JPH0272878A - 組換えｄｎａ、それを含む形質転換体及びそれを用いたグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、バチルス・メガテリウム由来のグルコースデ
ヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを大腸菌用ＤＮ１４
人ベクターに組み込んだ大腸菌内で？１製可能な組換え
ＤＮＡ、それらを含む形質転換体及びそれらを用いたグ
ルコースデヒドロゲナーゼ（以下ｒＧＤＨ，という。）
の製造法に関する。

〔従来技術） ＧＤＨ［ＥＣ１，１，１，４７）は、グルコース定量用
酵素として臨床検査及び食品工業の分野において重要な
酵素として使用されている。

従来、ＧＤＨを生産する微生物としては、バチルス・メ
ガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ
）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅ
ｕｓ）等のバチルス属菌が知られている　（特開昭５３
−１３７１９９号）。

〔解決すべき問題点〕

しかしながらグルコース測定用酵素としてＧＤ■１をよ
り簡便に使用するためには、ＧＤＨをより安価に製造す
ることが望まれていた。

そこで最近になってバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｊ
ｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のＧＤＨ遺伝子
を大腸菌に組み入れた組換え体を用いたＣＤＨの生産方
法が開示された〔ヨーロピアン・ジャーナル・オプ・バ
イオケミストリー（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　
１７４巻、４８５〜４９０．　（１９８８）　）。

しかし、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓ
＋ｅｇａｔｅｒｉｕｎ＋）由来のＧＤＨ遺伝子は複数個
存在することが推定され、それらの２種についての形質
転換体を得、ＧＤＨを生産しているが、使用しているベ
クターはＣＤＨの裔生産には向かないものであり、事実
生産性も低いものであった。

〔問題点を解決すべき手段・作用〕

本発明者らは、かねてよりＧＤＨをより安価に製造する
ため、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓ＋
ｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のＧＤＨ遺伝子を大腸菌に組
み入れた形質転換体を用い、ＣＤ　Ｈの大量生産方法を
検討してきた。そして本発明者らはバチルス・メガテリ
ウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来
のＧＤＨをコードするＤＮＡを組み入れるために使用す
るベクターとして酵素の高発現用のベクターを用いて組
換えＤＮＡを作製し、この組換えＤＮＡを大腸菌に組み
入れた形質転換体を栄養培地で培養することによって、
培養物中にＧＤＨを大量に製造することに成功するとと
もに、本発明者らが取り出したバチルス・メガテリウム
（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のＧＤ
ＨをコードするＤＮＡは、そのアミノ酸配列が前記文献
とは全く異なる新規なものであることを知り、本発明を
完成したものである。

本発明のバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｒ
＊ｅｇａ　ｔｅｒ　ｉｕｍ）由来のＧＤＨをコードする
組換えＤＮＡを調製するために使用する菌株としては、
ＧＤＨ生産能を有するバチルス・メガテリウム（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｎ＋）であればいずれ
のものも使用できるが、好ましくはバチルス・メガテリ
ウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａＬｅｒｉｕｍ）　Ｉ
ＡＭ１０３０及び土壌からスクリーニングしたバチルス
・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉ
ｕｍ）　ＩＷＧ３を用いるのがよい。

土壌から得られた菌株のバチルス・メガテリウム（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）　ＩＷＧ３は以
下のようにして同定され、本発明者らにより命名された
ものである。

刑ｊ口達肛 菌学的諸性質の試験は、ルース・イー・ゴートン著、ザ
・ジーナス・バチルス（Ｒｕｔｈ　Ｅ、Ｇｏｒｄｏｎ：
Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　（１９７３）
）に準拠し、分類方法はバージェイス・マニュアル・オ
ブ・デイタミネイティブ・バクテリオロジーＣＢｅｒｇ
ｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）　（第８版）及び前
記Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ　Ｂａｃｉｌｌｕｓによった。

Ａ、形態 ■細胞の大きさは１．１〜１．６μ×３．０〜５．０μ
で桿菌である。またグルコース栄養培地（ｇｌｕｃｏｓ
ｅ　ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ａｇａｒ）で生育した細胞をツ
クシンで染めると細胞内は粒状である。

