JP2787437B2 - 糖転移方法 - Google Patents
糖転移方法Info
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、シクロマルトデキ
ストリン グルカノトランスフェラーゼ活性を有するポ
リペプチドを用いる糖転移方法に関し、更に詳しくは、
微生物由来のＤＮＡを適宜宿主中で発現させて得ること
のできる、部分アミノ酸配列として配列表における配列
番号１乃至５に示すアミノ酸配列の１種または２種以上
を含んでなるシクロマルトデキストリン グルカノトラ
ンスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを用いること
を特徴とする糖転移方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】シクロマルトデキストリン グルカノト
ランスフェラーゼ（以下、本明細書では「ＣＧＴａｓ
ｅ」と略称する。）は、マセランス アミラーゼとも言
われ、古くからバチルス マセランスだけでなく、バチ
ルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス サ
ーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎ
ｓ）などの微生物によっても産生されることが知られ、
その糖転移作用が工業的に広く利用されるようになって
きた。例えば、糊化澱粉または液化澱粉液にＣＧＴａｓ
ｅを作用させて澱粉を処理したり、シクロデキストリン
を製造したり、また、液化澱粉とスクロースとの混合液
にＣＧＴａｓｅを作用させ澱粉からスクロースへの糖転
移反応を利用してグリコシルスクロースを製造したりし
ている。最近、シクロデキストリンは、例えば、酸化ま
たは揮発しやすい有機化合物を包接することにより、よ
り安定な包接化合物を形成するためのホストとしての需
要が増大し、また、グリコシルスクロースは、上品な甘
味を有する低う蝕性甘味料（林原株式会社製造、登録商
標「カップリングシュガー」）としての需要が増大して
いる。このような需要の増大に応えるためＣＧＴａｓｅ
の安定供給が急務になってきた。そこで、ＣＧＴａｓｅ
を安定供給するために、ＣＧＴａｓｅ活性を有するポリ
ペプチド（以下、本明細書では単に、「ポリペプチド」
と略称する。）をコードするＤＮＡを解明し、このＤＮ
Ａを導入した形質転換体を得る必要性が生じてきた。し
かしながら、ポリペプチドのアミノ酸配列は今だ知られ
ていない。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、ポリペプチ
ドのアミノ酸配列を解明し、そのアミノ酸配列を有する
ＤＮＡとその塩基配列を解明することにより、組換えＤ
ＮＡ技術によるポリペプチドの広範な給源確保と、ポリ
ペプチドの産生量の向上を達成し、もって、ポリペプチ
ドを用いた糖転移方法を実現することを、課題とする。 【０００４】 【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するために、鋭意研究を続けた。その結果、ポリ
ペプチドは、部分アミノ配列として、配列表における配
列番号１乃至５に示すアミノ酸配列の１種または２種以
上の配列を有していることが判明し、更に詳細には、こ
れらアミノ酸配列をＮ末端側から配列表における配列番
号１乃至５の順序で有していることが判明した。そし
て、その特徴的性質は、可溶性澱粉からシクロデキスト
リンを生成する蛋白質である。 【０００５】また、バチルス ステアロサーモフィラス
由来のポリペプチドは、後に説明するように、配列表に
おける配列番号８に示されるアミノ酸配列を有している
ことが判明した。更に、バチルス マセランスのポリペ
プチドは、後に説明するように、配列表における配列番
号１２に示されるアミノ酸配列を有していることが判明
した。 【０００６】以下、本発明の内容を詳述し、併せて本発
明の効果を説明する。本明細書の記載において、アミノ
酸、ペプチド、その他に関し略号で表記する場合、それ
らは当該分野における慣用略号に基づくものである。そ
れらの例を以下に列記する。アミノ酸に関し、光学異性
体があり得る場合には、特に明示しなければＬ体を示す
ものとする。 【０００７】 ＤＮＡ ： デオキシリボ核酸 ＲＮＡ ： リボ核酸 Ａ ： アデニン Ｔ ： チミン Ｇ ： グアニン Ｃ ： シトシン ｄＮＴＰ ： デオキシヌクレオチド三リン酸 ｄｄＮＴＰ： ジデオキシヌクレオチド三リン酸 ｄＣＴＰ ： デオキシシチジン三リン酸 ＳＤＳ ： ドデシル硫酸ナトリウム Ａｌａ ： アラニン Ａｒｇ ： アルギニン Ａｓｎ ： アスパラギン Ａｓｐ ： アスパラギン酸 Ｃｙｓ ： システィン Ｇｌｎ ： グルタミン Ｇｌｕ ： グルタミン酸 Ｇｌｙ ： グリシン Ｈｉｓ ： ヒスチジン Ｉｌｅ ： イソロイシン Ｌｅｕ ： ロイシン Ｌｙｓ ： リジン Ｍｅｔ ： メチオニン Ｐｈｅ ： フェニルアラニン Ｐｒｏ ： プロリン Ｓｅｒ ： セリン Ｔｈｒ ： スレオニン Ｔｒｐ ： トリプトファン Ｖａｌ ： バリン 【０００８】本発明に於いて、ポリペプチドのアミノ酸
配列は、ＣＧＴａｓｅ産生菌からポリペプチド遺伝子を
クロニーングした後、その塩基配列を解読して決定し
た。 【０００９】一方、ポリペプチドのＮ末端を含有する部
分アミノ酸配列は、ポリペプチドを高度に精製した後、
気相プロテイン シークエンサーを用いて調べた。 【００１０】〈ポリペプチドのクローニング〉本発明
は、ポリペプチド産生能を有する供与体微生物よりその
微生物のＤＮＡを分離し精製した後、例えば、超音波、
制限酵素などで切断し、得られたＤＮＡ断片と、同様に
してベクターを切断して得られたベクター断片とを、例
えば、ＤＮＡリガーゼなどにより結合させ、ポリペプチ
ド遺伝子を含む組換えＤＮＡを形成する。 【００１１】この際、供与体微生物として、ポリペプチ
ド産生能を有する微生物、例えば、特開昭４７−２０３
７３号公報、特開昭５０−６３１８９号公報、特開昭５
０−８８２９０号公報およびハンス ベンダー（Ｈａｎ
ｓ Ｂｅｎｄｅｒ）、『アーカイブズ・オブ・マイクロ
バイオロジー（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ）』、第１１１巻、第２７１〜２８２頁
（１９７７年）などに示されているバチルス マセラン
ス、バチルス メガテリウム、バチルス サーキュラン
ス、バチルス ポリミキサ、バチルス ステアロサーモ
フィラスなどのバチルス属、クレブシーラ ニューモニ
アエなどのクレブシーラ属などの細菌が適宜選ばれる。 【００１２】また、ポリペプチド産生能を有する遺伝子
組換えにより導入した形質転換微生物を供与体微生物と
して利用することもできる。供与体微生物由来のＤＮＡ
は、供与体微生物を、例えば、液体培地で約１〜３日間
通気攪拌培養し、得られる培養液を遠心分離して集菌
し、次いでこれを溶菌させることによって調製すること
ができる。溶菌方法としては、例えば、リゾチームやβ
−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素による処理や超音
波処理などが用いられる。また、必要によりプロテアー
ゼなどの他の酵素剤やラウリル硫酸ナトリウムなどの界
面活性剤を併用することも、更に凍結融解処理を施すこ
とも自由である。 【００１３】このようにして得られる溶菌物からＤＮＡ
を分離し、精製するには、常法に従って、例えばフェノ
ール抽出、除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレ
アーゼ処理、アルコール沈殿、遠心分離などの方法を適
宜組み合わせることによって行うことができる。 【００１４】ＤＮＡを切断する方法は、例えば、超音波
処理、制限酵素処理などにより行うことができるが、得
られるＤＮＡ断片とベクター断片との結合を容易にする
ためには、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列に
作用する、例えば、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｂ
ａｍＨ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ、Ｓｌａ Ｉ、Ｘｍａ Ｉ、Ｍ
ｂｏ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉなどの
ＩＩ型制限酵素が適している。 【００１５】ベクターとしては、宿主微生物で自律的に
増殖し得るファージまたはプラスミドが適している。フ
ァージとしては、例えば、エッシェリヒア コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場
合には、λｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが、バチルス
ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
を宿主微生物とする場合には、ρ１１、φ１、φ１０５
などが使用できる。また、プラスミドとしては、例え
ば、エッシェリヒア コリを宿主細胞とする場合には、
ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５などが、バチルス ズブチ
リスを宿主微生物とする場合には、ｐＵＢ１１０、ｐＴ
Ｚ４（ｐＴＰ４）、ｐＣ１９４などが使用でき、更に、
例えば、エッシェリヒア コリ、バチルス ズブチリス
などの２種以上の宿主微生物で自律的増殖の可能な、例
えば、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７など
のベクターを利用することも可能である。このようなベ
クターを、先に述べたＤＮＡと同様に制限酵素などで切
断し、ベクター断片を得る。 【００１６】ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合させる
方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよ
く、例えば、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリン
グの後、生体外で適当なＤＮＡリガーゼの作用により組
換えＤＮＡを作製する。必要ならば、アニーリングの
後、宿主微生物に導入して、生体内のＤＮＡリガーゼを
利用して組換えＤＮＡにすることもできる。宿主微生物
としては、組換えＤＮＡが安定かつ自律的増殖が可能で
その形質発現のできるものであればよい。中でも、α−
アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）産生能を欠いてい
る微生物は、ポリペプチド産生量の測定が容易であるだ
けでなく、産生されるポリペプチドの分離、精製も容易
であり有利に利用できる。 【００１７】宿主微生物に組換えＤＮＡを導入する方法
は、公知の方法、例えば、宿主微生物がエッシェリヒア
コリの場合にはカルシウムイオン存在下で行い、バチ
ルス属に属する微生物の場合にはコンピテントセル法ま
たはプロトプラスト法などを採用することができる。組
換えＤＮＡが導入された形質転換微生物の選択方法は、
澱粉を含む平板培地上で生育し、かつ、澱粉からシクロ
デキストリンを生成するものを選択すればよい。 【００１８】このようにして一度選択されたポリペプチ
ド遺伝子を含む組換えＤＮＡは、形質転換微生物から取
り出して、他の宿主微生物に導入することも容易に実施
できることが判明した。またポリペプチド遺伝子を含む
組換えＤＮＡを制限酵素などにより切断してポリペプチ
ド遺伝子を含むＤＮＡ断片とし、これと同様にして得ら
れるベクター断片とを結合させることも容易に実施でき
ることが判明した。 【００１９】〈ポリペプチド遺伝子の塩基配列〉ポリペ
プチドの遺伝子塩基配列は、『ジーン（Ｇｅｎｅ）』、
第９巻、第２５９〜２６８頁（１９８２年）に示されて
いるジデオキシ チェーンターミネーター法で解読すれ
ばよい。この方法は、クローニングにより得られたポリ
ペプチド遺伝子を含むＤＮＡ断片を、プラスミドｐＵＣ
１８などのプラスミドに制限酵素を利用してそのクロー
ニング部位に挿入する。得られた組換えプラスミドは、
形質転換によってエッシェリヒア コリ ＪＭ８３など
に移入し、次いで組換えプラスミドを有する微生物を選
択する。この微生物を増殖させたものを用いて組換えプ
ラスミドを調製する。 【００２０】得られた組換えプラスミドを合プライマー
とアニーリングし、これにクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断
片を働かせてプライマーを伸張させ相補ＤＮＡを生成さ
せる。この反応物をポリアクリルアミドゲル電気泳動、
次いで、ラジオオートグラフィー法を行った後、ポリペ
プチド遺伝子の塩基配列を決定する。また、ポリペプチ
ドを菌体外に分泌させるシグナルペプチド遺伝子の塩基
配列も、同様にして決定する。 【００２１】〈ポリペプチドのアミノ酸配列〉ポリペプ
チドのアミノ酸配列は、塩基配列により決定する。ま
た、ポリペプチドを菌体外に分泌させるシグナルペプチ
ドのアミノ酸配列も、同様に決定する。 【００２２】〈ポリペプチドのＮ末端を含有する部分ア
ミノ酸配列〉ポリペプチド産生能を有するバチルス属に
属する微生物を栄養培地で培養してポリペプチドを産生
させる。培養終了後、遠心分離して上清を採取し、これ
を硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体
クロマトグラフィーにより精製し高純度ポリペプチドと
する。この試料を用いて『ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第２５６
巻、第７９９０〜７９９７頁（１９８１年）の記載に準
じて、気相プロテイン シークエンサーにより分解し、
高速液体クロマトグラフィーで同定して、ポリペプチド
のＮ末端を有する部分アミノ酸配列を決定する。 【００２３】〈形質転換微生物によるポリペプチドの調
製〉以上のようにして得られた形質転換微生物を栄養培
