JP3150335B2 - 新規ポリペプチドとその発現を可能にするｄｎａ配列，調製法およびその利用 - Google Patents
新規ポリペプチドとその発現を可能にするｄｎａ配列，調製法およびその利用Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、鏡像選択的アミダーゼ活性を有するポリペ
プチドに関する。また本発明は、これらのポリペプチド
の発現に必要な遺伝子材料及びその微生物学的調製方法
に関する。さらに本発明は、これらポリペプチドの利用
及びラセミアミドから酸の鏡像選択的合成のための形質
転換微生物の利用に関する。上記酸としては、特にプロ
ピオン酸が挙げられるが、その中でも、とりわけ（Ｓ）
−２−アリールプロピオン酸及び（Ｒ）−２−アリール
オキシ−プロピオン酸が挙げられる。
プチドに関する。また本発明は、これらのポリペプチド
の発現に必要な遺伝子材料及びその微生物学的調製方法
に関する。さらに本発明は、これらポリペプチドの利用
及びラセミアミドから酸の鏡像選択的合成のための形質
転換微生物の利用に関する。上記酸としては、特にプロ
ピオン酸が挙げられるが、その中でも、とりわけ（Ｓ）
−２−アリールプロピオン酸及び（Ｒ）−２−アリール
オキシ−プロピオン酸が挙げられる。
不斉炭素原子が存在すると、多くの分子は２つの別個
の立体異性体（Ｒ及びＳ形）を有する。その内の１つ
は、他の１つに対して鏡像体を構成する。これは、２−
アリール−プロピオン酸の場合に該当する。これらの分
子は、大抵の場合、約当量で存在する２つの異性体のラ
セミ混合物として存在する。１つの特異的異性体のみが
要求される場合があり、２つの異性体を分離するか又は
所望の異性体の立体特異的合成により実行される。
の立体異性体（Ｒ及びＳ形）を有する。その内の１つ
は、他の１つに対して鏡像体を構成する。これは、２−
アリール−プロピオン酸の場合に該当する。これらの分
子は、大抵の場合、約当量で存在する２つの異性体のラ
セミ混合物として存在する。１つの特異的異性体のみが
要求される場合があり、２つの異性体を分離するか又は
所望の異性体の立体特異的合成により実行される。
本発明は、鏡像選択的手法において、アミドを加水分
解できるポリペプチドの分野に関する。特に、ラセミ２
−アリール−プロピオン酸アミドの（Ｓ）−２−アリー
ル−プロピオン酸への加水分解及びラセミ２−アリール
オキシ−プロピオン酸アミドの（Ｒ）−２−アリールオ
キシ−プロピオン酸への加水分解が挙げられる。
解できるポリペプチドの分野に関する。特に、ラセミ２
−アリール−プロピオン酸アミドの（Ｓ）−２−アリー
ル−プロピオン酸への加水分解及びラセミ２−アリール
オキシ−プロピオン酸アミドの（Ｒ）−２−アリールオ
キシ−プロピオン酸への加水分解が挙げられる。
上記酵素活性が実証されている微生物の内、ブレビバ
クテリウム（Brevibacterium）及びコリネバクテリウム
属の菌株（ヨーロッパ特許第89 400197,3号に記載）が
目立つ存在である。特に、ブレビバクテリウム株R312
（CBS 717,73）が挙げられている。加えて、ロドコッカ
スのごとき株も上記酵素活性を有する。
クテリウム（Brevibacterium）及びコリネバクテリウム
属の菌株（ヨーロッパ特許第89 400197,3号に記載）が
目立つ存在である。特に、ブレビバクテリウム株R312
（CBS 717,73）が挙げられている。加えて、ロドコッカ
スのごとき株も上記酵素活性を有する。
本発明は、鏡像選択的アミダーゼ活性物の特性化及び
精製、さらには、上記ペプチドの発現のための遺伝子物
質のクローニング及び配列決定をも包含するものであ
る。以下、用語「Amd」は、すべての鏡像選択的アミダ
ーゼ活性体を意味するものとする。用語「Amd配列」
は、該アミダーゼ活性体をコードするすべてのヌクレオ
チド配列を意味するものとする。
精製、さらには、上記ペプチドの発現のための遺伝子物
質のクローニング及び配列決定をも包含するものであ
る。以下、用語「Amd」は、すべての鏡像選択的アミダ
ーゼ活性体を意味するものとする。用語「Amd配列」
は、該アミダーゼ活性体をコードするすべてのヌクレオ
チド配列を意味するものとする。
特に、本発明の目的は、組換えDNA技術により異なる
宿主微生物における上記鏡像選択的アミダーゼの高水準
な発現を達成することにある。
宿主微生物における上記鏡像選択的アミダーゼの高水準
な発現を達成することにある。
本発明の目的の一つは、鏡像選択的アミダーゼ活性を
有するポリペプチド（特にラセミ２−アリール−プロピ
オン酸アミドに対して）をコードするDNA配列に関す
る。好ましい態様として、本発明は、ブレビバクテリウ
ムR312の鏡像選択的アミダーゼをコードするヌクレオチ
ド配列（第８図に示す。）又はロドコッカスの鏡像選択
的アミダーゼをコードするヌクレオチド配列（第13図に
示す。）、さらには、同じポリペプチドをコードするい
ずれの縮重合配列にも関するものである。本発明は又、
これらのDNA配列又はその断片とハイブリダイズする配
列に関し、及び鏡像選択的アミダーゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードする配列に関する。さらに本発明は、
上記DNA配列を含む遺伝子に関する。
有するポリペプチド（特にラセミ２−アリール−プロピ
オン酸アミドに対して）をコードするDNA配列に関す
る。好ましい態様として、本発明は、ブレビバクテリウ
ムR312の鏡像選択的アミダーゼをコードするヌクレオチ
ド配列（第８図に示す。）又はロドコッカスの鏡像選択
的アミダーゼをコードするヌクレオチド配列（第13図に
示す。）、さらには、同じポリペプチドをコードするい
ずれの縮重合配列にも関するものである。本発明は又、
これらのDNA配列又はその断片とハイブリダイズする配
列に関し、及び鏡像選択的アミダーゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードする配列に関する。さらに本発明は、
上記DNA配列を含む遺伝子に関する。
アミダーゼのペプチド配列間の相同関係についての研
究により、上記活性をもたらす保存領域が明らかにな
る。この領域は、第13図に示されるペプチド配列のアミ
ド酸137〜193（ヌクレオチド618〜788）に対応し、上記
ブレビバクテリウムR312のアミダーゼのペプチド配列の
アミノ酸159〜215に対応し、厳密な相同性（67％）を共
有する。
究により、上記活性をもたらす保存領域が明らかにな
る。この領域は、第13図に示されるペプチド配列のアミ
ド酸137〜193（ヌクレオチド618〜788）に対応し、上記
ブレビバクテリウムR312のアミダーゼのペプチド配列の
アミノ酸159〜215に対応し、厳密な相同性（67％）を共
有する。
本発明の目的の一つは、従って、上記のごときDNA配
列に関し、それが第13図におけるアミノ酸137〜193、第
８図における159〜215、又はそれらと少なくとも50％の
相同性を有するペプチド配列をコードする配列を少なく
とも含んでいることにより特徴づけられる。
列に関し、それが第13図におけるアミノ酸137〜193、第
８図における159〜215、又はそれらと少なくとも50％の
相同性を有するペプチド配列をコードする配列を少なく
とも含んでいることにより特徴づけられる。
特に、本発明の目的の一つは、第８図及び第13図に示
されるAmd配列の全部又は一部、又はそれらの変異体を
含むことを特徴とするDNA配列に関する。本発明の意図
するところにおいては、変異体とは、初期配列の特性を
保つ全ての配列を表わすことを意味し、そしてそれらの
配列が、例えば突然変異、欠失、挿入又は遺伝子コード
の縮重に起因する変質を含む場合も言えることである。
されるAmd配列の全部又は一部、又はそれらの変異体を
含むことを特徴とするDNA配列に関する。本発明の意図
するところにおいては、変異体とは、初期配列の特性を
保つ全ての配列を表わすことを意味し、そしてそれらの
配列が、例えば突然変異、欠失、挿入又は遺伝子コード
の縮重に起因する変質を含む場合も言えることである。
より正確には、DNA配列は、第８図又は第13図に示さ
れる配列を含む。
れる配列を含む。
これらの配列は、さまざまな方法により得ることがで
きる。一般的な方法は、精製ポリペプチドから導き出さ
れたヌクレオチドプローブの助けを借りて、所望のポリ
ペプチドをコードするゲノムDNA断片をクローン化する
ことによる。プライマー伸長、制限酵素、アダプターの
挿入、又はリンカーオリゴヌクレオチドの連結を包含す
る種々の方法を用いることにより、所望のDNA配列を含
むヌクレオチド挿入物を作ることができる。次いでそれ
を文献記載の技術によりマッピングし、配列決定するこ
とができる。
きる。一般的な方法は、精製ポリペプチドから導き出さ
れたヌクレオチドプローブの助けを借りて、所望のポリ
ペプチドをコードするゲノムDNA断片をクローン化する
ことによる。プライマー伸長、制限酵素、アダプターの
挿入、又はリンカーオリゴヌクレオチドの連結を包含す
る種々の方法を用いることにより、所望のDNA配列を含
むヌクレオチド挿入物を作ることができる。次いでそれ
を文献記載の技術によりマッピングし、配列決定するこ
とができる。
他の技術、すなわち、DNA及び／又は部分的又は全体
的化学合成物を利用する技術も同様に使用できる。これ
らの技術は良く知られており、第８図および第13図に示
される構造物は、従来の技術を用いて他の微生物におけ
る相当する配列を分離することができる。
的化学合成物を利用する技術も同様に使用できる。これ
らの技術は良く知られており、第８図および第13図に示
される構造物は、従来の技術を用いて他の微生物におけ
る相当する配列を分離することができる。
事実上、鏡像選択的アミダーゼ間の相同性を実証した
ことにより、本発明は、どのゲノムバンクにおいてもハ
イブリダイズできる遺伝子（十分な相同性を有する遺伝
子）を同定するのに役立つプローブの製造を可能にす
る。そういった遺伝子が、鏡像選択的アミダーゼをコー
ドすることを実証することは容易である。この方法でど
の微生物中でも多量のアミダーゼを得ることが可能であ
る。又、新規鏡像選択的アミダーゼ活性を明らかにする
ことも可能である。
ことにより、本発明は、どのゲノムバンクにおいてもハ
イブリダイズできる遺伝子（十分な相同性を有する遺伝
子）を同定するのに役立つプローブの製造を可能にす
る。そういった遺伝子が、鏡像選択的アミダーゼをコー
ドすることを実証することは容易である。この方法でど
の微生物中でも多量のアミダーゼを得ることが可能であ
る。又、新規鏡像選択的アミダーゼ活性を明らかにする
ことも可能である。
さらに本発明は、鏡像選択的アミダーゼ活性を有す
る、以下のペプチド配列の内の少なくとも１を含むポリ
ペプチドに関する。
る、以下のペプチド配列の内の少なくとも１を含むポリ
ペプチドに関する。
1. 第13図におけるアミノ酸137〜193に対応する配列、 2. 第８図におけるアミノ酸159〜215に対応する配列、 3. これらの配列と少なくとも50％の相同性を有する配
列。
列。
本発明のさらに他の目的は、上記DNA配列から誘導さ
れる構造を有し、鏡像選択的アミダーゼ活性を有する新
規ポリペプチドに関する。これらのポリペプチドは、天
然の又は、組換え微生物の培養物からの抽出及び精製に
より得られる。この精製は、一連の工程、すなわち、培
