４０】(c) で調製した組換え体プラスミドを含む
反応液を用いて大腸菌の形質転換を行った。チロシンフ
ェノ−ル・リア−ゼ生産能のない大腸菌である E.coli
MC-1061 を 5mlのＬ培地（バクト・トリプトン 10 g／
l、酵母エキス 5 g／l、塩化ナトリウム 5 g／l、pH 7.
2に調整）に植菌し、37 ℃で 3 時間振とう培養した
後、遠心分離により集菌した。

【００４１】菌体を 0.1M CaCl2 溶液 2 mlに懸濁し、0
℃で 30 分間放置した後、遠心分離し、0.1M CaCl2 溶
液 4 mlに再び懸濁した。

【００４２】このようにして調製した菌体懸濁液を 2 m
lづつ２本の試験管に分け、それぞれに、(c) で調製し
た反応液を加えて、0 ℃で 3 時間放置した後、42 ℃で
2 分間保った。

【００４３】遠心分離により集菌し、Ｌ培地を 5 mlづ
つ加えて37 ℃で 30 分間培養した後、遠心分離により
集菌した。

【００４４】菌体をそれぞれ 10 mlの 0.85 % NaCl に
懸濁した後、遠心分離により集菌し、それぞれ 1 mlの
0.85 % NaCl に懸濁した。

【００４５】このようにして調製した菌体懸濁液を、10
0 mg／lのアンピシリン、20 g／lのＬ−チロシン、15 g
／lの寒天を添加したＬ培地に塗布し、37 ℃で１日間
培養した。

【００４６】次いで、コロニ−が形成された寒天平板培
地に1.4% 炭酸水素ナトリウム0.85% 4-アミノアン
チピリン 5.4% フェリシアン化カリウムの各水溶
液を順次噴霧し、コロニ−の周囲が赤色に着色した株を
選択した。

【００４７】およそ 2-5 Kbp の染色体ＤＮＡ断片の画
分を用いて調製した組換え体プラスミドで形質転換した
大腸菌を塗布した寒天平板培地から、3 株のチロシンフ
ェノ−ル・リア−ゼ生産株を得た。この内、代表的なコ
ロニ−から分離した大腸菌をエシェリヒア・コリ（Esch
erichia coli）MT-10515 と名付けた。 (e)大腸菌の保持する組換え体プラスミドの分離。

【００４８】エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
MT-10515 より次のような方法により組換え体プラスミ
ドを分離した。

【００４９】エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
MT-10515 を 100 mlのＬ培地に植菌し、37 ℃で 15 時
間振とう培養した後、遠心分離により集菌した。

【００５０】菌体を 4 mg のリゾチ−ムを含む 4 mlの
50mM Glucose-25mM Tris-HCl-10mM EDTA (pH 8.0)溶液
に懸濁した。

【００５１】0.2N NaOH-1 % SDS 溶液 8 mlを加えて、
かくはんした。3M CH3COONa (pH 5.2) 溶液を 6 ml加
え、4 ℃で 5 分間時間放置したのち、遠心分離し、上
澄液を回収した。

【００５２】この溶液に、TE 緩衝液で飽和したフェノ
−ル・クロロホルム（フェノ−ル：クロロホルム＝１：
１）を等量加え、ゆるやかにかくはんした後、遠心分離
（10,000 rpm, 5 min）し、上層を回収した。

【００５３】回収した上層に２倍量の冷エタノ−ルを加
え、生じた沈澱を乾燥後、TE 緩衝液 1 mlに溶解した。

【００５４】このＤＮＡ溶液に、1 mg／mlのリボヌクレ
ア−ゼＡ（Riboinulease A, Boehringer Mannheim 社
製）を 20 μl加え、37 ℃で 20 分間放置した。

【００５５】この溶液に、フェノ−ル・クロロホルム
（フェノ−ル：クロロホルム＝１：１）を等量加え、
ゆるやかにかくはんした後、遠心分離（10,000 rpm, 5
min）し、上層を回収した。

【００５６】このＤＮＡ溶液を Bio-Gel A-50m（Bio-Ra
d社製）によるカラムクロマトグラフィにより精製し、
エタノ−ル沈澱によりプラスミドＤＮＡを回収した。

【００５７】このようにしてエシェリヒア・コリ（Esch
erichia coli）MT-10515 から約 1.2mg づつのプラスミ
ドＤＮＡを分離し、それぞれ 1 mlの TE 緩衝液に溶解
した。

【００５８】以下の組換え体プラスミドの解析において
は、上記ようにして得たプラスミドを使用した。 (f)組換え体プラスミドの解析。

【００５９】エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
MT-10515 から分離した組換え体プラスミドを pEH2 と
名付けた。この組換え体プラスミドは約 4.8 Kbp の大
きさであり、制限酵素 SacＩと PstＩで切断すると、約
2.1 KbpのＤＮＡ挿入断片が認められた。