地で培養することにより多量のポリペプチドが安定して
産生し得ることも見い出した。栄養培地には、例えば、
炭素源、窒素源、ミネラル、更に必要ならば、アミノ
酸、ビタミンなどの有機微量栄養素などを含有させると
良い。この際、炭素源としては、澱粉、澱粉部分加水分
解物、グルコース、フラクトース、スクロースなどの糖
質が有利に用いられる。窒素源としては、アンモニアガ
ス、アンモニア水、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機
窒素源、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンステ
ィープリカー、肉エキスなどの有機窒素源が適宜用いら
れる。 【００２４】培養方法は、例えば、液体培地をｐＨ４〜
１０、温度２５〜６５℃の範囲に維持しつつ、通気攪拌
などの好気的条件下で約１〜４日間培養し、ポリペプチ
ドを生成蓄積させればよい。培養物中のポリペプチド
は、そのまま採取し利用することもできるが、一般には
常法に従って、濾過、遠心分離などによりポリペプチド
溶液と微生物菌体とに分離した後に利用される。ポリペ
プチドが菌体中に存在する場合には、細胞を超音波、界
面活性剤、細胞壁溶解酵素などで処理し、次いで濾過、
遠心分離などしてポリペプチド溶液を採取する。 【００２５】このようにして得られるポリペプチド溶液
を、例えば、減圧濃縮し、膜濃縮し、更に、硫安、硫酸
ソーダなどによる塩析、メタノール、エタノール、アセ
トンなどによる分別沈殿法などを適宜組み合わせて精製
し、より高純度のポリペプチドを採取し、工業用ポリペ
プチド剤として有利に利用できる。本発明で言うＣＧＴ
ａｓｅ活性１単位とは、ｐＨ５．５、０．０２Ｍの酢酸
緩衝液および２×１０-3Ｍの塩化カルシウムを含む０．
３ｗ／ｗ％のソリュブルスターチ溶液５ｍｌに適当に希
釈した酵素液０．２ｍｌを加え、４０℃で１０分間反応
した後、その反応液０．５ｍｌをとり、０．０２Ｎ−硫
酸水溶液１５ｍｌに混合して反応を停止させ、更にこの
反応停止液に０．１Ｎヨウ素ヨウ化カリウム溶液０．２
ｍｌを加えて発色させ、次いで６６０ｎｍにおける吸光
度を測定して、４０℃で１０分間反応させることにより
ソリュブルスターチ１５ｍｇのヨウ素の呈色を完全に消
失させる酵素量を言う。 【００２６】以下、実施例で本発明を詳細に説明する。 【００２７】 【実施例１】〈バチルス ステアロサーモフィラスポリ
ペプチド遺伝子のエッシェリヒア コリへのクローニン
グ〉 【００２８】 【実施例１−１】 〈バチルス ステアロサーモフィラスの耐熱性ポリペプ
チド遺伝子を含む染色体ＤＮＡの調製〉バチルス ステ
アロサーモフィラスの耐熱性ポリペプチド遺伝子を含む
染色体ＤＮＡは、斉藤、三浦等の方法、『ビオキミカ・
エト・ビオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ
ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）』、第７２
巻、第６１９〜６２９頁（１９６３年）に準じて調製し
た。即ち、バチルス ステアロサーモフィラス（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−２２２５）をブレインハート インフュージョ
ン培地で５０℃、一夜通気攪拌培養した。培養液を遠心
分離して集菌し、得られた菌体をＴＥＳ緩衝液（ｐＨ
８．０、トリスアミノメタン、塩酸、ＥＤＴＡ、塩化ナ
トリウム含有）に懸濁し、次にリゾチームをｍｌ当たり
２ｍｇの割合で加え、３７℃で３０分間保持した。これ
を、−２０℃で一夜凍結した後、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ
９．０、トリスアミノメタン、ＨＣｌ、ラウリル硫酸ナ
トリウム、塩化ナトリウム含有）を加え、６０℃に加温
した後、ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）１容とフェノール
４容との混合液を加え、氷水中で冷却後、遠心分離し上
清を得た。この上清に２倍容の冷エタノールを加え粗染
色体ＤＮＡを回収し、これをＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．
１、塩化ナトリウム、クエン酸３ナトリウム含有）に溶
解し、リボヌクレアーゼ（シグマ社製造、商品名 ＲＮ
ａｓｅ Ａ）およびプロテアーゼ（科研製薬株式会社製
造、商品名、プロナーゼ Ｅ）を作用させ、次いで、、
ＴＥＳフェノール混液を加え、冷却し遠心分離して、得
られる上清に２培容の冷エタノールを加え精製染色体Ｄ
ＮＡを回収し、緩衝液（ｐＨ７．５、トリスアミノメタ
ン、ＨＣｌ、ＥＤＴＡ含有）に溶解して−２０℃で保存
した。 【００２９】 【実施例１−２】 〈プラスミド ｐＢＲ３２２の調製〉プラスミド ｐＢ
Ｒ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）は、ジェイ メイヤ
ーズ（Ｊ．Ｍｅｙｅｒｓ）等の方法、『ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）』、第１２７巻、第１，５２４〜
１，５３７頁（１９７６年）に準じてエッシェリヒア
コリから分離、調製した。 【００３０】 【実施例１−３】 〈ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡの作製〉実施
例１−１で調製した耐熱性ポリペプチド遺伝子を含む精
製染色体ＤＮＡに対して、制限酵素Ｍｂｏ Ｉ（株式会
社ニッポンジーン製造）を作用させ、ＤＮＡ断片が１〜
２０Ｋｂｐになるように染色体ＤＮＡを部分的に切断し
た。一方、実施例１−２で調製したプラスミドｐＢＲ３
２２に対して、制限酵素ＢａｍＨＩ（株式会社ニッポン
ジーン製造）を作用させ、完全に切断し、次いで、プラ
スミド断片のセルフライゲーションを防止するため、エ
ッシェリヒア コリ由来のアルカリフォスファターゼ
（宝酒造株式会社製造）を作用させ、ｐＢＲ３２２断片
の５´末端を脱リン酸化した。両断片の結合は、Ｔ4Ｄ
ＮＡリガーゼ （株式会社ニッポンジーン製造）を４℃
で一夜反応させて行い、組換えＤＮＡを作製した。 【００３１】 【実施例１−４】 〈組換えＤＮＡのエッシェリヒア コリへの導入〉宿主
細胞として、アミラーゼ産生能を欠いているエッシェリ
ヒア コリＨＢ１０１（ＡＴＣＣ ３３６９４）を用い
た。本微生物をＬ培地で３７℃、４時間培養し集菌した
後、１０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭ塩化マンガンを
含有する１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）に懸濁し、
遠心分離して集菌し、続いて２５ｍＭ塩化カルシウム、
１２５ｍＭ塩化マンガンを含有する１０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．６）に懸濁したものに、実施例１−３で得た
組換えＤＮＡを加え、氷水中で３０分間静置した。更
に、３７℃に加温し、Ｌ培地を加え３７℃で３０分間保
ち、これをアンピシリン（抗生物質）５０μｇ／ｍｌを
含有し、かつ澱粉２ｍｇ／ｍｌを含有するＬ−アガー平
板培地上に拡げ、３７℃で２４時間保ち、コロニーを形
成させた。 【００３２】本平板から、ヨード呈色法により、澱粉を
分解し、サイクロデキストリンを生成しているコロニー
を選択し、ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡが導
入されている形質転換微生物を選択した。本微生物を増
殖させ、実施例１−２のプラスミドの調製方法に準じて
組換えＤＮＡを取り出し、これに各種制限酵素を作用さ
せ、その切断部位を決定した後、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ
（株式会社ニッポンジーン製造）で完全切断し、次い
で、実施例１−３と同様にＴ４ＤＮＡリガーゼを作用さ
せ、組換えＤＮＡを作製し、上記の方法に準じてポリペ
プチド遺伝子を含む小型の組換えＤＮＡを保有する形質
転換微生物を選択した。 【００３３】更に、この小型の組換えＤＮＡを制限酵素
Ｓａｌ Ｉ（株式会社ニッポンジーン製造）で完全切断
し、以後、前記のＥｃｏＲ Ｉの場合と同様に処理し
て、ポリペプチド遺伝子を含む更に小型のＤＮＡを保有
する形質転換微生物を選択した。本微生物の一菌株をエ
ッシェリヒア コリＴＣＨ２０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−２
１０９）と命名し、これが保有する組換えＤＮＡをｐＴ
ＣＨ２０１と命名した。 【００３４】組換えＤＮＡ ｐＴＣＨ２０１について、
バチルス ステアロサーモフィラス由来ＤＮＡ部分の制
限酵素地図を図１に示す。 【００３５】図１から明らかなように、制限酵素Ｐｖｕ
ＩＩ（東洋紡績株式会社製造）、Ｋｐｎ Ｉ、Ｈｉｎ
ｄ ＩＩＩ（株式会社ニッポンジーン）、Ｘｂａ Ｉ
（宝酒造株式会社製造）で切断を受けることが判明し
た。一方、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、Ｐｓ
ｔ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ａｃｃ Ｉ（以
上、株式会社ニッポンジーン製造）では切断されなかっ
た。 【００３６】 【実施例２】 〈バチルス ステアロサーモフィラスポリペプチド遺伝
子のバチルス ズブチリスへのクローニング〉 【００３７】 【実施例２−１】 〈組換えＤＮＡ ｐＴＣＨ２０１の調製〉組換えＤＮＡ
ｐＴＣＨ２０１は、実施例１−２の方法に準じてエッ
シェリヒア コリＴＣＨ２０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１
０９）から分離調製した。 【００３８】 【実施例２−２】 〈プラスミド ｐＵＢ１１０の調製〉プラスミド ｐＵ
Ｂ１１０（ＡＴＣＣ ３７０１５）は、グリッガン（Ｇ
ｒｙｃｚａｎ）等の方法、『ジャーナル・オブ・バクテ
リオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ）』、第１３４巻、第３１８〜３２９頁（１９７
８年）に準じてバチルス ズブチリスから分離、調製し
た。 【００３９】 【実施例２−３】 〈ポリペプチド遺伝子を含む組替えＤＮＡの作製〉実施
例２−１で調製した耐熱性ポリペプチド遺伝子を含む組
換えＤＮＡ ｐＴＣＨ２０１に対して、制限酵素Ｅｃｏ
Ｒ ＩおよびＸｂａ Ｉを同時に作用させ完全に切断し
た。一方、実施例２−２で調製したプラスミドｐＵＢ１
１０に対して、制限酵素ＥｃｏＲ ＩおよびＸｂａ Ｉ
を同様に作用させ完全に切断した。両断片の結合は、Ｔ
4ＤＮＡリガーゼ を用いて、実施例１−３と同様に作用
させ組換えＤＮＡを作製した。 【００４０】 【実施例２−４】 〈組換えＤＮＡのバチルス ズブチリスへの導入〉宿主
微生物として、アミラーゼ産生能を欠いているバチルス
ズブチリス７１５Ａを用いた。本微生物をブレイン
ハート インフュージョン培地で２８℃、５時間培養し
集菌した後、シェーファー（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ）等の
方法、『プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイ
テッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉ
ｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅ
ｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉ
ｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）』、第
７３巻、第２，１５１〜２，１５５頁（１９７６年）に
準じてプロトプラスト懸濁液を調製した。 【００４１】本液に、実施例２−３で調製した組換えＤ
ＮＡを加え、関口等の方法、『アグリカルチュラル・ア
ンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃｕｌ
ｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ）』、第４６巻、第１，６１７〜１，６２１
頁（１９８２年）に準じて形質転換を行った後、ＨＣＰ
培地にカナマイシン（抗生物質）２５０μｇ／ｍｌを含
有し、かつ澱粉１０ｍｇ／ｍｌを含有する寒天平板培地
上に拡げ、２８℃、７２時間保ち、コロニーを形成させ
た。 【００４２】以後、実施例１−４の方法に準じて耐熱性
ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡが導入されてい
る形質転換微生物を選択した。本微生物の一菌株をバチ
ルスズブチリス ＴＣＵ２１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１
１２）と命名し、これが保有する組換えＤＮＡをｐＴＣ
Ｕ２１１と命名した。組換えＤＮＡ ｐＴＣＵ２１１に
ついて、バチルス ステアロサーモフィラス由来ＤＮＡ
部分の制限酵素切断地図を図２に示す。 【００４３】図２から明らかなように、制限酵素Ｐｖｕ
ＩＩ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、で切断を受け
ることが判明した。一方、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ、Ｂａ
ｍＨＩ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ａｃ
ｃ Ｉ、Ｘｂａ Ｉでは切断されなかった。 【００４４】 【実施例３】 〈バチルス ステアロサーモフィラス由来ポリペプチド
のＮ末端を含有した部分アミノ酸配列〉 【００４５】 【実施例３−１】 〈ポリペプチドの調製〉バチルス ステアロサーモフィ
ラス（ＦＥＲＭ Ｐ−２２２５）を、実施例５に示す方
法と同様にして液体培養し、培地中にポリペプチドを産
