JPH0638769A - プロリンイミノペプチダーゼの遺伝情報を有するｄｎａ断片およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 プロリンイミノペプチダーゼを効率的に製造
する方法を提供する。 【構成】 プロリンイミノペプチダーゼの遺伝情報を有
するＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組み換えベクター、宿
主細胞を該組み換えベクターで形質転換した形質転換体
および該形質転換体を培養して、プロリンイミノペプチ
ダーゼを産生させ、次いで該プロリンイミノペプチダー
ゼを採取することを特徴とするプロリンイミノペプチダ
ーゼの製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はプロリンイミノペプチダ
ーゼ（以下ＰＩＰと記載）の遺伝情報を有するＤＮＡ，
該ＤＮＡを含有する組み換えベクター，該組み換えベク
ターを用いて得られる形質転換体および該形質転換体に
より該ＤＮＡの遺伝情報を発現せしめて得られるＰＩＰ
の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＰＩＰ（Ｐｒｏｌｉｎｅ ｉｍｉｎｏｐ
ｅｐｔｉｄａｓｅ，ＥＣ．３．４．１１．５）は、Ｌ−
プロリンをアミノ末端にもつペプチド，タンパク質から
プロリンを遊離させる酵素であり、種々の動物組織（豚
腎，牛腎）及び植物（アンズ種子，シイタケ子実体），
微生物（大腸菌，枯草菌）にも広く存在することが知ら
れている（蛋白質核酸酵素，２９，３１７〜３１９（１
９８４））。しかしながら、これらの従来より知られて
いる動植物及び微生物は、ＰＩＰの生産能が極めて低い
ために、経済的なＰＩＰの製造法としては不適であっ
た。また、特開平２−１１３８８７にはエシェリヒア属
のＰＩＰをコードしている遺伝子について記載されてい
るが、ＤＮＡ，アミノ酸配列に関しては明らかにされて
いない。

【０００３】ＰＩＰの用途としては、本酵素の基質特異
性がＰｒｏ−Ｘ−…のＰｒｏの後を特異的に切断しＸ−
…なるペプチドを遊離するところから、リコンビナント
法で先導蛋白質と目的蛋白質を連結した融合蛋白質を蓄
積せしめる場合に、先導蛋白質と目的蛋白質との間にＰ
ｒｏを配置した融合蛋白質として蓄積せしめ、先導蛋白
質部分をアミノペプチダーゼ−Ｍなどおよびアミノペプ
チダーゼ−Ｐにより切断し、Ｎ末端にＰｒｏが付加した
目的蛋白質を収得し、しかる後にＰＩＰを作用させるこ
とによりＮ末端の揃った目的蛋白質を取得することなど
に用いられる。

【０００４】よってＰＩＰはタンパク質の配列決定に非
常に有用な酵素である。従来ＰＩＰは、例えばバチルス
コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａ
ｎｓ）より分離・精製されている（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ−ｉｓｔｒｙ，７９，１４
７７〜１４８５（１９８５））。

【０００５】

【発明が解決しようとする問題】従来より報告されてい
るＰＩＰ生産菌は、ＰＩＰの生産性が低く製造コスト的
に高価になるという難点があるだけでなく、共存する他
種酵素等の除去が非常に困難で、純度の高い良質なＰＩ
Ｐを得るため、精製コストが非常に高いものとなり、研
究用試薬として安易に広く用いるには必ずしも満足のい
くものではなかった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、該ＰＩＰ
の生産性向上を計るべく鋭意検討を試みたところ、該Ｐ
ＩＰ遺伝子の採取ならびに一次構造解析に成功すると共
に遺伝子工学的手法を応用することによって、以下に述
べる如く、高生産性である製造法を確立した。