養物からの粗抽出物の調製、該抽出物の硫酸アンモニウ
ム分画、及びクロマトグラフィー及びゲルロ過による精
製の工程により行われる。詳細は、実施例により明らか
にされる。
れる構造を有し、鏡像選択的アミダーゼ活性を有する新
規ポリペプチドに関する。これらのポリペプチドは、天
然の又は、組換え微生物の培養物からの抽出及び精製に
より得られる。この精製は、一連の工程、すなわち、培
養物からの粗抽出物の調製、該抽出物の硫酸アンモニウ
ム分画、及びクロマトグラフィー及びゲルロ過による精
製の工程により行われる。詳細は、実施例により明らか
にされる。
より正確には、本発明は、ブレビバクテリウムR312及
びロドコッカスの鏡像選択的アミダーゼに関する。
びロドコッカスの鏡像選択的アミダーゼに関する。
本発明は、また、上記に挙げられたDNA配列の少なく
とも１の発現カセットを含む形質転換微生物に関する。
これらのカセットは、所望の宿主中での発現を保証する
調節DNA配列の制御の下に置かれた、本発明に係るDNA配
列よりなることが好ましい。このカセットは、宿主ゲノ
ムに組み入れられるか、選択マーカー及び宿主中で機能
する複製の開始点を運ぶプラスミドへ挿入される。
とも１の発現カセットを含む形質転換微生物に関する。
これらのカセットは、所望の宿主中での発現を保証する
調節DNA配列の制御の下に置かれた、本発明に係るDNA配
列よりなることが好ましい。このカセットは、宿主ゲノ
ムに組み入れられるか、選択マーカー及び宿主中で機能
する複製の開始点を運ぶプラスミドへ挿入される。
本発明の関心の１つは、人工的条件下でのポリペプチ
ドの発現にある。すなわち、その培養条件が特に遊離で
あるある種の細胞における異種性配列の発現及び／又
は、生産を高め及び／又は培養条件を改善するために少
なくとも部分的異種性調節シグナルの制御の下での、相
同性配列の発現にある。
ドの発現にある。すなわち、その培養条件が特に遊離で
あるある種の細胞における異種性配列の発現及び／又
は、生産を高め及び／又は培養条件を改善するために少
なくとも部分的異種性調節シグナルの制御の下での、相
同性配列の発現にある。
本発明の対象であるDNA配列の発現を制御するDNA配列
は、好ましくは、転写及び翻訳開始領域を有する。この
領域は、プロモーター及びリボゾーム結合部位を含み、
生産されるペプチドと同種（由来）あるいは異種（由
来）でもよい。
は、好ましくは、転写及び翻訳開始領域を有する。この
領域は、プロモーター及びリボゾーム結合部位を含み、
生産されるペプチドと同種（由来）あるいは異種（由
来）でもよい。
調節領域の選択は、使用される宿主に依存する。特
に、原核宿主については、異種性プロモーターを多くの
強力な細菌プロモーターの内から選択できる。このプロ
モーターは、例えば、トリプトファンオペロンのプロモ
ータPtrp、ラクトースオペロンのプロモータPlac、ラム
ダバクテリオファージの右又は左プロモーターPR及び
PL、コリネバクテリウムフージの強力プロモーター各
種、又はコリネバクテリウムの同種プロモーターが挙げ
られる。より正確には、ラムダの右プロモーターの場
合、湿度感受性PRc I tsが好ましい。酵母のごとき真核
生物については、酵母解糖遺伝子のプロモーターが使用
できる。例えば、ホスホグリセレートキナーゼ（PG
K）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロ
ゲナーゼ（GPD）、ラクターゼ（LAC4）及びエノラーゼ
（ENO）等の遺伝子のプロモーターが挙げられる。
に、原核宿主については、異種性プロモーターを多くの
強力な細菌プロモーターの内から選択できる。このプロ
モーターは、例えば、トリプトファンオペロンのプロモ
ータPtrp、ラクトースオペロンのプロモータPlac、ラム
ダバクテリオファージの右又は左プロモーターPR及び
PL、コリネバクテリウムフージの強力プロモーター各
種、又はコリネバクテリウムの同種プロモーターが挙げ
られる。より正確には、ラムダの右プロモーターの場
合、湿度感受性PRc I tsが好ましい。酵母のごとき真核
生物については、酵母解糖遺伝子のプロモーターが使用
できる。例えば、ホスホグリセレートキナーゼ（PG
K）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロ
ゲナーゼ（GPD）、ラクターゼ（LAC4）及びエノラーゼ
（ENO）等の遺伝子のプロモーターが挙げられる。
宿主微生物が、原核である場合、リボソーム結合部位
は、ラムダのc II遺伝子かあるいはコリネバクテリアの
相同遺伝子に由来するのが望ましい。
は、ラムダのc II遺伝子かあるいはコリネバクテリアの
相同遺伝子に由来するのが望ましい。
宿主において機能する転写及び翻訳終結領域は、コー
ド配列の３′側（下流）に置かれる。プラスミドはま
た、組換え宿主の選択を可能にするための、１つ又は数
種のマーカーを運ぶ。アンピシリン、ストレプトマイシ
ンのごとき抗生物質又は他の毒素に対する耐性のような
優性マーカーが好ましい。
ド配列の３′側（下流）に置かれる。プラスミドはま
た、組換え宿主の選択を可能にするための、１つ又は数
種のマーカーを運ぶ。アンピシリン、ストレプトマイシ
ンのごとき抗生物質又は他の毒素に対する耐性のような
優性マーカーが好ましい。
使用される宿主微生物としては、特に、E.coliのごと
き腸内細菌及びコリネバクテリウム属、ブレビバクテリ
ウム属又はロドコッカス属のコリネバクテリウムが挙げ
られる。
き腸内細菌及びコリネバクテリウム属、ブレビバクテリ
ウム属又はロドコッカス属のコリネバクテリウムが挙げ
られる。
もちろん、同様の原理に基づき、他の細胞型を使用す
ることもできる。
ることもできる。
本発明の目的の１つは、少なくとも転写及び翻訳開始
領域、所望のポリペプチドをコードするDNA配列及び選
択マーカーを含む、上記プラスミドに関する。
領域、所望のポリペプチドをコードするDNA配列及び選
択マーカーを含む、上記プラスミドに関する。
本発明はまた、上記形質転換微生物の鏡像選択的アミ
ダーゼの調製における応用、及びラセミアミドから酸の
鏡像体選択的合成における使用に関する。
ダーゼの調製における応用、及びラセミアミドから酸の
鏡像体選択的合成における使用に関する。
鏡像選択的アミダーゼの調製法は、鏡像体選択的アミ
ダーゼをコードする配列の発現を許容する条件下で、上
記微生物を培養し、次いで生成されたアミダーゼを微生
物から分離することよりなる。
ダーゼをコードする配列の発現を許容する条件下で、上
記微生物を培養し、次いで生成されたアミダーゼを微生
物から分離することよりなる。
より正確には、本発明は、対応するラセミ２−アリー
ル−プロピオン酸アミドから２−アリール−プロピオン
酸の鏡像体選択的合成のための、上記組換え微生物又は
ポリペプチドの利用に関する。
ル−プロピオン酸アミドから２−アリール−プロピオン
酸の鏡像体選択的合成のための、上記組換え微生物又は
ポリペプチドの利用に関する。
本発明の好ましい態様の１つによれば、対応するラセ
ミアミドから有機酸の立体異性体の調製方法において、
ラセミアミドが上記形質転換微生物の存在下、又は、上
記のごとく得られたポリペプチドの存在下に置かれ、得
られた立体異性体が回収されることを特徴とする調製方
法が推薦される。
ミアミドから有機酸の立体異性体の調製方法において、
ラセミアミドが上記形質転換微生物の存在下、又は、上
記のごとく得られたポリペプチドの存在下に置かれ、得
られた立体異性体が回収されることを特徴とする調製方
法が推薦される。
この方法が適用できるアミドとしては、製薬業界にお
いて有用なＳ（＋）ケトプロフェンを得ることのできる
ケトプロフェンのラセミアミドが挙げられる。
いて有用なＳ（＋）ケトプロフェンを得ることのできる
ケトプロフェンのラセミアミドが挙げられる。
以下の実施例及び図は、本発明の他の特性及び優位性
を示すものである。これらは、例証として挙げられるの
であって、限定されるものではない。
を示すものである。これらは、例証として挙げられるの
であって、限定されるものではない。
出発材料としてのプラスミド プラスミドpXL1029は、ヤング等（Jung etal）（198
8）、アン．インスト．パスツール／マイクロバイオ
ル．（Ann.Inst.Pasteur/Microbiol.）139,129−146に
記載されている。該プラスミドは、PRc I ts−RBSc II
ΔtR Iを含むEcoR I−Nde I断片を運ぶ。
8）、アン．インスト．パスツール／マイクロバイオ
ル．（Ann.Inst.Pasteur/Microbiol.）139,129−146に
記載されている。該プラスミドは、PRc I ts−RBSc II
ΔtR Iを含むEcoR I−Nde I断片を運ぶ。
実施例１ ブレビバクテリウムR312の鏡像体選択的アミダーゼの同
定および精製 1.1 同定 ２−アリルオキシプロピオンアミドの誘導体である
（R,S）−２−（４−ヒドロキシフェノキシ）プロピオ
ンアミド（HPPAmide）は鏡像体選択的アミダーゼの基質
としては２−アリールプロピオンアミド誘導体、すなわ
ち２−フェニルプロピオンアミドや２−（３−ベンゾイ
ルフェニル）プロピオンアミドよりも優れた基質であ
る。さらにHPPアミドのＲ異性体に対する選択性は２−
アリルプロピオンアミド誘導体のＳ−異性体に対する選
択性を表わす。
定および精製 1.1 同定 ２−アリルオキシプロピオンアミドの誘導体である
（R,S）−２−（４−ヒドロキシフェノキシ）プロピオ
ンアミド（HPPAmide）は鏡像体選択的アミダーゼの基質
としては２−アリールプロピオンアミド誘導体、すなわ
ち２−フェニルプロピオンアミドや２−（３−ベンゾイ
ルフェニル）プロピオンアミドよりも優れた基質であ
る。さらにHPPアミドのＲ異性体に対する選択性は２−
アリルプロピオンアミド誘導体のＳ−異性体に対する選
択性を表わす。
したがって、鏡像体選択的酵素活性は２−（４−ヒド
ロキシフェノキシ）−プロピオンアミドを基質として検
出した。反応は25℃、50mMリン酸ナトリウムpH7.0の緩
衝液中、ブレビバクテリウムR312の存在下で撹拌しなが
ら行なった。反応は、0.05Mリン酸、アセトニトリル、1
N HClの混合物（55:40:5v/v）を添加して終了させた。
反応液を遠心したのち上性を逆相高速液体クロマトグラ
フィ（HPLC）（Hibar−Merk）により分析した。溶出は
0.005Mリン酸／アセトニトリル（85/15）（v/v）で行な
った。HPPAmideとHPPAcidのそれぞれの濃度は溶出ピー
クをスタンダードと比較して測定した。この基質に対す
る鏡像体過剰度は（Ｒ−Ｓ）／（Ｒ＋Ｓ）（ＲとＳはHP
PAcidのＲとＳ異性体のそれぞれの濃度を表わす）とし
て表わされる。鏡像体過剰度は589nmにおけるナトリウ
ムの吸収を用いた偏光分析法あるいはキラルカラムを用
いたHPLCによっても推測された。
ロキシフェノキシ）−プロピオンアミドを基質として検
出した。反応は25℃、50mMリン酸ナトリウムpH7.0の緩
衝液中、ブレビバクテリウムR312の存在下で撹拌しなが
ら行なった。反応は、0.05Mリン酸、アセトニトリル、1
N HClの混合物（55:40:5v/v）を添加して終了させた。
反応液を遠心したのち上性を逆相高速液体クロマトグラ
フィ（HPLC）（Hibar−Merk）により分析した。溶出は