生させた。遠心分離にて上清を採取し、硫安塩析によ
り、ポリペプチド画分を得、次いで、陰イオン交換体カ
ラムクロマトグラフィー（東洋曹達株式会社製『ＤＥＡ
Ｅ−トヨパール ６５０』）、クロマトフォーカッシン
グ法（ファマシア社製『ＭｏｎｏＰ』）により精製し
て、高度に精製されたポリペプチドを採取した。本品
は、ケイウエーバー アンド エム オズボー（Ｋ．Ｗ
ｅｂｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｏｓｂｏｒｎ）、『ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａ
ｌｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）』、第２４４巻、第４，４０６頁（１９６９年）の
記載に準じて行ったＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法で７０，０００±１０，０００の分子量を示し
た。また、比活性は、２００±３０単位／ｍｇ蛋白質を
示した。 【００４６】 【実施例３−２】 〈Ｎ末端を含有する部分アミノ酸配列〉実施例３−１の
方法で調製したポリペプチドを、気相プロテイン シー
クエンサー、アプライドバイオシステム社製『４７０Ａ
型』にかけ、次いで、高速液体クロマトグラフィーによ
り分析して、Ｎ末端を含有する部分アミノ酸配列を決定
した。結果は、配列表における配列番号６の配列を有し
ていることが判明した。 【００４７】 【実施例４】 〈バチルス ステアロサーモフィラス由来ポリペプチド
遺伝子の塩基配列およびポリペプチドのアミノ酸配列〉 【００４８】 【実施例４−１】 〈プラスミド ｐＵＣ １８の調製〉プラスミド ｐＵ
Ｃ １８は、これを導入したエッシェリヒア コリ Ｊ
Ｍ８３（ＡＴＣＣ ３５６０７）から実施例１−２の方
法に準じて調製した。 【００４９】 【実施例４−２】 〈ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡの作製〉実施
例１−３の方法に準じて組換えＤＮＡを作製した。即
ち、実施例２−３の方法で調製したポリペプチド遺伝子
を含む断片に、更に、各種制限酵素を作用させて切断
し、また、実施例４−１の方法で調製したプラスミド
ｐＵＣ １８を同様に各種制限酵素で切断し、これら両
断片にＴ4ＤＮＡリガーゼ を作用させて組換えＤＮＡを
作製した。 【００５０】 【実施例４−３】 〈組換えＤＮＡのエッシェリヒア コリへの導入〉宿主
微生物として、エッシェリヒア コリ ＪＭ８８を用い
た。この微生物に、実施例１−４の方法に準じて、組換
えＤＮＡを移入し、形質転換させた。次いで、５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド
（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌ
ｙｌ−β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅまたはＸｇａｌ）を
含有する培地に生育させ、無色のプラークを形成した微
生物を形質転換微生物として選択した。 【００５１】 【実施例４−４】 〈形質転換微生物からの組換えＤＮＡの調製〉形質転換
微生物を、抗生物質アンビシリン５０μｇ／ｍｌを含む
Ｌ−培地で培養し、得られる菌体からアルカリ溶菌法に
より組換えＤＮＡを調製した。 【００５２】 【実施例４−５】 〈組換えＤＮＡの塩基配列〉ジデオキシ チェーンター
ミネータ法に従って解読した。即ち、実施例４−４で調
製した組換えＤＮＡと合成プライマー（１７塩基）を加
え、６０℃で２０分間アニーリングした後、ｄＮＴＰ、
ｄｄＮＴＰ、〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰおよびクレノウ断片
を加え、３７℃で３０分間反応させ、プライマーを５´
側から３´方向へ伸長させて相補ＤＮＡを生成させた。
これに過剰のｄＮＴＰを加えて、更に３７℃で３０分間
反応させた後、ホルムアミド色素溶液を加えて反応を停
止させた。次いで、３分間煮沸し、これを６％ポリアク
リルアミドゲルを用いて、約２，０００Ｖ、約２５ｍＡ
で電気泳動し、伸長した相補ＤＮＡを分離した。電気泳
動した後、ゲルを固定し乾燥させた。本ゲルを用いて、
オートラジオグラフィーを行い、オートラジオグラム上
の塩基断片のシークエンス解析を行ってポリペプチド遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果は、配列表におけ
る配列番号９に示した。また、それの５´側の上流に続
くシグナルペプチド遺伝子の塩基配列も同様にして調べ
た。その結果は、配列表における配列番号１０に示し
た。 【００５３】 【実施例４−６】 〈ポリペプチドのアミノ酸配列〉配列表における配列番
号９の塩基配列を用いて、ポリペプチドのアミノ酸配列
を決定し、その結果を配列表における配列番号８に示し
た。また、それのＮ末端側の上流に続くシグナルペプチ
ドのアミノ酸配列を決定し、その結果を配列表における
配列番号１１に示した。以上の結果から、バチルス ス
テアロサーモフィラス由来ポリペプチドのアミノ酸配列
は、配列表における配列番号８の配列を有していること
が明らかになった。 【００５４】 【実施例５】 〈形質転換微生物によるポリペプチドとそれを用いた糖
転移反応〉 【００５５】 【実施例５−１】 〈形質転換微生物によるポリペプチドの調製〉バチルス
ステアロサーモフィラス由来の耐熱性ポリペプチド遺
伝子を含む組換えＤＮＡを導入した形質転換微生物エッ
シェリヒア コリ ＴＣＨ２０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−２
１０９）およびバチルス ズブチリス ＴＣＵ２１１
（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１１２）を用いてポリペプチドを
調製した。また、これら形質転換微生物と宿主微生物並
びに供与体微生物バチルス ステアロサーモフィラスの
産生するポリペプチド産生量をその活性で比較した。 【００５６】液体培地は、コーンスティープリカー１．
０ｗ／ｖ％、硫酸アンモニウム０．１ｗ／ｖ％、炭酸カ
ルシウム１．０ｗ／ｖ％、澱粉１ｗ／ｖ％および水から
なり、ｐＨ７．２に調製して１２０℃で２０分間滅菌
し、冷却して調製した。エッシェリヒア コリ ＴＣＨ
２０１の場合には、この培地に、抗生物質アンピシリン
をｍｌ当たり５０μｇの割合で加えて植菌し、また、エ
ッシェリヒア コリ ＨＢ１０１の場合には抗生物質を
加えずに植菌し、それぞれ３７℃、４８時間通気攪拌培
養した。また、バチルス ズブチリス ＴＣＵ２１１の
場合には、前記液体培地に抗生物質カナマイシンをｍｌ
当たり５μｇの割合で加えて植菌し、また、バチルス
ズブチリス ７１５Ａの場合には抗生物質を加えずに植
菌し、それぞれ２８℃で７２時間培養した。また、バチ
ルス ステアロサーモフィラス（ＦＥＲＭ Ｐ−２２２
５）の場合には、前記液体培地に抗生物質を加えること
なく、５０℃で４８時間培養した。各培養液を、遠心分
離し、上清と菌体とに分離し、上清はそのまま活性測定
し、培養液量に換算して活性を求めた。結果は、表１に
示す。 【００５７】 【表１】【００５８】表１の結果から明らかなように、形質転換
微生物からのポリペプチド産生量は向上しており、工業
的生産方法として好都合である。 【００５９】 【実施例５−２】 〈形質転換微生物によるポリペプチドの安定温度〉実施
例５−１で調製したエッシェリヒア コリ ＴＣＨ２０
１の上清を硫安０．６飽和で塩析して粗ポリペプチド剤
を調製し、採取した。このポリペプチド剤を用いて、そ
の安定温度について調べた。５ｍＭのＣａｃｌ2 を含有
する５０ｍＭトリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
中にて、ポリペプチド剤を異なる温度で３０分間インキ
ュベートし、残存するＣＧＴａｓｅ活性を測定し、その
残存活性を相対活性で表した。結果は、表２に示す。 【００６０】 【表２】 【００６１】表２から、形質転換微生物からのポリペプ
チドは、７０℃でも安定であることが判明した。また、
これと同様に、バチルス ズブチリス ＴＣＵ２１１の
安定温度についても調べたところ、エッシェリヒア コ
リ ＴＣＨ２０１と同様の結果を得た。 【００６２】 【実施例５−３】 〈ポリペプチドを用いた糖転移反応〉実施例５−１で調
製したエッシェリヒア コリ ＴＣＨ２０１の上清を硫
安０．６飽和で塩析して粗ポリペプチド剤を調製し、採
取した。このポリペプチド剤を用いて、澱粉に作用さ
せ、糖転移反応を起こさせた。その結果を調べ、澱粉か
らスクロースへの糖転移量、澱粉からのシクロデキスト
リンの生成量、シクロデキストリンα、β、γの生成比
率、ポリペプチドの至適温度、至適ｐＨ、安定温度、安
定ｐＨなどの酵素的性質について、供与体微生物バチル
ス ステアロサーモフィラスのものと比較したところ、
形質転換微生物の酵素的性質は、安定温度を含めて、供
与体微生物バチルス ステアロサーモフィラスのものと
よく一致した。すなわち、このポリペプチドは、供与体
微生物バチルス ステアロサーモフィラス由来のポリペ
プチドと同様に耐熱性のポリペプチドであった。 【００６３】 【実施例６】 〈バチルス マセランス ポリペプチド遺伝子のエッシ
ェリヒア コリへのクローニング〉 【００６４】 【実施例６−１】 〈バチルス マセランスのポリペプチド遺伝子を含む染
色体ＤＮＡの調製〉バチルス マセランスのポリペプチ
ド遺伝子を含む染色体ＤＮＡは、バチルスマセランス
１７Ａを２８℃で培養した以外は、実施例１−１の方法
に準じて調製した。 【００６５】 【実施例６−２】 〈ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡの作製〉実施
例６−１で調製したバチルス マセランス由来のポリペ
プチド遺伝子を含む精製染色体ＤＮＡに対して、制限酵
素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ（株式会社ニッポンジーン製造）を
作用させ、実施例１−３と同様に部分的に切断した。一
方、実施例１−２の方法で調製したプラスミド ｐＢＲ
３２２に対して、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを作用させ、
完全に切断し、次いで、実施例１−３で述べた方法で５
´末端の脱リン酸化を行い、更に両断片の結合を、実施
例１−３の方法に準じて行い組換えＤＮＡを作製した。 【００６６】 【実施例６−３】 〈組換えＤＮＡのエッシェリヒア コリへの導入〉宿主
微生物として、アミラーゼ産生能を欠いているエッシェ
リヒア コリ ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ ３３６９４）を
用いて、実施例１−４の方法に準じて、組換えＤＮＡが
導入されている形質転換微生物を選択した。この微生物
から組換えＤＮＡを取り出し、これに各種制限酵素を作
用させ、その切断部位を決定した後、制限酵素Ｓａｕ３
ＡＩ（株式会社ニッポンジーン社製）で部分切断し、一
方、実施例１−２の方法で得たプラスミドｐＢＲ３２２
を制限酵素ＢａｍＨ Ｉで完全に切断した後、実施例１
−３と同様に５´末端の脱リン酸化を行い、更に、Ｔ4
ＤＮＡリガーゼ を同様に作用させ、組換えＤＮＡを作
製し、実施例１−４の方法に準じてポリペプチド遺伝子
を含む小型の組換えＤＮＡを保有する形質転換微生物を
選択した。 【００６７】本微生物の一菌株をエッシェリヒア コリ
ＭＡＨ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１１０）と命名し、こ
れが保有する組換えＤＮＡをｐＭＡＨ２と命名した。組
換えＤＮＡ ｐＭＡＨ２について、バチルス マセラン
ス由来のＤＮＡ部分の制限酵素切断地図を図３に示す。 【００６８】図３から明らかなように、制限酵素Ｐｖｕ
ＩＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ａｖａ Ｉ（株式会社ニッポンジ
ーン製造）、Ｐｓｔ Ｉ（株式会社ニッポンジーン製）
で切断を受けることが判明した。一方、制限酵素Ｅｃｏ
Ｒ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｋｐｎ Ｉ、ＢａｍＨ
Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｓｍａ Ｉでは切断され
なかった。 【００６９】 【実施例７】 〈バチルス マセランス ポリペプチド遺伝子のバチル
ス ズブチリスへのクローニング〉 【００７０】 【実施例７−１】 〈組換えＤＮＡ ｐＭＡＨ２の調製〉組換えＤＮＡ ｐ
ＭＡＨ２は、実施例１−２の方法に準じてエッシェリヒ
アコリ ＭＡＨ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１１０）から分
離調製した。 【００７１】 【実施例７−２】 〈ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡの作製〉実施
例７−１で調製したポリペプチド遺伝子を含む組換えＤ
ＮＡｐ ＭＡＨ２に対して、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉおよ
びＢａｍＨ Ｉを同時に作用させ完全に切断した。一
方、実施例２−２の方法で調製したプラスミド ｐＵＢ
１１０に対して、制限酵素ＥｃｏＲ ＩおよびＢａｍＨ
Ｉを同時に作用させ完全に切断した。両断片の結合
は、Ｔ4ＤＮＡリガーゼ を用いて実施例１−３と同様に
作用させ組換えＤＮＡを作製した。 【００７２】 【実施例７−３】 〈組換えＤＮＡのバチルス ズブチリスへの導入〉宿主
微生物として、アミラーゼ産生能を欠いているバチルス
ズブチリス７１５Ａを用いて、実施例２−４の方法に
準じて、バチルス マセランス由来のポリペプチド遺伝
子を含む組換えＤＮＡが導入されている形質転換微生物
を選択した。本微生物の一菌株をバチルス ズブチリス
