JPH07163341A - 安定化された改変タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】銀イオン（Ａｇ）、水銀イオン（Ｈｇ）等の金
属イオンまたは生体内における他の成分に対するタンパ
ク質の安定性を向上させる。 【構成】親タンパク質、例えばザルコシンオキシダーゼ
を構成するアミノ酸配列中のシステイン残基が他のアミ
ノ酸、例えばセリン、アラニン、アスパラギン酸または
アルギニンに置換された安定化された改変タンパク質お
よび該改変タンパク質を遺伝子工学的に部位特異的変異
させることにより製造する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、金属イオンまたは他の
生体成分に対する安定性が増強された改変タンパク質お
よびその製法に関する。

【０００２】

【従来の技術】酵素を主とした産業上利用されるタンパ
ク質の多くは、銀イオン（Ａｇ）、水銀イオン（Ｈｇ）
等の金属イオン、または目的のタンパク質を生産する生
体内ににおける他の成分に対して安定性が充分ではな
い。このことは、目的のタンパク質を生産する生体の増
殖過程において、該タンパク質が本来有する機能を損な
う原因となり得るため、解決が望まれていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は銀イオン（Ａ
ｇ）、水銀イオン（Ｈｇ）等の金属イオンまたは生体内
における他の成分に対するタンパク質の安定性を向上さ
せることを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成するため、鋭意研究を重ね、親タンパク質のアミノ
酸を改変することにより、本発明を完成した。

【０００５】すなわち本発明は親タンパク質を構成する
アミノ酸配列中のシステイン残基が他のアミノ酸に置換
されたことを特徴とする安定化された改変タンパク質で
ある。

【０００６】また本発明は親タンパク質の遺伝情報を有
するＤＮＡ中のシステイン残基をコードする塩基を他の
アミノ酸をコードする塩基で置換した改変タンパク質の
遺伝情報を有するＤＮＡを作成し、該ＤＮＡを組み込ん
だ組換えプラスミドを宿主細胞へ導入し、得られた形質
転換体を栄養培地にて培養し、改変タンパク質を採取す
ることを特徴とする安定化された改変タンパク質の製造
法である。

【０００７】本発明の親タンパク質としては、システイ
ンを有するタンパク質であって、ＤＮＡ配列またはアミ
ノ酸配列が既知のタンパク質であればよく、例えば酵
素、生理活性タンパク（ホルモン，成長因子）などが挙
げられる。酵素の例としては、ザルコシンオキシダー
ゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、コレステロールオキ
シダーゼなどが挙げられる。

【０００８】親タンパク質を改変する方法としては、通
常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すな
わち、親タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡ中のシス
テイン残基をコードする塩基を、他のアミノ酸残基をコ
ードする塩基に変換することにより、システイン残基が
他のアミノ酸に置換された改変タンパク質の遺伝情報を
有するＤＮＡが作成される。他のアミノ酸としては、セ
リン、アラニン、アスパラギン酸、アルギニンなどが挙
げられる。

【０００９】ザルコシンオキシダーゼ活性を有する親タ
ンパク質の一例は配列表・配列番号１に記載されたアミ
ノ酸配列を有し、該アミノ酸配列中の第２６５番目がシ
ステイン残基を有する。また該アミノ酸配列をコードす
る塩基配列の一例は、配列表・配列番号２に記載されて
いる。アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパ
ク質については、Journal of Bacteriology, vol.169
P.2591 (1987), ibid., vol.174 P.1397 (1992) などに
記載されている。またコレステロールオキシダーゼ活性
を有するタンパク質については、Journal of Bacteriol
ogy, vol.171 P.596 (1989),Journal of Molecular Bio
logy, vol.219 P.533 (1991)などに記載されている。

【００１０】ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法と
しては、例えば市販のキット（TransformerTM ；Clonet
ech 製，T7-GEN インビトロミュータゲネシス Kit；St
ratagene製）の使用、或いはＰＣＲ法の利用が挙げられ
る。