0.005Mリン酸／アセトニトリル（85/15）（v/v）で行な
った。HPPAmideとHPPAcidのそれぞれの濃度は溶出ピー
クをスタンダードと比較して測定した。この基質に対す
る鏡像体過剰度は（Ｒ−Ｓ）／（Ｒ＋Ｓ）（ＲとＳはHP
PAcidのＲとＳ異性体のそれぞれの濃度を表わす）とし
て表わされる。鏡像体過剰度は589nmにおけるナトリウ
ムの吸収を用いた偏光分析法あるいはキラルカラムを用
いたHPLCによっても推測された。
全菌体あるいは水溶性抽出液を用いて得られた活性は
それぞれ15U/mgと24U/mg蛋白質であった（1U＝１μmol
生成HPPAcid/hour）。
それぞれ15U/mgと24U/mg蛋白質であった（1U＝１μmol
生成HPPAcid/hour）。
（Ｒ）−HPPAcidの対称体過剰度は95％であった。こ
れらの結果はブレビバクテリウムR312が鏡像体過剰度93
％より高い率でラセミ体の２−（３−ベンゾイルフェニ
ル）−プロピオンアミドとラセミ体の２−フェニルプロ
ピオンアミドを対応するＳ酸に加水分解できることを示
すものである。
れらの結果はブレビバクテリウムR312が鏡像体過剰度93
％より高い率でラセミ体の２−（３−ベンゾイルフェニ
ル）−プロピオンアミドとラセミ体の２−フェニルプロ
ピオンアミドを対応するＳ酸に加水分解できることを示
すものである。
1.2 精製 精製は４℃で行なった。凍結菌体（ブレビバクテリウ
ムの乾燥重量40g）は融解して300mlのバッファーＡ（50
mMリン酸ナトリウム（pH7.5）、5mMβメルカプトエタノ
ール）に懸濁した。菌株は超音波で破砕し膜破片は2000
0rpm、30分の遠心で除いた。30mlの上清に対し、25mlの
10％硫酸ストレプトマイシンの溶液を撹拌しながら徐々
に加えた。45分後、清澄化された溶液の上清の硫安処理
を行なった。硫安飽和30.8％と56.6％の間で沈殿してく
る蛋白区分を遠心で集め30mlのバッファーＡに溶解し、
同じバッファーに対してゆっくりと透析した。こうして
得られた溶液を硫安飽和20％に調節し、遠心して得られ
た上清を20％飽和硫酸アンモニウムを含むバッファーＡ
で平衡化したフェニルセファロースCL−4Bのカラム（フ
ァルマシア）にかけた。同じバッファーで活性区分を溶
出しアミコンダイアフローPM10を用いた限外濾過により
18mlにまで濃縮した。ついでグリセロール10％を濃縮液
に加えその液をあらかじめ50mMのTris−HCl、pH7.0、10
0mM NaClで平衡化したウルトロゲル（Ultrogel）AcA44
カラム（IBF−Biote chnics、フランス）にかけた。も
っとも高い比活性を有する画分（カラムにかけた全活性
の約32％）を集め同じゲルを用いて再度ゲル濾過をおこ
なった。平行して、最も高い比活性を有する画分（カラ
ムに掛けた全蛋白質の約30％に相当）をSDSゲル電気泳
動にかけて分析し、保存した。精製蛋白質の鏡像体過剰
度も測定した。
ムの乾燥重量40g）は融解して300mlのバッファーＡ（50
mMリン酸ナトリウム（pH7.5）、5mMβメルカプトエタノ
ール）に懸濁した。菌株は超音波で破砕し膜破片は2000
0rpm、30分の遠心で除いた。30mlの上清に対し、25mlの
10％硫酸ストレプトマイシンの溶液を撹拌しながら徐々
に加えた。45分後、清澄化された溶液の上清の硫安処理
を行なった。硫安飽和30.8％と56.6％の間で沈殿してく
る蛋白区分を遠心で集め30mlのバッファーＡに溶解し、
同じバッファーに対してゆっくりと透析した。こうして
得られた溶液を硫安飽和20％に調節し、遠心して得られ
た上清を20％飽和硫酸アンモニウムを含むバッファーＡ
で平衡化したフェニルセファロースCL−4Bのカラム（フ
ァルマシア）にかけた。同じバッファーで活性区分を溶
出しアミコンダイアフローPM10を用いた限外濾過により
18mlにまで濃縮した。ついでグリセロール10％を濃縮液
に加えその液をあらかじめ50mMのTris−HCl、pH7.0、10
0mM NaClで平衡化したウルトロゲル（Ultrogel）AcA44
カラム（IBF−Biote chnics、フランス）にかけた。も
っとも高い比活性を有する画分（カラムにかけた全活性
の約32％）を集め同じゲルを用いて再度ゲル濾過をおこ
なった。平行して、最も高い比活性を有する画分（カラ
ムに掛けた全蛋白質の約30％に相当）をSDSゲル電気泳
動にかけて分析し、保存した。精製蛋白質の鏡像体過剰
度も測定した。
この精製方法により80％以上純粋で比活性815U/mgで
ある酵素が得られた。この段階で見掛けの分子量59±5K
Dの主要バンド（全蛋白質の80％に相当）がSDS−ゲル電
気泳動上肉眼で認められた。さらに、HPLC TSK3000の
カラムから溶出されたアミダーゼ活性は分子量122KDに
相当し、この酵素が２量体であることが示された。
ある酵素が得られた。この段階で見掛けの分子量59±5K
Dの主要バンド（全蛋白質の80％に相当）がSDS−ゲル電
気泳動上肉眼で認められた。さらに、HPLC TSK3000の
カラムから溶出されたアミダーゼ活性は分子量122KDに
相当し、この酵素が２量体であることが示された。
表１は異なる画分の特徴を示す。本表はブレビバクテ
リウムR312の鏡像体選択的アミダーゼの別の精製工程を
示す。すなわち40gの湿菌体から出発し、硫酸ストレプ
トマイシン沈殿後である。
リウムR312の鏡像体選択的アミダーゼの別の精製工程を
示す。すなわち40gの湿菌体から出発し、硫酸ストレプ
トマイシン沈殿後である。
１ユニット（Ｕ）は１μmol生成HPPAcid/hour 実施例２ ブレビバクテリウムR312の鏡像体選択的アミダーゼの
クローニング 2.1 蛋白質配列の由来 ブレビバクテリウムR312の鏡像体選択的アミダーゼの
Ｎ−末端（27残基）及びトリプシン分解内部断片（21残
基）に夫々相当するペプチド配列は精製した酵素を用い
て決定された。
クローニング 2.1 蛋白質配列の由来 ブレビバクテリウムR312の鏡像体選択的アミダーゼの
Ｎ−末端（27残基）及びトリプシン分解内部断片（21残
基）に夫々相当するペプチド配列は精製した酵素を用い
て決定された。
この決定は３ナノモルのアミダーゼ調製品を還元及び
カルボキシメチル化せしめることにより行なった。主な
蛋白質成分を次に脱塩し、逆相HPLCにより均質にまで精
製した。Ｎ−末端配列は、アプライドバイオシステムモ
デル（Applied Biosystems Model）470A装置を用いた自
動連続エドマン（Edman）分解法により決定した。第1A
図で表わされている配列はこの手法により得た。付加的
な内部配列を得るために、同量の蛋白質をトリプシンで
消化した。還元及びカルボキシメチル化された断片を次
に逆相HPLC（2.1×10mm、流量0.2ml/分）により分離し
た。使用した溶出緩衝剤は、0.07％トリフルオロ酢酸中
の０〜50％勾配のアセトニトリルである。良く分離した
ピーク（40.8％アセトニトリル時）として溶出されたペ
プチドを配列決定した（第1A図）。
カルボキシメチル化せしめることにより行なった。主な
蛋白質成分を次に脱塩し、逆相HPLCにより均質にまで精
製した。Ｎ−末端配列は、アプライドバイオシステムモ
デル（Applied Biosystems Model）470A装置を用いた自
動連続エドマン（Edman）分解法により決定した。第1A
図で表わされている配列はこの手法により得た。付加的
な内部配列を得るために、同量の蛋白質をトリプシンで
消化した。還元及びカルボキシメチル化された断片を次
に逆相HPLC（2.1×10mm、流量0.2ml/分）により分離し
た。使用した溶出緩衝剤は、0.07％トリフルオロ酢酸中
の０〜50％勾配のアセトニトリルである。良く分離した
ピーク（40.8％アセトニトリル時）として溶出されたペ
プチドを配列決定した（第1A図）。
2.2 ヌクレオチド プローブの構築 ２つの方法を遂行した。
第１の方法においては、29−mer−（29ヌクレオチド
からなる）プローブ（59％最小相同性）の構築にあた
り、ブレビバクテリウムラクトフェルメンタム（Brevib
acterium lactofermentum）（６シストロンを含む7.7kb
配列：松井ら、モレキュラー アンド ジェネラル ジ
ェネティックス（Mol.Gen.Genet）、第209巻、299頁、1
987年）のトリプトファンオペロン中のコドンを使用す
ることを念頭において、内部断片（より小さい平均縮重
度に対応する）のIDGALGSYDV配列を使用した。比較的熱
力学的に中性なG:Tペアリングを考慮し、考慮したコド
ンの平均論理頻度を最大にするために（選択されたコド
ンの利用に関して88％）、数個の縮重を導入することに
より非コード鎖を製造した。上記の考慮によりプローブ
中のGC量約69％を導いた。このプローブの配列（Sq76
2）を第1B図に示した。
からなる）プローブ（59％最小相同性）の構築にあた
り、ブレビバクテリウムラクトフェルメンタム（Brevib
acterium lactofermentum）（６シストロンを含む7.7kb
配列：松井ら、モレキュラー アンド ジェネラル ジ
ェネティックス（Mol.Gen.Genet）、第209巻、299頁、1
987年）のトリプトファンオペロン中のコドンを使用す
ることを念頭において、内部断片（より小さい平均縮重
度に対応する）のIDGALGSYDV配列を使用した。比較的熱
力学的に中性なG:Tペアリングを考慮し、考慮したコド
ンの平均論理頻度を最大にするために（選択されたコド
ンの利用に関して88％）、数個の縮重を導入することに
より非コード鎖を製造した。上記の考慮によりプローブ
中のGC量約69％を導いた。このプローブの配列（Sq76
2）を第1B図に示した。
第２の方法においては、ジルゲス（Girges）第（Nucl
eic Acids Res.第16巻、10371頁、1988年）により記載
されたPCR法を、高度に縮重したコドンに相当するペプ
チドから正確なヌクレオチドプローブを得るために用い
た。上記を達成するために、25−マー（25ヌクレオチド
からなる）オリゴヌクレオチド（第2A図下線の配列参
照）を製造した。このヌクレオチドはＮ−末端ペプチド
配列の最初又は最後の５つのコドンをコードするすべて
の可能性に対応し、また５′−末端上に、夫々EcoR I及
びHind III部位を有するものである。これらの25−マー
はブレビバクテリウム R312ゲノムDNAの酵素的増幅を
開始するために用いた。増幅の30周期後に候補となる断
片をゲルで精製し、次にバクテリオファージM13mp19のH
ind IIIとEcoR I部位の間に挿入した。実際に、プライ
マーの２つの異ったハイブリダイゼーション温度（45℃
及び48℃）を使用し、結果として候補となる断片を２つ
得た。この様に断片のクローン化後、夫々の温度からの
数個のクローンの配列を比較した。結果を第2A図に示
す。プライマーにより導入された縮退を除いて、アミダ
ーゼのＮ−末端をコードするDNA断片は良く増幅された
と考えられる。それ故この内部断片に相当する40−マー
合成オリゴヌクレオチド（918配列）はアミダーゼのＮ
−末端に対する正確なプローブとしてクローン化の試験
に使用した。第2B図には特定プローブ918配列のヌクレ
オチド配列を示す。
eic Acids Res.第16巻、10371頁、1988年）により記載
されたPCR法を、高度に縮重したコドンに相当するペプ