ＭＡＵ２１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１１１）と命名
し、これが保有する組換えＤＮＡをｐＭＡＵ２１０と命
名した。組換えＤＮＡ ｐＭＡＵ２１０について、バチ
ルス マセランス由来ＤＮＡ部分の制限酵素切断地図を
図４に示す。 【００７３】図４から明らかなように、制限酵素Ｐｖｕ
ＩＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ａｖａ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉで切断を
受けることが判明した。一方、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ、
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｋｐｎ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、Ｘｂａ
Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、ＳｍａＩでは切断されなかった。 【００７４】 【実施例８】 〈バチルス マセランス由来ポリペプチドのＮ末端を含
有する部分アミノ酸配列〉 【００７５】 【実施例８−１】 〈ポリペプチドの調製〉バチルス ズブチリス ＭＡＵ
２１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１１１）を、実施例１０に
示す方法と同様に液体培養して培地中にポリペプチドを
産生させた。次いで、実施例４−１の方法に準じて精製
し、極めて高純度のポリペプチドを採取した。本品は、
ＳＤＳ−ポリアクリル電気泳動法で７０，０００±１
０，０００の分子量を示し、比活性２００±３０単位／
ｍｇ蛋白質を示した。 【００７６】 【実施例８−２】 〈Ｎ末端を含有するアミノ酸配列〉実施例８−１の方法
で調製したポリペプチドを用いて、実施例３−２と同様
にしてＮ末端を含有する部分アミノ酸配列を決定した。
その結果は、配列表における配列番号７の配列を有して
いることが判明した。 【００７７】 【実施例９】 〈バチルス マセランス由来ポリペプチド遺伝子の塩基
配列およびポリペプチドのアミノ酸配列〉 【００７８】 【実施例９−１】 〈ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡの作製〉実施
例４−３の方法に準じて組換えＤＮＡを作製した。即
ち、実施例７−２の方法で調製したポリペプチド遺伝子
を含む断片に、更に各種制限酵素を作用させて切断し、
また、実施例４−２の方法で調製したｐＵＣ１８を同様
に制限酵素で切断し、これら両断片にＴ4ＤＮＡリガー
ゼ を作用させて組換えＤＮＡを作製した。 【００７９】 【実施例９−２】 〈組換えＤＮＡのエッシェリヒア コリへの導入〉宿主
微生物として、エッシェリヒア コリ ＪＭ３８を用い
て、実施例４−３の方法に準じて、組換えＤＮＡを移入
し、形質転換微生物を選択した。 【００８０】 【実施例９−３】〈形質転換微生物からの組換えＤＮＡ
の調製〉 実施例４−４の方法に準じて、組換えＤＮＡを調製し
た。 【００８１】 【実施例９−４】 〈組換えＤＮＡの塩基配列〉実施例４−５の方法に準じ
て、ポリペプチド遺伝子の塩基配列を決定した。その結
果は、配列表における配列番号１３に示した。また、そ
れの５´側に続くシグナルペプチド遺伝子の塩基配列
も、同様にして調べた。その結果は、配列表における配
列番号１４に示した。 【００８２】 【実施例９−５】 〈ポリペプチドのアミノ酸配列〉配列表における配列番
号１３の塩基配列を用いて、ポリペプチドのアミノ酸配
列を決定し、その結果を配列表における配列番号１２に
示した。また、それのＮ末端側に続くシグナルペプチド
のアミノ酸配列を決定し、その結果を配列表における配
列番号１５に示した。以上の結果から、バチルス マセ
ランス由来のポリペプチドのアミノ酸配列は、配列表に
おける配列番号１２の配列を示していることが明らかに
なった。なお、配列表における配列番号８と配列表にお
ける配列番号１２の結果から、いずれのポリペプチドに
も共通な部分アミノ酸配列として、配列表における配列
番号１乃至５の配列を有していることが判明し、しか
も、これらアミノ酸配列を、Ｎ末端側から配列表におけ
る配列番号１乃至５の順序で有していることが判明し
た。 【００８３】 【実施例１０】 〈形質転換微生物によるポリペプチドの調製〉バチルス
マセランス由来ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮ
Ａを導入した形質転換微生物エッシェリヒア コリ Ｍ
ＡＨ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１１０）およびバチルス
ズブチリス ＭＡＵ２１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１１
１）を用いてポリペプチドを調製した。また、これら形
質転換微生物と宿主微生物並びに供与対微生物バチルス
マセランスの産生するポリペプチド生産量をその活性
で比較した。液体培地は、実施例５の方法で調製した。 【００８４】エッシェリヒア コリ ＭＡＨ２の場合に
は、この培地に、抗生物質アンピシリンをｍｌ当たり５
０μｇの割合で加えて植菌し、また、エッシェリヒア
コリＨＢ１０１の場合には、抗生物質を加えずに植菌
し、それぞれ３５℃で２４時間通気攪拌培養した。ま
た、バチルス ズブチリス ＭＡＵ２１０の場合には、
前記液体培地に抗生物質カナマイシンをｍｌ当たり５μ
ｇの割合で加えて植菌し、また、バチルス ズブチリス
７１５Ａの場合には抗生物質を加えずに植菌し、それ
ぞれ２８℃、７２時間培養した。また、バチルス マセ
ランス １７Ａの場合には、前記液体培地に抗生物質を
加えることなく、２８℃で７２時間培養した。各培養液
は、実施例５の場合と同様に処理して、活性を測定し
た。結果は、表３に示す。 【００８５】 【表３】 【００８６】表３の結果から明らかなように、形質転換
微生物からのポリペプチド産生量は向上しており、工業
的生産方法として好適である。 【００８７】 【実施例１１】 〈ポリペプチドを用いた糖転移反応〉実施例１０で調製
したエッシェリヒア コリ ＭＡＨ２の上清を硫安０．
６飽和で塩析して粗ポリペプチド剤を調製し、採取し
た。このポリペプチド剤を用いて、実施例５−３と同様
に、澱粉に作用させ、糖転移反応を起こさせた。その結
果を調べ、澱粉からスクロースへの糖転移量、澱粉から
のシクロデキストリンの生成量、シクロデキストリン
α、β、γの生成比率、ポリペプチドの至適温度、至適
ｐＨ、安定温度、安定ｐＨなどの酵素的性質について、
供与体微生物バチルス マセランスのものと比較したと
ころ、形質転換微生物の酵素的性質は、安定温度を含め
て、供与体微生物バチルス マセランスのものとよく一
致した。すなわち、このポリペプチドは、供与体微生物
バチルス マセランス由来のポリペプチドと同様に耐熱
性のポリペプチドであった。 【００８８】 【発明の効果】上記から明らかなように、本発明は、シ
クロマルトデキストリン グルカノトランスフェラーゼ
を用いる糖転移方法において、微生物由来のＤＮＡを適
宜宿主中で発現させて得ることのできる、部分アミノ酸
配列として配列表における配列番号１乃至５に示すアミ
ノ酸配列の１種または２種以上を含んでなるシクロマル
トデキストリン グルカノトランスフェラーゼ活性を有
するポリペプチドを用いて糖転移をおこなうものであ
る。本発明によれば、糖転移物を安定かつ容易に製造で
きることから、その工業的意義は大きい。 【００８９】 【配列表】 配列番号：1 配列の長さ：9 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：中間部フラグメント 配列 Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr 1 5 【００９０】配列番号：2 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：中間部フラグメント 配列 Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu 1 5 10 【００９１】配列番号：3 配列の長さ：12 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：中間部フラグメント 配列 Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe 1 5 10 【００９２】配列番号：4 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：中間部フラグメント 配列 Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Arg 1 5 10 15 【００９３】配列番号：5 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：中間部フラグメント 配列 Asn Pro Ala Leu Ala Tyr Gly 1 5 【００９４】配列番号：6 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：Ｎ末端フラグメント 配列 Ala Gly Asn Leu Asn Lys Val Asn Phe Thr 1 5 10 【００９５】配列番号：7 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：Ｎ末端フラグメント 配列 Ser Pro Asp Thr Ser Val Asn Asn Lys Leu 1 5 10 【００９６】配列番号：8 配列の長さ：680 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Gly Asn Leu Asn Lys Val Asn Phe Thr Ser Asp Val Val Tyr Gln Ile 1 5 10 15 Val Val Asp Arg Phe Val Asp Gly Asn Thr Ser Asn Asn Pro Ser Gly Ala 20 25 30 Leu Phe Ser Ser Gly Cys Thr Asn Leu Arg Lys Tyr Cys Gly Gly Asp Trp 35 40 45 50 Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr Asp Met Gly Val 55 60 65 Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Val Phe Ser Val Met Asn 70 75 80 85 Asp Ala Ser Gly Ser Ala Ser Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys 90 95 100 Lys Pro Asn Pro Phe Phe Gly Thr Leu Ser Asp Phe Gln Arg Leu Val Asp 105 110 115 Ala Ala His Ala Lys Gly Ile Lys Val Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His 120 125 130 135 Thr Ser Pro Ala Ser Glu Thr Asn Pro Ser Tyr Met Glu Asn Gly Arg Leu 140 145 150 Tyr Asp Asn Gly Thr Leu Leu Gly Gly Tyr Thr Asn Asp Ala Asn Met Tyr 155 160 165 170 Phe His His Asn Gly Gly Thr Thr Phe Ser Ser Leu Glu Asp Gly Ile Tyr 175 180 185 Arg Asn Leu Phe Asp Leu Ala Asp Leu Asn His Gln Asn Pro Val Ile Asp 190 195 200 Arg Tyr Leu Lys Asp Ala Val Lys Met Trp Ile Asp Met Gly Ile Asp Gly 205 210 215 220 Ile Arg Met Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys Ser Leu 225 230 235 Met Asp Glu Ile Asp Asn Tyr Arg Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe 240 245 250 255 Leu Ser Glu Asn Glu Val Asp Ala Asn Asn His Tyr Phe Ala Asn Glu Ser 260 265 270 Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Gly Gln Lys Leu Arg Gln Val Leu 275 280 285 Arg Asn Asn Ser Asp Asn Trp Tyr Gly Phe Asn Gln Met Ile Gln Asp Thr 290 295 300 305 Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Val Leu Asp Gln Val Thr Phe Ile Asp Asn His 310 315 320 Asp Met Asp Arg Phe Met Ile Asp Gly Gly Asp Pro Arg Lys Val Asp Met 325 330 335 340 Ala Leu Ala Val Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro Asn Ile Tyr Tyr Gly 345 350 355 Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Arg