【００１１】具体的にはまず親タンパク質を産生する細
胞から染色体ＤＮＡを分離する。得られた染色体ＤＮＡ
を制限酵素、例えば Sau3AIで部分分解反応させ、断片
に分解した後、同じ制限酵素で切断したプラスミドとＤ
ＮＡリガーゼによりＤＮＡを連結する。連結したＤＮＡ
はエシェリヒア・コリーのコンピテントセルを用いて形
質転換する。得られたコロニーは培地で培養し、遺伝子
が挿入された組換えＤＮＡをスクリーニングする。次い
で挿入ＤＮＡ断片を種々の制限酵素により切断して他の
プラスミドにサブクローニングし、挿入ＤＮＡ断片を有
するプラスミドを得る。種々のサブクローンは常法に従
い、SEQUENASE VERSION2.0 7-deaza-dGTP kit（東洋紡
製）を用いて、配列決定を行う。

【００１２】次いでシステインをコードする塩基を他の
アミノ酸をコードする塩基に置換したオリゴヌクレオチ
ドおよびTransformerTM (Clonetech製) を用い、Transf
ormerTM のプロトコールに従い、システイン残基が他の
アミノ酸に置換された改変タンパク質の遺伝情報を有す
るＤＮＡを作成する。

【００１３】作成された改変タンパク質の遺伝情報を有
するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微
生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換
体となる。

【００１４】この際、プラスミドとしては、例えばエシ
ェリヒア・コリーを宿主微生物とする場合にはpBluescr
ipt,pUC18 などが使用できる。

【００１５】宿主微生物としては、例えばエシェリヒア
・コリー W3110, エシェリヒア・コリーC600, エシェリ
ヒア・コリーJM109 ，エシェリヒア・コリーDH5 αなど
が利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する
方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属
する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組
換えDNA の移入を行なう方法などを採用することがで
き、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。こ
うして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で
培養されることにより、多量の改変タンパク質を安定し
て生産し得る。

【００１６】形質転換体である宿主微生物の培養形態は
宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば
よく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には
通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源とし
ては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され
得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよ
く、例えばグルコ−ス，シュークロース，ラクトース，
マルトース，フラクトース，糖蜜，ピルビン酸などが使
用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であれ
ばよく、例えばペプトン，肉エキス，酵母エキス，カゼ
イン加水分解物，大豆粕アルカリ抽出物などが使用され
る。その他、リン酸塩，炭酸塩，硫酸塩，マグネシウ
ム，カルシウム，カリウム，鉄，マンガン，亜鉛などの
塩類，特定のアミノ酸，特定のビタミンなどが必要に応
じて使用される。

【００１７】培養温度は菌が発育し、改変タンパク質を
生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリ
ーの場合、好ましくは20〜42℃程度である。培養時間は
条件によって多少異なるが、改変タンパク質が最高収量
に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すれば
よく、通常は6 〜48時間程度である。培地pHは菌が発育
し改変タンパク質を生産する範囲で適宜変更し得るが、
特に好ましくはpH6.0〜9.0 程度である。

【００１８】培養物中の改変タンパク質を生産する菌体
を含む培養液をそのまま採取し利用することもできる
が、一般には常法に従って改変タンパク質が培養液中に
存在する場合は濾過，遠心分離などにより、改変タンパ
ク質含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用され
る。改変タンパク質が菌体内に存在する場合には、得ら
れた培養物を濾過または遠心分離などの手段により菌体
を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチー
ムなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてEDTA等
のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加して改変タン
パク質を可溶化し、水溶液として分離採取する。

【００１９】この様にして得られた改変タンパク質含有
溶液を例えば減圧濃縮，膜濃縮，更に硫酸アンモニウ
ム，硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機
溶媒、例えばメタノール，エタノール，アセトンなどに
よる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱
処理や等電点処理も有効な精製手段である。吸着剤或い
はゲル濾過剤などによるゲル濾過，吸着クロマトグラフ
ィー，イオン交換クロマトグラフィー，アフィニティー
クロマトグラフィーにより、精製された改変タンパク質
を得る事ができる。

【００２０】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。実施例中、ザルコシンオキシダーゼの活性測定は以
下のように行なった。すなわち、48mMトリス緩衝液(pH
8.0) 、95mMザルコシン、0.47mM４−アミノアンチピリ
ン、2.0mM フェノール、0.045%トリトンＸ−１００、4.
5U/ml ペルオキシダーゼ中で酵素を３７℃，１０分反応
させ、500nm における吸光度を測定する。酵素活性の１
単位は、この条件下で１分間当たり１マイクロモルの過
酸化水素を生成する酵素量とした。

