HUT56138A

HUT56138A - Process for producing new polypeptides

Info

Publication number: HUT56138A
Application number: HU907151A
Authority: HU
Inventors: Dominique Petre; Edith Gerbelaud; Jean-Francois Mayaux; Patrice Yeh
Original assignee: Rhone Poulenc Sante
Priority date: 1989-12-11
Filing date: 1990-11-15
Publication date: 1991-07-29
Also published as: ATE152481T1; ZA909071B; FI905660A; DE69030615D1; CA2030073A1; KR910012245A; EP0433117A1; CN1052508A; EP0433117B1; PT95909B; FR2655660B1; US5260208A; FI102971B; IE904115A1; HU907151D0; DE69030615T2; IL96309A0; US5766918A; AU6661490A; KR0164850B1

Description

A Jelen találmány tárgyai enantioszelektiv amidáz aktivitással rendelkező polipeptidek. Tárgyai továbbá ezen pollpeptldek expresszálásához szükséges genetikai anyagok, valamint az előállításukhoz szükséges mikrobiológiai eljárás. Végül a Jelen találmány tárgya ezen polipeptidek és a transzformált mikroorganizmusok felhasználása savak, főként propionsavak, különösen (S)-2-aril-propionsavak és (R)-2-arlloxi-propionsavak racém amidokból való enanttioszeszelektív szintézise céljára.

Aszimmetrikus szénatom Jelenléte miatt számos molekula két sztereoizomer formával rendelkezik, nevezetesen az R és

S, formával, melyek tükörképei egymásnak. Ez a helyzet a

2-ariloxi-propionsavak esetében. Ezek a molekulák legtöbbször racém elegy formájában léteznek, és a két izomer többé kevésbé egyenlő arányban van Jelen. Bizonyos esetekben csak az egyik specifikus izomerre van szükség, ezért gyakorlati szempontból hasznos, ha van eszközünk a két izomer elválasztására, vagy a szükséges izomer sztereospeclf ikus szintézisére.

A Jelen találmány tárgya azon polipeptidek területe, amelyek képesek az amldokat enantioszelektív módon hidrollzálnl: főleg a racém 2-arll-proplonamldokat (S)-2-aril-propionsavakká, és a racém 2-arlloxl-propionamidokat (R)-2-ariloxi-propionsa vakká.

Az ilyen enzimatikus aktivitással rendelkező mikroorganizmusok közé tartoznak a

Brevibacterium nembe és a Corynebacterium nembe tartozó fajok (69 400197.3 számú Európai szabadalml bejelentés), és főleg a Brevibacterium R312 törzs

-3(CBS 717.73). Emellett például a Rhodococcus törzsek is rendelkeznek ilyen Jellegű enzlmatlkus aktivitással.

A Jelen találmány tárgya ezen enantloszelektiv amidáz aktivitások Jellemzése és tisztítása, valamint az expressziójukért felelős genetikai anyag klónozása és szekvenálása. A továbbiakban az Amd szakkifejezés Jelentése az összes enantloszelektiv amidáz aktivitás. Az Amd szekvencia szakkifejezés Jelentése az említett amidáz aktivitásokat kódoló összes nukleotid szekvencia.

A Jelen találmány tárgya főleg ezen enantloszelektiv amldázok magas szintű expressziójának különféle gazdaszervezetekben rekombináns DNS technika alkalmazásával történő biztosítása.

A találmány egyik további tárgya az enantloszelektiv amidáz aktivitással, különös tekintettel a racém 2-aril-proplonamldokra Irányuló aktivitással, rendelkező poiipeptideket kódoló DNS szekvenciák. A Jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány tárgya a Brevibacterium R312 enantloszelektiv amldázát (ő. ábra), vagy a Rhodococcus enantloszelektiv amldázát (13. ábra) kódoló nukleotid szekvencia, valamint az összes, ugyanezt a polipeptidet kódoló degenerált szekvencia. A találmány tárgyal továbbá ezekkel a DNS szekvenciákkal, vagy ezeknek a fragmentjeivel hibrldizálódó szekvenciák, valamint azok, amelyek enantloszelektiv amidáz aktivitással rendelkező poiipeptideket kódolnak. A találmány tárgyal továbbá ezeket a DNS szekvenciákat tartalmazó gének.

A fenti amldázok peptld-szekvenclái közti homológla « ·

-4tanulmányozása feltárt egy nagyon erősen konzervatív régiót, amely a megfigyelt aktivitásért felelős. Ez a régió megfelel a 13. ábrán mutatott peptld-szekvencla 137-193-as amlnosavainak (618-788-as nukleotldok), valamint a korábban említett Brevibacterium RR312 amldáz peptid szekvenciája 159-215-ös amlnosavainak, amellyel erős homológlát mutat (67Z).

A jelen találmány egyik tárgya tehát egy korábban leírt DNS szekvencia, melyre Jellemező, hogy legalább a 13. ábra 137-193-amlnosavait, vagy a ő. ábra 159-215-ös aminosavait kódolja, vagy egy ezekkel legalább 5OZ-os homológlát mutató peptid szekvenciát kódol.

A jelen találmány egyik kiemelt tárgya egy olyan DNS szekvencia, amely a

ő. és

13. ábrákon bemutatott Amd szekvenciákat, vagy ezek részelt, illetve variánsait tartalmazza. A jelen találmány szempontjából a variáns szakkifejezés az összes olyan szekvenciára vonatkozik, amely megőrzi a kiindulási szekvencia tulajdonságait, még akkor is, ha például mutációkból, deléclókból, inszerclókból, vagy a genetikai kód degeneráltságából származó módosításokat tartalmaz.

Előnyös megvalósítási módozat szerint a DNS szekvencia a 8. vagy 13. ábrán bemutatott DNS szekvenciát tartalmazza.

A fenti szekvenciákat változatos módszerekkel állíthatjuk elő. Az általános stratégia az, hogy a keresett pollpeptldet kódoló genomiális DNS fragmentet klónozzuk, a tisztított polipeptld aminosa v-szek venclá ja alapján előállított nukleotid próbák alkalmazásával. Különböző módszereket alkalmazva, beleértve az Indító molekula

elongáclóját, restrikciós enzimeket, adapterek beépítését vagy linker ollgonukleotidok ligálását, a keresett DNS szekvenciával rendelkező nukleotid inszertet elő lehet állítani. Ezt azután az irodalomban Ismert módszerekkel térképezni majd szekvenálni lehet.

Más technikák is alkalmazhatók, beleértve a DNS alkalmazását és/vagy részleges vagy teljes kémiai szintézist. Ezek a technikák Jól ismertek, és a β. valamint a 13. ábrán Ismertetett szerkezetek lehetővé teszik egy ekvivalens szekvencia izolálását bármely mikroorganizmusból, a klasszikus technikák alkalmazásával.

A különböző enantioszelektív amidázok közötti homológia kimutatásával a jelen találmány lehetővé teszi olyan próbák előállítását, amelyek szolgálhatják a hlbrldlzálódó gének azonosítását (azaz az elegendő homológiával rendelkező géneket) bármely genomiálls génbankban. Azt könnyen lehet igazolni, hogy ezek a gének egy enantioszelektív amidázt kódolnak. Ilymódon lehetséges, hogy nagy mennyiségben állítsunk elő amidázt bármely mikroorganizmusban. Az is lehetséges, hogy új enantioszelektív amidáz aktivitások fedezhetők fel ilymódon.

A Jelen találmány tárgyai továbbá enantioszelektív amidáz aktivitással pollpeptidek, amelyek a következő polipeptld szekvenciákból legalább egyet tartalmaznak:

a 13. ábra 137-193-as aminosavalnak megfelelő szekvenciák,

- a 6. ábra 159-215-ös amlnosavalnaK megfelelő szekvenciák,

- az ezekkel a szekvenciákkal legalább 50Z-os homológiát mutató szekvenciák.

A jelen találmány tárgyal továbbá olyan új pollpeptldek,

amelyek szerkezete a	korábban leírt DNS szekvenciákból
származik, és amelyek	enantioszelektiv amidáz aktivitással
rendelkeznek. Ezeket	a polipeptideket természetes vagy

rekombináns mikroorganizmusok tenyészeteiből extrakcióval és tisztítással állítjuk elő. A tisztítást egymás utáni lépésekben hajtjuk végre; előállítjuk a nyers kivonatot a tenyészetből, a kivonatot ammőnlum-szulfáttal frakclonáljuk, majd kromatográf Iával és gélszflréssel tisztítjuk. A részleteket a példákban ismertetjük.