Lys Met Met 360 365 370 Ser Ser Phe Asn Lys Asn Thr Arg Ala Tyr Gln Val Ile Gln Lys Leu Ser 375 380 385 390 Ser Leu Arg Arg Asn Asn Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Asp Thr Glu Gln Arg 395 400 405 Trp Ile Asn Gly Asp Val Tyr Val Tyr Glu Arg Gln Phe Gly Lys Asp Val 410 415 420 425 Val Leu Val Arg Val Asn Arg Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ser Ile Thr Gly 430 435 440 Leu Phe Thr Ala Leu Pro Ala Gly Thr Tyr Thr Asp Gln Leu Gly Gly Leu 445 450 455 Leu Asp Gly Asn Thr Ile Gln Val Gly Ser Asn Gly Ser Val Asn Ala Phe 460 465 470 475 Asp Leu Gly Pro Gly Glu Val Gly Val Trp Ala Tyr Ser Ala Thr Glu Ser 480 485 490 Thr Pro Ile Ile Gly His Val Gly Pro Met Met Gly Gln Val Gly His Gln 495 500 505 510 Val Thr Ile Asp Gly Glu Gly Phe Gly Thr Asn Thr Gly Thr Val Lys Phe 515 520 525 Gly Thr Thr Ala Ala Asn Val Val Ser Trp Ser Asn Asn Gln Ile Val Val 530 535 540 Ala Val Pro Asn Val Ser Pro Gly Lys Tyr Asn Ile Thr Val Gln Ser Ser 545 550 555 560 Ser Gly Gln Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Asn Phe Glu Val Leu Thr Asn Asp 565 570 575 Gln Val Ser Val Arg Phe Val Val Asn Asn Ala Thr Thr Asn Leu Gly Gln 580 585 590 595 Asn Ile Tyr Ile Val Gly Asn Val Tyr Glu Leu Gly Asn Trp Asp Thr Ser 600 605 610 Lys Ala Ile Gly Pro Met Phe Asn Gln Val Val Tyr Ser Tyr Pro Thr Trp 615 620 625 Tyr Ile Asp Val Ser Val Pro Glu Gly Lys Thr Ile Glu Phe Lys Phe Ile 630 635 640 645 Lys Lys Asp Ser Gln Gly Asn Val Thr Trp Glu Ser Gly Ser Asn His Val 650 655 660 Tyr Thr Thr Pro Thr Asn Thr Thr Gly Lys Ile Ile Val Asp Trp Gln Asn 665 670 675 680 【００９７】配列番号：9 配列の長さ：2040 配列の型：核酸 配列 GCTGGAAATC TTAATAAGGT AAACTTTACA TCAGATGTTG TCTATCAAAT TGTAGTGGAT 60 CGATTTGTGG ATGGAAATAC ATCCAATAAT CCGAGTGGAG CATTATTTAG CTCAGGATGT 120 ACGAATTTAC GCAAGTATTG CGGTGGAGAT TGGCAAGGCA TCATCAATAA AATTAACGAT 180 GGGTATTTAA CAGATATGGG TGTGACAGCG ATATGGATTT CTCAGCCTGT AGAAAATGTA 240 TTTTCTGTGA TGAATGATGC AAGCGGTTCC GCATCCTATC ATGGTTATTG GGCGCGCGAT 300 TTCAAAAAGC CAAACCCGTT TTTTGGTACC CTCAGTGATT TCCAACGTTT AGTTGATGCC 360 GCACATGCAA AAGGAATAAA GGTAATTATT GACTTTGCCC CCAACCATAC TTCTCCTGCT 420 TCAGAAACGA ATCCTTCTTA TATGGAAAAC GGACGACTGT ACGATAATGG GACATTGCTT 480 GGCGGTTACA CAAATGATGC CAACATGTAT TTTCACCATA ACGGTGGAAC AACGTTTTCC 540 AGCTTAGAGG ATGGGATTTA TCGAAATCTG TTTGACTTGG CGGACCTTAA CCATCAGAAC 600 CCTGTTATTG ATAGGTATTT AAAAGATGCA GTAAAAATGT GGATAGATAT GGGGATTGAT 660 GGTATCCGTA TGGATGCGGT GAAGCACATG CCGTTTGGAT GGCAAAAATC TCTGATGGAT 720 GAGATTGATA ACTATCGTCC TGTCTTTACG TTTGGGGAGT GGTTTTTGTC AGAAAATGAA 780 GTGGACGCGA ACAATCATTA CTTTGCCAAT GAAAGTGGAA TGAGTTTGCT CGATTTTCGT 840 TTCGGACAAA AGCTTCGTCA AGTATTGCGC AATAACAGCG ATAATTGGTA TGGCTTTAAT 900 CAAATGATTC AAGATACGGC ATCAGCATAT GACGAGGTTC TCGATCAAGT AACATTCATA 960 GACAACCATG ATATGGATCG GTTTATGATT GACGGAGGAG ATCCGCGCAA GGTGGATATG 1020 GCACTTGCTG TATTATTGAC ATCCCGTGGC GTACCGAATA TTTACTATGG TACAGAGCAA 1080 TACATGACCG GTAACGGCGA TCCAAACAAT CGTAAGATGA TGAGTTCATT CAATAAAAAT 1140 ACTCGCGCGT ATCAAGTGAT TCAAAAACTA TCTTCTCTCC GACGAAACAA TCCGGCGTTA 1200 GCTTATGGTG ATACGGAACA GCGTTGGATC AATGGCGATG TGTATGTGTA TGAGCGACAG 1260 TTTGGCAAAG ATGTTGTGTT AGTTCGGGTT AATCGTAGTT CAAGCAGTAA TTACTCGATT 1320 ACTGGCTTAT TTACAGCTTT ACCAGCAGGA ACATATACGG ATCAGCTTGG CGGTCTTTTA 1380 GACGGAAATA CAATTCAAGT CGGTTCAAAT GGATCAGTTA ATGCATTTGA CTTAGGACCG 1440 GGGGAAGTCG GTGTATGGGC ATACAGTGCA ACAGAAAGCA CGCCAATTAT TGGTCATGTT 1500 GGACCGATGA TGGGGCAAGT CGGTCATCAA GTAACCATTG ATGGCGAAGG ATTCGGAACA 1560 AATACGGGCA CTGTGAAGTT CGGAACGACA GCTGCCAATG TTGTGTCTTG GTCTAACAAT 1620 CAAATCGTTG TGGCTGTACC AAATGTGTCA CCAGGAAAAT ATAATATTAC CGTCCAATCA 1680 TCAAGCGGTC AAACGAGTGC GGCTTATGAT AACTTTGAAG TACTAACAAA TGATCAAGTG 1740 TCAGTGCGGT TTGTTGTTAA TAACGCGACT ACCAATCTAG GGCAAAATAT ATACATTGTT 1800 GGCAACGTAT ATGAGCTCGG CAACTGGGAC ACTAGTAAGG CAATCGGTCC AATGTTCAAT 1860 CAAGTGGTTT ACTCCTATCC TACATGGTAT ATAGATGTCA GTGTCCCAGA AGGAAAGACA 1920 ATTGAGTTTA AGTTTATTAA AAAAGACAGC CAAGGTAATG TCACTTGGGA AAGTGGTTCA 1980 AATCATGTTT ATACGACACC AACGAATACA ACCGGAAAAA TTATAGTGGA TTGGCAGAAC 2040 【００９８】配列番号：10 配列の長さ：93 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 シグナルペプチド遺伝子の塩基
配列 配列 ATGAGAAGAT GGCTTTCGCT AGTCTTGAGC ATGTCATTTG TATTTAGTGC AATTTTTATA 60 GTATCTGATA CGCAGAAAGT CACCGTTGAA GCA 93 【００９９】配列番号：11 配列の長さ：31 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を示す記号：sig peptide 配列 Met Arg Arg Trp Leu Ser Leu Val Leu Ser Met Ser Phe Val Phe Ser Ala -30 -25 -20 -15 Ile Phe Ile Val Ser Asp Thr Gln Lys Val Thr Val Glu Ala -10 -5 【０１００】配列番号：12 配列の長さ：686 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Pro Asp Thr Ser Val Asn Asn Lys Leu Asn Phe Ser Thr Asp Thr Val 1 5 10 15 Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Val Asp Gly Asn Ser Ala Asn Asn Pro 20 25 30 Thr Gly Ala Ala Phe Ser Ser Asp His Ser Asn Leu Lys Leu Tyr Phe Gly 35 40 45 50 Gly Asp Trp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr Gly 55 60 65 Met Gly Ile Thr Ala Leu Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Ile Thr Ala 70 75 80 85 Val Ile Asn Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ala Tyr His Gly Tyr Trp Pro 90 95 100 Arg Asp Phe Lys Lys Thr Asn Ala Ala Phe Gly Ser Phe Thr Asp Phe Ser 105 110 115 Asn Leu Ile Ala Ala Ala His Ser His Asn Ile Lys Val Val Met Asp Phe 120 125 130 135 Ala Pro Asn His Thr Asn Pro Ala Ser Ser Thr Asp Pro Ser Phe Ala Glu 140 145 150 Asn Gly Ala Leu Tyr Asn Asn Gly Thr Leu Leu Gly Lys Tyr Ser Asn Asp 155 160 165 170 Thr Ala Gly Leu Phe His His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Thr Glu 175 180 185 Ser Gly Ile Tyr Lys Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Ile Asn Gln Asn Asn 190 195 200 Asn Thr Ile Asp Ser Tyr Leu Lys Glu Ser Ile Gln Leu Trp Leu Asn Leu 205 210 215 220 Gly Val Asp Gly Ile Arg Phe Asp Ala Val Lys His Met Pro Gln Gly Trp 225 230 235 Gln Lys Ser Tyr Val Ser Ser Ile Tyr Ser Ser Ala Asn Pro Val Phe Thr 240 245 250 255 Phe Gly Glu Trp Phe Leu Gly Pro Asp Glu Met Thr Gln Asp Asn Ile Asn 260 265 270 Phe Ala Asn Gln Ser Gly Met His Leu Leu Asp Phe Ala Phe Ala Gln Glu 275 280 285 Ile Arg Glu Val Phe Arg Asp Lys Ser Glu Thr Met Thr Asp Leu Asn Ser 290 295 300 305 Val Ile Ser Ser Thr Gly Ser Ser Tyr Asn Tyr Ile Asn Asn Met Val Thr 310 315 320 Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Gln Gln Ala Gly Ala Ser Thr 325 330 335 340 Arg Pro Thr Glu Gln