【００２１】実施例１ 改変タンパク質の遺伝情報を有
するＤＮＡの作成 ザルコシンオキシダーゼの遺伝情報を有する組換え体プ
ラスミド、pSAOEP3 は以下の方法により作成した。アー
スロバクター・エスピーＴＥ１８２６ (微工研菌寄第 1
0637号) の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。同菌株
を100ml の２×ＹＴ培地（1.6%ポリペプトン，1%酵母エ
キス，0.5%塩化ナトリウム(pH7.2) で37℃一晩振盪培養
後、遠心(8000 rpm,10分) により集菌した。15mMクエン
酸ナトリウム,0.15M塩化ナトリウムを含んだ溶液で菌体
を洗浄した後、20% シュークロース, 1mMEDTA, 50mM ト
リス塩酸(pH 7.6)を含んだ溶液 5mlに懸濁させ、 0.5ml
のリゾチーム溶液(100mg/ml)を加えて37℃，30分間保温
した。次いで11mlの1%ラウロイルサルコシン酸, 0.1MED
TA(pH9.6 )を含む溶液を加えた。この懸濁液に臭化エチ
ジウム溶液を0.5%塩化セシウムを約100%加え、撹拌混合
し、55.000rpm, 20 時間の超遠心でＤＮＡを分取した。
分取したＤＮＡは、10mMトリス塩酸(pH8.0), 1mM EDTA
を含んだ溶液（ＴＥ）で透析し、精製ＤＮＡ標品とし
た。エシェリヒア・コリーJM109 のコンピテントセルは
Hanahan の方法により作成し、ライブラリー作成の宿主
として用いた。

【００２２】染色体ＤＮＡ 1μg を制限酵素 Sau3AI
（東洋紡製）で部分分解反応させ、2kbp以上の断片に分
解した後、Sal Ｉ（東洋紡製）で切断したpUC18 0.5 μ
g とM.G.LoftusらのBACKFILLING 法（Biotechniques V
ol12,No.2(1992))に従い、T4-ＤＮＡリガーゼ（東洋紡
製）1 ユニットで16℃，12時間反応させ、ＤＮＡを連結
した。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリーJM109 の
コンピテントセルを用いて形質転換した。使用したＤＮ
Ａ1 μg 当たり約 1×106 個の形質転換体のコロニーが
得られた。得られたコロニーは50μg/mlアンピシリン，
0.5%ザルコシン，0.005%パラロースアニリン，及び0.02
5%ソディウムハイドロジェンサルファイト入りＬ培地
（1%ポリペプトン，0.5%酵母エキス，0.5%塩化ナトリウ
ム）で37℃，18時間培養し、赤色コロニーを指標にザル
コシンオキシダーゼ遺伝子の入った組換えＤＮＡをスク
リーニングした。

【００２３】その結果、約1.000 個のコロニーのうち１
株の割合で赤色を示すコロニーを得た。この中の１株が
保有するプラスミドには約8.7kbpの挿入ＤＮＡ断片が存
在しており、このプラスミドをpSAO1 とした。次いでpS
AO1 より挿入ＤＮＡ断片を種々の制限酵素により切断し
てpUC18 にサブクローニングし、約1.7kbpの挿入ＤＮＡ
断片を有するpSAOEP3 を得た。pSAOEP3 の約1.7kbpの挿
入ＤＮＡ断片について種々の制限酵素で切断してサブク
ローンを調製した。種々のサブクローンは常法に従い、
SEQUENASE VERSION2.07-deaza-dGTP kit （東洋紡製）
を用いて、配列の決定を行った。決定したアミノ酸配列
を配列表の配列番号１に示した（Journal of Fermentat
ion and Bioengineering Vol.75 No.4 pp239-244 (199
3) を参照）。

【００２４】次いで配列表の配列番号３、４、５、６の
オリゴヌクレオチドおよびTransformerTM (Clonetech
製) を用い、TransformerTM のプロトコールに従い、配
列表・配列番号１に記載の第２６５番目のシステイン残
基がセリン、アラニン、アスパラギン酸、アルギニンに
それぞれ置換された改変ザルコシンオキシダーゼの遺伝
情報を有するＤＮＡを作成した。改変タンパク質の遺伝
情報を有するＤＮＡを保持する組換え体プラスミドを、
それぞれpSAOEP3-C265S (Cys-Ser), pSAOEP3-C265A(Cys
-Ala), pSAOEP3-C265D(Cys-Asp), pSAOEP3-C265R(Cys-A
rg) と命名した（図１参照）。