A találmány egyik előnyös megvalósítása a Brevibacterium R312 és a Rhodococcus enantioszelektiv amidázalval foglalkozik.

A találmány tárgyal továbbá olyan transzformált mikroorganizmusok, amelyek legalább egy, az előzőkben említett DNS szekvenciát tartalmazó expresszlós kazettát hordoznak. Ezek az expressziős kazetták előnyösen tartalmaznak egy, a jelen találmány szerinti DNS szekvenciát, olyan szabályozó DNS szekvenciák mögé helyezve, amelyek biztosítják expresszióját a kiválasztott gazdaszervezetben. A kazetta Integrálódhat a gazdaszervezet genomjába, vagy beépíthető egy plazmidba, amely a gazdaszervezetben működő szelekciós markert és replikációs origót tartalmaz.

-7A jelen találmány egyik célja ezeknek a pollpeptldeknek az expresszálása mesterséges körülmények között, azaz a heterolög szekvencia expresszálása egy bizonyos sejtben, amelynek a tenyésztési feltételei különösen előnyösek, és/vagy egy homológ szekvencia expresszálása egy legalább részben heterolög szabályozó jellel, abból a célból, hogy megnöveljük a termelést, és/vagy megjavítsuk a tenyésztési feltételeket.

A Jelen találmány tárgyát képező DNS szekvenciák expresszióját szabályozó DNS szekvenciák előnyösen egy transzkripciós és transzlációs lnlclációs régiót tartalmaznak. Ez a régió tartalmaz egy promotert és egy riboszómális kötőhelyet, amely a peptid termékkel lehet homológ vagy heterolög.

A szabályozó régió megválasztása függ a használt gazdaszervezettől, prokarióta gazdaszervezetek esetében a heterolög promotert az erős bakteriális promoterek közül választhatjuk, például lehetnek a Ptrp trlptofán operon, a Piac laktóz operon promoterel, a lambda bakteriofág Pr és Pl Jobb illetve baloldali promoterel, a corynebaktériumok fágjainak erős promoterel, vagy a corynebaktériumok homológ promoterel. Pontosabban, a lambda Jobboldali promotere esetében a PrcHs hőmérséklet-érzékeny forma az előnyös. Az eukarlóta mikroorganizmusokhoz, például az élesztőhöz az élesztő gllkolltlkus génjeinek promoterel használhatók, például a foszfogllcerát-klnáz (PGK), a gllceraldehid-3-foszfát-dehldrogenáz (GPD), a laktáz (LAC4) és az enoláz (ENO) gének promoterel.

-./fii 'rf jT> ^J1

Ha a gazda mikroorganizmus prokarióta, akkor a riboszóma rögzítési helyei előnyösen vagy a lambda fág cll génjéből, vagy a corynebaktérlumok homológ génjeiből származnak.

A gazdaszervezetben működő transzkripciós és transzlációs termlnáclós régiót a kódoló szekvencia után (3' irányban) helyezzük el. A plazmid emellett egy vagy több, a rekombináns gazdaszervezet szelektálására alkalmas genetikai bélyeget is hordoz. A domináns markerek az előnyösek, például azok, amelyek antibiotikumok, például amplcillln vagy streptomicin, illetve más toxlnok elleni rezisztenciát biztosítanak.

A használandó mikroorganizmusok közé tartoznak nevezetesen az enterobaktériumok, például az Escherichia coll, és a Corynebacterlum, Brevibacterium vagy Rhodococcus nembe tartozó corynebaktérlumok.

Természetesen, ugyanilyen elvi alapon más mikroorganizmusok is használhatók.

A találmány tárgyal egyebek között a korábban leírt plazmidok, amelyek legalább egy transzlációs és transzkripciós inlciációs régiót, a keresett polipeptidet kódoló DNS szekvenciát, és egy szelekciós genetikai bélyeget tartalmaznak.

A találmány tárgyai továbbá a korábban leírt transzformált mikroorganizmusok, az enantioszeiektív amldázok előállításában és a savak racém amidokból való enantioszeiektív szintézisében való alkalmazásukat tekintve.

Az enantioszeiektív amldázok előállítása magában foglalja a korábban ismertetett mikroorganizmusok • · «

-9tenyésztését olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik az enantloszelektív amidázt kódoló szekvencia expresszióját, majd a mikroorganizmusok elválasztását a termelt amldáztól.

Pontosabban, a találmány tárgya az ismertetett rekombináns mikroorganizmusok vagy polipeptidek alkalmazása 2-arll-propionsa vak enantloszelektív szintézisére a megfelelő 2-arll-propionamldokból.

A Jelen találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint egy Javasolt eljárást közlünk, amely tartalmazza egy szerves sav sztereolzomer Jének előállítását a megfelelő racém amidből, olymódon, hogy a racém amldot egy korábban leírt transzformált mikroorganizmus vagy egy korábban leírt módon előállított pollpeptld környezetébe helyezzük, és a kapott sztereoizomert kinyerjük.

Az említett eljárás alanyaként szereplő amldok között említhetjük a ketoprofén racém amidját, amelyből a S(+)ketoprofén - amely a gyógyszeriparban használható állítható elő.

Az alábbi példák és ábrák a Jelen találmány további Jellemzőit mutatják be. Ezek csak illusztratív jellegűnek tekinthetők, nem korlátozzák a találmány oltalmi körét.

-9tenyésztését olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik az enantioszelektív amidázt kódoló szekvencia expresszióját, majd a mikroorganizmusok elválasztását a termelt amldáztól.

Fontosabban, a találmány tárgya az Ismertetett rekombináns mikroorganizmusok vagy polipeptidek alkalmazása 2-arll-propionsa vak enantioszelektív szintézisére a megfelelő 2-arll-proplonamidokból.

A jelen találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint egy Javasolt eljárást közlünk, amely tartalmazza egy szerves sav sztereoizomer jének előállítását a megfelelő racém amidből, olymódon, hogy a racém amidot egy korábban leírt transzformált mikroorganizmus vagy egy korábban leírt módon előállított pollpeptid környezetébe helyezzük, és a kapott sztereolzomert kinyerjük.

Az említett eljárás alanyaként szereplő amldok között említhetjük a ketoprofén racém amldját, amelyből a S(+)ketoprofén - amely a gyógyszeriparban használható állítható elő.

t

-10AZ ABRAK LEIRASA

1. ábra:

A. A Brevibacterlum R312-ből tisztított amidázából nyert peptid-szekvenciák (N-terminálls és belső).

B. A belső peptid fragmentből származó oligonukleotld próba.

A. Az Sq 918 próba tervezési stratégiája, a Brevibacterlum R312 amidáz N-termlnálls peptld-f ragment Je alapján.

B. Az Sq 916 specifikus próba.

A.	Az Sq 916 próba	hibridizációs profilja	Ec0 R11
	HinDIII, Kpnl, PstI,	Smal és	Sphl	restrikciós
	enzimekkel	emésztett	Brevibacterlum	R312	teljes
	genomiálls	DNS-sel.
B.	AZ Sq 762	próba hibridizációs	profilja	BamHI,	BglII,
	EcoRI, Kpnl,	PstI, Sáli, Smal,	Sphl, SstI és	Xhol
	restrikciós	enzimekkel	emésztett	Brevibacterlum R312

teljes genomiálls DNS-sel.

4. ábra:

A pXL1650 és pXLlőől plazmldok restrikciós térképe.

5. ábra:

A Brevlbacterlum R312 enantloszelektív amidáz génjét tartalmazó 5.4 kb méretű PstI fragment restrikciós térképe.

5. ábra:

A Brevlbacterlum R312 enantloszelektív amidáz génjét tartalmazó BamHI-PstI fragment szekvenálásl stratégiája.

7, ábra:

A szekvenált fragment nyitott leolvasási kereteinek elemzése.

5. ábra:

A Brevlbacterlum R312 enantloszelektív amidáz génjének nukleotld és peptid szekvenciája.

9. ábra:

	A PXL1724	plazmid	restrikciós	térképe.
10.	ábra:
	A PXL1751	plazmid	restrikciós	térképe.
11.	ábra:

A PXL1752 plazmid restrikciós térképe.