【００６０】pEH2 中の挿入ＤＮＡ断片の制限酵素切断
地図を図１に示した。 (g)形質転換の再現性の確認 (e)で分離した組換え体プラスミド pEH2 によりチロシ
ンフェノ−ル・リア−ゼ生産能の欠如した大腸菌である
E.coli MC-1061 を(d)と同様に形質転換し、100 mg／l
のアンピシリンと 20 g／l のＬ−チロシンを添加した
Ｌ培地寒天平板に塗布した。生じたコロニ−について
(d) と同様に 4-アミノアンチピリン法によりチロシン
フェノ−ル・リア−ゼ生産を調べたところ、全てのコロ
ニ−の周囲が赤色に着色しており、pEH2 上にチロシン
フェノ−ル・リア−ゼの遺伝子を担うＤＮＡが存在する
ことが確認された。 (h)サブクロ−ニングとＤＮＡ断片の解析 pEH2 の挿入ＤＮＡ断片からその一部が欠如した種々の
ＤＮＡ断片を調製し、それぞれリガ−ゼにより発現ベク
タ− pKK223-3 （ファルマシア社製）の tac プロモ−
タ−の下流のポリリンカ−部に挿入した。これらの組換
え体プラスミドにより、エシェリヒア・コリ（Escheric
hia coli）MC-1061 を(d)と同様に形質転換し、100 mg
／lのアンピシリンと 20 g／l のＬ−チロシンを添加し
たＬ培地寒天平板に塗布した。生じたコロニ−について
(d) と同様に 4-アミノアンチピリン法によりチロシン
フェノ−ル・リア−ゼ生産を調べることにより、チロシ
ンフェノ−ル・リア−ゼ遺伝子のおおよその位置を決定
し図１に示した。pEH2 の中で、チロシンフェノ−ル・
リア−ゼ遺伝子が含まれると思われる BssII−HaeIII挿
入ＤＮＡ断片約 1.6kb について、M13mp 系のベクタ−
（Messing,J.(1983) Methods in Enzymology,Vol.101,
p.20-78）を用いるジデオキシ法（Sager,F. etal.(197
7) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,Vol.74,p.5463-5467）
でＤＮＡ塩基配列を決定した。その結果、この塩基配列
中には、図２に示したようにオ−プンリ−ディングフレ
−ムが確認された（配列３）。 (i)チロシンフェノ−ル・リア−ゼ高発現プラスミドの
構築構築例１プラスミド pKK223-3（Pharmacia 社製）1μgを、制限
酵素 SmaＩ（ニッポンジ−ン社製）及びPstI（ニッポン
ジ−ン社製）で完全消化後、アルカリフォスファタ−ゼ
処理し、エタノ−ル沈澱により回収することにより、ベ
クタ−ＤＮＡを調製した。一方、プラスミド pEH2 を、
（e）と同様に抽出しその内の 2 μgを、制限酵素 BssH
ＩＩ（ニッポンジーン社製）で完全消化後、フェノール
処理、エタノール沈澱し、５unitsのKlenow Fragment
（宝酒造製）を３７℃、１時間作用させ、末端を平滑化
した。その後フェノール処理、エタノール沈澱し制限酵
素ＰｓｔＩ（ニッポンジーン社製）で完全消化した。次
いで、この反応液中のＤＮＡを 0.8%アガロ−ス電気泳
動し、約 1.6 Kb の大きさのＤＮＡを含むゲルを切り出
し、電気的溶出、エタノ−ル沈澱により回収し、チロシ
ンフェノ−ル・リア−ゼ遺伝子を含む挿入ＤＮＡを調製
した。

【００６１】TE 緩衝液に溶解したベクタ−ＤＮＡとチ
ロシンフェノ−ル・リア−ゼ遺伝子を含む挿入ＤＮＡを
を混合し、5mM MgCl2、10mM ジチオスレイト−ル、1mM
ATP 、66mM Tris-HCl 緩衝液（pH 7.5）の反応液 0.1 m
l中で、300 Units の T4 DNAリガ−ゼ（Boehringer Man
nheim 社製）により、16 ℃、4hr 反応させた。この反
応液をそのまま用い、チロシンフェノ−ル・リア−ゼ生
産能の欠如した大腸菌である E.coli MC-1061 を(d)と
同様に形質転換し、100 mg／lのアンピシリンと20 g／l
のＬ−チロシンを添加したＬ培地寒天平板に塗布し
た。生じたコロニ−について (d) と同様に 4-アミノア
ンチピリン法によりチロシンフェノ−ル・リア−ゼ生産
を調べたところ、約 1000 株にチロシンフェノ−ル・リ
ア−ゼ生産が認められた。このようにして得た形質転換
株から４株を選び、（e）に示した方法に準じてプラス
ミドを抽出した。得られたプラスミドは、全て、約 6.2
Kb の大きさで、同一の制限酵素切断地図を有してい
た。このプラスミドを pEH21と名付けた。pEH21の制限
酵素地図を図３に示した。大腸菌 MC-1061 をpEH21によ
り形質転換した株を、エシェリヒア・コリ（Escherichi
acoli）MT-10516 と名付け工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託した（FERM P-11386)。構築例２プラスミドｐＵＣ１１８（宝酒造製）１μｇを制限酵素
ＳｍａＩ（ニッポンジーン社製）及びＰｓｔＩ（ニッポ
ンジーン社製）で完全消化後、アルカリフォスファター
ゼ処理し、エタノール沈澱により回収することにより、
ベクターＤＮＡを調製した。

【００６２】一方、プラスミドｐＥＨ２を（ｅ）と同様
に抽出し、構築例１と同様にして、約１．６ｋｂのチロ
シンフェノール・リアーゼ遺伝子を含む挿入ＤＮＡ断片
を調製し、構築例１と同様な条件でベクターＤＮＡとチ
ロシンフェノール・リアーゼ遺伝子を含む挿入ＤＮＡを
連結し、大腸菌ＪＭ１０１を（ｄ）と同様に形質転換し
た。１００ｍｇ／ｌのアンピシリンの入ったＬ培地寒天
平板で生じたコロニーを（ｅ）に示した方法に準じてプ
ラスミドを抽出し、このプラスミドをｐＣＥ２２と名付
けた。

【００６３】次にプラスミドｐＣＥ２２を保持する大腸
菌ＪＭ１０１からヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を用い
て以下に示す方法により１本鎖ＤＮＡを調製した。ｐＣ
Ｅ２２を保持する大腸菌ＪＭ１０１を２ＹＴ（バクトト
リプトン１．６％，イーストエキストラクト１．０％，
食塩０．５％）に１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンの入
った培地で前培養した。新たに２ＹＴに１５０μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンの入った培地５ｍｌに前培養液をＯＤ
₆₀₀＝0.02-0.05になるように接種して３７℃で培養し、
ＯＤ₆₀₀＝0.1-0.2のときＭ１３ＫＯ７のヘルパーファー
ジ液（宝酒造製）３０μｌを加え、３７℃で３０分間ゆ
っくり振とう後７０μｇ／ｍｌとなるようにカナマイシ
ンを加え、３７℃で１４時間振とう培養した。その後培
養液をミクロ遠心管に移し、遠心分離（８０００ｇ，５
分間）にて菌体を除き、上清を回収した。上清１ｍｌに
対し、ＰＥＧ−ＮａＣｌ溶液（２０％ポリエチレングリ
コール、２．５ＭＮａＣｌ）を２００μｌ加え、よく混
合し１５分間室温に放置し、遠心分離（８０００ｇ，５
分間）により上清を完全に除去し、沈澱を１００μｌの
ＴＥ緩衝溶液で溶解させた。この溶液にＴＥ飽和フェノ
ールを５０μｌ添加し約１０秒間振とう後、約１０分間
放置し、その後クロロホルム：イソアミルアルコール
（２４：１で混合したもの）を５０μｌ添加し、約１０
秒間振とう後５分間遠心して、水層（上清）を別のミク
ロ遠心管に移した。１０μｌの酢酸ナトリウムを添加
し、２５０μｌの氷冷エタノールを加え、エタノール沈
澱により回収し、沈澱を５０μｌのＴＥ緩衝溶液に溶解
しｐＣＥ２２の１本鎖ＤＮＡ１０μｇを回収した。