【００２５】実施例２ 形質転換体の作成 pSAOEP3-C265S, pSAOEP3-C265A, pSAOEP3-C265D, pS
AOEP3-C265R でエシェリヒア・コリーJM109 のコンピテ
ントセルを氷中３０分間接触後、４２℃で４５秒間ヒー
トショックを行うことにより形質転換し、それぞれ形質
転換体、JM109(pSAOEP3-C265S)、JM109(pSAOEP3-C265
A)、JM109(pSAOEP3-C265D)、JM109(pSAOEP3-C265R)を得
た。

【００２６】 実施例３ 形質転換体の培養と改変タンパク質の生成 ２×ＹＴ培地（1.6%ポリペプトン，1%酵母エキス，0.5%
塩化ナトリウム(pH7.2))50mlを500ml フラスコに分注
し、 121℃，15分間オートクレーブを行い放冷後、別途
無菌濾過した 50mg/mlアンピシリン（ナカライテスク
製）を0.1%添加した。この培地に上記と同一組成の培地
で予め37℃で18時間振盪培養した形質転換体の培養液1m
l をそれぞれ接種し、37℃で通気撹拌培養した。培養経
過を表１に示した。

【００２７】

【表１】

【００２８】親タンパク質を生産する形質転換体（JM10
9(pSAOEP3)）は、培養開始より12時間後でザルコシンオ
キシダーゼ活性がピークとなり、以降、時間経過と共に
活性は減少していった。これに対し改変タンパク質を生
産する形質転換体は、培養開始より60時間後まで活性の
減少はほとんど見られなかった。すなわち、改変タンパ
ク質の生体成分に対する安定性の増強とその効果が明ら
かとなった。

【００２９】また、形質転換体(JM109(pSAOEP3-C265S))
を培養液より12,000rpm,５分間の遠心にて分離し、同量
の50mM燐酸カリウムバッファー(pH8.0) に懸濁後、90秒
間の超音波破砕を行った。この破砕液の安定性評価結果
を図２に示した。親タンパク質は破砕液中で不安定であ
ったが、改変タンパク質は４℃或いは25℃で３日間保存
後もほぼ安定であった。すなわち、改変タンパク質の生
体成分に対する安定性増強が効果的であることが分かっ
た。

【００３０】実施例４ 改変タンパク質の精製と金属イ
オンに対する安定性評価 それぞれの改変タンパク質を、菌体破砕，除核酸，塩析
後、イオン交換カラムクロマトグラフィーを実施するこ
とにより(Journal of Fermentation andBioengineering
Vol.75 No.4 pp239-244 (1993)参照) 、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にて単一のバンドを形成す
るまで精製した。

【００３１】精製された改変タンパク質と親タンパク質
の酵素特性の評価結果を表２に示した。

【００３２】

【表２】

【００３３】改変タンパク質の酵素特性は、親タンパク
質と実質的に変わらず、アミノ酸の置き換えに関し何等
問題ないことが分かった。次にそれぞれの改変タンパク
質及び親タンパク質をザルコシンオキシダーゼ活性 10U
/ml となるように50mM燐酸カリウムバッファー(pH7.5)
に溶解後、10μＭ濃度となるように硝酸銀或いは塩化水
銀を添加し、37℃，20〜60分後の安定性を調べた。評価
結果を表３に示した。

【００３４】

【表３】

【００３５】改変タンパク質は親タンパク質と比べ硝酸
銀や塩化水銀に対する安定性が大幅に向上した。すなわ
ち改変タンパク質の金属イオンに対する安定性の増強が
明らかとなった。

【００３６】

【発明の効果】本発明において遺伝子工学的手法を用い
て親タンパク質を構成するアミノ酸配列中のシステイン
残基を任意のアミノ酸に置換することにより、金属イオ
ンまたは他の生体成分に対する安定性が増強された改変
タンパク質が得られる。本発明の改変タンパク質は、親
タンパク質に比べ、培養時、精製時の安定性が著しく向
上し、タンパク質の工業的生産に於いて極めて有利なも
のとなる。