Ala Leu Ala Val Thr Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro 345 350 355 Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly Asn Gly Asp Pro Asn 360 365 370 Asn Arg Gly Met Met Thr Gly Phe Asp Thr Asn Lys Thr Ala Tyr Lys Val 375 380 385 390 Ile Lys Ala Leu Ala Pro Leu Arg Lys Ser Asn Pro Ala Leu Ala Tyr Gly 395 400 405 Ser Thr Thr Gln Arg Trp Val Asn Ser Asp Val Tyr Val Tyr Glu Arg Lys 410 415 420 425 Phe Gly Ser Asn Val Ala Leu Val Ala Val Asn Arg Ser Ser Thr Thr Ala 430 435 440 Tyr Pro Ile Ser Gly Ala Leu Thr Ala Leu Pro Asn Gly Thr Tyr Thr Asp 445 450 455 Val Leu Gly Gly Leu Leu Asn Gly Asn Ser Ile Thr Val Asn Gly Gly Thr 460 465 470 475 Val Ser Asn Phe Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr 480 485 490 Thr Thr Glu Ser Ser Pro Ile Ile Gly Asn Val Gly Pro Thr Met Gly Lys 495 500 505 510 Pro Gly Asn Thr Ile Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Thr Thr Lys Asn 515 520 525 Lys Val Thr Phe Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ala Asn Ile Val Ser Trp 530 535 540 Glu Asp Thr Glu Ile Lys Val Lys Val Pro Asn Val Ala Ala Gly Asn Thr 545 550 555 560 Ala Val Thr Val Thr Asn Ala Ala Gly Thr Thr Ser Ala Ala Phe Asn Asn 565 570 575 Phe Asn Val Leu Thr Ala Asp Gln Val Thr Val Arg Phe Lys Val Asn Asn 580 585 590 595 Ala Thr Thr Ala Leu Gly Gln Asn Val Tyr Leu Thr Gly Asn Val Ala Glu 600 605 610 Leu Gly Asn Trp Thr Ala Ala Asn Ala Ile Gly Pro Met Tyr Asn Gln Val 615 620 625 Glu Ala Ser Tyr Pro Thr Trp Tyr Phe Asp Val Ser Val Pro Ala Asn Thr 630 635 640 645 Ala Leu Gln Phe Lys Phe Ile Lys Val Asn Gly Ser Thr Val Thr Trp Glu 650 655 660 Gly Gly Asn Asn His Thr Phe Thr Ser Pro Ser Ser Gly Val Ala Thr Val 665 670 675 680 Thr Val Asp Trp Gln Asn 685 【０１０１】配列番号：13 配列の長さ：2058 配列の型：核酸 配列 TCCCCGGATA CGAGCGTGAA CAACAAGCTC AATTTTAGCA CGGATACGGT TTACCAGATT 60 GTAACCGACC GGTTTGTGGA CGGCAATTCC GCCAACCACC CGACCGGAGC AGCCTTCAGC 120 AGCGATCATT CCAACCTGAA GCTGTATTTC GGGGGCGACT GGCAGGGGAT CACGAACAAA 180 ATCAACGACG GCTATCTGAC CGGAATGGGC ATCACCGCCC TCTGGATCTC GCAGCCGGTT 240 GAGAACATCA CCGCCGTCAT CAAATATTCG GGCGTCAACA ATACAGCTTA CCACGGTTAC 300 TGGCCTCGCG ACTTCAAGAA GACCAATGCC GCGTTCGGCA GCTTCACCGA CTTCTCCAAT 360 TTGATCGCCG CAGCGCATTC ACACAATATC AAGGTAGTTA TGGACTTTGC ACCTAATCAC 420 ACCAACCCGG CTTCGAGTAC GGACCCCTCG TTCGCCGAGA ACGGCGCGCT CTACAACAAC 480 GGAACGCTGC TCGGCAAGTA TAGCAACGAT ACCGCCGGCC TGTTCCACCA CAATGGCGGC 540 ACCGATTTCT CGACGACTGA AAGCGGTATC TACAAGAACC TGTACGATCT CGCGGATATC 600 AATCAGAACA ACAACACCAT CGACTCGTAT CTCAAGGAAT CGATCCAGCT GTGGCTGAAT 660 CTCGGAGTCG ACGGCATCCG CTTCGACGCC GTGAAGCATA TGCCTCAGGG CTGGCAGAAG 720 AGCTACGTCT CGTCGATCTA CAGCAGCGCC AATCCGGTGT TCACCTTCGG TGAATGGTTC 780 CTCGGCCCCG ACGAAATGAC CCAGGACAAC ATCAACTTCG CGAATCAGAG CGGCATGCAC 840 CTGCTGGACT TTGCGTTTGC GCAGGAAATC CGTGAAGTGT TCCGCGACAA GTCGGAGACG 900 ATGACCGACC TGAACTCGGT GATCTCCAGC ACCGGCTCCA GCTATAATTA CATCAACAAC 960 ATGGTTACGT TCATCGACAA CCATGACATG GACCGCTTCC AGCAAGCCGG AGCGAGCACT 1020 CGCCCGACCG AGCAGGCTCT TGCGGTAACG CTGACTTCCC GCGGCGTTCC GGCAATCTAC 1080 TACGGTACAG AGCAATATAT GACCGGCAAC GGCGACCCGA ACAACCGCGG CATGATGACC 1140 GGCTTCGATA CGAACAAGAC AGCGTACAAA GTGATCAAGG CGCTGGCTCC GCTTCGCAAG 1200 TCCAACCCGG CTCTCGCCTA CGGCTCGACG ACCCAGCGTT GGGTGAACAG CGACGTCTAC 1260 GTATATGAAC GCAAGTTCGG AAGCAACGTA GCTCTCGTTG CCGTCAACCG CAGCTCGACG 1320 ACTGCCTATC CGATATCGGG AGCGCTTACT GCTCTGCCAA ACGGAACGTA TACCGACGTT 1380 CTCGGCGGCC TGCTTAATGG CAATTCAATT ACCGTTAACG GCGGCACGGT CAGCAACTTT 1440 ACACTTGCAG CGGGCGGTAC GGCAGTCTGG CAGTACACGA CGACGGAATC CTCGCCGATT 1500 ATCGGCAACG TCGGCCCGAC TATGGGCAAG CCCGGCAACA CCATCACGAT CGACGGACGC 1560 GGCTTCGGTA CTACGAAGAA CAAAGTTACT TTCGGTACGA CAGCCGTTAC CGGCGCGAAC 1620 ATCGTGAGCT GGGAAGATAC CGAAATCAAG GTCAAAGTTC CGAACGTGGC CGCCGGCAAC 1680 ACGGCCGTTA CGGTAACGAA CGCCGCCGGC ACTACCAGCG CAGCGTTCAA CAACTTTAAC 1740 GTACTGACTG CCGATCAGGT CACTGTCCGC TTCAAAGTCA ACAATGCCAC CACGGCCCTG 1800 GGACAAAACG TCTACCTGAC CGGTAACGTC GCCGAGCTTG GCAACTGGAC AGCCGCCAAC 1860 GCAATCGGTC CGATGTACAA CCAGGTAGAA GCCAGCTATC CGACTTGGTA CTTCGACGTC 1920 AGCGTTCCGG CCAACACGGC GCTGCAATTC AAGTTCATCA AAGTGAACGG CTCGACAGTG 1980 ACTTGGGAAG GCGGCAACAA CCACACCTTC ACCTCGCCTT CGAGCGGCGT TGCGACCGTA 2040 ACGGTCGATT GGCAGAAC 2058 【０１０２】配列番号：14 配列の長さ：81 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 シグナルペプチド遺伝子の塩基
配列 配列 ATGAAAAAGC AAGTCAAATG GTTGACGTCG GTGTCGATGT CCGTAGGGAT CGCACTCGGC 60 GCGGCGCTGC CTGTATGGGC A 81 【０１０３】配列番号：15 配列の長さ：27 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を示す記号：sig peptide 配列 Met Lys Lys Gln Val Lys Trp Leu Thr Ser Val Ser Met Ser Val Gly Ile -25 -20 -15 Ala Leu Gly Ala Ala Leu Pro Val Trp Ala -10 -5 【０１０４】配列番号：16 配列の長さ：2040 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 起源 生物名：バチルス ステアロサーモフィラス 株名：ＦＥＲＭ Ｐ−２２２５ 配列 GCT GGA AAT CTT AAT AAG GTA AAC TTT ACA TCA GAT GTT GTC TAT CAA 48 Ala Gly Asn Leu Asn Lys Val Asn Phe Thr Ser Asp Val Val Tyr Gln 1 5 10 15 ATT GTA GTG GAT CGA TTT GTG GAT GGA AAT ACA TCC AAT AAT CCG AGT 96 Ile Val Val Asp Arg Phe Val Asp Gly Asn Thr Ser Asn Asn Pro Ser 20 25 30 GGA GCA TTA TTT AGC TCA GGA TGT ACG AAT TTA CGC AAG TAT TGC GGT 144 Gly Ala Leu Phe Ser Ser Gly Cys Thr Asn Leu Arg Lys Tyr Cys Gly 35 40 45 GGA GAT TGG CAA GGC ATC ATC AAT AAA ATT AAC GAT GGG TAT TTA ACA 192 Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr 50 55 60 GAT ATG GGT GTG ACA GCG ATA TGG ATT TCT CAG CCT GTA GAA AAT GTA 240 Asp Met Gly Val Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Val 65 70 75 80 TTT TCT GTG ATG AAT GAT GCA AGC GGT TCC GCA TCC TAT CAT GGT TAT 288 Phe Ser Val Met Asn Asp Ala Ser Gly Ser Ala Ser Tyr His Gly Tyr 85 90 95 TGG GCG CGC GAT TTC AAA AAG CCA AAC CCG TTT TTT GGT ACC CTC AGT 336 Trp Ala Arg Asp Phe Lys Lys Pro Asn Pro Phe Phe Gly Thr Leu Ser 100 105 110 GAT TTC CAA CGT TTA GTT GAT GCC GCA CAT GCA AAA GGA ATA AAG GTA 384 Asp Phe Gln Arg Leu Val Asp Ala Ala His Ala Lys Gly Ile Lys Val 115 120 125 ATT ATT GAC TTT GCC CCC AAC CAT ACT TCT CCT GCT TCA GAA ACG AAT 432 Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala Ser Glu Thr Asn 130 135 140 CCT TCT TAT ATG GAA AAC GGA CGA CTG TAC GAT AAT GGG ACA TTG CTT 480 Pro Ser Tyr Met Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn Gly Thr Leu Leu 145 150 155 160 GGC GGT TAC ACA AAT GAT GCC AAC ATG TAT TTT CAC CAT AAC GGT GGA 528 Gly Gly Tyr Thr Asn Asp Ala Asn Met Tyr Phe His His Asn Gly Gly 165 170 175 