■運動性はない。

■胞子を形成し、大きさは１．０〜１．３μ×２．０〜
２．５μで、印形ないしは円柱形である。胞子のうは膨
らまない。中立ないしは準端立である。

■ダラム染色性は陽性である。

Ｂ９生理学的性質 ■硝酸塩の還元：陰性 ■脱窒反応　　：陰性 ■ＶＰテスト　：陰性。ブロスのｐｌ＋は７日間の培養
で４．６〜５．０である。

■インドールの生成：陰性 ■デンプンの加水分解：陰性 ■クエン酸塩の利用：陽性 ■無機窒素源の利用：アンモニウム塩と硝酸塩を共に利
用する。

■色素の生成：チロシン培地で茶褐色の水溶性色素を生
成する。

■ウレアーゼ：弱陽性 ［相］カタラーゼ：陽性 ■酸素に対する態度：好気性 ｏｔｉａからの酸及びガスの生成： アラビノース、キシロース、グルコース。

フラクトース、ガラクトース、マルトース、シュクロー
ス、ラクトース　トレハロース、マンニット、イノジッ
ト、グリセリン、デンプンから酸を生成するが、ガスは
生成しない。マンノース、ソルビットからは酸もガスも
生成しない。

■７χＮａＣ１培地での生育：生育しないｏ４５°Ｃに
おける生育：生育する ■６５゛Ｃにおける生育：生育しない ■フェニルアラニンのデアミネーション：陽性■ゼラチ
ンの液化性：陽性 ■カゼインの分解性：陽性 ［相］チロシンの分解性：陽性 ■卵黄反応：陰性 以上の諸性質をバージェイス・マニュアル・オプ・ディ
タミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ
　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）（第８版）の分類方法にし
たがって検索すると、本菌株はダラム陽性の好気性桿菌
で胞子を形成するのでＢａｃｉｌｌｕｓ属に分類される
。種については■栄養細胞の大きさが１．０−１．６μ
×３．０〜５．０μであり、グルコース培地で細胞内が
粒状であること、■胞子のうが膨らまないこと、胞子形
成部位は中央部ないしはやや末端よりであること、■グ
ルコースから酸を生成すること、ＶＰテストが陰性であ
ること、■嫌気条件下では生育しないこと、■サブロー
、デキストローズ（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ　ｄｅｘｔｒｏ
ｓｅ）培地で生育すること、■アラビノース、キシロー
ス、マンニットから酸を生成すること、■卵黄反応が陰
性であること等の性質からバチルス・メガテリウム（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｎ＋）と同定され
た。

本発明者らは、本菌株をバチルス・メガテリウム（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）　ＩＷＧ３　と
命名した。

旭實転換体■璽袈 本発明にかかる組換えＤＮＡ及び形質転換体は、概略下
記の工程によって調製することができる。

（１）バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅ
ｇａｔｅｒｉｕｍ）菌を培養して得られる粗酵素より、
ＤＥＡＥ−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）八−５
０等の処理によって精製酵素を得、アミノ基末端アミノ
酸配列を決定する。

（２）得られたＧＤＨのアミノ基末端アミノ酸配列の一
部分について、これより推定される遺伝子のＤＮＡ塩基
配列を持つオリゴヌクレオチドを合成し、３ｔｐでラベ
ルし、これをＤＮＡプローブとする。

（３）バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｔｌｌｕｓｍｅ
ｇａｔｅｒｉｕｍ）から全ＤＮＡを抽出し、制限酵素で
切断した後、適切な長さのＤＮＡ断片をベクターに組み
込み、大腸菌に導入し、ＤＮＡライブラリーを作成する
。

（４）上記（２）で調製されたＤＮＡプローブを用いて
前記ＤＮＡライブラリーとコロニーハイブリダイゼーシ
ョンを行わせ、ＤＮＡプローブと相補性を有する大腸菌
のコロニーを選択分離する。

（５）選択された大腸菌からプラスミドＤＮＡを取り出
し、ベクターに組み込まれたバチルス・メガテリウム（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のＤＮ
Ａ塩基配列を決定し、そのアミノ酸配列の一部と前記（
１）で決定されたアミノ基末端アミノ酸配列が一致する
ことを確認する。