12. ábra:

12.57.-os SDS-poliakrllamid gél Coomassle blue festés után, amely a Brevlbacterlum R312 enantioszelektiv amidáz expresszióját mutatja Escherlchla coll B és Escherlchla coll K12 E103S törzsben. Mindegyik sáv 60 pl, OD 2.1-es (E103S), vagy 0,7-es (Escherlchla coll B) tenyészetben levő fehérjének felel meg. T, ultrahanggal feltárt (PXL1029 és pXL906), amely az ILl-β gént tartalmazza a Ppclts vagy Ftrp promoter szabályozása alatt.

13. ábra:

A Rhodococcus enantioszelektiv amidáz gén (a PXL1636 plazmldből származó BamHI fragment) nukleotid és peptid szekvenciája.

14. ábra:

A pSV73 ingázó vektor restrikciós térképe.

15. ábra:

	A PYG617B	expressziós	plazmid	restrikciós	térképe.
16.	ábra:
	A PYGÖ17B	expressziós	plazmid	restrikciós	térképe.
17.	ábra:

A PYG822 expressziós plazmid restrikciós térképe.

• · ·

-13KIINDULASI PLAZMIDOK

A PXL1O29 plazmidot Jung és munkatársai Írták le [Ann.

Inst. Pasteur/Microblol., 139, 129-145 (1956)]. Ez egy

EcoRi-Ndel fragmentet tartalmaz, amelyben megtalálható a P_RCltS-RBScIItRI.

1. Példa

A Brevibacterium R312 enantioszelektlv amidáz azonosítása és tisztítása

1.1 Azonosítás

Az (R,S)-2-(4-hldroxl-fenoxi)-proplonamld (HPPAmld), egy 2-ariloxl-propionamld származék, jobb szubsztrátja az enantioszelektlv amidáznak| mint a 2-arll-proplonamid származékok, nevezetesen a 2-f enll-propionamid és a 2-(3-benzoil-f enll)-propionamid. Továbbá, az amidáz szelektivitása a HPPAmld R enantlomerje irányába Jellemzi a 2-arll-propionamld származékok S enantlomerje iránti szelektivitást.

Ennek következtében az enantioszelektlv enzlmatikus aktivitást szubsztrátként 2-(4-hidroxl-fenoxi)-propionamidot alkalmazva detektáltuk. A reakciót 25'C-on hajtjuk végre keverés közben, 50 mmól nátrium-foszfát (pH=7.0) pufferben, Brevlbacterlum R312 jelenlétében; 0.05 mól foszforsav, acetonitril és 1 normál HC1 55/40/5 térfogat-arányú keverékével állítjuk le a reakciót. A tenyészet centrifugálása után a felülúszót vizsgáljuk fordított fázisú nagynyomású folyadék-kromatográfiával (HPLC) (Hibar-Merck « · ····

-14RP-18, 5 pm). Az elúclót 0.005 mólos foszforsav és acetonltrll 85/15 térfogat-arányú elegyével végezzük. A HPPAmid és HPPSav megfelelő koncentrációit úgy mérjük, hogy az elúciós csúcsokat egy standardhoz hasonlítjuk. Erre a szubsztrátra az enantiomer felesleget az (R-S)/R+S) x 100 képlettel határozzuk meg, ahol R és S a HPPSav R és S enantiomer Jelnek megfelelő koncentrációi. Az enantiomer felesleget vagy polarlmetrlás mérésből (a nátrium 569 nm-es abszorpcióját használva), vagy királls oszlopot használva HPLC-vel határozzuk meg.

A teljes sejtekkel és egy oldható kivonattal kapott aktivitások értéke 15 E/mg illetve 24 E/mg fehérje (1 E=1 pmol HPPSav keletkezése óránként). Az (R)-HPPSav enantiomer feleslege 95Z. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Brevibacterium R312 enantioszelektiv amidáz aktivitással rendelkezik, amely képes a racém 2-(3-benzoil-fenll)-proplonamldot a megfelelő S savvá hldrollzálnl, 93Z-nál nagyobb enantiomer felesleggel.

1.2 Tisztítás

A tisztítást 4'C-on végezzük. A sejteket (40g száraz-súlyú Brevibacterium R312) megolvasztjuk, és 300 ml A pufferben szuszpendáljuk (50 mmól nátrium-foszfát pH=7.5, 7.5 mmól B-merkapto-etanol). A sejteket ezután ultrahangos módszerrel tárjuk fel, majd a membrán-törmelékeket centrifugálással távolltjuk el (20 OOO/perc, 30 perc). 30 ml felülúszóhoz lassan 25 ml streptomlcln-szulfátot adunk, keverés közben. 45 perc elteltével az oldatot a fentiek ♦· · • · ·· 4 4 « ¹ ·

-152 4 4 · ··· *«· szerint Kitisztítjuk,

-szulfáttal kezeljük.

és a kapott felülúszót ammóniumA 30.δ'Ζ és 56.6Z ammónium-szulf át telítés mellett kicsapódó fehérje-frakciót centrifugálással összegyűjtjük, majd 35 ml A pufferben oldjuk, és lassan ugyanezzel a pufferrel szemben dializáljuk. Az így kapott oldatot 20Z-ig telítjük ammónium-szulfáttal, majd fenll

-Sepharose CL-4B (Pharmacia) oszlopra visszük, amelyet

20Z-os ammónium-szulfát telítettségű A pufferrel hozunk egyensúlyba. Az aktív frakciókat ugyanezzel a pufferrel eluáljuk, majd ultraszűréssel betöményitjük 16 ml térfogatra,

Amicon	Dlaflo	PH10	cellát	alkalmazva.	A	betöményített
oldathoz	ezután	10Z	glicerint	adunk, majd	a	kapott oldatot
Ultrogel	AcA	44	oszlopra	visszük	(IBF-Blotechnlcs,

Franciaország), amelyet elette 50 mmól TRIS-HC1 pH=7, 100 mmól NaCl összetételű oldattal hoztunk egyensúlyba. A legmagasabb specifikus aktivitású frakciókat (az összes aktivitásnak körülbelül 32Z-át vittük fel az oszlopra) összegyűjtjük, betöményítjük, majd ugyanazon a gélen kiegészítő szűrésnek vetjük alá. Ezzel párhuzamosan, a legmagasabb specifikus aktivitású frakciókat (az összes fehérjének körülbelül 3O’/.-át vittük az oszlopra) SDS-PAGE módszerrel vizsgáljuk, majd tároljuk. A tisztított fehérje enantloszelektivitását is meghatározzuk.

Ez a tisztítási módszer egy olyan enzimet eredményez, amely több mint 60/. tisztaságú, specifikus aktivitása 615 E/mg. Ennél a lépésnél egy fő csík látható az SDS-PAGE-n, ennek látszólagos molekulasúlya 59 i 5 kD, és az összes fehérjének legalább βοζ.-át képezi. Továbbá a HPLC TSK 3000

-16oszloprói leoldott amldáz aktivitás 122 kD molekulasúlynak felel meg, Jelezve, hogy az enzim dlmer formában fordul el6.

Az 1. táblázat mutatja a különböze frakciók Jellemzőit. Ez a táblázat leírja a Brevlbacterlum R312 enantloszelektiv amldáz tisztításának különböze lépéseit:

- 40g nedves sejtbél, streptomicln-szulf áttal végzett kicsapás után

- egy egység (E) megfelel 1 pmöl HPPSav keletkezésének egy öra alatt, az alábbiakban Ismertetett körülmények között.

1. Táblázat

Tisztítási Térf. A fehérje Aktivitás Kitermelés Tisztítási

lépés	(ml)	mennyisége (mg)	(E/mg)	Z	faktor
1. Nyers kivonat	325	191S	26.4	100	1
2. Amménlum szulfát csapadék	29.5	613	62.5	75	2.4
3. Fenil- -Sepharose eluátum	77	200	196	7Ő	7.5
4. ACA44 első eluátum	6	27	457	24.4	17.3
5. ACA44	3	3.9	Ő15	6.3	31

második eluátum

2. példa

A Brevlbacterlum R312 enantloszelektív amldázának klónozása ·» ·

J2.1

A fehérje-szekvencia meghatározása

A Brevibacterium R312 enantloszelektlv amldáza

N-terminális fragmentjének (27 aminosav csoport ) és egy belső trlpszlnes fragmentnek (21 aminosav csoport) az aminosav-szekvenciáját a tisztított enzim felhasználásával határozzuk meg.

Ezt úgy végezzük, hogy 3 nmOl amldáz preparátumot komponenst ezután vetünk alá redukciónak és karboximetilezésnek. A fő fehérje só$(a nit Juk, majd fordított fázisú

HPLC-vel homogénre tisztítjuk.