ACA ACG TTT TCC AGC TTA GAG GAT GGG ATT TAT CGA AAT CTG TTT GAC 576 Thr Thr Phe Ser Ser Leu Glu Asp Gly Ile Tyr Arg Asn Leu Phe Asp 180 185 190 TTG GCG GAC CTT AAC CAT CAG AAC CCT GTT ATT GAT AGG TAT TTA AAA 624 Leu Ala Asp Leu Asn His Gln Asn Pro Val Ile Asp Arg Tyr Leu Lys 195 200 205 GAT GCA GTA AAA ATG TGG ATA GAT ATG GGG ATT GAT GGT ATC CGT ATG 672 Asp Ala Val Lys Met Trp Ile Asp Met Gly Ile Asp Gly Ile Arg Met 210 215 220 GAT GCG GTG AAG CAC ATG CCG TTT GGA TGG CAA AAA TCT CTG ATG GAT 720 Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys Ser Leu Met Asp 225 230 235 240 GAG ATT GAT AAC TAT CGT CCT GTC TTT ACG TTT GGG GAG TGG TTT TTG 768 Glu Ile Asp Asn Tyr Arg Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu 245 250 255 TCA GAA AAT GAA GTG GAC GCG AAC AAT CAT TAC TTT GCC AAT GAA AGT 816 Ser Glu Asn Glu Val Asp Ala Asn Asn His Tyr Phe Ala Asn Glu Ser 260 265 270 GGA ATG AGT TTG CTC GAT TTT CGT TTC GGA CAA AAG CTT CGT CAA GTA 864 Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Gly Gln Lys Leu Arg Gln Val 275 280 285 TTG CGC AAT AAC AGC GAT AAT TGG TAT GGC TTT AAT CAA ATG ATT CAA 912 Leu Arg Asn Asn Ser Asp Asn Trp Tyr Gly Phe Asn Gln Met Ile Gln 290 295 300 GAT ACG GCA TCA GCA TAT GAC GAG GTT CTC GAT CAA GTA ACA TTC ATA 960 Asp Thr Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Val Leu Asp Gln Val Thr Phe Ile 305 310 315 320 GAC AAC CAT GAT ATG GAT CGG TTT ATG ATT GAC GGA GGA GAT CCG CGC 1008 Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Met Ile Asp Gly Gly Asp Pro Arg 325 330 335 AAG GTG GAT ATG GCA CTT GCT GTA TTA TTG ACA TCC CGT GGC GTA CCG 1056 Lys Val Asp Met Ala Leu Ala Val Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro 340 345 350 AAT ATT TAC TAT GGT ACA GAG CAA TAC ATG ACC GGT AAC GGC GAT CCA 1104 Asn Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly Asn Gly Asp Pro 355 360 365 AAC AAT CGT AAG ATG ATG AGT TCA TTC AAT AAA AAT ACT CGC GCG TAT 1156 Asn Asn Arg Lys Met Met Ser Ser Phe Asn Lys Asn Thr Arg Ala Tyr 370 375 380 CAA GTG ATT CAA AAA CTA TCT TCT CTC CGA CGA AAC AAT CCG GCG TTA 1200 Gln Val Ile Gln Lys Leu Ser Ser Leu Arg Arg Asn Asn Pro Ala Leu 385 390 395 400 GCT TAT GGT GAT ACG GAA CAG CGT TGG ATC AAT GGC GAT GTG TAT GTG 1248 Ala Tyr Gly Asp Thr Glu Gln Arg Trp Ile Asn Gly Asp Val Tyr Val 405 410 415 TAT GAG CGA CAG TTT GGC AAA GAT GTT GTG TTA GTT CGG GTT AAT CGT 1296 Tyr Glu Arg Gln Phe Gly Lys Asp Val Val Leu Val Arg Val Asn Arg 420 425 430 AGT TCA AGC AGT AAT TAC TCG ATT ACT GGC TTA TTT ACA GCT TTA CCA 1344 Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ser Ile Thr Gly Leu Phe Thr Ala Leu Pro 435 440 445 GCA GGA ACA TAT ACG GAT CAG CTT GGC GGT CTT TTA GAC GGA AAT ACA 1392 Ala Gly Thr Tyr Thr Asp Gln Leu Gly Gly Leu Leu Asp Gly Asn Thr 450 455 460 ATT CAA GTC GGT TCA AAT GGA TCA GTT AAT GCA TTT GAC TTA GGA CCG 1440 Ile Gln Val Gly Ser Asn Gly Ser Val Asn Ala Phe Asp Leu Gly Pro 465 470 475 480 GGG GAA GTC GGT GTA TGG GCA TAC AGT GCA ACA GAA AGC ACG CCA ATT 1488 Gly Glu Val Gly Val Trp Ala Tyr Ser Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ile 485 490 495 ATT GGT CAT GTT GGA CCG ATG ATG GGG CAA GTC GGT CAT CAA GTA ACC 1536 Ile Gly His Val Gly Pro Met Met Gly Gln Val Gly His Gln Val Thr 500 505 510 ATT GAT GGC GAA GGA TTC GGA ACA AAT ACG GGC ACT GTG AAG TTC GGA 1584 Ile Asp Gly Glu Gly Phe Gly Thr Asn Thr Gly Thr Val Lys Phe Gly 515 520 525 ACG ACA GCT GCC AAT GTT GTG TCT TGG TCT AAC AAT CAA ATC GTT GTG 1632 Thr Thr Ala Ala Asn Val Val Ser Trp Ser Asn Asn Gln Ile Val Val 530 535 540 GCT GTA CCA AAT GTG TCA CCA GGA AAA TAT AAT ATT ACC GTC CAA TCA 1680 Ala Val Pro Asn Val Ser Pro Gly Lys Tyr Asn Ile Thr Val Gln Ser 545 550 555 560 TCA AGC GGT CAA ACG AGT GCG GCT TAT GAT AAC TTT GAA GTA CTA ACA 1728 Ser Ser Gly Gln Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Asn Phe Glu Val Leu Thr 565 570 575 AAT GAT CAA GTG TCA GTG CGG TTT GTT GTT AAT AAC GCG ACT ACC AAT 1776 Asn Asp Gln Val Ser Val Arg Phe Val Val Asn Asn Ala Thr Thr Asn 580 585 590 CTA GGG CAA AAT ATA TAC ATT GTT GGC AAC GTA TAT GAG CTC GGC AAC 1824 Leu Gly Gln Asn Ile Tyr Ile Val Gly Asn Val Tyr Glu Leu Gly Asn 595 600 605 TGG GAC ACT AGT AAG GCA ATC GGT CCA ATG TTC AAT CAA GTG GTT TAC 1872 Trp Asp Thr Ser Lys Ala Ile Gly Pro Met Phe Asn Gln Val Val Tyr 610 615 620 TCC TAT CCT ACA TGG TAT ATA GAT GTC AGT GTC CCA GAA GGA AAG ACA 1920 Ser Tyr Pro Thr Trp Tyr Ile Asp Val Ser Val Pro Glu Gly Lys Thr 625 630 635 640 ATT GAG TTT AAG TTT ATT AAA AAA GAC AGC CAA GGT AAT GTC ACT TGG 1968 Ile Glu Phe Lys Phe Ile Lys Lys Asp Ser Gln Gly Asn Val Thr Trp 645 650 655 GAA AGT GGT TCA AAT CAT GTT TAT ACG ACA CCA ACG AAT ACA ACC GGA 2016 Glu Ser Gly Ser Asn His Val Tyr Thr Thr Pro Thr Asn Thr Thr Gly 660 665 670 AAA ATT ATA GTG GAT TGG CAG AAC 2040 Lys Ile Ile Val Asp Trp Gln Asn 675 680 【０１０５】配列番号：17 配列の長さ：2058 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 起源 生物名：バチルス マセランス 株名：バチルス マセランス １７Ａ 配列 TCC CCG GAT ACG AGC GTG AAC AAC AAG CTC AAT TTT AGC ACG GAT ACG 48 Ser Pro Asp Thr Ser Val Asn Asn Lys Leu Asn Phe Ser Thr Asp Thr 1 5 10 15 GTT TAC CAG ATT GTA ACC GAC CGG TTT GTG GAC GGC AAT TCC GCC AAC 96 Val Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Val Asp Gly Asn Ser Ala Asn 20 25 30 CAC CCG ACC GGA GCA GCC TTC AGC AGC GAT CAT TCC AAC CTG AAG CTG 144 Asn Pro Thr Gly Ala Ala Phe Ser Ser Asp His Ser Asn Leu Lys Leu 35 40 45 TAT TTC GGG GGC GAC TGG CAG GGG ATC ACG AAC AAA ATC AAC GAC GGC 192 Tyr Phe Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Ile Asn Asp Gly 50 55 60 TAT CTG ACC GGA ATG GGC ATC ACC GCC CTC TGG ATC TCG CAG CCG GTT 240 Tyr Leu Thr Gly Met Gly Ile Thr Ala Leu Trp Ile Ser Gln Pro Val 65 70 75 80 GAG AAC ATC ACC GCC GTC ATC AAA TAT TCG GGC GTC AAC AAT ACA GCT 288 Glu Asn Ile Thr Ala Val Ile Asn Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ala 85 90 95 TAC CAC GGT TAC TGG CCT CGC GAC TTC AAG AAG ACC AAT GCC GCG TTC 336 Tyr His Gly Tyr Trp Pro Arg Asp Phe Lys Lys Thr Asn Ala Ala Phe 100 105 110 GGC AGC TTC ACC GAC TTC TCC AAT TTG ATC GCC GCA GCG CAT TCA CAC 384 Gly Ser Phe Thr Asp Phe Ser Asn Leu Ile Ala Ala Ala His Ser His 115 120 125 AAT ATC AAG GTA GTT ATG GAC TTT GCA CCT AAT CAC ACC AAC CCG GCT 432 Asn Ile Lys Val Val Met Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Asn Pro Ala 130 135 140 TCG AGT ACG GAC CCC TCG TTC GCC GAG AAC GGC GCG