【００６４】このようにして得られた１本鎖ＤＮＡに対
し、５’−ＧＧＡＴＡＧＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＴＴＣ
ＴＣＣＡＧ−３’（配列６）のような合成プライマーを
作成し、サイトデレクテッドミュウタジェネシスの手
法を用いてチロシンフェノール・リアーゼの開始コドン
ＡＴＧの直前の塩基−３ー−１（ＡＡＣ）を（ＣＡＴ）
に置換して制限酵素ＮｄｅＩのサイトを作成し、このプ
ラスミドをｐＣＥ２３と名付けた。サイトデレクテッド
ミュウタジェネシスは、ＦｒｉｔｚＥｃｋｓｔｅｉ
ｎらの方法（Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｗ．ｅｔａｌ．（１
９８５）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，ｐｐ８７４
９−８７８５；Ｎａｋａｍａｙｅ，Ｋ．ｅｔａｌ．
（１９８６）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，ｐｐ
９６７９−９６９８；Ｓａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ
ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．，ｐｐ７９１−８０２）を用いた。次いで合成リン
カー5'-CCCGGGTATCAACACTGTTACTGGAGAAACA-3’（配列
４）及び5'-TATGTTTCTCCAGTAACAGTGTTGATACCCGGGGTAC-
3'(配列５）各々約0.01μｇずつを１０ｍＭＭｇＣｌ
2，７ｍＭジチオスレイトール，１ｍＭＡＴＰ，１０
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）の反応
液0.1ｍｌ中でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニッポ
ンジーン社製）により３７℃で３０分間反応させた後、
７０℃で１０分間の熱処理を行い調製した。そして１μ
ｇのｐＣＥ２３を制限酵素ＮｄｅＩ（ニッポンジーン社
製）及びＫｐｎＩ（東洋紡社製）で完全に消化し、フェ
ノール処理後エタノール沈澱により回収し、調製した合
成リンカー５μｌずつを加え、混合し、５ｍＭＭｇＣ
ｌ2，１０ｍＭジチオスレイトール，１ｍＭＡＴＰ，
６６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．５）の
反応液0.1ｍｌ中で３００ｕｎｉｔｓのＴ４ＤＮＡリカ
ーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ社製）に
より４℃ １６ｈｒ反応させた。この反応液をそのま
ま用い、構築例１と同様にしてチロシンフェノ−ル・リ
ア−ゼ生産能の欠如した大腸菌である E.coli MC-1061
を(d)と同様に形質転換し、100 mg／lのアンピシリンと
20 g／l のＬ−チロシンを添加したＬ培地寒天平板に
塗布した。生じたコロニ−について (d) と同様に 4-ア
ミノアンチピリン法によりチロシンフェノ−ル・リア−
ゼ生産を調べたところ、約 100 株にチロシンフェノ−
ル・リア−ゼ生産が認められた。このようにして得た形
質転換株から４株を選び、（e）に示した方法に準じて
プラスミドを抽出した。得られたプラスミドは、全て、
約 1.4kbの挿入断片を含む約4.6 Kb の大きさで、同一
の制限酵素切断地図を有していた。このプラスミドを
ｐＣＥ２６と名付けた。ｐＣＥ２６の制限酵素地図を図
４に示した。大腸菌 MC-1061 をｐＣＥ２６により形質
転換した株を、エシェリヒア・コリ（Escherichia col
i）MT-10519 と名付け工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託した（FERM BP-3287 )。 (j)チロシンフェノ−ル・リア−ゼの製造エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）MT-10516及び
MT-10519を、0 または20 g／l のＬ−チロシンを添加し
たＬ培地（バクト・トリプトン 10 g／l、酵母エキス
5 g／l、塩化ナトリウム 5 g／l、pH 7.2に調整）100 m
lに植菌し、37℃で 20 時間振とう培養した後、遠心分
離により集菌した。

【００６５】これら菌体のチロシンフェノ−ル・リア−
ゼ活性を次のように測定した。菌体を洗浄後、0.1mM の
ピリドキサ−ルリン酸を含む10mM ピロリン酸緩衝液
(pH 8.5) 10 mlに懸濁した。超音波処理により無細胞抽
出液を調製し、この酵素液を、Ｌ−セリン 70 g／l、フ
ェノ−ル 17g／l、酢酸アンモニウム 17 g／lを含みpH
8.5 にアンモニアで調整した反応液 90 mlに加え、37℃
で 1 時間ゆるやかに振とうしながら反応した。生成し
たＬ−チロシン量を Kondo らの方法（Kondo,N. et al.
(1984) Agric.Biol.Chem.,Vol.48,pp1595-1601）により
高速液体クロマトグラフィ−で定量した。

【００６６】各菌株のチロシンフェノ−ル・リア−ゼ活
性を第１表に示した。なお、チロシンフェノ−ル・リア
−ゼ活性の 1 unit は、37℃で 1 分間当り 1 μmol の
チロシンを生成する酵素量である。