【００３７】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：３８９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源 生物名：アースロバクター・エスピー(Arthrobacter S
P.) 株名：ＴＥ１８２６ 配列 Met Ser Ile Lys Lys Asp Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser 1 5 10 15 Met Gly Met Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Ser Lys Gln Gly Val Lys Thr 20 25 30 Leu Leu Val Asp Ser Phe His Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His 35 40 45 Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr 50 55 60 Val Pro Phe Ala Leu Arg Ala Gln Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys 65 70 75 80 Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu Val Phe Gly 85 90 95 Pro Lys Gly Glu Ala Pro Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala Ala Lys 100 105 110 Glu His Ser Leu Asp Val Asp Leu Leu Glu Gly Ser Glu Ile Asn Lys 115 120 125 Arg Trp Pro Gly Val Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu 130 135 140 Lys Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg 145 150 155 160 Glu Leu Ala Glu Ala Asn Gly Ala Lys Val Leu Thr Tyr Thr Pro Val 165 170 175 Glu Asp Phe Glu Ile Ala Glu Asp Phe Val Lys Ile Gln Thr Ala Tyr 180 185 190 Gly Ser Phe Thr Ala Ser Lys Leu Ile Val Ser Met Gly Ala Trp Asn 195 200 205 Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Ile Glu Ile Pro Leu Gln Pro Tyr 210 215 220 Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Lys Lys Tyr Ser Asn 225 230 235 240 Thr His Gly Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Pro Thr Gly Ile Tyr 245 250 255 Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His 260 265 270 Thr Tyr Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly 275 280 285 Ile Tyr Pro Glu Asp Glu Gly Asn Ile Arg Lys Phe Leu Glu Thr Tyr 290 295 300 Met Pro Gly Ala Thr Gly Glu Leu Lys Ser Gly Ala Val Cys Met Tyr 305 310 315 320 Thr Lys Thr Pro Asp Glu His Phe Val Ile Asp Leu His Pro Gln Phe 325 330 335 Ser Asn Val Ala Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly His Gly Phe Lys Phe 340 345 350 Ser Ser Val Val Gly Glu Thr Leu Ser Gln Leu Ala Val Thr Gly Lys 355 360 365 Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg Pro Ala Leu Lys 370 375 380 Gln Lys Glu Thr Ile 385