チドから正確なヌクレオチドプローブを得るために用い
た。上記を達成するために、25−マー（25ヌクレオチド
からなる）オリゴヌクレオチド（第2A図下線の配列参
照）を製造した。このヌクレオチドはＮ−末端ペプチド
配列の最初又は最後の５つのコドンをコードするすべて
の可能性に対応し、また５′−末端上に、夫々EcoR I及
びHind III部位を有するものである。これらの25−マー
はブレビバクテリウム R312ゲノムDNAの酵素的増幅を
開始するために用いた。増幅の30周期後に候補となる断
片をゲルで精製し、次にバクテリオファージM13mp19のH
ind IIIとEcoR I部位の間に挿入した。実際に、プライ
マーの２つの異ったハイブリダイゼーション温度（45℃
及び48℃）を使用し、結果として候補となる断片を２つ
得た。この様に断片のクローン化後、夫々の温度からの
数個のクローンの配列を比較した。結果を第2A図に示
す。プライマーにより導入された縮退を除いて、アミダ
ーゼのＮ−末端をコードするDNA断片は良く増幅された
と考えられる。それ故この内部断片に相当する40−マー
合成オリゴヌクレオチド（918配列）はアミダーゼのＮ
−末端に対する正確なプローブとしてクローン化の試験
に使用した。第2B図には特定プローブ918配列のヌクレ
オチド配列を示す。
この方法によって得られた２つのプローブ762配列及
び918配列は32Pを用いた５′リン酸化により標識され
た。
び918配列は32Pを用いた５′リン酸化により標識され
た。
2.3 ブレビバクテリウムR312の鏡像体選択的アミダー
ゼをコードする遺伝子のクローニング 本法はまずプローブの特異性を確かめること及びサザ
ンブロットによりクローン化されるべきゲノムDNA断片
の性質を決定することから成る。ブレビバクテリウムR3
12ゲノムDNAは、可能なクローニング部位、特にpUCプラ
スミドの多部位クローニング領域に存在する部位に対応
する数個の制限酵素により切断された。特に、Pst Iを
用いた。アガロースゲルを用いた電気泳動後ナイロン膜
に転写し、種々な切断物をプローブ762配列及び918配列
とハイブリダイズさせた。第３図に示した結果は、２つ
のプローブがハイブリダイゼーション条件下で十分な特
異性を表わしている（最大１つの断片が各々の切断物に
対してハイブリダイズする）ことを証明している。さら
に、２つのプローブはほとんど同じハイブリダイゼーシ
ョンパターンを与えるので、必要とされる遺伝子のハイ
ブリダイゼーションシグナルはかなり特異的であり、ま
たトリプシン消化後に得られる内部ペプチドはＮ−末端
に非常に近接しているものと信じられるであろう。特に
ハイブリダイゼーションのフットプリントは、２つのプ
ローブと強力にハイブリダズする独特な5.4kb Pst Ｉ
断片の存在を示している。それ故この断片をクローン化
することを決めた。
ゼをコードする遺伝子のクローニング 本法はまずプローブの特異性を確かめること及びサザ
ンブロットによりクローン化されるべきゲノムDNA断片
の性質を決定することから成る。ブレビバクテリウムR3
12ゲノムDNAは、可能なクローニング部位、特にpUCプラ
スミドの多部位クローニング領域に存在する部位に対応
する数個の制限酵素により切断された。特に、Pst Iを
用いた。アガロースゲルを用いた電気泳動後ナイロン膜
に転写し、種々な切断物をプローブ762配列及び918配列
とハイブリダイズさせた。第３図に示した結果は、２つ
のプローブがハイブリダイゼーション条件下で十分な特
異性を表わしている（最大１つの断片が各々の切断物に
対してハイブリダイズする）ことを証明している。さら
に、２つのプローブはほとんど同じハイブリダイゼーシ
ョンパターンを与えるので、必要とされる遺伝子のハイ
ブリダイゼーションシグナルはかなり特異的であり、ま
たトリプシン消化後に得られる内部ペプチドはＮ−末端
に非常に近接しているものと信じられるであろう。特に
ハイブリダイゼーションのフットプリントは、２つのプ
ローブと強力にハイブリダズする独特な5.4kb Pst Ｉ
断片の存在を示している。それ故この断片をクローン化
することを決めた。
クローニングに関して、ブレビバクテリウムR312全DN
AのPst I切断で得られる4.6と5.5kbとの間及び5.5〜6.5
kbの近辺のサイズの全断片を、アガロースで精製し、電
解溶離し、Pst Iで切断したpUC19切片に結合した。大腸
菌（E.Coli）株DH5αを形質転換した後、500個の白いコ
ロニーをＸ−ガル（gal）培地上で得た。これは論理的
には組換体微生物に相当する。各々のコロニーを別々に
単離し、ナイロン膜に転写し、次に32Pで標識した918配
列プローブでハイブリダイゼーションすることにより分
析した。２つのクローンが非常に強力にハイブリダイズ
したので、これらを単離し次の工程に使用した。
AのPst I切断で得られる4.6と5.5kbとの間及び5.5〜6.5
kbの近辺のサイズの全断片を、アガロースで精製し、電
解溶離し、Pst Iで切断したpUC19切片に結合した。大腸
菌（E.Coli）株DH5αを形質転換した後、500個の白いコ
ロニーをＸ−ガル（gal）培地上で得た。これは論理的
には組換体微生物に相当する。各々のコロニーを別々に
単離し、ナイロン膜に転写し、次に32Pで標識した918配
列プローブでハイブリダイゼーションすることにより分
析した。２つのクローンが非常に強力にハイブリダイズ
したので、これらを単離し次の工程に使用した。
この２つのクローンから単離した２つの組換体プラス
ミドpXL1650及びpXL1651は、制限地図作成、プローブを
配列決定のプライマーとして用いる部分的配列決定、及
びサザンブロットを含む種々な手法により分析した。第
４図は、２つのプラスミドが２配向性で同一な5.4kb Ps
t I挿入片を含むことを示す。第５図はこの断片の制限
地図を示す。この２つのプラスミドは特徴的なペプチド
（Ｎ末端に隣接するトリプシン断片）をコードする配列
を事実含んでいる（第８図）。さらに、これらの結果
は、ブレビバクテリウムR312の鏡像体選択的アミダーゼ
をコードする遺伝子は2.3kb Bam H I−Pst I断片上に位
置し、センス方向はBam H IからPst Iの方へ向いている
ことを示す。コード配列の５′末端が判明し、また酵素
がせいぜい2kb（我々の評価に従うと57〜63KD）により
コードされるという知見から、完全な遺伝子がBam H I
−Pst I断片中に含まれていことは確かであることから
我々は配列決定に進んだ。
ミドpXL1650及びpXL1651は、制限地図作成、プローブを
配列決定のプライマーとして用いる部分的配列決定、及
びサザンブロットを含む種々な手法により分析した。第
４図は、２つのプラスミドが２配向性で同一な5.4kb Ps
t I挿入片を含むことを示す。第５図はこの断片の制限
地図を示す。この２つのプラスミドは特徴的なペプチド
（Ｎ末端に隣接するトリプシン断片）をコードする配列
を事実含んでいる（第８図）。さらに、これらの結果
は、ブレビバクテリウムR312の鏡像体選択的アミダーゼ
をコードする遺伝子は2.3kb Bam H I−Pst I断片上に位
置し、センス方向はBam H IからPst Iの方へ向いている
ことを示す。コード配列の５′末端が判明し、また酵素
がせいぜい2kb（我々の評価に従うと57〜63KD）により
コードされるという知見から、完全な遺伝子がBam H I
−Pst I断片中に含まれていことは確かであることから
我々は配列決定に進んだ。
実施例３ ブレビバクテリウムR312の鏡像体選択的アミダーゼをコ
ード化する遺伝子を含有するBamH I−Pst Iフラグメン
トの配列 Bam H I−Pst Iフラグメントの配列決定を図６に示
す。種々の配列は全て、サブフラグメントを有する一本
鎖M13基質について、または直接プラスミドpXL1650につ
いて読み終わり法（chain termination method）（７−
デアザ−dGTP;（35S）−dATP存在下のシークエナーゼキ
ット）を用いて得られた。この目的のため、いくつかの
特定のプライマーも合成した。得られた配列の平均GC含
量は61.5％である。図７はオープン読み取りわくの分析
を示すものであり、アミダーゼに対応するオープン読み
取りわくが、計算分子量54671の521アミノ酸の遺伝暗号
を指定することがわかる。このオープン読み取りわくの
GC含量は、第１、第２および第３コドン部位に対し、そ
れぞれ65.8％、52.5％および70％であり、これはGC含量
の多い微生物のコード配列に典型的な分布である。図８
は、BamH I−Pst Iフラグメントの完全な配列を示す。
ード化する遺伝子を含有するBamH I−Pst Iフラグメン
トの配列 Bam H I−Pst Iフラグメントの配列決定を図６に示
す。種々の配列は全て、サブフラグメントを有する一本
鎖M13基質について、または直接プラスミドpXL1650につ
いて読み終わり法（chain termination method）（７−
デアザ−dGTP;（35S）−dATP存在下のシークエナーゼキ
ット）を用いて得られた。この目的のため、いくつかの
特定のプライマーも合成した。得られた配列の平均GC含
量は61.5％である。図７はオープン読み取りわくの分析
を示すものであり、アミダーゼに対応するオープン読み
取りわくが、計算分子量54671の521アミノ酸の遺伝暗号
を指定することがわかる。このオープン読み取りわくの
GC含量は、第１、第２および第３コドン部位に対し、そ
れぞれ65.8％、52.5％および70％であり、これはGC含量
の多い微生物のコード配列に典型的な分布である。図８
は、BamH I−Pst Iフラグメントの完全な配列を示す。
実施例４ ブレビバクテリウムR312の鏡像体選択的アミダーゼをコ
ードする遺伝子の大腸菌における発現 4.1 プラスミドの構造 いくつかのプラスミドを構築した。ここでは、同種リ
ボソーム結合部位（RBS）またはラムダファージのc II
遺伝子からのRBSを含むアミダーゼの構造遺伝子を、そ
れ自身のプロモーター、トリプトファンオペロンのプロ
モーターまたはラムダファージの温度感受性右側プロモ
ーターのコントロール下にあるよう配置した。ブレビバ
クテリウムR312全ゲノムDNAのPst I消化物から得られた
5.4kbフラグメントをプラスミドpUC19の単一のPst I部
位に挿入することにより、プラスミドpXL1650（図４）
を得た。従って、このプラスミドは、ラクトースオペロ
ンPlacのプロモーター次いでリボソーム結合部位および
ブレビバクテリウムR312の鏡像体選択的アミダーゼをコ
ードする構造遺伝子、ならびにアンピシリン耐性をコー
ドするマーカーを有している。
ードする遺伝子の大腸菌における発現 4.1 プラスミドの構造 いくつかのプラスミドを構築した。ここでは、同種リ
ボソーム結合部位（RBS）またはラムダファージのc II
遺伝子からのRBSを含むアミダーゼの構造遺伝子を、そ
れ自身のプロモーター、トリプトファンオペロンのプロ
モーターまたはラムダファージの温度感受性右側プロモ
ーターのコントロール下にあるよう配置した。ブレビバ
クテリウムR312全ゲノムDNAのPst I消化物から得られた
5.4kbフラグメントをプラスミドpUC19の単一のPst I部
位に挿入することにより、プラスミドpXL1650（図４）
を得た。従って、このプラスミドは、ラクトースオペロ