【０００７】すなわち、本発明の要旨はＰＩＰを含むポ
リペプチドのアミノ酸をコードしているＤＮＡ，該ＤＮ
Ａを含有する組み換えベクター，宿主細胞を該組み換え
ベクターで形質転換した形質転換体及び該形質転換体を
培養してＰＩＰを産生させ、次いで該ＰＩＰを採取する
ことを特徴とするＰＩＰの製造法に存する。

【０００８】本発明の上記ＤＮＡとしては、例えば配列
表の配列番号１に記載された塩基配列を有するＤＮＡを
挙げることができる。なお、本発明のＤＮＡは遺伝子組
み換え技術により、基本となるＤＮＡの特定部位に、該
ＤＮＡがコードするものの基本的な特性を変化させるこ
となく、あるいはその特性を改善するように人為的に変
異を起こさせたものも含むものである。

【０００９】ＰＩＰ遺伝子の供与体である微生物として
は、ＰＩＰ産生能を有する微生物であれば良く、例えば
バチルス コアギュランスが好適であり、特にバチルス
コアギュランス ＥＫ−１９（微工研菌寄第１２７５
８）が好適である。

【００１０】また、遺伝子組み換え技術を駆使してＰＩ
Ｐ産生能を付与せしめた形質転換微生物もＰＩＰ遺伝子
の供与体として利用してもよい。

【００１１】本発明のＤＮＡは、例えばＰＩＰを生産す
るＰＩＰ遺伝子の供与体である微生物より、該微生物の
ＤＮＡを分離・精製した後、超音波，制限酵素などを用
いてＤＮＡを切断したものとリニヤーな発現ベクターと
を両ＤＮＡの平滑または接着末端部においてＤＮＡリガ
ーゼなどにより結合閉環させ、こうして得られた組み換
えＤＮＡベクターを複製可能な宿主微生物に移入した
後、ベクターのマーカーとＰＩＰの活性とを指標とし
て、スクリーニングして取得した該組み換えＤＮＡベク
ターを保持する微生物を培養し、該培養菌体から該組み
換えＤＮＡベクターを分離・精製し、次いで該組み換え
ＤＮＡベクターからＰＩＰ遺伝子であるＤＮＡを採取す
ればよい。

【００１２】以下に上記採取方法をより詳細に説明す
る。遺伝子の供与体である微生物に由来するＤＮＡは次
の如くにして採取される。すなわち、供与微生物である
上述した細菌のいずれかを例えば液体培地で約１〜３日
間通気撹拌培養し、得られる培養物を遠心分離して集菌
し、次いでこれを溶菌させることによってＰＩＰ遺伝子
の含有溶菌物を調製することができる。溶菌方法として
は例えばリゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶
解酵素による処理が施され、必要によりプロテアーゼな
どの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性
剤が併用され、さらに細胞壁の物理的破壊法である凍結
融解やフレンチプレス処理を上述の溶菌法との組み合せ
で行ってもよい。

【００１３】この様にして得られた溶菌物からＤＮＡを
分離・精製するには常法に従って例えばフェノール抽出
による除蛋白処理，プロテアーゼ処理，リボヌクレアー
ゼ処理，アルコール沈澱遠心分離などの方法を適宜組み
合わせることにより行うことができる。

【００１４】分離・精製された微生物ＤＮＡを切断する
方法は、例えば超音波処理，制限酵素処理などにより行
うことができるが、得られるＤＮＡ断片とベクターとの
結合を容易ならしめるため制限酵素とりわけ特定ヌクレ
オチド配列に作用する例えばＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄII1
，ＢａｍＨＩなどの 型制限酵素が適している。

【００１５】ベクターとしては、宿主微生物で自律的に
増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組み換
え用として構築されたものが適している。

【００１６】ファージとしては、例えばエシェリヒア
コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）を宿主微生
物とする場合には、λｇｔ・１０，λｇｔ・１１などが
使用できる。