Ezután az N-termlnálls szekvenciát Edman degradációt alkalmazó automatikus lebontással határozzuk meg, egy

Applled Blosystems Model

470A berendezéssel. Az 1A ábrán bemutatott szekvenciát ilyen módon kaptuk. A további, belső szekvencia kinyeréséhez ugyanilyen mennyiségű fehérjét emésztünk trlpszinnel. A redukált és karboxlmetilezett fragmenteket ezután fordított fázisú HPLC-vel (2.1 x 10 mm, áramlási sebesség 0.2 ml/perc) választjuk el, a következő összetételű elúciós puffért alkalmazva: 0 - 50Z acetonitril gradiens 0.07Z trlfluor-ecetsavban. Egy Jól elkülönülő csúcsban (40.8Z acetonitril) eluálődó peptidet szekvenálunk (IA ábra).

2.2 Nukleotid próbák készítése

Két stratégiát követtünk.

Az első stratégiában egy 29 tagú próbát (59Z-os

-19minlmális homológiával) készítünk, szem előtt tartva a

Brevibacterlum lactofermentum trlptofán operonjában levő kodon-hasznosítást [7.7 kb szekvencia, amely 6 cisztront tartalmaz: Matsui et al., Mól. Gén.

Génét., 209, 299 (1987)], és a belső fragment IDGALGSYDV szekvenciáját (kisebb az átlagos degenerációja).

A nem-kódoló láncot szintetizáljuk, figyelembe véve a G:T párosítás viszonylagos termodinamikai semlegességét, és bizonyos degeneráltságot bejuttatva, hogy maximalizáljuk a figyelembe vett kodonok átlagos elméleti frekvenciáját (88Z a választott kodonok használatához viszonyítva). Ezek a meggondolások vezettek a próba körülbelül 69Z-os GC tartalmának kialakításához. Az Sq762 próba szekvenciáját az IB ábrán mutatjuk be.

A második stratégiában a Glrge és munkatársai által leírt PCR módszert [Nuclelc Aclds Rés., 16, 10371 (1988)] használjuk egy pontos próba előállítására egy peptid alapján, amely megfelel az erősen degenerált kodonoknak. Ennek a végrehajtásához 25 tagú oligonukleotidokat szintetizálunk (lásd aláhúzott szekvenciák a 2A ábrán), amelyek tartalmazzák az N-terminális peptid-szekvencia első vagy utolsó öt kodonjának az összes lehetőségét, és az 5' végükön EcoRI illetve Hindin hasítási helyet tartalmaznak. Ezeket a 25 tagú oligonukleotidokat használjuk a Brevlbacterlum R312 genomlális DNS enzlmatlkus ampllf ikálására. 30 ciklusos amplifikálás után a jelölt fragmentet gélen tisztítjuk, majd az M13mp9 bakteriofág Hindin és EcoRI restrikciós helyei közé építjük be. A prlmerrel két hibridizációs hőmérsékletet alkalmaztunk (45'C

-εοés 48’C), így két Jelölt fragmentet Kaptunk. A fragmentek klónozása után mindegyik Hőmérsékletről néhány kiónt szekvenáltunk, majd összehasonlítottuk őket. Az eredmények a 2A ábrán láthatók. Az látható, hogy az indító molekulák által bevitt degenerációtól eltekintve az amidáz N-terminális végét kódoló DNS fragment (egyféle az indító molekulák között) Jól ampllf ikálódott. Egy 40-tagü szintetikus oligonukleotldot (Sq 918), amely megfelel a belső fragmentnek, használunk ezután a további klónozási munkákban, az amidáz N-terminállsa pontos próbájaként.

Az így kapott Sq762 és Sq913 próbákat az 5' végükön 32p__vei foszforilezve jelöljük.

2.3 A Brevibacterlum enantioszelektív amldázát kódoló gén klónozása

A stratégia szerint először igazoljuk a próbák specifitását és meghatározzuk a klónozandó genomiális DNS-fragment természetét Southern biottot alkalmazva. Röviden, a Brevibacterlum R312 genomiális DNS-t felváltva emésztjük a lehetséges klónozó helyeknek megfelelő restrikciós enzimekkel, főleg azokkal, amelyek a pUC plazmldok poliklónozó helyében megtalálhatók. Nevezetesen a PstI restrikciós hasítási helyet használjuk. Agaróz gélen végzett elektroforézls és nylon membránra való transzfer után a különböző emésztések eredményeit az Sq762 és Sq91ö próbákhoz hlbrldizáljuk. A 3. ábrán bemutatott eredmények igazolják, hogy a két próba elegendő specif icitással rendelkezik a hibridizáció körülményei között (legalább az ·· ·

-21egylk fragment hibrldizál minden egyes emésztés eredményéhez). Továbbá, mivel a két próba majdnem ugyanazt a hlbridizálási profilt mutatja, az arra a gondolatra vezethet bárkit, hogy a keresett gén hibridizációs Jelei meglehetősen specifikusak, és a tripszines emésztés után Kapott belső peptid nagyon közel van az N-terminálishoz. A hibridizációs lenyomat egyetlen 5.4 kb méretű PstI fragment Jelenlétét igazolja, amely erősen hibridizál a két próbával. Tehát ezt a fragmentet kell klónozni.

A klónozáshoz a Brevibacterium R312 DNS össz-DNS-ének PstI emésztéséből származó összes, 4.6 és 5.5 kb közötti, valamint 5.5 és 6.5 kb közötti fragmentjét agarózon tisztítjuk, elektroeluáljuk, majd PstI restrikciós enzimmel emésztett pUC19 plazmidba ligáljuk. Az E.coli DH5a törzs transzformálása után X-gal tartalmú táptalajon 500 fehér telepet kaptunk, amelyek elvileg megfelelnek a rekombináns mikroorganizmusnak. Mindegyik telepet külön izoláljuk, nylon membránra átvisszük, majd ³²P-vel Jelzett Sq 916 próbával végzett hibridizálással analizáljuk. Két klón erősen hibridizált, ezeket izoláltuk, és a következő lépésekben használtuk.

Az ebből a két kiónból Izolált PXL1650 és PXL1651 rekombináns plazmidot különböző módszerekkel elemezzük, beleértve a restrikciós térképezést, részleges szekvenálást a próbákat szekvenáló indító molekulaként alkalmazva, valamint a Southern hlbridizálást. A 4. ábrán látható, hogy a két plazmld ugyanazt az 5.4 kb méretű PstI lnszertet tartalmazza, különböző orientációban. Az 5. ábrán ennek a

-szfragmentnek a restrikciós térképe látható. Ez a két plazmid valóban tartalmazza a jellemzett peptideket kódoló szekvenciákat, az N-terminális melletti triptikus fragmentet (δ. ábra). Ezek az eredmények továbbá azt mutatják, hogy a Brevibacterium R312 enantloszelektív amldázát kódoló gén egy

2.3 kb méretű BamHI-PstI restrikciós fragmenten található, iránya a BamHI-től a PstI felé mutat. A kódoló szekvencia 5' végének a helyét megadva, és ismerve hogy az enzimet legfeljebb 2000 bp kódolja (becslésünk szerint egy 57-63 kD méretű monomer molekula), biztos hogy a korábban szekvenált BamHI-PstI fragment tartalmazza a teljes gént.

3. Példa

A Brevibacterium R312 enantloszelektív amldázát kódoló gént tartalmazó BamHI-PstI fragment szekvenciája

A BamHI-PstI fragment szekvenálásának stratégiáját a 6. ábrán mutatjuk be. Az összes különböző szekvenciát a lánc-termlnáclós módszerrel kaptuk (Sequenase kit, 7-deaza-dGTP és (³⁵S)dATP Jelenlétében), a szubf ragmenteket akár egyszálú H13 hordozón, vagy közvetlenül a PXL1650 plazmidon vizsgálva. Ebből a célból különböző specifikus indító molekulákat is szintetizálunk. A kapott szekvencia átlagos GC tartalma 61.57.. A 7. ábrán látható a nyílt leolvasási keretek elemzése. Az látható, hogy az amldáznak megfelelő nyílt leolvasási keret 521 aminosavat kódol, a fehérje számított molekulasúlya 54671. Ennek a nyílt leolvasási keretnek a GC tartalma 65.ő 7., 52.5 7. és 70 7. az első, a

-23második és a harmadik kodon pozíciójában, ami GC gazdag mikroorganizmusok esetében a kódoló szekvenciákra jellemzó eloszlás. A 8. ábrán látható a BamHI-PstI fragment teljes szekvenciája.