ンPlacのプロモーター次いでリボソーム結合部位および
ブレビバクテリウムR312の鏡像体選択的アミダーゼをコ
ードする構造遺伝子、ならびにアンピシリン耐性をコー
ドするマーカーを有している。
プラスミドpXL1724（図９）は、大腸菌のトリプトフ
ァンオペロンのプロモーターのコントロール下にある、
5.4kb Pst Iフラグメントから切り出された2.3kb Bam H
I−Pst Iフラグメントを含有している。従ってこの構
成において、ブレビバクテリウムR312のアミダーゼ遺伝
子は、リボソーム結合部位を含むATGコドンの上流58塩
基対の後に付随している（図８）。
ァンオペロンのプロモーターのコントロール下にある、
5.4kb Pst Iフラグメントから切り出された2.3kb Bam H
I−Pst Iフラグメントを含有している。従ってこの構
成において、ブレビバクテリウムR312のアミダーゼ遺伝
子は、リボソーム結合部位を含むATGコドンの上流58塩
基対の後に付随している（図８）。
ブレビバクテリウムR312の鏡像体選択的アミダーゼを
コードする構造遺伝子が異種リボソーム結合部位ととも
に、異種プロモーターのコントロール下におかれた他の
２種類の構造を作成した。これらプラスミド（pXL1751
およびpXL1752）を下記のようにして得た。
コードする構造遺伝子が異種リボソーム結合部位ととも
に、異種プロモーターのコントロール下におかれた他の
２種類の構造を作成した。これらプラスミド（pXL1751
およびpXL1752）を下記のようにして得た。
アミダーゼ構造遺伝子の上流に位置するATGコドンをN
de I部位（CATATG）に置換するため、プラスミドpXL172
4をPCRにより突然変異を起こさせた。増幅は、開始コド
ンとハイブリッド形成する、Nde I部位に対応するプラ
イマー、およびATGコドンの下流に位置するXho Iに対応
するプライマーを用いて行なった。増幅されたフラグメ
ントはNde IおよびXho Iを用いた消化によって切り出し
た。
de I部位（CATATG）に置換するため、プラスミドpXL172
4をPCRにより突然変異を起こさせた。増幅は、開始コド
ンとハイブリッド形成する、Nde I部位に対応するプラ
イマー、およびATGコドンの下流に位置するXho Iに対応
するプライマーを用いて行なった。増幅されたフラグメ
ントはNde IおよびXho Iを用いた消化によって切り出し
た。
−プロモーターPtrpの利用： EcoR IおよびXho Iにより切断されたプラスミドpXL17
24中に、転写終了配列tR1を除去したラムダファージc I
I遺伝子のリボソーム結合部位およびPtrpプロモーター
ならびにアミダーゼ構造遺伝子の５′領域（フラグメン
トNde I−Xho I）を有するEcoR I−Nde Iフラグメント
を挿入した。これによりプラスミドpXL1751が構築され
た（図10）。
24中に、転写終了配列tR1を除去したラムダファージc I
I遺伝子のリボソーム結合部位およびPtrpプロモーター
ならびにアミダーゼ構造遺伝子の５′領域（フラグメン
トNde I−Xho I）を有するEcoR I−Nde Iフラグメント
を挿入した。これによりプラスミドpXL1751が構築され
た（図10）。
−プロモーターPRc I tsの利用： 同じ手法を用いたが、今度はPRc I tsプロモーターお
よび転写終了配列tR1の欠損したラムダファージc II遺
伝子のリボソーム結合部位を含むプラスミドpXL1029か
らのEcoR I−Nde Iを用いた。これにより、プラスミドp
XL1752が構築された（図11）。
よび転写終了配列tR1の欠損したラムダファージc II遺
伝子のリボソーム結合部位を含むプラスミドpXL1029か
らのEcoR I−Nde Iを用いた。これにより、プラスミドp
XL1752が構築された（図11）。
4.2 大腸菌Ｂおよび大腸菌K12E103Sにおけるブレビバ
クテリウムR312のアミダーゼ遺伝子発現 プラスミドpXL1751およびpXL1752を用いて大腸菌Ｂお
よび大腸菌K12E103S各々の菌株を塩化カルシウム法で形
質転換した。組替え型微生物の選択を、アンピシリン培
地中で実施した。
クテリウムR312のアミダーゼ遺伝子発現 プラスミドpXL1751およびpXL1752を用いて大腸菌Ｂお
よび大腸菌K12E103S各々の菌株を塩化カルシウム法で形
質転換した。組替え型微生物の選択を、アンピシリン培
地中で実施した。
細胞の音波処理の後粗分画について、または遠心分離
の後にペレットおよび上清についてSDS−PAGEを用いて
ブレビバクテリウムR312の鏡像体選択的アミダーゼの発
現を測定した。図12中の結果は、全タンパク質の20％に
及ぶ高いレベルのアミダーゼ発現を示す。
の後にペレットおよび上清についてSDS−PAGEを用いて
ブレビバクテリウムR312の鏡像体選択的アミダーゼの発
現を測定した。図12中の結果は、全タンパク質の20％に
及ぶ高いレベルのアミダーゼ発現を示す。
実施例５ ２−アリール−プロピオン酸の鏡像体選択的合成のため
のブレビバクテリウムR312の鏡像体選択的アミダーゼの
利用 以下の菌株を使用して以下の操作を行なった： E.coli（pXL1751）−アミダーゼコード配列をトリプト
ファンオペロンのプロモーターの制御下に配している。
のブレビバクテリウムR312の鏡像体選択的アミダーゼの
利用 以下の菌株を使用して以下の操作を行なった： E.coli（pXL1751）−アミダーゼコード配列をトリプト
ファンオペロンのプロモーターの制御下に配している。
E.coli（pXL1752）−指数増殖期の終わりに温度30℃か
ら42℃に上げることによりアミダーゼが生産される（ラ
ムダPRプロモーターは温度感受性リプレッサーc I tsの
制御下にある）。
ら42℃に上げることによりアミダーゼが生産される（ラ
ムダPRプロモーターは温度感受性リプレッサーc I tsの
制御下にある）。
２種の対照株も用いた： E.coli（pXL906）−アミダーゼ遺伝子が遺伝子IL1βに
より置換されたE.coli（pXL1751）に相当する。E.coli
（pXL1029）−アミダーゼ遺伝子が遺伝子IL1βにより置
換されたE.coli（pXL1752）に相当する。
より置換されたE.coli（pXL1751）に相当する。E.coli
（pXL1029）−アミダーゼ遺伝子が遺伝子IL1βにより置
換されたE.coli（pXL1752）に相当する。
以下の操作を用いてこれら微生物の活性を試験した： 適当な誘導条件下で成長させた細胞懸濁液を、例えば −ヒドロキシ−４−フェノキシ−２−プロピオンアミド
（HPPAm）、又は −フェニル−２−プロピオンアミド（PPAm）、又は −ケトプロフェンのアミド（KAm）を含む溶液に添加し
た。
（HPPAm）、又は −フェニル−２−プロピオンアミド（PPAm）、又は −ケトプロフェンのアミド（KAm）を含む溶液に添加し
た。
次いで反応混合物をアセトニトリル:N塩酸（90:10）
（v/v）を含む緩衝液に希釈し、細胞を遠心分離により
除去した。反応混合物をHPLCで分析しアミダーゼ活性を
産出した。表２に示す結果はこの方式の効率を示してい
る。
（v/v）を含む緩衝液に希釈し、細胞を遠心分離により
除去した。反応混合物をHPLCで分析しアミダーゼ活性を
産出した。表２に示す結果はこの方式の効率を示してい
る。
表２は誘導条件下のE.coli中で生産されたブレビバク
テリウムR312のアミダーゼのラセミ基質HPPAm、PPAmお
よびKAmに対する比活性、並びに生産されるキラル酸の
鏡像体過剰度を示している。本実験においてはプラスミ
ドpXL1751（アミダーゼ）またはpXL906（対照）を宿し
ているE.coli株は37℃で成長させた。
テリウムR312のアミダーゼのラセミ基質HPPAm、PPAmお
よびKAmに対する比活性、並びに生産されるキラル酸の
鏡像体過剰度を示している。本実験においてはプラスミ
ドpXL1751（アミダーゼ）またはpXL906（対照）を宿し
ているE.coli株は37℃で成長させた。
表３は誘導または抑制条件下28℃において成長させた
E.coli中で生産されたブレビバクテリウムR312（発現プ
ラスミドpXL1751）のアミダーゼのラセミ基質KAmに対す
る比活性、並びに生産されるキラル酸の鏡像体過剰度を
示している。
E.coli中で生産されたブレビバクテリウムR312（発現プ
ラスミドpXL1751）のアミダーゼのラセミ基質KAmに対す
る比活性、並びに生産されるキラル酸の鏡像体過剰度を
示している。
従って、プレビバクテリウムR312（遺伝子型Amd+）の
アミダーゼ遺伝子を宿しているE.coli株は以下の３種の
アミド類を効率的に加水分解することができる（表現型
AMD+）。
アミダーゼ遺伝子を宿しているE.coli株は以下の３種の
アミド類を効率的に加水分解することができる（表現型
AMD+）。
− ２−（４−ヒドロキシ−フェノキシ）−プロピオン
アミド（HPPAm） − ２−フェニル−プロピオンアミド（PPAm） − ケトプロフェンのアミド（KAm） 得られた鏡像体過剰度は常に93％より大きかった。
アミド（HPPAm） − ２−フェニル−プロピオンアミド（PPAm） − ケトプロフェンのアミド（KAm） 得られた鏡像体過剰度は常に93％より大きかった。
実施例６ ロドコッカスの鏡像体選択的アミダーゼの精製 I. 酵素活性のアッセイ 活性画分を30℃で30min、緩衝液（0.1MトリスHCl（pH
7.5）、5mM DTT、18mM2−フェニルプロピオンアミド）5
00μ中でインキュベートした。インキュベート後、ア
セトニトリル/HCllN（90/10）の混合物2ml及びそれから
50mMH3PO4/CH3CN（75/25）の混合物2mlを反応混合物に
加えた。5000rpmで10minの遠心の後、上清の一部を高速
液体クロマトグラフィに付し、反応生成物を測定した。
7.5）、5mM DTT、18mM2−フェニルプロピオンアミド）5
00μ中でインキュベートした。インキュベート後、ア
セトニトリル/HCllN（90/10）の混合物2ml及びそれから
50mMH3PO4/CH3CN（75/25）の混合物2mlを反応混合物に
加えた。5000rpmで10minの遠心の後、上清の一部を高速
液体クロマトグラフィに付し、反応生成物を測定した。
カラム：ヌクレオシル５−C18（Nucleosil 5−C18）25c
m 溶離剤:50mM H3PO4/CH3Cn（75/25） 注入量:10μ 流 量:1ml/min 活性の単位は、時間当り２−フェニル−プロピオンア
ミド１μmolの加水分解に必要な酵素の量として定義さ
れる。
m 溶離剤:50mM H3PO4/CH3Cn（75/25） 注入量:10μ 流 量:1ml/min 活性の単位は、時間当り２−フェニル−プロピオンア
ミド１μmolの加水分解に必要な酵素の量として定義さ
れる。
II. 精製のプロトコール 6.1 酵素抽出物の調製 細胞7gの0.1MトリスHCl（pH7.5）、5mM DTTの15ml中
に懸濁させ、４℃で15min超音波処理した。50000rpmで1
h遠心して粗酵素抽出物を集めた。
に懸濁させ、４℃で15min超音波処理した。50000rpmで1
h遠心して粗酵素抽出物を集めた。
6.2 第１回イオン交換クロマトグラフィ 粗抽出物20mlに、緩衝液Ａ（25mMトリスHCl（pH7.