（６）決定されたＤＮＡ塩基配列を基に、ＧＤＨ遺伝子
断片の一部に適当な修飾を行い、大腸菌の遺伝子発現の
ためのベクターに組み込み、発現用の組換えＤＮＡを調
製する。

（７）発現用の組換えＤＮＡを宿主大腸菌に導入し、Ｃ
ＤＨを生産する新規な大腸菌を調製する。

上記工程中、ＤＮＡの取扱いに関しては、たとえば〔モ
レキユラー　クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｎｇ）、ティー・マニアティス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ）ら。

コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏ
ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）社、　（１９８２））のような実験書に従えば容
易に実施できる。また、酵素試薬類はすべて市販の製品
が使用できる。

発現用ベクターとしては、大腸菌宿主内で機能するプロ
モーターやりボゾーム結合部位を有するものであればい
ずれでもよいが、高発現のためには強力なプロモーター
を有する発現ベクターが望ましい。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本
発明は下記の実施例に限定されるものではない。

尖施勇上 １）グルコース脱水素酵素の精製 バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａ
ｔｅｒｉｕｍ）ＩＷＧ３を２ＸＴＹブロスに植菌し、培
養後集菌し、菌体破砕後、遠心分離して得られる上清液
を脱塩濃縮後、凍結乾燥して得られたＧＤＨ粗酵素粉末
１０５μｇをグリセロール１０％含有イミダゾール緩衝
液（２０ｍＭ、　ｐＨ６，５）　１５Ｉｄに溶解し、Ｄ
ＥＡＲ−セファデックス八−５０に吸着させた後、食塩
濃度勾配（０，１Ｍ　−０，５Ｍ）により溶出させ、活
性画分を集め脱塩濃縮する。次にＴＳに−ｇｅｌ口ＥＡ
Ｅ３　ＳＷを担体とする高速液体クロマトグラフィーに
より分子量分画を行い、さらにＴＳＫ−ｇｅｌ　Ｇ３０
００　ＳＷを担体とする高速液体クロマトグラフィーに
より吸着溶離して電気泳動的に均一な活性画分（蛋白質
量として約５■）を得た。

２）ＧＤＨのアミノ基末端アミノ酸配列の決定前記１に
より得た精製酵素蛋白質のアミノ基末端アミノ酸配列を
ＡＢＩ（アプライド　バイオシステム（＾ｐｐｌｉｅｄ
　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＋＋＋）　３社製ペプチドシーケン
サーＧａｓ　Ｐｈａｓｅ　４７０＾により分析し、Ｎ末
端より２９アミノ酸残基の配列を決定した。得られたア
ミノ基末端アミノ酸配列を以下に示す。

Ｍｅｔ−Ｔ　ｒ−Ｌｙｓ−Ａｓ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−１ｉｅ−
＾ｒｇ−Ｐｂｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ注：下線部はプローブ
合成に用いられた配列を示す。

３）ＤＮＡプローブの合成 前記アミノ酸配列から下線で示した１個所の配列を選択
し、これらのアミノ酸配列から推定される遺伝子上の可
能なりＮＡ塩基配列のうち、枯草菌のコドン利用頻度を
参考にしてＤＮＡ塩基配列を推定し、３８ｍａｒの１種
のＤＮＡプローブの塩基配列を下記の如く決定した。

ＴＡＣＡＴＡ　　ＴＴＴ　　ＣＴＡ　　ＧＡＣＣＴＴ　
　ＣＣＴ　　ＴＴＴ　　ＣＡＡ　　Ｃ＾＾ＣＡＡ　　Ｔ
ＡＡ　　ＴＧ ＤＮＡの合成はＡＢＩ社製でシンセサイザー（Ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｚｅｒ）モデル３８１八を用いて行った。