【００６７】表１に示したように MT-10516株及びMT-10
519株においては、培地へのチロシン添加なしで高い酵
素活性が認められた。比較例１宿主として用いたエシェリヒア・コリ（Escherichia co
li）MC-1061および染色体ＤＮＡ源として用いたエルビ
ニア・ヘルビコーラ(Erwinia herbicora)MT-10509およ
び pEH2 を有するエシェリヒア・コリ（Escherichia co
li）MT-10515 を実施例１（ｊ）に示したのと同様に培
養して、そのチロシンフェノ−ル・リア−ゼ活性を実施
例１（ｊ）に示したのと同様に測定し、その値を表２に
示した。

【００６８】MT-10509株では、培地にチロシンを添加し
ない場合は、ほとんど酵素活性が認められず、培地にチ
ロシンを添加した場合に酵素活性が認められた。MT-105
15株では、チロシン無添加でも酵素活性が認められた
が、その値は、チロシンを添加した場合の約１／２であ
った。

【００６９】表１、表２から、MT-10516株，及びMT-105
19株の酵素活性はMC-1061株、MT-10509株、MT-10515株
の酵素活性よりも著しく高いものであり、さらにMT-105
16株，及びMT-10519株については培地中にチロシンを添
加しなくても高い酵素活性が認められたが、MT-10509
株、MT-10515株については培地中にチロシンを添加しな
い場合は添加した場合に比べ著しく低いものであった。比較例２エルビニア・ヘルビコーラ（Erwinia herbicola) ATCC2
1434より染色体DNAを調製し、特開昭６２−２５９５８
９記載の方法により、β−チロシナーゼ活性を有し、そ
の塩基対が、1.7kbであり、そのDNA鎖中に制限酵素EcoR
Iで切断される箇所を含むSau3AI-PstI 1.7kbのDNA断片
を調製し、プラスミドベクターpUC18のBamHI-PstI制限
酵素サイトに導入し、これをpSP17と名付けた。pSP17か
ら、β−チロシナーゼ活性を有する SmaI-HindIII DNA
断片 1.7kb を調製し、Klenow fragment により、HindI
II末端を平滑化してプラスミドベクターpKK223-3のSmaI
サイトに導入し、tac プロモーターに対し、向きの異な
る２つのプラスミドベクターpSP18,pSP19を得た。pSP1
8,pSP19をそれぞれエッシェリヒア・コリ（Escherichia
coli) MC-1061株に導入し、それらを実施例１（ｊ）と
同様に培養してそのチロシンフェノールリアーゼ活性を
測定し、その値を表３に示した。

【００７０】MC1061/pSP18株、及びMC1061/pSP19株は、
表１のMT-10516株，及びMT-10519株に比べて、その酵素
活性は著しく低いものであった。

【００７１】

【発明の効果】本発明によればチロシンフェノ−ル・リ
ア−ゼの効率的生産に有用な遺伝子、その遺伝子を有す
る組換え体プラスミド、それにより形質転換された大腸
菌およびこの大腸菌を用いるチロシンフェノ−ル・リア
−ゼの製造法が提供される。