【００１７】また、プラスミドとしては、例えばエシェ
リヒア コリーを宿主微生物とする場合にはｐＢＲ３２
２，ｐＢＲ３２５，ｐＡＣＹＣＩ８４，ｐＵＣ１２，ｐ
ＵＣ１３，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９などが、バチルス
サブチリス（Ｂａｃｉｌｌ−ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
を宿主微生物とする場合にはｐＵＢ１１０，ｐＣ１９４
などが使用でき、さらにエシェリヒア コリーおよびバ
チルス サブチリスなどのグラム陰陽性にまたがる二種
以上の宿主微生物で自律的に増殖可能なシャトルベクタ
ーを利用することもできる。このようなベクターを、先
に述べたＰＩＰ遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断
に使用した制限酵素と同じ制限酵素で切断して、ベクタ
ー断片を得ることが望ましい。

【００１８】微生物ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合
させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であ
ればよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベクタ
ー断片の接着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡ
リガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクター断片
との組み換えＤＮＡを作成する。必要ならば、アニーリ
ングの後、宿主微生物に移入して、生体内のＤＮＡリガ
ーゼを利用し、組み換えＤＮＡを作成することもでき
る。

【００１９】宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安
定かつ自律的に増殖可能で、且つ外来性ＤＮＡの形質が
発現のできるものであればよく、例えば宿主微生物がエ
シェリヒア コリーＤＨＩ，エシェリヒア コリーＨＢ
１０１，エシェリヒア コリーＷ３１１０，エシェリヒ
ア コリーＣ６００，エシェリヒア コリーＪＭ８３な
どが利用できる。

【００２０】宿主微生物に組み換えＤＮＡを移入する方
法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属す
る微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み
換えＤＮＡの移入を行い、またバチルス属に属する微生
物の場合には、コンピテントセル法またはプロトプラス
ト法などを採用することができ、さらにマイクロインジ
ェクション法を用いても良い。こうして得られた形質転
換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより
多量のＰＩＰを安定して産生し得ることを見出した。

【００２１】宿主微生物への目的組み換えＤＮＡ移入の
有無についての選択は、目的組み換えＤＮＡを保持する
ベクターの薬剤耐性マーカーとＰＩＰとを同時に発現し
得る微生物を検索すればよく、例えば薬剤耐性マーカー
に基づく選択培地で生育し、かつＰＩＰを生成する微生
物を選択すればよい。

【００２２】好ましくは、選択培地に生育したコロニー
について基質としてＬ−プロリン−ｐ−ニトロアニリド
（Ｌ−Ｐｒｏｌｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄ
ｅ）を用い、ＰＩＰ活性を指標に酵素遺伝子の入った組
み換えＤＮＡをスクリーニングする。

【００２３】上述の方法により得られたＰＩＰ遺伝子の
塩基配列はサイエンス（Ｓｃｉｅ−ｎｃｅ），２１４，
１２０５〜１２１０（１９８１）に記載されているジデ
オキシ法で解読し、またＰＩＰのアミノ酸配列は塩基配
列より推定した。

【００２４】この様にして一度選択されたＰＩＰ遺伝子
を保有する組み換えＤＮＡは、形質転換微生物から取り
出され、他の宿主微生物に移入することも容易に実施で
きる。また、ＰＩＰ遺伝子を保持する組み換えＤＮＡか
ら制限酵素などにより切断して、ＰＩＰ遺伝子であるＤ
ＮＡを切り出し、これを同様な方法により切断して得ら
れるベクター断片とを結合させて、宿主微生物に移入す
ることも容易に実施できる。