４）バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇ
ａ　ｔｅｒ　ｉｕｍ）からの全ＤＮＡの抽出と切断斉藤
、三浦らの方法〔バイオロジー・バイオロジー・アクタ
（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）、
　７２巻６１９　（１９６３））に従ってバチルス・メ
ガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ
）ＩＷＧ３から全ＤＮＡを抽出精製した。このＤＮＡ２
４０μｇをとり、制限酵素ＥｃｏＲＩ　、Ｂｇｌ　ｎそ
れぞれ１５０単位と３７°Ｃ，３時間反応させた。反応
液の全量を１％アガロースゲル電気泳動に供し、３〜４
にｂの大きさに相当するＤＮＡを含む部分を切出して、
電気抽出法によりゲルからＤＮＡ断片を溶出させた。次
いで溶出液を当量のフェノール及びフェノール・クロロ
ホルムで順次抽出し、得られた水層にエタノールを添加
してＤＮＡを沈澱させた後、ＴＥ緩衝液１００μρに溶
かした。

５）ベクターへのＤＮＡ断片の挿入 ベクターとしてはｐＢＲ３２２を用いたが、ＤＮＡ断片
挿入のためには、ｐＢＲ３２２２０ｕ　ｇをＩ！ｃｏＲ
ＩＢａｍｌｌ　Ｉで完全分解して得られた直鎖状ベクタ
ーＤＮＡをＴＥ緩衝液２００ｕｌに溶解して使用した。

上記工程４で得られたＤＮＡ断片との結合は、工程４で
得られた溶液と直鎖状ベクターＤＮＡ溶液を１０：１の
割合に混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを１４°Ｃで一夜反
応させることにより行った。

６）バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇ
ａ　ｔｅｒｉｕｍ）のＤＮＡライブラリーの作成上記工
程５で得られた組換えＤＮＡを形質転換により宿主大腸
菌エシェリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）　Ｃ６００に導
入し、アンピシリン５０ｕｇ／１ｌｄｌを含むＬ−プロ
ス寒天培地上で生育してきたコロニーを集めてバチルス
・メガテリウム　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒ
ｉｕｍ）ＩＷＧ３のＤＮＡライブラリーと称した。

７）ＤＮＡライブラリーからＣ，ＤＨクローンの選択・
分離 上記工程３で得られたＤＮＡプローブを各々イングリア
（Ｉｎｇｌｉａ）らの方法〔ヌクレイツク・アシ・ンド
・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）
、　　９巻。

１６２７〜１６４２　（１９８２）　）に従ってＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼとｒ　−”Ｐ−ＡＴ　Ｐを用い
てラベルした。次に前記工程６で得られた大腸菌をアン
ピシリン５０ｕｇ／ｄを含むＬ−ブロス寒天培地上でコ
ロニーとして生育させ、これをレプリカ法によって、ア
マ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ナイロンメンプランへ
移し、リゾチーム溶菌し、アルカリでＤＮＡ変性させ、
塩酸による中和処理を行った後、前記プローブとハイブ
リダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションは６
倍濃度のＳ　Ｓ　Ｃ（０，１５ＭＮａＣｌ、　０．０１
５Ｍクエン酸ナトリウム、　ｐＨ７，０）、　　５倍濃
度のデンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄ　ｔ）液（０，０２％
フィコール、　０．０２％ポリビニルピロリドン、　０
．０２％牛血清アルブミン）、　　０．５％ＳＤＳ、牛
胸腺ＤＮＡ２０μｇ／ｒｔｔｌ　（終濃度）及びラベル
したＤＮＡプローブ約５　ＸＩＯ’　ｃｐｍ／ｍｌを用
いてプレハイブリダイゼーションを４５°Ｃ，３時間行
った後、４５°Ｃ１−夜のハイブリダイゼーションを行
った。この後、５倍濃度のＳＳＣを用いて４５°Ｃで２
回、つづいて５倍濃度（７）ＳＳＣ（０，１％ＳＤＳを
含む）を用いて４５°Ｃで２回、４倍濃度のＳＳＣで２
回ナイロンメンブランを洗浄した。この後ナイロンメン
プランを乾燥させ、オートラジオグラフィー（条件；−
８０°Ｃ１−夜）に供した。その結果、ハイブリダイゼ
ーション陽性のコロニーが３つ見出された。そこで陽性
のコロニーについて液体培養をした後、バーンボイム（
Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）らの方法〔ヌクレイツク・アシッド
・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）
＋　　７巻。