4. Példa

A Brevlbacterlum R312 enantioszelektív amidázát kódoló gén expressziója Escherlchla coliban

4.1 A plazmldok előállítása

Számos plazmid készült, amelyben az amidáz struktúrgénjét, amely tartalmaz egy homológ riboszómális kötőhelyet (RBS), vagy a lambda fáig dl génjéből származó

RBS-t, a saját promoterének, a promoterének, vagy a lambda fág triptofán operon hőmérséklet-érzékeny

Jobboldali promoterének a szabályozása alá helyeztük. A PXL155O plazmidot (4. ábra) úgy kapjuk, hogy a teljes Brevlbacterlum R312 genomiálls DNS-t emésztjük PstI restrikciós enzimmel, majd az így kapott 5.4 kb méretű fragmentet a pUC19 plazmid PstI hasítási helyére építjük be. Tehát ez a plazmid hordozza a laktóz operon Piac promoterét, ezt követi egy riboszómális kötőhely, majd a Brevlbacterlum R312 enantioszelektív amidázát kódoló struktúrgén, valamint egy ampiclllln rezisztenciát kódoló genetikai bélyeg.

A pXL1724 plazmid (9. ábra) tartalmazza az 5.4 kb méretű PstI fragmentből kihasított 2.3 kb méretű BamHI-PstI restrikciós fragmentet, az Escherlchla coli triptofán operonja promoterének szabályozása alatt. Ebben a

-24!··· .« konstrukcióban a Brevibacterium R312 amldáz génjét az ATG kodon előtt egy 56 bázispár méretű szakasz, amely tartalmazza a saját riboszómálls kötőhelyét, (ö. ábra).

Két másik konstrukció is készült, amelyekben a Brevibacterium R312 enantioszeiektív amidázát kódoló struktúrgént heterológ promoterek szabályozása alá helyezzük, heterológ riboszómálls kötőhelyekkel. Ezeket a plazmldokat (PXL1751 és pXL1752) a következőképpen kapjuk:

A pXL1724 plazmidot PCR technikával mutagenizáljuk, abból a célból, hogy az ATG kodonnál behelyettesítsünk egy Ndel restrikciós enzim hasítási helyet (CATATG), az amldáz struktúrgén elé. Az ampllflkálást ügy hajtjuk végre, hogy az egyik indító molekula tartalmazza az ATG iniciációs kodonnál hibridlzáló Ndel restrikciós enzim hasítási helyet, a másik indító molekula pedig az ATG kodon után található Xhol restrikciós enzim hasítási helyet. Az ampllfikált fragmentet Ndel és Xhol restrikciós enzimekkel emésztve hasítjuk ki.

- A Ptrp promoter alkalmazása:

Az EcoRI és Xhol restrikciós enzimekkel emésztett pXL1724 plazmidba beépítünk egy Ptrp promotert és a lambda fág cll génjének riboszómálls kötőhelyét hordozó EcoRI-Ndel restrikciós fragmentet, amelyből a íRj termlnációs szekvenciát kivágtuk, valamint az amldáz struktúrgén 5' régióját (az Ndel-Xhol fragmentet). Az így létrehozott plazmid Jele PXL1751 (10. ábra).

- A Ppdts promoter használata:

Ugyanezt a stratégiát alkalmazzuk, ez alkalommal a PXL1029 plazmldból származó EcoRI-Ndel fragmentet használjuk, amely • «

-25tartalmazza a Ppclts promotert és a lambda cll gén rlboszőmális kötőhelyét, amelyből a tRj terminációs szekvenciát eltávolították. Az így létrehozott plazmid Jele

PXL1752 (11. ábra).

4.2 A Brevibacterium R312 amldáz génjének expresszálása Escherlchia coli B és Escherlchia coli K12 E1O3S törzsekben

A PXL1751 és pXL1752 plazmidokat használjuk Escherlchia coll B és Escherlchia coli K12 E103S törzsek transzformálására, a kálcium-klor id módszerrel. A rekomblnáns mikroorganizmusok szelektálását amplcllimt tartalmazó táptalajon végezzük.

A Brevibacterium R312 enantioszelektí v amldáz expresszálását a sejtek ultrahangos feltárása után mérjük, a nyers frakciók, vagy a centrifugálás után az üledék és a felülúszó SDS-PAGE elemzésével. A 12. ábrán látható eredmények magas szintű amldáz expressziót mutatnak, az összes fehérje-tartalom 20 x-ig.

5. Példa

A Brevibacterium R312 enantioszelektí v amidázának felhasználása_______2-aril-propionsavak________enantloszelektív szintézisére

A következő törzseket használjuk:

Escherlchia coll(pXL1751) - az amldázt Kódoló szekvenciát a trlptofán operon promoterének a szabályozása alá helyezzük.

Escherlchia coli (pXL1752) - az amldázt úgy állítjuk elő, hogy a hőmérsékletet az exponenciális fázis végén 3O’C-:ról

-2642‘C-ra emeljük (a lambda fág Pr promotere a clts hőmérséklet-érzékeny represszor szabályozása alatt).

Két kontroli-törzset is használunk:

Escherlchla coli(pXL906) - megfelel az Escherlchla coll (pXL1751)-nek, de az amldáz gén helyett az ILlg génjét tartalmazza.

Escherlchla cq11(pXL1029) - megfelel az Escherlchla coli(pXL1752)-nek, de az amldáz gén helyett az IL1B gént tartalmazza.

Az alábbi eljárást alkalmazzuk ezen mikroorganizmusok aktivitásának a vizsgálatára:

A megfelelő indukáló körülmények között növekedő sejt-szuszpenzióhoz a következő anyagot tartalmazó oldatot adjuk például:

- hidroxi-4-fenoxl-2-propionamld (HPPAm); vagy

- fenil-2-propionamid (PPAm); vagy a ketoprofén amidját (KAm)

A reakcióelegyet egy acetonitril : 1 normál sósav (90:10 térfogatarány) keveréket tartalmazó pufferben hígítjuk meg, majd a sejteket centrifugálással eltávolítjuk. A reakcióelegyet HPLC-vel választjuk el, és az amldáz aktivitást kiszámítjuk. Az eredmények a 2. táblázatban láthatók, ezek a rendszer hatékonyságát bizonyítják.

A 2. táblázatban látható az Escherlchla coliban indukáló körülmények között előállított Brevibacterlum R312 amldáz specifikus aktivitása a HPPAm, PPAm és KAm racém szubsztrátokkal szemben, valamint a termelt királis savak enantlomer feleslege. Ebben a kísérletben a PXL1751 (amldáz • · · ·

-27gént tartalmaz) vagy pXL906 (kontroll) plazmidokat hordozó

Escherlchla coli törzseket 37‘C-on növesztjük.

2. Táblázat

E. coli törzs

Specifikus

Enantiomer indukáló körülmények aktivitás felesleg körülmények pmol/h/g fehérje között

HPPAm PPAm KAm HPPAR+ PPAS+ KetoS+

pXL	1751	1300	50	4	93	96	95
pXL	1752	1300	50	5	94	97	95
pXL	906	0	nd	nd	nd	nd	nd
pXL	1029	14	0	0	nd	nd	nd

A 3. táblázat a Brevlbacterium R312 amidáz specifikus aktivitását mutatja (a pXL1751 expressziós plazmid) 28‘C-on indukáló vagy represszáló körülmények között növesztett Escherlchla coliban előállítva, a KAm racém szubsztráttal szemben, valamint a termelt királis sav enantiomer feleslegét.

-263. Táblázat

• ·

Baktérium törzs Plazmid	Represszor (1)	Specifikus aktivitás pmol/h/g fehérje	ee (X)
E. coll	PXL1751		55	96
E. coli	PXL1751	Trp	13	nd

nd: nincs meghatározva ee: enantlomer felesleg (X) (1) - Trp:L-triptofán

Tehát a Brevibacterlum R312 (Amd⁺ genotípus) amidáz génjét tartalmazó Escherlchla törzsek hatékonyan képesek a kővetkező három amid (a fenotípus AHD⁺) hldrollzálására:

2-(4-hldroxl-fenoxl)-proplonamld (HPPAm) 2-fenll-proplonamid (PPAm)

- a ketoprofén amldja (KAm).

A kapott enantlomer felesleg mindig nagyobb 93 Z-nál.