【００７２】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：１３６８塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡハイポセチィカル： YES アンチセンス：NO 起源：生物名： Erwinia herbicola 直接の起源クローン名： pEH21, pCE26 配列の特徴： NAME/KEY: CDS 存在位置: 1..1368 配列 ATG AAC TAT CCT GCC GAG CCT TTC CGC ATT AAA AGT GTT GAA ACC GTA 48 Met Asn Tyr Pro Ala Glu Pro Phe Arg Ile Lys Ser Val Glu Thr Val 1 5 10 15 TCA ATG ATC TCA CGC GAT GAG CGT GTT AAA AAA ATG CAA GAA GCG GGC 96 Ser Met Ile Ser Arg Asp Glu Arg Val Lys Lys Met Gln Glu Ala Gly 20 25 30 TAT AAC ACG TTT TTA CTG AAT TCA AAG GAT ATC TAC ATC GAT CTG CTG 144 Tyr Asn Thr Phe Leu Leu Asn Ser Lys Asp Ile Tyr Ile Asp Leu Leu 35 40 45 ACA GAC AGC GGT ACA AAT GCC ATG AGT GAC AAG CAG TGG GCA GGG ATG 192 Thr Asp Ser Gly Thr Asn Ala Met Ser Asp Lys Gln Trp Ala Gly Met 50 55 60 ATG ATT GGT GAT GAA GCC TAC GCA GGC AGT GAA AAC TTC TAC CAT CTC 240 Met Ile Gly Asp Glu Ala Tyr Ala Gly Ser Glu Asn Phe Tyr His Leu 65 70 75 80 GAA AAA ACG GTG AAA GAG TTG TTT GGT TTC AAA CAC ATC GTT CCA ACC 288 Glu Lys Thr Val Lys Glu Leu Phe Gly Phe Lys His Ile Val Pro Thr 85 90 95 CAC CAG GGA CGC GGG GCG GAA AAC CTG CTC TCG CAG CTG GCC ATT AAG 336 His Gln Gly Arg Gly Ala Glu Asn Leu Leu Ser Gln Leu Ala Ile Lys 100 105 110 CCC GGT CAA TAT GTC GCA GGA AAT ATG TAC TTT ACA ACA ACC CGC TTC 384 Pro Gly Gln Tyr Val Ala Gly Asn Met Tyr Phe Thr Thr Thr Arg Phe 115 120 125 CAT CAG GAA AAA AAT GGC GCA ACC TTT GTG GAT ATT GTC CGC GAT GAA 432 His Gln Glu Lys Asn Gly Ala Thr Phe Val Asp Ile Val Arg Asp Glu 130 135 140 GCA CAT GAC GCC AGC CTG AAT CTC CCC TTT AAA GGT AAT ATT GAC CTG 480 Ala His Asp Ala Ser Leu Asn Leu Pro Phe Lys Gly Asn Ile Asp Leu 145 150 155 160 AAT AAA TTA GCG ACG CTC ATT AAA GAA AAA GGC GCC GAG AAC ATC GCC 528 Asn Lys Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Lys Gly Ala Glu Asn Ile Ala 165 170 175 TAT ATC TGC CTT GCG GTC ACC GTG AAT CTG GCG GGT GGG CAG CCT GTT 576 Tyr Ile Cys Leu Ala Val Thr Val Asn Leu Ala Gly Gly Gln Pro Val 180 185 190 TCA ATG GCG AAT ATG CGT GCC GTA CAT GAA ATG GCC AGC ACG TAT GGC 624 Ser Met Ala Asn Met Arg Ala Val His Glu Met Ala Ser Thr Tyr Gly 195 200 205 ATT AAG ATC TAT TAC GAT GCT ACC CGT TGC GTT GAA AAT GCC TAT TTT 672 Ile Lys Ile Tyr Tyr Asp Ala Thr Arg Cys Val Glu Asn Ala Tyr Phe 210 215 220 ATC AAA GAG CAG GAG GCG GGC TAC GAG AAC GTC AGT ATC AAA GAT ATC 720 Ile Lys Glu Gln Glu Ala Gly Tyr Glu Asn Val Ser Ile Lys Asp Ile 225 230 235 240 GTG CAT GAA ATG TTC AGC TAT GCC GAT GGG TGC ACC ATG AGC GGT AAA 768 Val His Glu Met Phe Ser Tyr Ala Asp Gly Cys Thr Met Ser Gly Lys 245 250 255 AAA GAT TGT CTG GTG AAT ATC GGC GGC TTC TTG TGT ATG AAC GAT GAG 816 Lys Asp Cys Leu Val Asn Ile Gly Gly Phe Leu Cys Met Asn Asp Glu 260 265 270 GAG ATG TTC TCA GCG GCA AAA GAG TTG GTT GTC GTT TAT GAA GGT ATG 864 Glu Met Phe Ser Ala Ala Lys Glu Leu Val Val Val Tyr Glu Gly Met 275 280 285 CCG TCA TAC GGC GGG CTG GCC GGT CGG GAT ATG GAA GCA ATG GCT ATT 912 Pro Ser Tyr Gly Gly Leu Ala Gly Arg Asp Met Glu Ala Met Ala Ile 290 295 300 GGG CTA CGT GAA GCC ATG CAG TAT GAA TAT ATT GAA CAT CGG GTC AAA 960 Gly Leu Arg Glu Ala Met Gln Tyr Glu Tyr Ile Glu His Arg Val Lys 305 310 315 320 CAG GTG CGC TAT CTG GGC GAT AAA CTC CGT GAA GCC GGC GTA CCC ATT 1008 Gln Val Arg Tyr Leu Gly Asp Lys Leu Arg Glu Ala Gly Val Pro Ile 325 330 335 GTT GAA CCG ACG GGC GGA CAT GCG GTA TTT CTT GAT GCT CGT CGT TTC 1056 Val Glu Pro Thr Gly Gly His Ala Val Phe Leu Asp Ala Arg Arg Phe 340 345 350 TGT CCA CAC CTG ACG CAG GAT CAG TTC CCT GCG CAG AGC CTG GCA GCC 1104 Cys Pro His Leu Thr Gln Asp Gln Phe Pro Ala Gln Ser Leu Ala Ala 355 360 365 AGC ATC TAT ATG GAA ACC GGC GTG CGA AGT ATG GAA CGT GGA ATT GTT 1152 Ser Ile Tyr Met Glu Thr Gly Val Arg Ser Met Glu Arg Gly Ile Val 370 375 380 TCC GCC GGT CGT AGC AAG GAA ACG GGG GAG AAC CAT AGC CCC AAA CTG 1200 Ser Ala Gly Arg Ser Lys Glu Thr Gly