5）、5mM DTT）20mlを加えた。その試料を、緩衝液Ａ中
に平衡させたモノQ HR10/10（Mono Q HR 10/10）カラム
（ファーマシア（Pharmacia）製）上に3ml/minの流量で
注入した。カラムの洗浄の後、蛋白質は、0.1乃至1M KC
lの線形濃度勾配により、3ml/minの流量で溶出された。
画分サイズは6mlであった。アミダーゼは、約0.3M KCl1
8ml中に溶出した。
5）、5mM DTT）20mlを加えた。その試料を、緩衝液Ａ中
に平衡させたモノQ HR10/10（Mono Q HR 10/10）カラム
（ファーマシア（Pharmacia）製）上に3ml/minの流量で
注入した。カラムの洗浄の後、蛋白質は、0.1乃至1M KC
lの線形濃度勾配により、3ml/minの流量で溶出された。
画分サイズは6mlであった。アミダーゼは、約0.3M KCl1
8ml中に溶出した。
6.3 第２回イオン交換クロマトグラフィ 活性画分をあわせ、セントリプレプ限界濾過システム
（Centriprep ultrafiltration system）（アミコン（A
micon）製）を用いて2mlに濃縮した。緩衝液A6mlで希釈
した後、その試料4mlを緩衝液Ａ中に平衡させたモノQ H
R5/5（Mono Q HR 5/5）カラム上に1ml/minで注入した。
蛋白質は、緩衝液Ａ中KC10〜0.5Mの線形勾配により溶出
された。活性画分を合わせ、15％になるようグリセロー
ル（v/v）を加え、それから上述のように1mlに濃縮し
た。
（Centriprep ultrafiltration system）（アミコン（A
micon）製）を用いて2mlに濃縮した。緩衝液A6mlで希釈
した後、その試料4mlを緩衝液Ａ中に平衡させたモノQ H
R5/5（Mono Q HR 5/5）カラム上に1ml/minで注入した。
蛋白質は、緩衝液Ａ中KC10〜0.5Mの線形勾配により溶出
された。活性画分を合わせ、15％になるようグリセロー
ル（v/v）を加え、それから上述のように1mlに濃縮し
た。
6.4 疎水性クロマトグラフィ 緩衝液Ｂ（0.1MトリスHCl（pH7.5）、0.5mM DTT、1.7
M（NH4）2SO4）1mlを試料に加え、それからフェニル−
スパロースHR5/5（phenyl−Superose HR5/5）カラム
（ファーマシア（Pharmacia）製）上に0.25ml/minの流
量で（２回の注入で）注入した。蛋白質は、25mlの（NH
4）2SO4の減少線形勾配（1.7MからOM）により0.5ml/min
で溶出された。画分サイズは0.5mlであった。活性画分
に15％になるようグリセロールを加え、それから緩衝液
Ａで1mlに希釈した。
M（NH4）2SO4）1mlを試料に加え、それからフェニル−
スパロースHR5/5（phenyl−Superose HR5/5）カラム
（ファーマシア（Pharmacia）製）上に0.25ml/minの流
量で（２回の注入で）注入した。蛋白質は、25mlの（NH
4）2SO4の減少線形勾配（1.7MからOM）により0.5ml/min
で溶出された。画分サイズは0.5mlであった。活性画分
に15％になるようグリセロールを加え、それから緩衝液
Ａで1mlに希釈した。
6.5 ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ 試料を、緩衝液Ｃ（85mMトリスHCl（pH7.5）、0.5mM
DTT、10μM CaCl2、15％グリセロール）で平衡化させた
バイオ−ゲルHPHT（Bio−Gel HPHT）カラム（バイオ−
ラド（Bio−Rad）製）上に0.5ml/minで注入した。アミ
ダーゼは、緩衝液ｃに対するpH7.5の0.35Mリン酸カルシ
ウム、0.5mM DTT、10μM CaCl2、15％グリセロールの緩
衝液の０から100％の線形勾配により0.5ml/minの流量で
20分間で溶出された。
DTT、10μM CaCl2、15％グリセロール）で平衡化させた
バイオ−ゲルHPHT（Bio−Gel HPHT）カラム（バイオ−
ラド（Bio−Rad）製）上に0.5ml/minで注入した。アミ
ダーゼは、緩衝液ｃに対するpH7.5の0.35Mリン酸カルシ
ウム、0.5mM DTT、10μM CaCl2、15％グリセロールの緩
衝液の０から100％の線形勾配により0.5ml/minの流量で
20分間で溶出された。
これらの工程により988U/mgという比活性を有する均
一の精製酵素が得られる。
一の精製酵素が得られる。
それによって得られた酵素は、見かけの分子量53±2K
Dの同一のサブユニットのダイマーの形で存在する。
Dの同一のサブユニットのダイマーの形で存在する。
実施例７ 本アミダーゼをコードする遺伝子のクローニング TSK−G3000SWによる補足的精製工程の後、この酵素の
配列決定を行なった。Ｎ末端がエドマン型の反応を受け
ないため、全トリプシン加水分解を行なったところ、加
水分解生製物の３つのHPLC画分−123、124および162−
から明確な配列を与えるペプチドが得られた。画分123
から得られた配列より、32マーのヌクレオチドプローブ
を合成した。これは８種類のオリゴヌクレオチドの混合
体であり、３回以上縮重している位置７箇所にはイノシ
ンを含むものである。
配列決定を行なった。Ｎ末端がエドマン型の反応を受け
ないため、全トリプシン加水分解を行なったところ、加
水分解生製物の３つのHPLC画分−123、124および162−
から明確な配列を与えるペプチドが得られた。画分123
から得られた配列より、32マーのヌクレオチドプローブ
を合成した。これは８種類のオリゴヌクレオチドの混合
体であり、３回以上縮重している位置７箇所にはイノシ
ンを含むものである。
５′末端を32Pでラベルしたこのプローブの効率を、
予めSst I、Sph I、Sma I、Pst I、Kpn I、EcoR I、Sal
IおよびBamH Iのいずれかの制限酵素で消化したロード
コッカス（Rhodococcus）由来のゲノムDNA上へのサザー
ン転写によって調べた。実験条件は次のとおりである：
ハイブリダイゼーションバッファー、5xSSC、5xデンハ
ールト、0.1％SDS、50mM NaPO4pH6.5、サケ精子DNA;ハ
イブリダイゼーション温度は50℃又は55℃（２つの実
験）；洗浄条件は6xSSC中室温にて１時間そして2xSSC、
0.1％SDS中50℃にて５分である。
予めSst I、Sph I、Sma I、Pst I、Kpn I、EcoR I、Sal
IおよびBamH Iのいずれかの制限酵素で消化したロード
コッカス（Rhodococcus）由来のゲノムDNA上へのサザー
ン転写によって調べた。実験条件は次のとおりである：
ハイブリダイゼーションバッファー、5xSSC、5xデンハ
ールト、0.1％SDS、50mM NaPO4pH6.5、サケ精子DNA;ハ
イブリダイゼーション温度は50℃又は55℃（２つの実
験）；洗浄条件は6xSSC中室温にて１時間そして2xSSC、
0.1％SDS中50℃にて５分である。
この条件下で、プローブＡは強い明確なシグナルをも
たらした；特にBamH I、Kpn I、Sph I、Sst I、Sma I、
Sal IおよびPst Iによる消化では、プローブＡに強くハ
イブリダイズする一つのゲノム帯域が見つかった。Pst
I消化の場合、プローブＡへのハイブリダイゼーション
シグナルの大きさは、約3.2kbのゲノム断片に相当す
る。
たらした；特にBamH I、Kpn I、Sph I、Sst I、Sma I、
Sal IおよびPst Iによる消化では、プローブＡに強くハ
イブリダイズする一つのゲノム帯域が見つかった。Pst
I消化の場合、プローブＡへのハイブリダイゼーション
シグナルの大きさは、約3.2kbのゲノム断片に相当す
る。
かくして、ゲノムDNAの３乃至4kbのPst I消化断片を
アガロースを通す調製電気泳動およびそれに続く電気溶
出で精製し、Pst Iで切っておいたプラスミドpUC19に結
合した。E.coli株DH5αの形質転換の後、LB Amp−Ｘ−g
al上の600の白色クローンを個々に再採取し、コロニー
ハイブリダイゼーションによりサザーン法と同様の厳し
い条件でプローブＡを用いて探査した。そして、特に強
いハイブリダイゼーションシグナルを有する９つのクロ
ーンをプラスミドDNAの制限切断により分析した。同じ
3.2kb断片を２つの向きで明らかに挿入しているこれら
のクローンの６つのうち、それぞれの向きを代表する２
つのクローン（pXL1835およびpXL1836）をより詳しく分
析し（詳細なマッピング、サザーン分析）、これにより
所望の断片が得られることを確認した。
アガロースを通す調製電気泳動およびそれに続く電気溶
出で精製し、Pst Iで切っておいたプラスミドpUC19に結
合した。E.coli株DH5αの形質転換の後、LB Amp−Ｘ−g
al上の600の白色クローンを個々に再採取し、コロニー
ハイブリダイゼーションによりサザーン法と同様の厳し
い条件でプローブＡを用いて探査した。そして、特に強
いハイブリダイゼーションシグナルを有する９つのクロ
ーンをプラスミドDNAの制限切断により分析した。同じ
3.2kb断片を２つの向きで明らかに挿入しているこれら
のクローンの６つのうち、それぞれの向きを代表する２
つのクローン（pXL1835およびpXL1836）をより詳しく分
析し（詳細なマッピング、サザーン分析）、これにより
所望の断片が得られることを確認した。
実施例８ 3.2kb Pst I断片の配列 上記3.2kb Pst I断片の完全なヌクレオチド配列を、
その２本の鎖について決定した。この断片のGC含量は6
2.4％であり、R312のGC含量（約62％）と同等であっ
た。分析の結果、この配列は1386ヌクレオチドのオープ
ン読取り枠を含み（位置210乃至1595）、これは642個の
アミノ酸からポリペプチド（分子量計算値48554）をコ
ードし、前記トリプシン断片の配列決定により予め得ら
れた３つのペプチドを含んでいることがわかった。この
オープン読取り枠はBamH Iでサブクローニングした断片
に含まれており、そのヌクレオチド配列は第13図に示さ
れる。
その２本の鎖について決定した。この断片のGC含量は6
2.4％であり、R312のGC含量（約62％）と同等であっ
た。分析の結果、この配列は1386ヌクレオチドのオープ
ン読取り枠を含み（位置210乃至1595）、これは642個の
アミノ酸からポリペプチド（分子量計算値48554）をコ
ードし、前記トリプシン断片の配列決定により予め得ら
れた３つのペプチドを含んでいることがわかった。この
オープン読取り枠はBamH Iでサブクローニングした断片
に含まれており、そのヌクレオチド配列は第13図に示さ
れる。
３つのアンダーラインしたペプチド配列は、精製酵素
のトリプシン断片について直接決定されたペプチド断片
に対応する（ペプチド123、124および162）。アンダー
ラインしたヌクレオチド配列は、遺伝子をクローニング
するのに用いた（縮重）プローブに対応する。イタリッ
ク体で書かれたペプチド配列は、ブレビバクテリウム
（Brevibacterium）株R312およびロードコッカス（Rhod
ococcus）属の株の鏡像体選択的アミダーゼの間に高度
に保持されている残基137乃至193に対応する（下記参
照）。
のトリプシン断片について直接決定されたペプチド断片
に対応する（ペプチド123、124および162）。アンダー
ラインしたヌクレオチド配列は、遺伝子をクローニング
するのに用いた（縮重）プローブに対応する。イタリッ
ク体で書かれたペプチド配列は、ブレビバクテリウム
（Brevibacterium）株R312およびロードコッカス（Rhod
ococcus）属の株の鏡像体選択的アミダーゼの間に高度
に保持されている残基137乃至193に対応する（下記参
照）。
このオープン読取り枠は、上記鏡像体選択的アミダー
ゼの構造遺伝子を表わしている。
ゼの構造遺伝子を表わしている。
実施例９ 異なるアミダーゼ間の相同性：アミダーゼ活性の配列特
性の同定 R312の鏡像体選択的アミダーゼのペプチド配列（第８
図）と第13図に示されるアミダーゼとを比較すると、配
列の約三分の二において強い相同性が見られ、これはR3
12の150と300の間の残基（50％は全く同じ）にわたり、
159乃至215の間の残基においては相同性は67％に達す
る。
性の同定 R312の鏡像体選択的アミダーゼのペプチド配列（第８
図）と第13図に示されるアミダーゼとを比較すると、配
列の約三分の二において強い相同性が見られ、これはR3
12の150と300の間の残基（50％は全く同じ）にわたり、
159乃至215の間の残基においては相同性は67％に達す
る。
相同配列についてのGENPRO遺伝子バンクをサーチした
ところ、150乃至200領域の間でいくつかの強い相同性が
見られ、これにはアスペルギルス・ニドゥランス（Aspe
rgillus nidulans）のアセトアミダーゼの配列、シュー
ドモナス・シリンジ（Pseudomonas syringae）およびブ
ラジリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobium japon
icum）のインドールアセトアミドヒドロラーゼ（IA
H）、アグロバクテリウム・トゥメファシエンス（Agrob
acterium tumefaciens）のtms2プロテインおよびフラホ
バクテリウム（Flavobacterium）株K172およびシュード
モナス（Pseudomonas）株NK87の６−アミノヘキサノエ
ート環状ダイマーヒドロリアーゼ（ACDH）があった。
ところ、150乃至200領域の間でいくつかの強い相同性が
見られ、これにはアスペルギルス・ニドゥランス（Aspe
rgillus nidulans）のアセトアミダーゼの配列、シュー
ドモナス・シリンジ（Pseudomonas syringae）およびブ
ラジリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobium japon
icum）のインドールアセトアミドヒドロラーゼ（IA