１５１３〜１５２３　（１９７９）　）によりプラスミ
ドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限
酵素ＥｃｏＲＩ、　Ｓａｌ　Ｉで切断し、アガロースゲ
ル電気泳動を行った後、ラベルしたＤＮＡプローブとサ
ザン（Ｓｏｎｔｈｅｒｎ）ハイブリダイゼーション〔ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍ
ｏｌ。

Ｂｉｏｌ、）、９８巻、　　５０３〜５１７　（１９７
５））を行った。その結果、ＥｃｏＲｒ、　Ｓａｌ　Ｉ
切断で生成する約３．６ＫｂのＤＮＡ断片にＤＮＡプロ
ーブが強（ハイブリダイズすることが見出された。なお
分離された３株は同−のプラスミドを有することが示さ
れ、Ｇ　Ｄ　Ｈクローンの候補としてこのプラスミドを
ｐＧＤＡｌと命名した。

８）ＧＤＨクローンの同定とＤＮＡ塩基配列の決定 プラスミドｐＧＤＡ１よりＥｃｏＲＩ　＋　５ａｕ３八
Ｉ切断により生成する９３０ｂρのＤＮＡ断片について
サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らの方法〔プロシーデインゲ
ス・オブ・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ニー
ニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ目、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ
、　Ｕ、Ｓ、八、）、　７４巻。

５４６３〜５’４６７、　（１９７７））に従ってＤＮ
Ａ塩基配列を決定した。その結果、上記工程２で得られ
たＣＤＨのアミノ基末端アミノ酸配列に完全に一致する
アミノ酸配列をコードする塩基配列が見出され、この断
片がＧＤＨ遺伝子の一部を含むことが明らかになった。

プラスミドｐＧＤＡ１については、制限酵素切断の結果
にもとづいて第１図に表される制限酵素地図を作成した
。すでに決定された塩基配列から遺伝子読取り方向の下
流部位のＤＮＡ塩基配列を決定したところ、第２図に示
される２６１個のアミノ酸よりなる蛋白質をコードする
塩基配列が存在することが示された。以上の結果により
プラスミドｐＧｏＡｔ中のバチルス・メガテリウム（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａＬｅｒｉｕｍ）ＩＷＧ３由来
のＤＮＡ断片中にはＧＤＦ（の構造遺伝子が完全に含ま
れているものと推定される。

９）ＧＤＨ遺伝子の発現 クローニングされたＧＤＨ遺伝子を大腸菌で発現させる
ためにプラスミドｐＧＤＡｌ中のバチルス・メガテリウ
ム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＷＧ
３由来のＤＮＡ断片から、以下に示す工程に従い遺伝子
の発現を試みた。

プラスミドｐＧＤＡ１１０μｇをＥｃｏＲＩ及びＰｖｕ
ｌｌで切断し、１％アガロース電気床動に供し、約１．
５Ｋｂの大きさの断片を回収した。得られた断片１１１
ｇにｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰを
終濃度各１　ｍＭ。

ＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏ
ｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）　　４単位を加え、１０ＩＩＩ
Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐ！１７．５）、　７ｍＭ　Ｍ
ｇｃ＋□、　　１　ｍＭジチオスレイトールの反応液２
０με中で、３０’Ｃ，２０分間反応させた。これによ
り両端が平滑末端にされたＤＮ　Ａ断片を精製し、その
約０．５μｇにＰｓｔｌリンカ−とＴ４ＤＮＡリガーゼ
１０単位を加え、６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７
，５）、　　５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、　　５ｍＭジチオス
レイトール、１＋ｎＭＡＴＰの反応液２０μ２中で、１
４’Ｃ，−夜反応させた。反応後ＤＮＡ断片を精製し、
Ｂａｎ　ＩＩで切断後、この断片にマングビーンヌクレ
アーゼ（Ｍｕｎｇ　ｂｅａｎ　ｎｕｃｌｅａｓｅ）　　
Ｉ　Ｕを加え、４０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）
、　１００１１Ｍ　ＮａＣｌ。

２　ｍＭ　ＺｎＣ１ｚ＋　１０％グリセロールの反応液
５０ｕＥ中で、３０°Ｃ５３０分間反応させた。この操
作によりＢａｎ　Ｕの突出末端を平滑末端にし、さらに
上述したのと同様の方法でＥｃｏＲＩリンカ−を連結し
た。