【００２５】形質転換体である宿主微生物の培養形態は
宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば
良く、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には
通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源とし
ては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用さ
れ得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であれば
よく、例えばグルコ−ス，シュクロース，ラクトース，
マルトース，フラクトース，糖蜜，ピルビン酸などが使
用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であれ
ばよく、例えばペプトン，肉エキス，酵母エキス，カゼ
イン加水分解物，大豆粕アルカリ抽出物などが使用され
る。その他、リン酸塩，炭酸塩，硫酸塩，マグネシウ
ム，カルシウム，カリウム，鉄，マンガン，亜鉛などの
塩類，特定のアミノ酸，特定のビタミンなどが必要に応
じて使用される。 培養温度は菌が発育し、ＰＩＰを生
産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア コリー
の場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間
は条件によって多少異なるが、ＰＩＰが最高収量に達す
る時期を見計らって適当な時期に培養を終了すれば良
く、通常は１２〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が
発育し、ＰＩＰを生産する範囲で適宜変更し得るが、特
に好ましくはｐＨ６．０〜８．０程度である。

【００２６】培養物中のＰＩＰは菌体を含む培養液をそ
のまま採取し利用することもできるが、一般には常法に
従ってＰＩＰが培養液中に存在する場合には濾過，遠心
分離などにより、ＰＩＰ含有溶液と微生物菌体とを分離
した後に利用される。ＰＩＰが菌体内に存在する場合に
は、得られた培養物を濾過または遠心分離などの手段に
より、菌体を採取し次いでこの菌体を機械的方法または
リゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じ
てＥＤＴＡ等のキレート剤および／または界面活性剤を
添加してＰＩＰを可溶化し、水溶液として分離採取す
る。

【００２７】この様にして得られたＰＩＰ含有溶液を、
例えば減圧濃縮，膜濃縮，更に硫酸アンモニウム，硫酸
ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、
例えばメタノール，エタノール，アセトンなどによる分
別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱処理や
等電点処理も有効な精製手段である。吸着剤あるいはゲ
ル濾過剤などによるゲル濾過，吸着クロマトグラフィ
ー，イオン交換クロマトグラフィー，アフィニティーク
ロマトグラフィーにより、精製されたＰＩＰを得る。以
下、実施例で本発明を詳細に説明する。

【００２８】

【実施例】

実施例１〔染色体ＤＮＡの分離〕 バチルス コアギュランス ＥＫ−１９の染色体ＤＮＡ
を次の方法で分離した。同菌株を１５０ｍｌの普通ブイ
ヨン培地で３７℃一晩振盪培養後、遠心（８０００ｒｐ
ｍ，１０分）により集菌した。

【００２９】１０％シュクロース５０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ溶液５ｍ
ｌに懸濁させ、１ｍｌのリゾチーム溶液（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）を加えて３７℃，１５分間保温し、次いで１ｍｌの
１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液を加え
た。この懸濁液に等量のクロロホルム・フェノール溶液
（１：１）を加え、撹拌混合し、１０，０００ｒｐｍ，
３分間の遠心で水層と溶媒層に分け、水層を合取した。
この水層に２倍量のエタノールを静かに重層し、ガラス
棒でゆっくり撹拌しながらＤＮＡをガラス棒にまきつか
せて分離した。これを１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．
０）、１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ溶液（以下ＴＥと記
載）で溶解した。これを等量のクロロホルム・フェノー
ル溶液で処理後、遠心により水層を分取し、２倍量のエ
タノールを加えて、上記の方法でもう一度ＤＮＡを分離
し２ｍｌのＴＥで溶解した。

【００３０】エシェリヒア コリーＤＨ ，エシェリヒ
ア コリーＪＭ８３のコンピテントセルはＨａｎａｈａ
ｎの方法により作成し、ライブラリー作成の宿主として
用いた。

【００３１】実施例２〔ＰＩＰをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を有する組み換えベ
クターの調製〕 実施例１で得たＤＮＡ１μｇを制限酵素ＨｉｎｄIII
（東洋紡製）１０ユニットで３７℃，１時間反応させ完
全に分解した後、同様にしてＨｉｎｄIII で切断したｐ
ＢＲ３２２ ０．５μｇにＴ4 −ＤＮＡリガーゼ（東洋
紡製）１ユニットで１６℃，１２時間反応させＤＮＡを
連結した。連結したＤＮＡは、エシェリヒア コリーＤ
ＨＩのコンピテントセルを用いて形質転換した。使用し
たＤＮＡ１μｇ当り約１×１０6 個の形質転換体のコロ
ニーが得られた。得られたコロニーは５０μｇ／ｍｌア
ンピシリン入りＮ培地（１％ポリペプトン，１％肉エキ
ス，０．５％塩化ナトリウム）で３７℃で１８時間培養
し、菌体破砕液を用いて以下の方法によりＰＩＰ活性を
測定した。