H）、アグロバクテリウム・トゥメファシエンス（Agrob
acterium tumefaciens）のtms2プロテインおよびフラホ
バクテリウム（Flavobacterium）株K172およびシュード
モナス（Pseudomonas）株NK87の６−アミノヘキサノエ
ート環状ダイマーヒドロリアーゼ（ACDH）があった。
第４表は、上記のアミダーゼのペプチド137−193の相
同性を、これらの他の酵素のそれぞれの部位とともに示
すものである（アミノ酸の厳格な同一率％として表わ
す）： この強く保存された領域が、おそらくはこれらの酵素の
活性（活性部位）に係わっていると思われる。
同性を、これらの他の酵素のそれぞれの部位とともに示
すものである（アミノ酸の厳格な同一率％として表わ
す）： この強く保存された領域が、おそらくはこれらの酵素の
活性（活性部位）に係わっていると思われる。
実施例10 大腸菌における鏡像体選択的アミダーゼの発現 鏡像体選択的アミダーゼをコードする相（phase）の
同定を確認するため、位置210（第13図）の推定ATGコド
ンにおいてPCRによりNde I部位（CATATG）を作成し、ア
ミダーゼをコードする領域を特異に含むこの210と1683
のSal I部位間の断片を大腸菌中で機能できる転写開始
（プロモーターPtrpまたはPR）および翻訳開始（リボゾ
ーム結合部位c II）シグナルの制御下に置いた。そこで
得られたベクター（pXL1893、PtrpおよびpXL1894、PR−
c I ts）は、前述したようにR312アミダーゼを発現する
ベクターpXL1752およびpXL1751に類似している。プラス
ミドpXL1893およびpXL1894からの発現はそれぞれE.coli
BおよびE.coli K12E103Sで研究された。精製アミダー
ゼと同じ易動度をしめすタンパク質がプラスミドpXL189
4の存在下42℃で特異的に生成された。
同定を確認するため、位置210（第13図）の推定ATGコド
ンにおいてPCRによりNde I部位（CATATG）を作成し、ア
ミダーゼをコードする領域を特異に含むこの210と1683
のSal I部位間の断片を大腸菌中で機能できる転写開始
（プロモーターPtrpまたはPR）および翻訳開始（リボゾ
ーム結合部位c II）シグナルの制御下に置いた。そこで
得られたベクター（pXL1893、PtrpおよびpXL1894、PR−
c I ts）は、前述したようにR312アミダーゼを発現する
ベクターpXL1752およびpXL1751に類似している。プラス
ミドpXL1893およびpXL1894からの発現はそれぞれE.coli
BおよびE.coli K12E103Sで研究された。精製アミダー
ゼと同じ易動度をしめすタンパク質がプラスミドpXL189
4の存在下42℃で特異的に生成された。
実施例11 コリネバクテリウム中の鏡像体選択的アミダーゼの発現 1. 発現ベクターの構築 これらのベクターはコリネバクテリウムの複製ベクタ
ーから誘導される。これらは 大腸菌のレプリコン コリネバクテリウムのレプリコン 選択マーカー Amd配列 を含有する。
ーから誘導される。これらは 大腸菌のレプリコン コリネバクテリウムのレプリコン 選択マーカー Amd配列 を含有する。
ベクターpSV73（図14）：このプラスミドは、大腸菌
レプリコンおよびトランスポゾンTn903上に保持される
カナマイシン耐性遺伝子を含有するプラスミドpUC8の挿
入によってC.グルタミクム（ヨシハマ（yoshihama）
ら、J.Bacteriol.第162巻、第591頁、1985年）のプラス
ミドpSR1から誘導される。
レプリコンおよびトランスポゾンTn903上に保持される
カナマイシン耐性遺伝子を含有するプラスミドpUC8の挿
入によってC.グルタミクム（ヨシハマ（yoshihama）
ら、J.Bacteriol.第162巻、第591頁、1985年）のプラス
ミドpSR1から誘導される。
このプラスミドは図13に示されるAmd配列に対して異
なる発現ベクターを構築するのに使用された。即ち： ○ ベクターpYG811A及びＢ（図15）：これらの発現ベ
クターは、図13に表されるSal I断片に含有されAmd配列
をpSV73のSal I部位に両配向でクローン化することによ
り得られる。
なる発現ベクターを構築するのに使用された。即ち： ○ ベクターpYG811A及びＢ（図15）：これらの発現ベ
クターは、図13に表されるSal I断片に含有されAmd配列
をpSV73のSal I部位に両配向でクローン化することによ
り得られる。
○ ベクターpYG817A及びＢ（図16）：これらの発現ベ
クターは、図13に表されるBamH I断片に含有されるAmd
配列をpSV73のBgl II部位に両配向でクローン化するこ
とにより得られる。
クターは、図13に表されるBamH I断片に含有されるAmd
配列をpSV73のBgl II部位に両配向でクローン化するこ
とにより得られる。
○ ベクターpYG822（図17）：この発現ベクターは、大
腸菌のトリプトファンオペロンのPtrpプロモーターの制
御下に図13に表されるAmd配列を含有する発現カセット
をSal I及びBgl II部位間に挿入することによりpSV73か
ら誘導される。
腸菌のトリプトファンオペロンのPtrpプロモーターの制
御下に図13に表されるAmd配列を含有する発現カセット
をSal I及びBgl II部位間に挿入することによりpSV73か
ら誘導される。
○ 他の機能不明のコリネバクテリウムプラスミドは、
コリネバクテリア中で機能するAmd配列のための発現ベ
クターの構築に使用できる。例えば、B.ラクトフェルメ
ンタム（B.lactofermentum）（イェー（Yeh）ら、Gen
e、第47巻、第310〜360頁、1986年）から単離したプラ
スミドpX18は、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）
R312中で複製できるシャトルベクターpYG820A及びpYG82
0Bを構築することができた。それゆえに、数種のコリネ
バクテリウムにおけるクローン化及び発現実験用受容体
として使用できる。
コリネバクテリア中で機能するAmd配列のための発現ベ
クターの構築に使用できる。例えば、B.ラクトフェルメ
ンタム（B.lactofermentum）（イェー（Yeh）ら、Gen
e、第47巻、第310〜360頁、1986年）から単離したプラ
スミドpX18は、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）
R312中で複製できるシャトルベクターpYG820A及びpYG82
0Bを構築することができた。それゆえに、数種のコリネ
バクテリウムにおけるクローン化及び発現実験用受容体
として使用できる。
2. コリネバクテリウムの形質転換 すべての知られた形質転換技術は使用でき、特に上記
に引用したヨシマ（Yoshima）らにより記載されたプロ
トプラスト再生技術が使用できる。しかし、出願人はエ
レトロポレーション（electroporation）が非常に有効
であり、形質転換の頻度は1000倍になることを示してき
ている。
に引用したヨシマ（Yoshima）らにより記載されたプロ
トプラスト再生技術が使用できる。しかし、出願人はエ
レトロポレーション（electroporation）が非常に有効
であり、形質転換の頻度は1000倍になることを示してき
ている。
超音波処理された細胞のSDS−PAGE分析は、組換体宿
主中の酵素の細胞内発現の研究に使用される。
主中の酵素の細胞内発現の研究に使用される。
実施例12 酵素の触媒作用 この実施例では、Amd−型の蛋白質、又はこれらの蛋
白質を発現する組換体微生物を、ラセミ体アミドの加水
分解による光学的に活性な有機酸の鏡像体選択性合成に
用いる場合について説明する。
白質を発現する組換体微生物を、ラセミ体アミドの加水
分解による光学的に活性な有機酸の鏡像体選択性合成に
用いる場合について説明する。
1. 菌体の調製 ２リットルの三角フラスコ内で、600mlの媒質を用い
て温度28℃で、適切な培養条件下で150回転／分の撹拌
をしながら、異なった菌株を培養した。培養が終結した
後、細胞を採取し、NaCl（9g/）の溶液で洗浄し、−1
8℃で貯蔵した。
て温度28℃で、適切な培養条件下で150回転／分の撹拌
をしながら、異なった菌株を培養した。培養が終結した
後、細胞を採取し、NaCl（9g/）の溶液で洗浄し、−1
8℃で貯蔵した。
2. 基質として２−フェニル−プロピオンアミドを用い
た場合 プロトコールは次のとおりである。
た場合 プロトコールは次のとおりである。
２−フェニル−プロピオンアミド及び細胞懸濁液を、
撹拌機付きのフラスコに加え、その容積を50mMリン酸カ
ルシウム緩衝剤pH7.0で、5mlに調節した。そのフラスコ
を25℃でサーモスタット付きの結晶化皿におき、１時間
撹拌した。反応混合物をアセトニトリル/HCl（9/1）、
（v/v）の溶液で希釈した。遠心分離により、バクテリ
ア及び細胞の破片を除去した。酸とアミドの組成をHPLC
で決定した。
撹拌機付きのフラスコに加え、その容積を50mMリン酸カ
ルシウム緩衝剤pH7.0で、5mlに調節した。そのフラスコ
を25℃でサーモスタット付きの結晶化皿におき、１時間
撹拌した。反応混合物をアセトニトリル/HCl（9/1）、
（v/v）の溶液で希釈した。遠心分離により、バクテリ
ア及び細胞の破片を除去した。酸とアミドの組成をHPLC
で決定した。
ブレビバクテリウムR312及びブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタム（ATCC21086）で得られた結果は次
の通りである。
クトファーメンタム（ATCC21086）で得られた結果は次
の通りである。
3. 基質としてラセミ体ケトプロフェンアミドを用いた
場合 表６に示すように、ロドコッカスからのアミダーゼを
発現する組換体コバネクテリウムは、pSV73で形質転換
した対照標準細胞より、有意により高い活性を与えた。
場合 表６に示すように、ロドコッカスからのアミダーゼを
発現する組換体コバネクテリウムは、pSV73で形質転換
した対照標準細胞より、有意により高い活性を与えた。
第１図A.ブレビバクテリウムR312からの精製されたアミ
ダーゼから得られたペプチド配列（Ｎ−末端及び内部）
を示す図、 B.内部ペプチド断片から導き出されたオリゴヌクレオチ
ドプローブの配列を示す図。 第２図A.ブレビバクテリウムR312のアミダーゼに由来す
るＮ−末端ペプチド断片からプローブSg918をデザイン
する方法を示す図、 B.特異的プローブSq918の配列を示す図。 第３図 EcoR I、Hind III,Kpn I、Pst I,Sma I及びSph
Iで切断されたブレビバクテリウムR312の全ゲノムDNA
とプローブSq918のハイブリダイゼーションプロフィー
ル、 および BamH I、Bgl II、EcoR I、Kpn I、Pst I、Sal I、Sma
I、Sph I、Sst I及びXho Iで切断されたブレビバクテリ
ムR312の全ゲノムDNAとプローブSq762のハイブリダイゼ
ーションプロフィールを示すゲル電気泳動の写真。 第４図 プラスミドpXL1650及びpXL1651の制限地図を示
す図。 第５図 ブレビバクテリウムR312の鏡像体選択的アミダ
ーゼ遺伝子を含むPst I断片（5.4kb）の制限地図。 第６図 ブレビバクテリウムR312の鏡像体選択的アミダ
ーゼ遺伝子を含むBamH I−Pst I断片の配列決定方法を
示す図。 第７図 配列決定した断片のオープン読取枠の分析法を
示す図。 第８図 ブレビバクテリウムR312の鏡像体先選択的アミ
ダーゼ遺伝子のヌクレオチド及びペプチド配列を示す
図。 第９図 プラスミドpXL1724の制限地図。 第10図 プラスミドpXL1751の制限地図。 第11図 プラスミドpXL1752の制限地図。 第12図 E.coli B及びE.coli K12E103S株におけるブレ
ビバクテリウムR312の鏡像体選択的アミダーゼの発現を
示すクーマシーブル−染色後の12.5％SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動の写真。 各レーンは、それぞれO.D.2.1（E103S）又は0.7（E.col
i B）の培養物60μに相当する量のタンパク質に対応
する。Ｔ（超音波処理）。pXL1029及びpXL906は、それ
ぞれPRc I ts又はPtrpプロモーターの制御下にあるIL1
−β遺伝子を含む。 第13図 ロドコッカスの鏡像体選択的アミダーゼ遺伝子
のヌクレオチド配列及びペプチド配列（プラスミドpXL1
836からのBamH I断片）を示す図。 第14図 シャトルベクターpSV73の制限地図を示す図。 第15図 発現プラスミドpYG811Bの制限地図を示す図。 第16図 発現プラスミドpYG817Bの制限地図。 第17図 発現プラスミドpYG822の制限地図を示す図。
ダーゼから得られたペプチド配列（Ｎ−末端及び内部）
を示す図、 B.内部ペプチド断片から導き出されたオリゴヌクレオチ
ドプローブの配列を示す図。 第２図A.ブレビバクテリウムR312のアミダーゼに由来す
るＮ−末端ペプチド断片からプローブSg918をデザイン
する方法を示す図、 B.特異的プローブSq918の配列を示す図。 第３図 EcoR I、Hind III,Kpn I、Pst I,Sma I及びSph
Iで切断されたブレビバクテリウムR312の全ゲノムDNA
とプローブSq918のハイブリダイゼーションプロフィー
ル、 および BamH I、Bgl II、EcoR I、Kpn I、Pst I、Sal I、Sma
I、Sph I、Sst I及びXho Iで切断されたブレビバクテリ
ムR312の全ゲノムDNAとプローブSq762のハイブリダイゼ
ーションプロフィールを示すゲル電気泳動の写真。 第４図 プラスミドpXL1650及びpXL1651の制限地図を示
す図。 第５図 ブレビバクテリウムR312の鏡像体選択的アミダ
ーゼ遺伝子を含むPst I断片（5.4kb）の制限地図。 第６図 ブレビバクテリウムR312の鏡像体選択的アミダ