【００３８】配列番号：２ 配列の長さ：１６７０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 起源： 生物名：アースロバクター・エスピー(Arthrobacter s
p.) 株名：ＴＥ１８２６ 配列の特徴 特徴を表す記号：−３５ｓｉｇｎａｌ 存在位置：１１４．．１１９ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：−１０ｓｉｇｎａｌ 存在位置：２３７．．２４２ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２９８．．１４６４ 特徴を決定した方法：Ｐ 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：３０１．．１４６４ 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：ザルコシンオキダーゼ活性を有する蛋白質を
コードする遺伝子。 配列 CTGCAGTTCT TCCTCCAGCT TTTGAATCCT CACGGTAACA TAAGATTGAA CATAATTTAA 60 ACTTTTGGCC GCCTTTGAAA CGCTGCCATA TTCAACTACC TTTTGAAAAA TCTGCAAATC 120 TTTAATTTCC AAGTATAATC ACTCCCAAAA CGTTCTTTTA CTACTAGCAC TAGAATATTT 180 CTAAAAGTGA TAGCTGCTAT CACTTTTAAG CATTTTACAT GATGGCCAAT AGGCCGTATG 240 ATGTAAATAG ATAATTAAGA AAATTCAAAT TACCTGTTTG AAAAAGGAGA GGAAACA 297 ATG AGT ATT AAA AAA GAT TAT GAT GTA ATT GTG GTT GGC GCT GGT TCC 345 Met Ser Ile Lys Lys Asp Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser 1 5 10 15 ATG GGA ATG GCA GCT GGG TAC TAT CTG TCT AAA CAA GGT GTT AAA ACA 393 Met Gly Met Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Ser Lys Gln Gly Val Lys Thr 20 25 30 CTA TTG GTA GAT TCA TTT CAT CCT CCC CAT ACA AAT GGC AGC CAT CAT 441 Leu Leu Val Asp Ser Phe His Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His 35 40 45 GGC GAT ACA CGG ATC ATT CGT CAC GCA TAT GGC GAA GGA AGA GAG TAT 489 Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr 50 55 60 GTA CCG TTT GCC TTG AGA GCA CAA GAG TTA TGG TAT GAA TTA GAA AAG 537 Val Pro Phe Ala Leu Arg Ala Gln Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys 65 70 75 80 GAG ACT CAT CAT AAA ATA TTT ACA AAA ACA GGT GTA CTC GTT TTT GGT 585 Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu Val Phe Gly 85 90 95 CCT AAA GGA GAA GCT CCT TTC GTT GCC GAA ACA ATG GAA GCC GCA AAG 633 Pro Lys Gly Glu Ala Pro Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala Ala Lys 100 105 110 GAA CAT TCA TTA GAT GTT GAT TTA CTA GAA GGA AGT GAA ATA AAT AAG 681 Glu His Ser Leu Asp Val Asp Leu Leu Glu Gly Ser Glu Ile Asn Lys 115 120 125 CGT TGG CCA GGT GTA ACG GTT CCT GAG AAT TAT AAT GCT ATT TTT GAA 729 Arg Trp Pro Gly Val Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu 130 135 140 AAA AAT TCT GGT GTC TTA TTT AGT GAA AAT TGT ATT CGC GCT TAC CGT 777 Lys Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg 145 150 155 160 GAA TTG GCG GAA GCA AAT GGT GCG AAA GTT CTA ACG TAC ACA CCC GTT 825 Glu Leu Ala Glu Ala Asn Gly Ala Lys Val Leu Thr Tyr Thr Pro Val 165 170 175 GAA GAT TTC GAG ATT GCC GAG GAC TTC GTC AAA ATC CAA ACC GCC TAT 873 Glu Asp Phe Glu Ile Ala Glu Asp Phe Val Lys Ile Gln Thr Ala Tyr 180 185 190 GGC TCC TTT ACA GCC AGT AAA TTA ATT GTT AGC ATG GGC GCT TGG AAT 921 Gly Ser Phe Thr Ala Ser Lys Leu Ile Val Ser Met Gly Ala Trp Asn 195 200 205 AGC AAA CTG CTA TCA AAA TTA AAT ATT GAA ATC CCA TTG CAG CCA TAC 969 Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Ile Glu Ile Pro Leu Gln Pro Tyr 210 215 220 CGT CAA GTT GTC GGA TTC TTC GAA TGT GAT GAA AAA AAA TAT AGC AAT 1017 Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Lys Lys Tyr Ser Asn 225 230 235 240 ACA CAT GGT TAT CCG GCG TTC ATG GTC GAA GTC CCA ACT GGC ATC TAT 1065 Thr His Gly Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Pro Thr Gly Ile Tyr 245 250 255 TAC GGA TTT CCA AGC TTC GGC GGC TGC GGC TTG AAA ATA GGC TAT CAT 1113 Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His 260 265 270 ACG TAT GGT CAA AAA ATC GAT CCA GAT ACG ATT AAT CGT GAA TTT GGT 1161 Thr Tyr Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly 275 280 285 ATT TAC CCG GAG GAT GAA GGG AAT ATT CGC AAA TTC CTG GAA ACA TAT 1209 Ile Tyr Pro Glu Asp Glu Gly Asn Ile Arg Lys Phe Leu Glu Thr Tyr 290 295 300 ATG CCG GGA GCA ACC GGC GAA TTA AAA AGT GGG GCA GTT TGC ATG TAC 1257 Met Pro Gly Ala Thr Gly Glu Leu Lys Ser Gly Ala Val Cys Met Tyr 305 310 315 320 ACA AAA ACA CCT GAT GAG CAT TTC GTG ATT GAT TTA CAT CCT CAA TTC 1305 Thr Lys Thr Pro Asp Glu His Phe Val Ile Asp Leu His Pro Gln Phe 325 330 335 TCG AAT GTC GCG ATT GCA GCC GGA TTC TCC GGA CAT GGG TTT AAA TTC 1353 Ser Asn Val Ala Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly His Gly Phe Lys Phe 340 345 350 TCA AGC GTA GTT GGT GAA ACA TTA AGT CAA TTA GCT GTA ACC GGT AAA 1401 Ser Ser Val Val Gly Glu Thr Leu Ser Gln Leu Ala Val Thr Gly Lys 355 360 365 ACA GAA CAC GAT ATT TCC ATC TTT TCA ATC AAT CGC CCT GCT TTA AAA 1449 Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg Pro Ala Leu Lys 370 375 380 CAA AAA GAA ACG ATT TAAAAACGCA AGCAAGCCGT ACATAAATTT CGATAGATAT 1504 Gln Lys Glu Thr Ile 385 TATGTACGGC TTACTTTATT TACAACTTAA AAATCTGCAT ATCAATCCTG TCCCTCTACT 1564 GATTGAAGCA CAAACTGTAC TTGAACGGCT TTTTTATTAA CTTGTAACGA TAACAGGAAC 1624 GCTAAAATAA GAAGACCGCT GCATAAGAAT AGTACGGGAG GAATTC 1670