【００３２】（試薬） Ａ．０．１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０） Ｂ．１ｍＭ Ｌ−プロリン−ｐ−ニトロアニリド
溶液 Ｃ．１Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）

【００３３】（方法）Ａ液２．０ｍｌにＢ液０．５ｍｌ
を加え、３０℃で約５分予備加温する。酵素溶液０．５
ｍｌを加え、３０℃で正確に１０分間反応させる。その
後Ｃ液１．０ｍｌを加え、反応を止める。 この液につ
き４１０ｎｍにおける吸光度を測定する。酵素活性の１
単位は、この条件下で１分間当り１μｍｏｌのｐ−ニト
ロアニリンを生成する酵素量とした。

【００３４】上記方法により約３，０００個のコロニー
のＰＩＰ活性を測定したところ、１個のＰＩＰ活性を有
するコロニーを得た。この保有するプラスミドには約１
２ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片が存在しており、このプラス
ミドをｐ１とした。 次いでｐ１より挿入ＤＮＡ断片を
種々の制限酵素により切断またはディレーションを行っ
た後、ｐＵＣ１９にサブクローニングし、エシェリヒア
コリーＪＭ８３を形質転換した。種々の組み換えプラ
スミドの挿入ＤＮＡ及びエシェリヒア コリーＤＨ
（ｐ１）のＰＩＰ生産性を１とした場合のＰＩＰ生産性
の向上を図１に示した。

【００３５】実施例３〔塩基配列の決定〕 ｐ１０の約２．１ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片について、Ｔ
ＡＫＡＲＡ ｋｉｌｏｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｌｅｔｉ
ｏｎ ｋｉｔを用いてｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ
の作製を行った。 ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔは
常法に従い一本鎖ＤＮＡとし、得られた一本鎖ＤＮＡに
ついて、Ｍ１３シークエンシングキット（Ｍ１３ Ｓｅ
ｑｕｅｎ−ｃｉｎｇ ｋｉｔ、東洋紡製）を用いて、塩
基配列の決定を行った。決定した塩基配列及びアミノ酸
配列を配列表１に示した。

【００３６】実施例４〔ＰＩＰの製造〕 前記のＮ培地６ｌを１０ｌジャーファメンターに分注
し、１２１℃，１５分間オートクレーブを行い放冷後、
５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカライテスク製）を６
ｍｌ添加した。この培地に上記と同一組成の培地で予め
３７℃で１８時間振盪培養したエシェリヒア コリーＪ
Ｍ８３（ｐ５ｂ）の培養液６０ｍｌを接種し、３７℃で
１８時間通気撹拌培養した。培養終了後のＰＩＰ活性
は、４．０ｕｎｉｔ／ｍｌであった。

【００３７】培養液６ｌを遠心分離にて集菌し、２０ｍ
Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）２００ｍｌに懸
濁し、常法によりＤｙｎｏ−Ｍｉｌｌで破砕した後、１
５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離してＰＩＰの粗酵
素液を得た。

【００３８】このようにして得た粗酵素液にプロタミン
を用いて処理を施した後、硫酸アンモニウムを用いた塩
析分画を行った。塩析沈澱物を５０ｍｌの２０ｍＭ ト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、ＤＥＡＥ−
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東ソー）クロマトグラフィーに供
して、ＰＩＰ活性画分を得た。