反応後ＤＮＡ断片を精製し、ＥｃｏＲＩとＰｓｔｌで両
端を切断し、ＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片として回収
した。

本実施例に用いられる発現用ベクターｐＫＫ２２３−３
は、ブロシウス（Ｂｒｏｓｉｕｓ、　Ｊ、）　　ら〔プ
ロシーデインゲス・オプ・ナショナル・アカデミ−・サ
イエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、）、　８１巻、　６９２９〜６９３３．　
（１９８４））により報告されたものであり、プロモー
ターとしてｔａｃプロモーターを有している。

この発現ベクターｐＫＫ２２３−３を制限酵素ＥｃｏＲ
ＩとＰｓｔｌで切断した後、回収したＥｃｏＲＩ　−Ｐ
ｓｔ　Ｉ断片と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合反応
を行わせた。その反応液を用いてエシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｊａ　ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０５を形
質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍ１１．　　イソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）
を含むし一ブロス寒天培地上で生育してくるコロニーを
選択した。

得られたコロニーについてＣＤＨの発現を確認するため
に、色素共役法を用いたコロニーアッセイを行った。コ
ロニーをろ紙上にレプリカし、５゜ｌトリス−塩酸（ｐ
Ｈ７，５）、　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ緩衝液にリゾチーム
をｌ　ｍｇ　／　ｒｔｄｌの濃度に調整したりゾチーム
溶液をろ紙上のコロニーに加え、３０″Ｃ，２０分間保
温後、１％トリトン溶液を加え室温で５分間放置した。

さらに熱処理用の緩衝液（５０＋＋＋Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ６，５）、　２Ｍ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　ＥＤＴＡ
）を加え、６０’Ｃ。

２０分間熱処理を行った。

次に基質混合液（２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８，０）
・ＩＭ　ＮａＣｌ、　１００ｍＭグルコース、　　０．
５ｍＭフェナジンエトサルフェート（ＰＥＳ）、　０．
５ｍＭ　３−（４’、５’−ジメチルチアゾール−２−
イールー２，５−ジフェニルテトラゾリウム　ブロマイ
ド（ＭＴＴ）、　　５０μＭ　ＮＡＤ）を加え、３７°
Ｃ，５分間暗所にて放置する。対照実験として上記基質
混合液中のグルコースを除いたものを用いた。反応の停
止は、１０％酢酸溶液を加えることにより行った。コロ
ニーの選択は、コロニーが青紫色に変化したものを選ん
だ。コロニーアッセイの結果、多数の陽性コロニーを得
、この中の１株からプラスミドＤＮＡを抽出し、これを
ｐＧＤＡ２と命名し、制限酵素による切断で予想される
構造（第２図）を確認した。

なお、本プラスミドをエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０５へ形質転換によ
り導入してＧＤＨ高発現株エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０５／ｐＧＤＡ
２を得た。

本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄
第１０２４７号として寄託されている。

１０）形質転換体によるＣＤＨの生産 形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉ）　ＪＭ１０５／ｐＧＤＡ２　　ＦＥＲＭ−
Ｐ　Ｎｏ、　１０２４７をアンビシリフ５０ｐｇ／ｍｌ
を含む２ＸＴＹプロス１００瀬に植菌し、３７°Ｃで１
３時間振盪培養後、ＩＰＴＧ（終濃度０．１ｍＭ）を添
加して２時間後に遠心分離により集菌し、ＮａＣｌ　２
Ｍを含む５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐ１１６．５）で洗
浄後、１０ｍ１の同緩衝液に懸濁し、超音波破砕機によ
り破砕後、遠心分離して上清液を得た。一方、対照とし
てバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇ
ａｔｅｒｉｕｍ）ＩＷＧ３株を２ＸＴＹブロス１００ｍ
ｆｆ１に植菌し、３７”Ｃ，２４時間振盪培養した。次
に上記と同様に集菌し、洗浄後超音波破砕処理した後、
遠心分離し、その上清を酵素液とした。