6. Példa

A Rhodococcus enantioszelektiv amidázának tisztítása

I. Az enzlmatikus aktivitás vizsgálata

Az aktív frakciót 30 percig 30‘C-on lnkubáljuk 500 pl pufferben (0.1 mól TRIS-HC1 pH=7.5, 5 mmól DTT, lö mmól

2-f enil-pr oplonamid). Az lnkubálás után 2 ml 90/10 térfogatarányú acetonitrll/HCl elegyet, majd 2 ml 50 mmól H3PO4/CH3CN 75/25 arányú elegyet adunk a reakclóelegyhez. 10 percig 5000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk, majd a felülúszó egy alikvot részét HPLC-vel vizsgáljuk, a reakciótermékek mérése céljából.

Oszlop: Nucleosil 5-C1S 25 cm

- Eluálószer: 50 mmól H3PO4/CH3CN 75/25 arányú elegye

- A felvitt minta mennyisége: 10 pl

Áramlási sebesség: 1 ml/perc

Az aktivitás egységének meghatározása: az az enzim-mennyiség, amely ahhoz szükséges, hogy 1 óra alatt 1 pmól 2-fenil-proplonamld elhidrolizáljon.

II. Tisztítási eljárás

6.1 Az enzim-kivonat elóállítása g sejtet szuszpendálunk 15 ml 0.1 mól TRIS-HC1 pH:7.5, 5 mmól DTT összetételű pufferben, majd 15 percig 4*C-on ultrahanggal besugározzuk. A nyers enzim-kivonatot centrifugálissal nyerjük ki (50 OOO/perc, 1 óra).

6.2 Első ioncserélő kromatográf la ml nyers kivonathoz 20 ml A puffért (25 mmól TRIS-HC1 pH:7.5, 5 mmél DTT) adunk. A mintát Mono Q HR 10/10 oszlopra (Pharmacia) visszük, amelyet A pufferrel hoztunk egyensúlyba, az áramlási sebesség 3 ml/perc. Az oszlop mosása után a fehérjéket lineáris 0.1-1.0 mólos 1 órás gradienssel eluáljuk, az áramlási sebesség 3 ml/perc. A frakciók térfogata 6 ml. Az amldáz lő ml-ben eluálódik körülbelül 0.3 mól KCl-nél.

6.3 A második ioncserélő kromatográfla

Az aktív frakciókat egyesítjük, majd 2 ml-re töményítjük be egy Centriprep ultraszűrő rendszerrel (Amicon). 6 ml A pufferrel végzett hígítás után 4 ml mintát viszünk fel 1 ml/perc áramlási sebességgel Mono Q HR 5/5 oszlopra, amelyet A pufferrel hoztunk egyensúlyba. A fehérjéket A pufferben készült 0-0.5 mól KC1 gradienssel eluáljuk. Az aktív frakciókat egyesítjük, 15 térfogat z glicerin-koncentrációt állítunk be bennük, majd a fentiek szerint 1 ml-re töményítjük be.

6.4 Hidrofób kromatográfla ml B puffért (0.1 mól TRIS-HC1 ρΗ=7.5, 0.5 mmól DTT,

1.7 mól (NH^í^SOq.) adunk a mintához, majd ezután két részletben Phenll-Superose HR 5/5 oszlopra (Pharmacia) visszük 0.25 ml/perc áramlási sebességet alkalmazva. A fehérjék 0.5 ml/perc-nél eluálódnak ammónium-szulf át csökkenő lineáris gradiensével (1.7 mól - 0 mól) 25 ml-ben.

« · • · · · · ····· *·* · • · · · · · * • · · ··· ·*·«

-31A frakciók térfogata 0.5 ml. Az aktív frakciókban 15Z glicerin koncentrációt állítunk be, majd 1 ml-re hígítjuk A pufferrel.

6.5 Hldroxilapatlt kromatográf la

A mintát 0.5 ml/perc sebességgel Blo-Gel HPHT oszlopra (Blo-Rad) injektáljuk, amelyet C pufferrel hoztunk egyensúlyba (85 mmól TRIS-HC1 pH=7.5,

0.5 mmól DTT, pmól

CaClg, 15Z glicerin). az amidáz

0.5 ml/perc áramlási sebesség mellett 20 perc alatt eluálódik a következő összetételű puffer 0-100Z-os lineáris gradiensével:

0.35 mól kálium-foszfát pH:7.5,

0.5 mmól DTT, 10 pmól CaClg, 15Z glicerin a C pufferben.

Ezek a lépések lehetővé teszik egy 988 E/mg fehérje specifikus aktivitással rendelkező enzim homogenitásig való tisztítását.

Az így kapott enzim dimer formában van Jelen, a két alegység azonos, látszólagos molekulasúlyuk 53 i 2 kD.

7. Példa

Az ezt az amldázt kódoló gén klónozása

TSK-G3000 sw-vel végzett kiegészítő tisztítás után az enzimet szekvenálásnak vetjük alá. Az N-termlnális rész nem alkalmas az Edman típusú kémia számára, tehát egy teljes tripszlnes hidrolízist végzünk, és a hldrollzátum három HPLC frakciója és

162-es olyan peptideket szolgáltat, amely lehetővé teszi egyértelmű szekvencia meghatározását. a 123-as frakcióból kapott szekvencia • · · ·

-32alapján egy 32 tagú oligonukleotld próbát szintetizálunk, amely 6 oligonukleotid keveréke, és a legalább háromszorosan degenerált pozíciókban 7 inozint tartalmaz:

A próba (a 123-as pepiidből)

ATVDVPVPDYA

5'

GCIACIGTIGATGTICCIGTICCIGATTATGC

Ennek az 5' végén ³²P-vel jelzett próbának a hatékonyságát Southern hibridizációval ellenőrizzük, a hibridizációhoz SstI, Sphl, Smal, PstI, KpnI, EcoRI, Sáli és BamHI enzimekkel emésztett Rhodococcus genomiális DNS-t használunk. A kísérleti körülmények a következők: hibridizációs puffer, 5x SSC, 5x Denhardt, 0.1Z SDS, 50 mmól NaP0₄ pH=6.5, 250 pg/ml hering-sperma DNS; a hibridizációs hőmérséklet 50'C vagy 55‘C (két kísérlet); a mosási körülmények: 1 óra 6x SSC-ben szobahőmérsékleten és 5 perc 2xSSC, 0.1Z SDS összetételű oldatban 50'C-on.

Ilyen körülmények Között az A próba erős, egyértelmű Jeleket adott, különösen a BamHI, KpnI, Sphl, SstI, Smal, Sáli és PstI emésztésekkel, ezeknél egyetlen, az A próbával erősen hibridizálódó genomiális csík található, A PstI emésztésnél az A próbához hibridizálódó Jel mérete megfelel egy körülbelül 3.2 kb méretű genomiális fragmentnek.

* · · ···· ·· • · · · · ··· · · *·· · * · · · · « · *· · ··· ····

-33A genomlális DNS 3-4 Kb méretű PstI emésztési fragmentjét preparatív agaróz gélelektroforézlssel majd elektroelúclóval tisztítjuk, majd PstI restrikciós enzimmel emésztett pUC19 enzimbe ligáljuk. Az Escherichla coll DH5a törzs transzformálása után 600, LB Amp-X-gal táptalajon növő fehér kiónt izolálunk, majd az A próbával telephlbrldlzálást végzünk, a Southern hibridizáláshoz hasonló feltételek között. A 9 különösen erós hibridizációs jelet szolgáltató kiónt a plazmid DNS restrikciós elemzésével analizáljuk. Ezek közül 6 Kiónba épült be ugyanaz a 3.2 kb méretű fragment a két orientációban, az egyes orientációjú kiónok közül egyet-egyet kiválasztunk (PXL1635 és pXL1836), és részletesebben analizáljuk (részletes térképezés, Southern analízis), ezzel megerősítjük, hogy a keresett fragmentet klónoztuk.

6. Példa

A 3.2 kb méretű PstI fragment szekvenciája

A 3.2 kb méretű PstI fragment mindkét szálának meghatározzuk teljes nukleotid szekvenciáját.

Ennek a fragmentnek

GC tartalma 62.4Z, hasonló az

R312 GC tartalmához (körülbelül 62Z).