Glu Asn His Ser Pro Lys Leu 385 390 395 400 GAG ACG GTA CGT CTC ACT ATT CCA CGC CGT GTT TAC ACT TAC GCG CAC 1248 Glu Thr Val Arg Leu Thr Ile Pro Arg Arg Val Tyr Thr Tyr Ala His 405 410 415 ATG GAT GTT ATT GCC GAT GGC ATC ATT AAA CTG TAC CAG CAT AAA GAA 1296 Met Asp Val Ile Ala Asp Gly Ile Ile Lys Leu Tyr Gln His Lys Glu 420 425 430 GAT ATT CGT GGT CTG ACG TTT GTT TAC GAA CCT AAA CAA CTT CGC TTC 1344 Asp Ile Arg Gly Leu Thr Phe Val Tyr Glu Pro Lys Gln Leu Arg Phe 435 440 445 TTT ACT GCG CGT TTT GAC TTT ATT 1368 Phe Thr Ala Arg Phe Asp Phe Ile 450 455 配列番号：２配列の長さ：４５６残基配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Asn Tyr Pro Ala Glu Pro Phe Arg Ile Lys Ser Val Glu Thr Val 1 5 10 15 Ser Met Ile Ser Arg Asp Glu Arg Val Lys Lys Met Gln Glu Ala Gly 20 25 30 Tyr Asn Thr Phe Leu Leu Asn Ser Lys Asp Ile Tyr Ile Asp Leu Leu 35 40 45 Thr Asp Ser Gly Thr Asn Ala Met Ser Asp Lys Gln Trp Ala Gly Met 50 55 60 Met Ile Gly Asp Glu Ala Tyr Ala Gly Ser Glu Asn Phe Tyr His Leu 65 70 75 80 Glu Lys Thr Val Lys Glu Leu Phe Gly Phe Lys His Ile Val Pro Thr 85 90 95 His Gln Gly Arg Gly Ala Glu Asn Leu Leu Ser Gln Leu Ala Ile Lys 100 105 110 Pro Gly Gln Tyr Val Ala Gly Asn Met Tyr Phe Thr Thr Thr Arg Phe 115 120 125 His Gln Glu Lys Asn Gly Ala Thr Phe Val Asp Ile Val Arg Asp Glu 130 135 140 Ala His Asp Ala Ser Leu Asn Leu Pro Phe Lys Gly Asn Ile Asp Leu 145 150 155 160 Asn Lys Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Lys Gly Ala Glu Asn Ile Ala 165 170 175 Tyr Ile Cys Leu Ala Val Thr Val Asn Leu Ala Gly Gly Gln Pro Val 180 185 190 Ser Met Ala Asn Met Arg Ala Val His Glu Met Ala Ser Thr Tyr Gly 195 200 205 Ile Lys Ile Tyr Tyr Asp Ala Thr Arg Cys Val Glu Asn Ala Tyr Phe 210 215 220 Ile Lys Glu Gln Glu Ala Gly Tyr Glu Asn Val Ser Ile Lys Asp Ile 225 230 235 240 Val His Glu Met Phe Ser Tyr Ala Asp Gly Cys Thr Met Ser Gly Lys 245 250 255 Lys Asp Cys Leu Val Asn Ile Gly Gly Phe Leu Cys Met Asn Asp Glu 260 265 270 Glu Met Phe Ser Ala Ala Lys Glu Leu Val Val Val Tyr Glu Gly Met 275 280 285 Pro Ser Tyr Gly Gly Leu Ala Gly Arg Asp Met Glu Ala Met Ala Ile 290 295 300 Gly Leu Arg Glu Ala Met Gln Tyr Glu Tyr Ile Glu His Arg Val Lys 305 310 315 320 Gln Val Arg Tyr Leu Gly Asp Lys Leu Arg Glu Ala Gly Val Pro Ile 325 330 335 Val Glu Pro Thr Gly Gly His Ala Val Phe Leu Asp Ala Arg Arg Phe 340 345 350 Cys Pro His Leu Thr Gln Asp Gln Phe Pro Ala Gln Ser Leu Ala Ala 355 360 365 Ser Ile Tyr Met Glu Thr Gly Val Arg Ser Met Glu Arg Gly Ile Val 370 375 380 Ser Ala Gly Arg Ser Lys Glu Thr Gly Glu Asn His Ser Pro Lys Leu 385 390 395 400 Glu Thr Val Arg Leu Thr Ile Pro Arg Arg Val Tyr Thr Tyr Ala His 405 410 415 Met Asp Val Ile Ala Asp Gly Ile Ile Lys Leu Tyr Gln His Lys Glu 420 425 430 Asp Ile Arg Gly Leu Thr Phe Val Tyr Glu Pro Lys Gln Leu Arg Phe 435 440 445 Phe Thr Ala Arg Phe Asp Phe Ile 450 455 配列番号：３配列の長さ：１５７１塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列の特徴： NAME/KEY: CDS 存在位置: 176..1543 配列 GCGCGCATAG TGACGCGCTA TTTTCACGCA TGATAAATCC CGCATGATGG TGTCGTATTA 60 TTTCCACCTC AATTCTGAGG TTATTGTTAT ATCTTCCTGT GCATTTCATC TATGCACCAG 120 ACTTATTCGA CGCGCATTTT TCTGCGTATG AAAATGGATA ACTGGAGAAA TAAAC ATG 178 Met 1 AAC TAT CCT GCC GAG CCT TTC CGC ATT AAA AGT GTT GAA ACC GTA TCA 226 Asn Tyr Pro Ala Glu Pro Phe Arg Ile Lys Ser Val Glu Thr Val Ser 5 10 15 ATG ATC TCA CGC GAT GAG CGT GTT AAA AAA ATG CAA GAA GCG GGC TAT 274 Met Ile Ser Arg Asp Glu Arg Val Lys Lys Met Gln Glu Ala Gly Tyr 20 25 30 AAC ACG TTT TTA CTG AAT TCA AAG GAT ATC TAC ATC GAT CTG CTG ACA 322 Asn Thr Phe Leu Leu Asn Ser Lys Asp Ile Tyr Ile Asp Leu Leu Thr 35 40 45 GAC AGC GGT ACA AAT GCC ATG AGT GAC AAG CAG TGG GCA GGG ATG ATG 370 Asp Ser Gly Thr Asn Ala Met Ser Asp Lys Gln Trp Ala Gly Met Met 50 55 60 65 ATT GGT GAT GAA GCC TAC GCA GGC AGT GAA AAC TTC TAC CAT CTC GAA 418 Ile Gly Asp Glu Ala Tyr Ala Gly Ser Glu Asn