酵素活性の測定は、Ｄ−グルコース０．１．Ｍ、　　Ｎ
ＡＤ２０ｍＭを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）　
７５ｍＭに酵素液を加えて、光度計セル内にて３０°Ｃ
で反応させ、３４０ｎｍにおける吸光度の増大を調べる
ことにより行った。反応の１分間に１μｍｏｌｅのＮＡ
Ｄ　Ｈを生成する酵素活性を１単位と定め、比活性は酵
素液中の蛋白質１ｍｇ当りの単位数として示した。その
結果エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ
ｌｉ）　Ｊ旧０５／ｐＧＤＡ２　　ＦＩＥＲＭ−Ｐ　Ｎ
ｏ、　１０２４７の比活性はＧ、４ｕ／■であった。な
お、前記文献〔ヨーロピアン・ジャーナル・オプ・バイ
オケミストリー（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　　
１７４巻、　　４８５〜４９０ページ。

（１９８８）　）記載の組換え菌においては生産性が低
く、その比活性は０．３ｕ／■である。

夫籐炎又 バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａ
ｔｅｒｉｕｍ）ＩＷＧ３にかえてバチルス・メガテリウ
ム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）　ＩＡ旧
０３０を用い、実施例１の１〜９と同様に操作し、形質
転換体であるｃＤＨｋ発現株エシェリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｊ旧０５／ｐＧＤ＾
３を得た。

なお、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅ
ｇａｔｅｒｉｕｍ）　１４Ｍ１０３０より得られたＣＤ
ＨのＤＮＡ塩基配列は、第２図で示されたバチルス・メ
ガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ
）ＩＷＧ３由来ＧＤＨのＤＮＡアミノ酸配列と比較して
そのＮ末端より２２位のセリンがアラニンに、４３位の
アスパラギン酸がグルタミン酸に、７９位のアラニンが
セリンにそして９５位のロイシンがメチオニンにそれぞ
れ置き換わったにすぎないことがわかった。

形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ　ｉｃｈ
　１ａｃｏｌｉ）　ＪＭ１０５／ｐＧＤΔ３をアンピシ
リン５０１ｔｇ／ｍｌを含む２ＸＴＹブｏス１ｏｏｉに
植菌し、３７°Ｃで１３時間振盪培養後、ＩＰＴＧ（終
濃度０．１ｍＭ）を添加して、２時間後に遠心分離によ
り集菌し、ＮａＣｌ　２阿を含む５０ｍＭリン酸塩緩衝
液（ｐＨ６，５）で洗浄後、１０ｍ！の同緩衝液に懸濁
し、超音波破砕機により破砕後、遠心分離して上澄液を
得た。

本上澄液の比活性を実施例１の比活性測定法に準じて求
めたところ、６．Ｏｕ／ｍｇであった。

〔発明の効果〕

本発明は、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｍｅｇａ　ｔｅｒｉｕｍ）由来のＧＤＨをコードするＤ
ＮＡをＧ　Ｄ　Ｈ高発現用ヘクターに組み込んだ大腸菌
内で複製可能な組換えＤＮＡを含む形質転換体を培養す
ることによってＧ　Ｄ　Ｈを安価に大量に供給すること
を可能としたものである。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＧＤＡ２の制限酵素地図を示すも
のであり、第２図はバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＷＧ３由来ＣＤ　
ＨのＤＮＡアミノ酸配列を示すものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）次のアミノ酸配列で示されるバチルス・メガテリウ
   ム由来のグルコースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮ
   Ａを、大腸菌用ＤＮＡ導入ベクターに組み込んだ大腸菌
   内で複製可能な組換えＤＮＡ。 【アミノ酸配列があります】 （但しＡはＳｅｒ又はＡｌａ、ＸはＡｓｐ又はＧｌｕ、
   ＹはＡｌａ又はＳｅｒ、ＢはＬｅｕ又はＭｅｔである。 ）２）特許請求の範囲第１項記載の組換えＤＮＡで形質
   転換したエシエリヒア・コリ。 ３）特許請求の範囲第２項記載の形質転換体を栄養培地
   で培養し、グルコースデヒドロゲナーゼを培養物中に産
   生せしめ、該培養物中よりグルコースデヒドロゲナーゼ
   を取得することを特徴とするグルコースデヒドロゲナー
   ゼの製造法。