【００３９】この活性画分をＰＣＭＢ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅに供し、２０ｍＭの２−メルカプトエタノールで溶
出した後、ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅ
ｘ２００（ファルマシアＬＫＢ）でゲル濾過し、純化さ
れたＰＩＰを得た。収率は２５％であった。

【００４０】

【発明の効果】本発明によって、ＰＩＰ遺伝子の塩基配
列およびＰＩＰのアミノ酸配列が明らかになり、また遺
伝子工学的手法による効率的なＰＩＰの製造法を提供し
た。また本発明のＰＩＰ遺伝子と種々の遺伝子工学的手
法とを用いることにより、より効率的なＰＩＰの製造法
をもたらしめるものである。

【００４１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１４３２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： genomic DNA 起源 生物名：バチルス コアギュランス（Bacillus coagula
ns） 株名：ＥＫ−１９ 配列の特徴 261〜264 S RBS 271〜1131 P CDS TGGTAATCTT TGTCGGAATT GGACTAATAT TTGGTATAAT CGGATGGAAA AAGAAACAAT 60 ACGCTAAAAT GTATGGTGGG TTCGGTCATT TTTTCGGTGT TATCATCAGC TGGATCTTAA 120 GTGTCCTTGT TAGTTTGGAT GATCCCAGCA AGGGAATTGC CATTATGGTT CTTTATCCGC 180 TATTTTCTAT CGGGGGCTGG TTAATTGGTT TGCACTTTGG GAAAGAAAAG GATAAGCGTA 240 CTAGGGATTA ACAATAAGGG GGAATGAAGT 270 TTG TAT ACG GAA GGA TTT ATC GAT GTT ACC GGC GGT AGG GTT TCT TTT 318 Met Tyr Thr Glu Gly Phe Ile Asp Val Thr Gly Gly Arg Val Ser Phe 1 5 10 15 CAA AAA TTT GAT GAA AAC GGC GGG GGT ACC TTT ATT GTT TTG CAC GGG 366 Gln Lys Phe Asp Glu Asn Gly Gly Gly Thr Phe Ile Val Leu His Gly 20 25 30 GGT CCG GGG TCT TCT TGT TAT TCG CTG CTT GGT TTA AAG GCG CTC GCA 414 Gly Pro Gly Ser Ser Cis Tyr Ser Leu Leu Gly Leu Lys Ala Leu Ala 35 40 45 AAG GAT CGG CCA GTA ATT TTA TAT GAC CAA TTG GGA TGC GGA AAG TCC 462 Lys Asp Arg Pro Val Ile Leu Tyr Asp Gln Leu Gly Cis Gly Lys Ser 50 55 60 １T CGG CCA ATG GAT ACG ACG TTA TGG CGC CTC GAC CGT TTT GTA GAA 510 Asp Arg Pro Met Asp Thr Thr Leu Trp Arg Leu Asp Arg Phe Val Glu 65 70 75 80 GAA TTA GCA CAA ATT AGA CAG GCG CTT AAC CTT GAT GAA GTA CAT ATC 558 Glu Leu Ala Gln Ile Arg Gln Ala Leu Asn Leu Asp Glu Val His Ile 85 90 95 TCG GTC ACT CCT GGG GAC TAC GCT CGC AGC TGC TTA TTG CTT AAC GAA 606 Ser Val Thr Pro Gly Asp Tyr Ala Arg Ser Cis Leu Leu Leu Asn Glu 100 105 110 GCC AAG CGT GTG AAA AGT GTA ATT TTT TCA AGT CCA TGT CTC AGT GCG 654 Ala Lys Arg Val Lys Ser Val Ile Phe Ser Ser Pro Cis Leu Ser Ala 115 120 125 CCG TTA TGG GAA CAG GAC CAA AAG CGA AAT CTA AAG AAA TTG CCG CTT 702 Pro Leu Trp Glu Gln Asp Gln Lys Arg Asn Leu Lys Lys