【００３９】配列番号：３ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CCAAGCTTCGGCGGCTCCGGCTTGAAAATAGGCTAT 36

【００４０】配列番号：４ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CCAAGCTTCGGCGGCGCCGGCTTGAAAATAGGCTAT 36

【００４１】配列番号：５ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CCAAGCTTCGGCGGCGACGGCTTGAAAATAGGCTAT 36

【００４２】配列番号：６ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CCAAGCTTCGGCGGCCGCGGCTTGAAAATAGGCTAT 36

【図面の簡単な説明】

【図１】改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡを保
持する組換え体プラスミド〔pSAOEP3-C265S (Cys-Ser),
pSAOEP3-C265A(Cys-Ala),pSAOEP3-C265D(Cys-Asp),
pSAOEP3-C265R(Cys-Arg)〕の構造を示す。

【図２】形質転換体破砕液の安定性評価結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 1/107 8318−4Ｈ (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:06） Ｃ１２Ｒ 1:06）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 親タンパク質を構成するアミノ酸配列中
   のシステイン残基が他のアミノ酸に置換されたことを特
   徴とする安定化された改変タンパク質。
2. 【請求項２】 他のアミノ酸がセリン、アラニン、アス
   パラギン酸またはアルギニンであることを特徴とする請
   求項１記載の安定化された改変タンパク質。
3. 【請求項３】 親タンパク質がザルコシンオキシダーゼ
   活性を有するタンパク質であることを特徴とする請求項
   １記載の安定化された改変タンパク質。
4. 【請求項４】 ザルコシンオキシダーゼ活性を有するタ
   ンパク質が配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配
   列を有し、該アミノ酸配列中の第２６５番目のシステイ
   ン残基が他のアミノ酸に置換されたことを特徴とする請
   求項１記載の安定化された改変タンパク質。
5. 【請求項５】 親タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡ
   中のシステイン残基をコードする塩基を他のアミノ酸を
   コードする塩基で置換した改変タンパク質の遺伝情報を
   有するＤＮＡを作成し、該ＤＮＡを組み込んだ組換えプ
   ラスミドを宿主細胞へ導入し、得られた形質転換体を栄
   養培地にて培養し、改変タンパク質を採取することを特
   徴とする安定化された改変タンパク質の製造法。
6. 【請求項６】 他のアミノ酸がセリン、アラニン、アス
   パラギン酸またはアルギニンであることを特徴とする請
   求項５記載の安定化された改変タンパク質の製造法。
7. 【請求項７】 親タンパク質がザルコシンオキシダーゼ
   活性を有するタンパク質であり、配列表・配列番号１に
   記載されるアミノ酸配列を含有することを特徴とする請
   求項５記載の安定化された改変タンパク質の製造法。
8. 【請求項８】 ザルコシンオキシダーゼ活性を有するタ
   ンパク質が配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配
   列を有し、該アミノ酸配列中の第２６５番目のシステイ
   ン残基をコードする塩基が他のアミノ酸をコードする塩
   基に置換されたことを特徴とする請求項７記載の安定化
   された改変タンパク質の製造法。
9. 【請求項９】 ザルコシンオキシダーゼ活性を有する親
   タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡが配列表・配列番
   号２に記載されたＤＮＡを含有することを特徴とする請
   求項７記載の安定化された改変タンパク質の製造法。