Phe Tyr His Leu Glu 70 75 80 AAA ACG GTG AAA GAG TTG TTT GGT TTC AAA CAC ATC GTT CCA ACC CAC 466 Lys Thr Val Lys Glu Leu Phe Gly Phe Lys His Ile Val Pro Thr His 85 90 95 CAG GGA CGC GGG GCG GAA AAC CTG CTC TCG CAG CTG GCC ATT AAG CCC 514 Gln Gly Arg Gly Ala Glu Asn Leu Leu Ser Gln Leu Ala Ile Lys Pro 100 105 110 GGT CAA TAT GTC GCA GGA AAT ATG TAC TTT ACA ACA ACC CGC TTC CAT 562 Gly Gln Tyr Val Ala Gly Asn Met Tyr Phe Thr Thr Thr Arg Phe His 115 120 125 CAG GAA AAA AAT GGC GCA ACC TTT GTG GAT ATT GTC CGC GAT GAA GCA 610 Gln Glu Lys Asn Gly Ala Thr Phe Val Asp Ile Val Arg Asp Glu Ala 130 135 140 145 CAT GAC GCC AGC CTG AAT CTC CCC TTT AAA GGT AAT ATT GAC CTG AAT 658 His Asp Ala Ser Leu Asn Leu Pro Phe Lys Gly Asn Ile Asp Leu Asn 150 155 160 AAA TTA GCG ACG CTC ATT AAA GAA AAA GGC GCC GAG AAC ATC GCC TAT 706 Lys Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Lys Gly Ala Glu Asn Ile Ala Tyr 165 170 175 ATC TGC CTT GCG GTC ACC GTG AAT CTG GCG GGT GGG CAG CCT GTT TCA 754 Ile Cys Leu Ala Val Thr Val Asn Leu Ala Gly Gly Gln Pro Val Ser 180 185 190 ATG GCG AAT ATG CGT GCC GTA CAT GAA ATG GCC AGC ACG TAT GGC ATT 802 Met Ala Asn Met Arg Ala Val His Glu Met Ala Ser Thr Tyr Gly Ile 195 200 205 AAG ATC TAT TAC GAT GCT ACC CGT TGC GTT GAA AAT GCC TAT TTT ATC 850 Lys Ile Tyr Tyr Asp Ala Thr Arg Cys Val Glu Asn Ala Tyr Phe Ile 210 215 220 225 AAA GAG CAG GAG GCG GGC TAC GAG AAC GTC AGT ATC AAA GAT ATC GTG 898 Lys Glu Gln Glu Ala Gly Tyr Glu Asn Val Ser Ile Lys Asp Ile Val 230 235 240 CAT GAA ATG TTC AGC TAT GCC GAT GGG TGC ACC ATG AGC GGT AAA AAA 946 His Glu Met Phe Ser Tyr Ala Asp Gly Cys Thr Met Ser Gly Lys Lys 245 250 255 GAT TGT CTG GTG AAT ATC GGC GGC TTC TTG TGT ATG AAC GAT GAG GAG 994 Asp Cys Leu Val Asn Ile Gly Gly Phe Leu Cys Met Asn Asp Glu Glu 260 265 270 ATG TTC TCA GCG GCA AAA GAG TTG GTT GTC GTT TAT GAA GGT ATG CCG 1042 Met Phe Ser Ala Ala Lys Glu Leu Val Val Val Tyr Glu Gly Met Pro 275 280 285 TCA TAC GGC GGG CTG GCC GGT CGG GAT ATG GAA GCA ATG GCT ATT GGG 1090 Ser Tyr Gly Gly Leu Ala Gly Arg Asp Met Glu Ala Met Ala Ile Gly 290 295 300 305 CTA CGT GAA GCC ATG CAG TAT GAA TAT ATT GAA CAT CGG GTC AAA CAG 1138 Leu Arg Glu Ala Met Gln Tyr Glu Tyr Ile Glu His Arg Val Lys Gln 310 315 320 GTG CGC TAT CTG GGC GAT AAA CTC CGT GAA GCC GGC GTA CCC ATT GTT 1186 Val Arg Tyr Leu Gly Asp Lys Leu Arg Glu Ala Gly Val Pro Ile Val 325 330 335 GAA CCG ACG GGC GGA CAT GCG GTA TTT CTT GAT GCT CGT CGT TTC TGT 1234 Glu Pro Thr Gly Gly His Ala Val Phe Leu Asp Ala Arg Arg Phe Cys 340 345 350 CCA CAC CTG ACG CAG GAT CAG TTC CCT GCG CAG AGC CTG GCA GCC AGC 1282 Pro His Leu Thr Gln Asp Gln Phe Pro Ala Gln Ser Leu Ala Ala Ser 355 360 365 ATC TAT ATG GAA ACC GGC GTG CGA AGT ATG GAA CGT GGA ATT GTT TCC 1330 Ile Tyr Met Glu Thr Gly Val Arg Ser Met Glu Arg Gly Ile Val Ser 370 375 380 385 GCC GGT CGT AGC AAG GAA ACG GGG GAG AAC CAT AGC CCC AAA CTG GAG 1378 Ala Gly Arg Ser Lys Glu Thr Gly Glu Asn His Ser Pro Lys Leu Glu 390 395 400 ACG GTA CGT CTC ACT ATT CCA CGC CGT GTT TAC ACT TAC GCG CAC ATG 1426 Thr Val Arg Leu Thr Ile Pro Arg Arg Val Tyr Thr Tyr Ala His Met 405 410 415 GAT GTT ATT GCC GAT GGC ATC ATT AAA CTG TAC CAG CAT AAA GAA GAT 1474 Asp Val Ile Ala Asp Gly Ile Ile Lys Leu Tyr Gln His Lys Glu Asp 420 425 430 ATT CGT GGT CTG ACG TTT GTT TAC GAA CCT AAA CAA CTT CGC TTC TTT 1522 Ile Arg Gly Leu Thr Phe Val Tyr Glu Pro Lys Gln Leu Arg Phe Phe 435 440 445 ACT GCG CGT TTT GAC TTT ATT TAATACAACC CTGGCCCCGC AGGGGGCC 1571 Thr Ala Arg Phe Asp Phe Ile 450 455 配列番号：４配列の長さ：３１塩基配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列 CCCGGGTATC AACACTGTTA CTGGAGAAAC A 31 配列番号：５配列の長さ：３７塩基配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列 TATGTTTCTC CAGTAACAGT GTTGATACCC GGGGTAC 37 配列番号：６配列の長さ：２５塩基配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列 GGATAGTTCA TATGTATTTC TCCAG 25