A szekvencia analízise felfedett egy

1366 nukleotid hosszúságú nyitott leolvasási keretet (a

210-es és

1595-ös pozíció között), amely 462 aminosavat kódol (a számított molekulasúly

46554), és tartalmazza a három trlptlkus fragment szekvenálásakor kapott peptidet. Ez a nyitott leolvasási keret megtalálható « « 4 ♦ *·· ·4·4

-34> · · · • 4 4 · ···· • · · « ·4 ·· ·· · 4

egy szubklónozott	BamHI fragmenten,	amelynek a	nukleotid
szekvenciája a 13.	ábrán látható.
A 3 aláhúzott	peptid szekvencia	megfelel a	tisztított
enzim triptikus	fragmentjei (123-	as, 124-es	és 162-es)

közvetlenül meghatározott szekvenciájának. Az aláhúzott nukleotid szekvencia megfelel a gén klónozásához használt (degenerált) próbának. A dóit betűkkel írt peptid szekvencia megfelel a 137 - 193-as csoportoknak, amelyek erősen konzerválódtak a Brevibacterium R312 törzs és a Rhodococcus nembe tartozó törzs (lásd a továbbiakban) enantioszelektlv amidázaiban.

Ez a nyitott leolvasási keret jelenti az enantioszelektlv amidáz struktúrgénjét.

9. Példa

Homológja a különböző amidázok között: egy, az amidáz aktivitásra Jellemző szekvencia azonosítása az R312 enantioszelektlv amidáz (ö. ábra) és a 13. ábrán bemutatott amidáz erős homológlát mutat a szekvenciának körülbelül a kétharmadában, az R312 150-300 aminosavai között (50Z-os erős azonosság), a homológla a 159-es és 215-ös aminosavak között 67Z-ot is elér.

A GENPRO génbank átvizsgálása homológ szekvenciák után erős homológlát fedezett fel a 15O-2OO-as régió és az Asperglllus nldulans acetamldáz, a Pseudomonas syringlae és Bradyrhizobium Japonicum indolacetamld hidrolázok (IAH), az Agrobacterium tumefaclens tms2 fehérjéje és a ··»· ·«

-35Flavobacterium K172 törzs, valamint a Pseudomonas NK2Ö7 törzs 6-aminohexanoát-clkllkus-dlmer-hldroliázok (ACDH) között.

A 4. táblázatban a fentiekben ismertetett amidáz 137-193-as aminosavakat tartalmazó peptldje és a többi enzim megfelelő helyei Közötti homológlát mutatja (az aminosavak Z-os erős azonosságában kifejezve):

4. Táblázat

Amidáz	homológia
R312	65.5
tms2 A. tumefaciens	64.3
IAH P. syrlnglae	61.6
ACDH (F.K172 vagy P. NK87)	61 .4
IAH B. japonicum	54.4
Acetamldáz (A. nidulans)	47.4

Ez az erősen konzervált régió a felelős legnagyobb valószínűséggel ezeknek az enzimeknek az aktivitásáért (katalitikus hely).

···» ·

10. Példa

Az enantloszelektív amldáz expresszálása Escherlchla coliban

Abból a célból, hogy megerősítsük az enantloszelektív amldázt kódoló fázis azonosítását, egy Ndel hasítási helyet (CATATG) hozunk létre PCR-rel a feltételezett ATG kolonnái a 210-es pozícióban (13. ábra), és az ezen hasítási hely, valamint az 1683-as pozícióban levő Sáli hely közötti fragmentet, amely egyedül tartalmazza az amldázt Kódoló régiót, Escherlchla coliban működő transzkripciós lnlcláclós jelek (Ptrp vagy Pr promoterek) és transzlációs

Jelek (cll rlboszómálls kötőhely) szabályozó hatása alá helyezzük.

Az igy kapott vektorok (pXL1893,

Ptrp; és a

PXL1894, Pp-clts) hasonlóak a PXL1752 és pXL1751-es vektorokhoz, amelyek az R312 amldázhoz, a korábbiakban leírtak szerint. A pXL1893 és pXL1894 plazmldok expresszióját Escherlchla coll B és Escherlchla coll K12

E103S törzsekben oldjuk meg. A tisztított amidázzal együtt vándorló fehérjét 42‘C-on lehet előállítani, a pXL1894 plazmid Jelenlétében.

11. Példa

Az enantloszelektív amldáz expresszálása corynebaktérlumban

1. AZ expressziós vektorok készítése

Ezek a vektorok corynebaktériumokban repllkálódó vektorokból származnak. Szerkezeti elemeik:

- egy E.coll replikon

- egy corynebaktérium replikon

- egy szelektálható marker

- egy Amd szekvencia

A pSV73 vektor (14. ábra): Ez a plazmid a C. glutamicum pSRl plazmidjából származik (Yoshlhama et al., J.Bacteriol, 162, 591 (1965)], olymódon, hogy a pUC8 plazmidot építették bele, amely egy Escherlchla coli repllkont tartalmaz, valamint a Tn903 transzpozonon levő kanamlcln rezisztencia gént.

Ezt a plazmidot használjuk a 13. ábrán bemutatott Amd szekvenciák különböze expressziós vektorainak az előállítására, nevezetesen:

- A pYGőllA és B vektorok (15. ábra). Ezeket az expressziós vektorokat úgy állítjuk elő, hogy az Amd szekvenciát tartalmazó, a 13. ábrán bemutatott Sáli fragmentet a pSV73 Sáli helyére építjük be, mindkét orientációban.

A PYG817A és B vektorok (16.

ábra). Ezeket az expressziós vektorokat úgy állítjuk elő, hogy az Amd szekvenciát tartalmazó,

13. ábrán bemutatott BamHI fragmentet a PSV73 BglII helyére építjük be, mindkét orientációban.

A PYG822 vektor (17.

ábra). Ez az expressziós vektor a pSV73 vektorból származik, olymódon, hogy a Sáli és a BglII helyek közé egy expressziós kazettát építünk be, amely a 13 ábrán bemutatott Amd szekvenciát tartalmazza, az Escherlchla coli triptofán operonja Ptrp promoterének • ·

-38szabályozása alatt.

Hás kriptikus corynebaktérium plazmidok is használhatók az Amd szekvencia corynebaktériumokban működó expressziós vektorainak az előállításához. Például a

B.lactof ermentum-ból izolált pX18 plazmid (Yeh et al.,

Gene, 47, 301-306 (1986)] lehetővé teszi a pYG820A és a

PYG820B ingázó vektorok előállítását, amelyek képesek Brevibacterium R312-ben replikálódni, ennélfogva recipiensként használhatók bizonyos corynebaktériumokban végzett klónozásl és expressziós kísérletekben.

2. A corynebaktérlumok transzformálása

Az összes ismert transzformációs technika alkalmazható, főleg a fentiekben idézett Yoshima és munkatársai által leírt protoplaszt-regenerációs technika. A bejelentők azonban kimutatták, hogy az elektroporációs technika nagyon hatékony, a transzformációs frekvencia hatékonyságát 1000-szeresre növeli.

Az ultrahanggal feltárt sejtek SDS-PAGE analízisét használjuk az enzim rekomblnáns gazdaszervezetben való lntracelluláris expressziójának vizsgálatára.

12. Példa

Enzimes katalízis

Ebben a példában bemutatjuk az Amd-típusú fehérjék vagy az ezeket a fehérjéket expresszáló mikroorganizmusok alkalmazását alkalmazását optikailag aktív szerves savak

enantloszelektív szintézisére, a megfelelő racém amidok hidrolízisével.

1. A sejtek elkészítése

A k-ülönbözö törzseket kétliteres Erlenmeyer lombikokban tenyésztjük 600 ml táptalajban, 28’C-on megfelelő tenyésztési körülmények között, 150/perc fordulatszámmal rázatva a lombikokat. A tenyésztés leállítása után a sejteket kinyerjük, 9 g/1 koncentrációjú NaCl oldatban mossuk, majd -18’C-on tároljuk.

2. A 2-fenll-propionamid mint szubsztrát

A kísérlet a következő:

A 2-f enil-proplonamidot és a sejtszuszpenziót egy keverővei ellátott lombikba tesszük, a térfogatát 5 ml-re állítjuk 50 mmól kálium-foszfát pufferrel (pH=7.0). A lombikot termosztálható kristályosító csészébe helyezzük 25’C-ra, és 1 órán át kevertetjuk. A reakcióelegyet ezután acetonitril/HCl 9/1 térfogatarányú elegyével meghigítjuk, majd a sejttörmeléket és a baktériumokat centrifugálással eltávolítjuk. A sav és az amid összetételét HPLC-vel határozzuk meg.