Leu Pro Leu 130 135 140 GAT GTG CAG GAA ACC ATC AAC CGC TGT GAA GAA AAT GGC ACG ACC GAT 750 Asp Val Gln Glu Thr Ile Asn Arg Cis Glu Glu Asn Gly Thr Thr Asp 145 150 155 160 TCA GAA GAA TTT GCA GCG GCC ATT GAG GTA TTT GGA AAG CAT TTT GTT 798 Ser Glu Glu Phe Ala Ala Ala Ile Glu Val Phe Gly Lys His Phe Val 165 170 175 AAT CGG CTT GAG AAG CAG CCG GAA TGG CTG GAG CAA AAA CCA TCA GGA 846 Asn Arg Leu Glu Lys Gln Pro Glu Trp Leu Glu Gln Lys Pro Ser Gly 180 185 190 TAT CGG AAT GCT GAC ATT TAC AAT ATT ATG TGG GGA CCG TCT GAA TTT 894 Tyr Arg Asn Ala Asp Ile Tyr Asn Ile Met Trp Gly Pro Ser Glu Phe 195 200 905 ACC GTG CTT GGA AAT TTG AAG AAT TTT GAT TGC ACC ACA CAA TTA AAA 942 Thr Val Leu Gly Asn Leu Lys Asn Phe Asp Cis Thr Thr Gln Leu Lys 210 215 220 GAA ATT ACC TGC CCC TCT CTA TAT ACG TGT GGG CGT TTT GAC GAA GCT 990 Glu Ile Thr Cis Pro Ser Leu Tyr Thr Cis Gly Arg Phe Asp Glu Ala 225 230 235 240 ACA CCG GAA ACG ACG GAG TAT TAC AGC AGC CTG ACA CCG AAG TCG AAA 1038 Thr Pro Glu Thr Thr Glu Tyr Tyr Ser Ser Leu Thr Pro Lys Ser Lys 245 250 255 TTC CAT GTT TTT GAA AAA AGT GCA CAC ATG CCA TAC ATT GAG GAG CCG 1086 Phe His Val Phe Glu Lys Ser Ala His Met Pro Tyr Ile Glu Glu Pro 260 265 270 GAG GAG TAT TTA GCG GTA ATT GGA GAT TTT CTT AAT TCT ATT TAA TAA 1134 Glu Glu Tyr Leu Ala Val Ile Gly Asp Phe Leu Asn Ser Ile 275 280 285 TCTTTTAGTT CGAAGCGATT AAAGGAGTGG AGCTGATCCC TTTCAGGTTC CACTCCTTTT 1194 TTATGTGAAA ATGGGAAAAT AAAACCATCT CAGCATCAAT TATCAATAAT CAGTTAATTA 1254 TATGGACCAA TTAAACCAGG AATAAAGGAT TATTTTTGGA AAATATAGGA ATCAAACCCT 1314 ATGAAAAATG TAAGAAAATA GTTATAAAGT TTTATTTTAA ACACAAAACA AGGTCTGTCT 1374 ACATGCACTT GGACCAATTT TCCATTTTTC CCAACAACAA CCAAACTATC ATTTTCCT 1432

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐ１，ｐ２，ｐ３，ｐ４，ｐ５ａ，ｐ５ｂ，ｐ
１０，ｐ１４の挿入ＤＮＡ及び各ＰＩＰ生産性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/48 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＤＮＡが配列表の配列番号１に記載され
   た塩基配列をコードしているプロリンイミノペプチダー
   ゼの遺伝情報を有するＤＮＡ。
2. 【請求項２】 請求項１記載のＤＮＡを含有する組み換
   えベクター。
3. 【請求項３】 宿主細胞を請求項２記載の組み換えベク
   ターで形質転換した形質転換体。
4. 【請求項４】 請求項３記載の形質転換体を培養して、
   プロリンイミノペプチダーゼを産生させ、次いで該プロ
   リンイミノペプチダーゼを採取することを特徴とするプ
   ロリンイミノペプチダーゼの製造法。