【図面の簡単な説明】

【図１】組換え体プラスミドｐＥＨ２の中のエルビ
ニア・ヘルビコーラ（Ｅｒｗｉｎｉａｈｅｒｂｉｃｏ
ｌａｄｉｉ）由来の挿入ＤＮＡ部分の制限酵素切断地図
とチロシンフェノ−ル・リア−ゼ遺伝子のおおよその位
置を示した図である。

【図２】チロシンフェノ−ル・リア−ゼ遺伝子のＤＮＡ
塩基配列とチロシンフェノ−ル・リア−ゼのアミノ酸配
列を示した図である。

【図３】組換え体プラスミドｐＥＨ２１の制限酵素切
断地図を示した図である。

【図４】組換え体プラスミドｐＣＥ２６の制限酵素切
断地図を示した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:18） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 5/90 C12N 1/00 - 1/38 C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（ＧＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】次のアミノ酸配列で表されるチロシンフ
ェノ−ル・リア−ゼをコ−ドし、培地中のチロシンによ
る誘導に関与しない遺伝子。 MNYPAEPFRI KSVETVSMIS RDERVKKMQE AGYNTFLLNS KDIYIDLLTD SGTNAMSDKQ WAGMMIGDEA YAGSENFYHL EKTVKELFGF KHIVPTHQGR GAENLLSQLA IKPGQYVAGN MYFTTTRFHQ EKNGATFVDI VRDEAHDASL NLPFKGNIDL NKLATLIKEK GAENIAYICL AVTVNLAGGQ PVSMANMRAV HEMASTYGIK IYYDATRCVE NAYFIKEQEA GYENVSIKDI VHEMFSYADG CTMSGKKDCL VNIGGFLCMN DEEMFSAAKE LVVVYEGMPS YGGLAGRDME AMAIGLREAM QYEYIEHRVK QVRYLGDKLR EAGVPIVEPT GGHAVFLDAR RFCPHLTQDQ FPAQSLAASI YMETGVRSME RGIVSAGRSK ETGENHSPKL ETVRLTIPRR VYTYAHMDVI ADGIIKLYQH KEDIRGLTFV YEPKQLRFFT ARFDFI （ただし、Ａアラニン、Ｃシステイン、Ｄアスパ
ラギン酸、Ｅグルタミン酸、Ｆフェニルアラニン、
Ｇグリシン、Ｈヒスチジン、Ｉイソロイシン、Ｋ
リジン、Ｌロイシン、Ｍメチオニン、Ｎアスパ
ラギン、Ｐプロリン、Ｑグルタミン、Ｒアルギニ
ン、Ｓセリン、Ｔスレオニン、Ｖバリン、Ｗト
リプトファン、Ｙチロシンを示す。）
【請求項２】その５’末端から該アミノ酸配列の３’
末端のイソロイシンをコードするコドンまでの長さが
１．６ｋｂｐ以下であることを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載の遺伝子。
【請求項３】次のＤＮＡ塩基配列で表され、培地中の
チロシンによる誘導に関与しないチロシンフェノ−ル・
リア−ゼ遺伝子。 ATGAACTATC CTGCCGAGCC TTTCCGCATT AAAAGTGTTG AAACCGTATC AATGATCTCA CGCGATGAGC GTGTTAAAAA AATGCAAGAA GCGGGCTATA ACACGTTTTT ACTGAATTCA AAGGATATCT ACATCGATCT GCTGACAGAC AGCGGTACAA ATGCCATGAG TGACAAGCAG TGGGCAGGGA TGATGATTGG TGATGAAGCC TACGCAGGCA GTGAAAACTT CTACCATCTC GAAAAAACGG TGAAAGAGTT GTTTGGTTTC AAACACATCG TTCCAACCCA CCAGGGACGC GGGGCGGAAA ACCTGCTCTC GCAGCTGGCC ATTAAGCCCG GTCAATATGT CGCAGGAAAT ATGTACTTTA CAACAACCCG CTTCCATCAG GAAAAAAATG GCGCAACCTT TGTGGATATT GTCCGCGATG AAGCACATGA CGCCAGCCTG AATCTCCCCT TTAAAGGTAA TATTGACCTG AATAAATTAG CGACGCTCAT TAAAGAAAAA GGCGCCGAGA ACATCGCCTA TATCTGCCTT GCGGTCACCG TGAATCTGGC GGGTGGGCAG CCTGTTTCAA TGGCGAATAT GCGTGCCGTA CATGAAATGG CCAGCACGTA TGGCATTAAG ATCTATTACG ATGCTACCCG TTGCGTTGAA AATGCCTATT TTATCAAAGA GCAGGAGGCG GGCTACGAGA ACGTCAGTAT CAAAGATATC GTGCATGAAA TGTTCAGCTA TGCCGATGGG TGCACCATGA GCGGTAAAAA AGATTGTCTG GTGAATATCG GCGGCTTCTT GTGTATGAAC GATGAGGAGA TGTTCTCAGC GGCAAAAGAG TTGGTTGTCG TTTATGAAGG TATGCCGTCA TACGGCGGGC TGGCCGGTCG GGATATGGAA GCAATGGCTA TTGGGCTACG TGAAGCCATG CAGTATGAAT ATATTGAACA TCGGGTCAAA CAGGTGCGCT ATCTGGGCGA TAAACTCCGT GAAGCCGGCG TACCCATTGT TGAACCGACG GGCGGACATG CGGTATTTCT TGATGCTCGT CGTTTCTGTC CACACCTGAC GCAGGATCAG TTCCCTGCGC AGAGCCTGGC AGCCAGCATC TATATGGAAA CCGGCGTGCG AAGTATGGAA CGTGGAATTG TTTCCGCCGG TCGTAGCAAG GAAACGGGGG AGAACCATAG CCCCAAACTG GAGACGGTAC GTCTCACTAT TCCACGCCGT GTTTACACTT ACGCGCACAT GGATGTTATT GCCGATGGCA TCATTAAACT GTACCAGCAT AAAGAAGATA TTCGTGGTCT GACGTTTGTT TACGAACCTA AACAACTTCG CTTCTTTACT GCGCGTTTTG ACTTTATT
【請求項４】特許請求の範囲第１項〜第３項の何れか
一項に記載の遺伝子を担うＤＮＡがプロモ−タ−の下流
に連結しており、宿主細胞中で培地中のチロシンによる
誘導に関与しないでチロシンフェノ−ル・リア−ゼを生
産する組換え体プラスミド。
【請求項５】プロモ−タ−が、ｔａｃまたはｌａｃ
プロモ−タ−である特許請求の範囲第４項記載の組換え
体プラスミド。
【請求項６】その構成が図３により規定される新規な
組換え体プラスミドである pEH21。
【請求項７】その構成が図４により規定される新規な
組換え体プラスミドであるpCE26。
【請求項８】特許請求の範囲第４項から第７項の何れ
か一項に記載の組換え体プラスミドで形質転換された大
腸菌。
【請求項９】請求項６に記載の組換え体プラスミドpE
H21により形質転換された大腸菌であるエッシェリヒア
・コリ(Escherichia coli)MT-10516(MC1061/pEH21)(FE
RM P-11386)。
【請求項１０】請求項７に記載の組換え体プラスミド
pCE26により形質転換された大腸菌であるエッシェリヒ
ア・コリ(Escherichia coli)MT-10519(MC1061/pCE26)
(FERM BP-3287)。
【請求項１１】特許請求の範囲第８項から第１０項の
何れか一項に記載の大腸菌を培養し、培養物中にチロシ
ンフェノ−ル・リア−ゼを生成させることを特徴とする
チロシンフェノ−ル・リア−ゼの製造法。