A Brevibacterium R312-vel és a Brevibacterium lactofermentummal (ATCC 21086) kapott eredmények a következők:

5. Táblázat

Törzs	Plazmid	Specifikus aktivitás pmól/h/mg fehérje
Brevibacterlum R312	PSV73	0.1
Brevibacterlum R312	pYG811A	4.3
Brevibacterlum R312	pYGÖHB	5.4
B .lactofermentum	PSV73	0
B .lactofermentum	PYG622	2.8

3. A racém ketoprofén amid mint szubsztrát

Amint az a 6. táblázatban látható, a Rhodococcus amidázt expresszáló rekombináns corynebaktériumok lényegesen magasabb aktivitást mutatnak, mint a pSV73-mal transzformált kontroll sejtek.

-416. Táblázat

Baktérium törzs	Plazmid	Inducer (1)	Specifikus aktivitás pmöl/h/mg fehérje	ee (X)
Brevibact. 312	PSV73	IBN	O.O1	nd
Brevibact. 312	pYGÖl1A	IBN	0.04	96
Brevibact. 312	pYGÖl1B	IBN	0.04	94
B .lactofermentum	PSV73	ΙΒΝ+ IBNAm	0	nd
B .lactofermentum	PYGÖ22	IBN+ IBNAm	0.02	nd

nd :	; nincs meghatározva
ee =	; enantlomer felesleg (S+ ketoprofén)
(1)	= IBN: izobutil-nitril;

IBNAm: izobutiramid

Claims

1. Enantloszelektív aktivitással rendelkező pollpeptidet kódoló DNS szekvencia.

2. Az 1. igénypont szerinti DNS szekvencia, azzal jellemezve, hogy az alábbiak közül választjuk:

- a ő. ábrán bemutatott Brevlbacterlum R312 enantloszelektív amidázt kódoló szekvencia, valamint a 13. ábrán bemutatott Rhodococcus enantloszelektív amidázt kódoló szekvencia;

- ezeknek a szekvenciáknak az analógjai, amelyek ugyanazt a fehérjét kódolják, de a genetikai kód degeneráltságából származnak:

ezen szekvenciák egyikével vagy annak fragment jével hlbrldlzálódó DNS szekvencia, amely enantloszelektív amidáz aktivitással rendelkező fehérjét kódol.

3. Az 1. igénypont szerinti DNS szekvencia, azzal Jellemezve, hogy legalább a 13. ábrán bemutatott 137-193 amlnosavakat, vagy a ő.ábrán bemutatott 159-215 amlnosavakat kódoló szekvenciákat tartalmazza, vagy egy ezekkel a peptid szekvenciákkal legalább 50Z-os homológiát mutató peptid szekvenciát.

4. DNS szekvencia, amely legalább a 6. ábrán bemutatott kódoló régiót tartalmazza.

5. DNS szekvencia, amely legalább a 13.ábrán bemutatott kódoló régiót tartalmazza.

-43• «· « ·· • ·· ·· • · · · · • · ·

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti DNS szekvenciát tartalmazó gén. 7. ΛΖ 1-6. igénypontok bármelyike szerinti DNS

szekvencla polipeptidek, expresszálásával előállított új

azzal Jellemezve, hogy enantloszelektív amldáz aktivitással rendelkeznek. ő. A 7. igénypont szerinti pollpeptid, azzal Jellemezve, hogy a ő. vagy 13. ábrán látható szekvenciával

írható le.

9. Enantloszelektív amldáz aktivitással rendelkező pollpeptid, amelynek szekvenciája az alábbiak közül választható:

- a 13. ábra 137-193-as aminosavalnak megfelelő szekvenciák;

a ö. ábra 159-215-ös aminosavalnak megfelelő szekvenciák;

az említett szekvenciákkal legalább 50Z-os homológlát mutató szekvenciák.

10. A 7-9. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidek, azzal Jellemezve, hogy természetes eredetűek.

11. Transzformált mikroorganizmusok, azzal Jellemezve, hogy legalább egy olyan expressziós kazettát tartalmaznak, amely az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti szekvenciát tartalmazza, ennek a szekvenciának a gazdaszervezetben való expresszióját lehetővé tevő DNS szekvenciák szabályozása alatt.

12. A 11. igénypont szerinti mikroorganizmus, azzal jellemezve, hogy az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti • · « • · * · · ·«··· ··· · • · · · · · · ·· · ··· ····

-44szekvencia expresszióját biztosító DNS szekvenciák egy transzkripciós és transzlációs iniciációs régiót tartalmaznak.

13. A 11. igénypont szerinti mikroorganizmus, azzal jellemezve, hogy a transzkripciós és transzlációs iniciációs régió tartalmaz egy promoter szekvenciát és egy rlboszómálls kötőhelyet.

14. A 13. igénypont szerinti mikroorganizmus, azzal jellemezve, hogy a promoter szekvencia és a rlboszómálls kötőhely a termelt pepiidhez viszonyítva lehet homológ vagy heter ológ.

15. A 14. igénypont szerinti mikroorganizmus, azzal

jellemezve, hogy a promoterek a következők közül vannak kiválasztva: a corynebaktérlum fágok erős promoterei, a trlptofán operon Ptrp promotere, a lac operon Piac promotere, a lambda fág baloldali Pl promotere, vagy a lambda fág jobboldali PR promotere. 16. A 15. igénypont szerinti mikroorganizmus, azzal

jellemezve, hogy a promotert a trlptofán operon Ptrp promotere és a lambda fág P^clts jobboldali promotere közül választjuk.

17. A 11. igénypont szerinti mikroorganizmus, azzal jellemezve, hogy a rlboszómálls kötőhely a lambda fág cll génjéből, vagy a corynebaktérlum homológ génjeiből van kiválasztva.

lő. A 11-17. igénypontok bármelyike szerinti mikroorganizmus, azzal jellemezve, hogy az expressziós kazettát egy olyan plazmldon találjuk, amely szelekcióra alkalmas.

19. A 11. igénypont szerinti mikroorganizmus, azzal

Jellemezve, hogy a szelekció eszköze egy antibiotikum rezisztenciát biztosító szelekciós bélyeg.

20. A 11. igénypont szerinti mikroorganizmus, azzal

Jellemezve, hogy a plazmid a trlptofán operon Ptrp promoterét, a lambda fág dl génje riboszómális kötőhelyét, amelyről a tRl terminációs szekvenciát eltávolították, a Brevibacterium R312 enantioszelektív amidázát kódoló DNS-t és egy ampicillln rezisztenciát biztosító gént tatalmazza.

21. A 11. igénypont szerinti mikroorganizmus, azzal jellemezve, hogy a plazmid a lambda fág Jobboldali PrcIís hőmérséklet-érzékeny promoterét, a lambda fág tRl terminációs szekvencia nélküli cll génje riboszómális kötőhelyét, a Brevibacterium R312 enantioszelektív amidázát kódoló DNS-t és egy ampicillln rezisztenciát biztosító gént tarrtalmazza.

22. A 11-21. igénypontok bármelyike szerinti mikroorganizmus, azzal Jellemezve, hogy az Escherlchia coll, Brevibacterium, Corynebacterium és Rhodococcus törzsek közül van kiválasztva.

23. A 22. igénypont szerinti mikroorganizmus, azzal

Jellemezve, hogy vagy Escherlchia coll B, vagy Escherlchia coli K12 E103S törzs.

24. Eljárás egy enantioszelektív amldáz előállítására, azzal Jellemezve, hogy egy a 11-23. igénypontok bármelyike szerinti mikroorganizmust az amldázt kódoló szekvencia expresszióját lehetővé tevő körülmények között tenyésztünk, majd a mikroorganizmus tenyészetét elválasztjuk és az «*«· ·· amidázt extraháljuk.

25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal Jellemezve, hogy a tenyészetet ultrahanggal feltárjuk, ammónlum-szulfáttal frakclonáljuk, phenyl-Sepharose-on kromatografáljuk, majd kétszeres gélszűrésnek vetjük alá.

26. Eljárás egy szerves sav sztereolzomer Jének az előállítására a megfelelő racém amidből, azzal jellemezve, hogy a racém amldot a 11-23. igénypontok bármelyike szerinti mikroorganizmus, vagy a 7-10. igénypontok bármelyike szerinti polipeptíd köörnyezetébe helyezzük, és a reakció lejátszódása után a sztereolzomert kinyerjük.

27. A 26. igénypont bármelyike szerinti eljárás, azzal Jellemezve, hogy az amid racém 2-aril-propionamid, és a sav egy (S) sav.

26. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal Jellemezve, hogy a racém 2-aril-propionamid a ketoprofén amidja, és a sav az S(+)-ketoprofén.

29. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az amid egy racém 2-ariloxl-propionamid, és a sav a megfelelő R sztereolzomer.