ーゼ遺伝子を含むBamH I−Pst I断片の配列決定方法を
示す図。 第７図 配列決定した断片のオープン読取枠の分析法を
示す図。 第８図 ブレビバクテリウムR312の鏡像体先選択的アミ
ダーゼ遺伝子のヌクレオチド及びペプチド配列を示す
図。 第９図 プラスミドpXL1724の制限地図。 第10図 プラスミドpXL1751の制限地図。 第11図 プラスミドpXL1752の制限地図。 第12図 E.coli B及びE.coli K12E103S株におけるブレ
ビバクテリウムR312の鏡像体選択的アミダーゼの発現を
示すクーマシーブル−染色後の12.5％SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動の写真。 各レーンは、それぞれO.D.2.1（E103S）又は0.7（E.col
i B）の培養物60μに相当する量のタンパク質に対応
する。Ｔ（超音波処理）。pXL1029及びpXL906は、それ
ぞれPRc I ts又はPtrpプロモーターの制御下にあるIL1
−β遺伝子を含む。 第13図 ロドコッカスの鏡像体選択的アミダーゼ遺伝子
のヌクレオチド配列及びペプチド配列（プラスミドpXL1
836からのBamH I断片）を示す図。 第14図 シャトルベクターpSV73の制限地図を示す図。 第15図 発現プラスミドpYG811Bの制限地図を示す図。 第16図 発現プラスミドpYG817Bの制限地図。 第17図 発現プラスミドpYG822の制限地図を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 ジャン―フランソワ メヨー フランス国．92260 フォントネーオ ローゼ，ブールヴァール ド ラ レプ ブリーク，21 テール (72)発明者 パトリス イェー フランス国．75005 パリ，リュ リヌ, 13 (56)参考文献 特開 昭61−88895（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/57 C12N 9/80 C12P 41/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ
Claims (52)
- 【請求項１】鏡像体選択的アミダーゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードするDNA配列であって、（１）以下に
示すブレビバクテリウムR312の鏡像体選択的アミダーゼ
をコードする配列、 【化１】 【化２】 （２）同じタンパク質をコードする、（１）の遺伝暗号
縮重類似体、 （３）鏡像体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチ
ドをコードする、上記（１）及び（２）の配列のいずれ
か１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
るDNA のいずれかであることを特徴とするDNA配列。 - 【請求項２】少なくとも下記アミノ酸配列をコードする
配列を含むことを特徴とする、 【化３】 あるいはこれらの配列に１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されたペプチドをコードすること
を特徴とする請求項１記載のDNA配列。 - 【請求項３】少なくとも下記に示す配列のコード領域を
有するDNA配列。 【化４】 【化５】 - 【請求項４】請求項１から３のいずれかに記載されたDN
A配列を有する遺伝子。 - 【請求項５】請求項１から４のいずれかに記載されたDN
A配列の発現によるものであって、鏡像体選択的アミダ
ーゼ活性を有する新規なポリペプチド。 - 【請求項６】下記配列 【化６】 【化７】 により特徴付けられる請求項５記載のポリペプチド。
- 【請求項７】天然由来でないことを特徴とする、請求項
５から６のいずれか１項に記載のポリペプチド。 - 【請求項８】請求項１から４のいずれか１項に記載され
たDNA配列を含みその配列が宿主細胞で確実に発現され
るためにいくつかのDNA配列のコントロール下にある発
現カセットを少なくとも１つ有する、形質転換微生物。 - 【請求項９】請求項１から４のいずれか１項に記載され
たDNA配列の発現を確実にするためのDNA配列が転写及び
翻訳の開始領域を含むことを特徴とする、請求項８記載
の微生物。 - 【請求項１０】転写及び翻訳の開始領域がプロモーター
配列とリボゾーム結合部位を含むことを特徴とする請求
項９記載の微生物。 - 【請求項１１】プロモーター配列とリボゾーム結合部位
が、生産されるペプチドによって同種由来あるいは異種
由来であることができることを特徴とする、請求項10記
載の微生物。 - 【請求項１２】下記群： コリネバクテリウムファージの強力なプロモーター トリプトファンオペロンのPtrpプロモーター lacオペロンのPlacプロモーター λファージの左側プロモーターPL λファージの右側プロモーターPR からプロモーター配列が選択されることを特徴とする、
請求項11記載の微生物。 - 【請求項１３】プロモーターがトリプトファンオペロン
のPtrpプロモーターとλファージの温度感受性右側プロ
モーターPRc I tsから選択されることを特徴とする、請
求項12記載の微生物。 - 【請求項１４】リボゾーム結合部位がλファージのc II
遺伝子に由来するか、あるいはコリネバクテリウムの相
同遺伝子に由来する、請求項８記載の微生物。 - 【請求項１５】発現カセットを担うプラスミドが選択の
手段を担っていることを特徴とする、請求項８から14の
いずれか１項に記載の微生物。 - 【請求項１６】選択の手段が抗生物質の１つに耐性を与
える選択マーカーであることを特徴とする、請求項15記
載の微生物。 - 【請求項１７】プラスミドが、トリプトファンオペロン
のPtrpプロモーター、転写終了配列tR1を欠損したλフ
ァージのc II遺伝子のリボゾーム結合部位、ブレビバク
テリウムR312の鏡像体選択的アミダーゼをコードするDN
A、及びアンピシリン耐性を与える遺伝子を有すること
を特徴とする、請求項８記載の微生物。 - 【請求項１８】プラスミドが、λファージ温度感受性右
側プロモーターPRc I ts、転写終了配列tR1を欠損した
λファージのc II遺伝子のリボゾーム結合部位、ブレビ
バクテリウムR312の鏡像体選択的アミダーゼをコードす
るDNA、及びアンピシリン耐性を与える遺伝子を有する
ことを特徴とする、請求項８記載の微生物。 - 【請求項１９】大腸菌、ブレビバクテリウム、コリネバ
クテリウム、ロドコッカスの菌株から選ばれることを特
徴とする、請求項８から18のいずれか１項に記載の微生
物。 - 【請求項２０】菌株がE.coli BあるいはE.coli K12 E10
3Sであることを特徴とする、請求項19記載の微生物。 - 【請求項２１】請求項８から20のいずれか１項に記載の
微生物をアミダーゼのコード配列が発現されるような条
件下で培養し、培養終了後微生物を分離してアミダーゼ
を抽出することを特徴とする、鏡像体選択的アミダーゼ
の調製方法。 - 【請求項２２】培養物を超音波破砕し、硫酸アンモニウ
ムで分画し、フェニルセファロースで分画し、ゲルろ過
を２回行うことを特徴とする、請求項21に記載の方法。 - 【請求項２３】請求項８から20のいずれか１項に記載の
微生物、あるいは請求項５から７のいずれか１項に記載
のポリペプチドの存在下に有機酸のラセミ体アミドを置
き、反応後立体異性体を回収することを特徴とする、有
機酸の立体異性体の１種をその対応するラセミ体アミド
から調製する方法。 - 【請求項２４】アミドがラセミ体２−アリールプロピオ
ンアミドであり、酸が（Ｓ）酸であることを特徴とす
る、請求項23記載の方法。 - 【請求項２５】ラセミ体２−アリールプロピオンアミド
がケトプロフェンのアミドであり、酸がＳ（＋）ケトプ
ロフェンであることを特徴とする、請求項24記載の方
法。 - 【請求項２６】アミドがラセミ体２−アリールオキシプ
ロピオンアミドであり、酸が対応するＲ立体異性体であ
ることを特徴とする請求項23記載の方法。 - 【請求項２７】鏡像体選択的アミダーゼ活性を有するポ
リペプチドをコードするDNA配列であって （１）以下に示すロドコッカスの鏡像体選択的アミダー
ゼをコードする配列、 【化８】 【化９】 （２）同じタンパク質をコードする、（１）の遺伝暗号
縮重類似体、 （３）鏡像体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチ
ドをコードするDNAであって、上記（１）及び（２）の
配列のいずれか１つのストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズするDNA のいずれかであることを特徴とするDNA配列。 - 【請求項２８】少なくとも下記アミノ酸配列をコードす
る配列を含むことを特徴とする、 【化１０】 あるいはこれらの配列に１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されたペプチドをコードすること
を特徴とする請求項27記載のDNA配列。 - 【請求項２９】少なくとも下記に示す配列のコード領域
を有するDNA配列。 【化１１】 【化１２】 - 【請求項３０】請求項27から29のいずれかに記載された
DNA配列を有する遺伝子。 - 【請求項３１】請求項27から30のいずれかに記載された
DNA配列の発現によるものであって、鏡像体選択的アミ
ダーゼ活性を有する新規なポリペプチド。 - 【請求項３２】下記配列 【化１３】 【化１４】 により特徴付けられる請求項31記載のポリペプチド。
- 【請求項３３】天然由来でないことを特徴とする、請求
項31から32のいずれか１項に記載のポリペプチド。 - 【請求項３４】請求項27から30のいずれか１項に記載さ
れたDNA配列を含みその配列が宿主細胞で確実に発現さ
れるためにいくつかのDNA配列のコントロール下にある
発現カセットを少なくとも１つ有する、形質転換微生
物。 - 【請求項３５】請求項27から30のいずれか１項に記載さ
れたDNA配列の発現を確実にするためのDNA配列が転写及
び翻訳の開始領域を含むことを特徴とする、請求項34記
載の微生物。 - 【請求項３６】転写及び翻訳の開始Ｋ領域がプロモータ
ー配列とリボゾーム結合部位を含むことを特徴とする請
求項35記載の微生物。 - 【請求項３７】プロモーター配列とリボゾーム結合部位
が、生産されるペプチドにとって同種由来あるいは異種
由来であることができることを特徴とする、請求項36記
載の微生物。 - 【請求項３８】下記群： コリネバクテリウムファージの強力なプロモーター トリプトファンオペロンのPtrpプロモーター lacオペロンのPlacプロモーター λファージの左側プロモーターPL λファージの右側プロモーターPR からプロモーター配列が選択されることを特徴とする、
請求項37記載の微生物。 - 【請求項３９】プロモーターがトリプトファンオペロン
のPtrpプロモーターとλファージの温度感受性右側プロ
モーターPRc I tsから選択されることを特徴とする、請
求項38記載の微生物。 - 【請求項４０】リボゾーム結合部位がλファージのc II
遺伝子に由来するか、あるいはコリネバクテリウムの相
同遺伝子に由来する、請求項37記載の微生物。 - 【請求項４１】発現カセットを担うプラスミドが選択の
手段も担っていることを特徴とする、請求項37から40の
いずれか１項に記載の微生物。 - 【請求項４２】選択の手段が抗生物質の１つに耐性を与
える選択マーカーであることを特徴とする、請求項41記
載の微生物。 - 【請求項４３】プラスミドが、トリプトファンオペロン
のPtrpプロモーター、転写終了配列tR1を欠損したλフ
ァージのc II遺伝子のリボゾーム結合部位、ロドコッカ
スの鏡像体選択的アミダーゼをコードするDNA、及びア
ンピリシン耐性を与える遺伝子を有することを特徴とす
る、請求項34記載の微生物。 - 【請求項４４】プラスミドが、λファージ温度感受性右
側プロモーターPRc I ts、転写終了配列tR1を欠損した
λファージのc II遺伝子のリボゾーム結合部位、ロドコ
ッカスの鏡像体選択的アミダーゼをコードするDNA、及
びアンピシリン耐性を与える遺伝子を有することを特徴
とする、請求項34記載の微生物。 - 【請求項４５】大腸菌、ブレビバクテリウム、コリネバ
クテリウム、ロドコッカスの菌株から選ばれることを特
徴とする、請求項34から44のいずれか１項に記載の微生
物。 - 【請求項４６】菌株がE.coli BあるいはE.coli K12 E10
3Sであることを特徴とする、請求項45記載の微生物。 - 【請求項４７】請求項34から46のいずれか１項に記載の
微生物をアミダーゼのコード配列が発現されるような条
件下で培養し、培養終了後微生物を分離してアミダーゼ
を抽出することを特徴とする、鏡像体選択的アミダーゼ
の調製方法。 - 【請求項４８】培養物を超音波破砕し、硫酸アンモニウ
ムで分画し、フェニルセファロースで分画し、ゲルろ過
を２回行うことを特徴とする、請求項47に記載の方法。 - 【請求項４９】請求項34から46のいずれか１項に記載の
微生物、あるいは請求項30から33のいずれか１項に記載
のポリペプチドの存在下に有機酸のラセミ体アミドを置
き、反応後立体異性体を回収することを特徴とする、有
機酸の立体異性体の１種をその対応するラセミ体アミド
から調製する方法。 - 【請求項５０】アミドがラセミ体２−アリールプロピオ
ンアミドであり、酸が（Ｓ）酸であることを特徴とす
る、請求項49記載の方法。 - 【請求項５１】ラセミ体２−アリールプロピオンアミド
がケトプロフェンのアミドであり、酸がＳ（＋）ケトプ
ロフェンであることを特徴とする、請求項50記載の方
法。 - 【請求項５２】アミドがラセミ体２−アリールオキシプ
ロピオンアミドであり、酸が対応するＲ立体異性体であ
ることを特徴とする請求項49記載の方法。
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