CTC TAC AAC AAC 480 Ser Ser Thr Asp Pro Ser Phe Ala Glu Asn Gly Ala Leu Tyr Asn Asn 145 150 155 160 GGA ACG CTG CTC GGC AAG TAT AGC AAC GAT ACC GCC GGC CTG TTC CAC 528 Gly Thr Leu Leu Gly Lys Tyr Ser Asn Asp Thr Ala Gly Leu Phe His 165 170 175 CAC AAT GGC GGC ACC GAT TTC TCG ACG ACT GAA AGC GGT ATC TAC AAG 576 His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Thr Glu Ser Gly Ile Tyr Lys 180 185 190 AAC CTG TAC GAT CTC GCG GAT ATC AAT CAG AAC AAC AAC ACC ATC GAC 624 Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Ile Asn Gln Asn Asn Asn Thr Ile Asp 195 200 205 TCG TAT CTC AAG GAA TCG ATC CAG CTG TGG CTG AAT CTC GGA GTC GAC 672 Ser Tyr Leu Lys Glu Ser Ile Gln Leu Trp Leu Asn Leu Gly Val Asp 210 215 220 GGC ATC CGC TTC GAC GCC GTG AAG CAT ATG CCT CAG GGC TGG CAG AAG 720 Gly Ile Arg Phe Asp Ala Val Lys His Met Pro Gln Gly Trp Gln Lys 225 230 235 240 AGC TAC GTC TCG TCG ATC TAC AGC AGC GCC AAT CCG GTG TTC ACC TTC 768 Ser Tyr Val Ser Ser Ile Tyr Ser Ser Ala Asn Pro Val Phe Thr Phe 245 250 255 GGT GAA TGG TTC CTC GGC CCC GAC GAA ATG ACC CAG GAC AAC ATC AAC 816 Gly Glu Trp Phe Leu Gly Pro Asp Glu Met Thr Gln Asp Asn Ile Asn 260 265 270 TTC GCG AAT CAG AGC GGC ATG CAC CTG CTG GAC TTT GCG TTT GCG CAG 864 Phe Ala Asn Gln Ser Gly Met His Leu Leu Asp Phe Ala Phe Ala Gln 275 280 285 GAA ATC CGT GAA GTG TTC CGC GAC AAG TCG GAG ACG ATG ACC GAC CTG 912 Glu Ile Arg Glu Val Phe Arg Asp Lys Ser Glu Thr Met Thr Asp Leu 290 295 300 AAC TCG GTG ATC TCC AGC ACC GGC TCC AGC TAT AAT TAC ATC AAC AAC 960 Asn Ser Val Ile Ser Ser Thr Gly Ser Ser Tyr Asn Tyr Ile Asn Asn 305 310 315 320 ATG GTT ACG TTC ATC GAC AAC CAT GAC ATG GAC CGC TTC CAG CAA GCC 1008 Met Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Gln Gln Ala 325 330 335 GGA GCG AGC ACT CGC CCG ACC GAG CAG GCT CTT GCG GTA ACG CTG ACT 1056 Gly Ala Ser Thr Arg Pro Thr Glu Gln Ala Leu Ala Val Thr Leu Thr 340 345 350 TCC CGC GGC GTT CCG GCA ATC TAC TAC GGT ACA GAG CAA TAT ATG ACC 1104 Ser Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr 355 360 365 GGC AAC GGC GAC CCG AAC AAC CGC GGC ATG ATG ACC GGC TTC GAT ACG 1152 Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Arg Gly Met Met Thr Gly Phe Asp Thr 370 375 380 AAC AAG ACA GCG TAC AAA GTG ATC AAG GCG CTG GCT CCG CTT CGC AAG 1200 Asn Lys Thr Ala Tyr Lys Val Ile Lys Ala Leu Ala Pro Leu Arg Lys 385 390 395 400 TCC AAC CCG GCT CTC GCC TAC GGC TCG ACG ACC CAG CGT TGG GTG AAC 1248 Ser Asn Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Ser Thr Thr Gln Arg Trp Val Asn 405 410 415 AGC GAC GTC TAC GTA TAT GAA CGC AAG TTC GGA AGC AAC GTA GCT CTC 1296 Ser Asp Val Tyr Val Tyr Glu Arg Lys Phe Gly Ser Asn Val Ala Leu 420 425 430 GTT GCC GTC AAC CGC AGC TCG ACG ACT GCC TAT CCG ATA TCG GGA GCG 1344 Val Ala Val Asn Arg Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Ile Ser Gly Ala 435 440 445 CTT ACT GCT CTG CCA AAC GGA ACG TAT ACC GAC GTT CTC GGC GGC CTG 1392 Leu Thr Ala Leu Pro Asn Gly Thr Tyr Thr Asp Val Leu Gly Gly Leu 450 455 460 CTT AAT GGC AAT TCA ATT ACC GTT AAC GGC GGC ACG GTC AGC AAC TTT 1440 Leu Asn Gly Asn Ser Ile Thr Val Asn Gly Gly Thr Val Ser Asn Phe 465 470 475 480 ACA CTT GCA GCG GGC GGT ACG GCA GTC TGG CAG TAC ACG ACG ACG GAA 1488 Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Thr Thr Glu 485 490 495 TCC TCG CCG ATT ATC GGC AAC GTC GGC CCG ACT ATG GGC AAG CCC GGC 1536 Ser Ser Pro Ile Ile Gly Asn Val Gly Pro Thr Met Gly Lys Pro Gly 500 505 510 AAC ACC ATC ACG ATC GAC GGA CGC GGC TTC GGT ACT ACG AAG AAC AAA 1584 Asn Thr Ile Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Thr Thr Lys Asn Lys 515 520 525 GTT ACT TTC GGT ACG ACA GCC GTT ACC GGC GCG AAC ATC GTG AGC TGG 1632 Val Thr Phe Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ala Asn Ile Val Ser Trp 530 535 540 GAA GAT ACC GAA ATC AAG GTC AAA GTT CCG AAC GTG GCC GCC GGC AAC 1680 Glu Asp Thr Glu Ile Lys Val Lys Val Pro Asn Val Ala Ala Gly Asn 545 550 555 560 ACG GCC GTT ACG GTA ACG AAC GCC GCC GGC ACT ACC AGC GCA GCG TTC 1728 Thr Ala Val Thr Val Thr Asn Ala Ala Gly Thr Thr Ser Ala Ala Phe 565 570 575 AAC AAC TTT AAC GTA CTG ACT GCC GAT CAG GTC ACT GTC CGC TTC AAA 1776 Asn Asn Phe Asn Val Leu Thr Ala Asp Gln Val Thr Val Arg Phe Lys 580 585 590 GTC AAC AAT GCC ACC ACG GCC CTG GGA CAA AAC GTC TAC CTG ACC GGT 1824 Val Asn Asn Ala Thr Thr Ala Leu Gly Gln Asn Val Tyr Leu Thr Gly 595 600 605 AAC GTC GCC GAG CTT GGC AAC TGG ACA GCC GCC AAC GCA ATC GGT CCG 1872 Asn Val Ala Glu Leu Gly Asn Trp Thr Ala Ala Asn Ala Ile Gly Pro 610 615 620 ATG TAC AAC CAG GTA GAA GCC AGC TAT CCG ACT TGG TAC TTC GAC GTC 1920 Met Tyr Asn Gln Val Glu Ala Ser Tyr Pro Thr Trp Tyr Phe Asp Val 625 630 635 640 Ser Val Pro Ala Asn Thr Ala Leu Gln Phe Lys Phe Ile Lys Val Asn AGC GTT CCG GCC AAC ACG GCG CTG CAA TTC AAG TTC ATC AAA GTG AAC 1968 645 650 655 GGC TCG ACA GTG ACT TGG GAA GGC GGC AAC AAC CAC ACC TTC ACC TCG 2016 Gly Ser Thr Val Thr Trp Glu Gly Gly Asn Asn His Thr Phe Thr Ser 660 665 670 CCT TCG AGC GGC GTT GCG ACC GTA ACG GTC GAT TGG CAG AAC 2058 Pro Ser Ser Gly Val Ala Thr Val Thr Val Asp Trp Gln Asn 675 680 685
ストリン グルカノトランスフェラーゼ活性を有するポ
リペプチドを用いる糖転移方法に関し、更に詳しくは、
微生物由来のＤＮＡを適宜宿主中で発現させて得ること
のできる、部分アミノ酸配列として配列表における配列
番号１乃至５に示すアミノ酸配列の１種または２種以上
を含んでなるシクロマルトデキストリン グルカノトラ
ンスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを用いること
を特徴とする糖転移方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】シクロマルトデキストリン グルカノト
ランスフェラーゼ（以下、本明細書では「ＣＧＴａｓ
ｅ」と略称する。）は、マセランス アミラーゼとも言
われ、古くからバチルス マセランスだけでなく、バチ
ルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス サ
ーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎ
ｓ）などの微生物によっても産生されることが知られ、
その糖転移作用が工業的に広く利用されるようになって
きた。例えば、糊化澱粉または液化澱粉液にＣＧＴａｓ
ｅを作用させて澱粉を処理したり、シクロデキストリン
を製造したり、また、液化澱粉とスクロースとの混合液
にＣＧＴａｓｅを作用させ澱粉からスクロースへの糖転
移反応を利用してグリコシルスクロースを製造したりし
ている。最近、シクロデキストリンは、例えば、酸化ま
たは揮発しやすい有機化合物を包接することにより、よ
り安定な包接化合物を形成するためのホストとしての需
要が増大し、また、グリコシルスクロースは、上品な甘
味を有する低う蝕性甘味料（林原株式会社製造、登録商
標「カップリングシュガー」）としての需要が増大して
いる。このような需要の増大に応えるためＣＧＴａｓｅ
の安定供給が急務になってきた。そこで、ＣＧＴａｓｅ
を安定供給するために、ＣＧＴａｓｅ活性を有するポリ
ペプチド（以下、本明細書では単に、「ポリペプチド」
と略称する。）をコードするＤＮＡを解明し、このＤＮ
Ａを導入した形質転換体を得る必要性が生じてきた。し
かしながら、ポリペプチドのアミノ酸配列は今だ知られ
ていない。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、ポリペプチ
ドのアミノ酸配列を解明し、そのアミノ酸配列を有する
ＤＮＡとその塩基配列を解明することにより、組換えＤ
ＮＡ技術によるポリペプチドの広範な給源確保と、ポリ
ペプチドの産生量の向上を達成し、もって、ポリペプチ
ドを用いた糖転移方法を実現することを、課題とする。 【０００４】 【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するために、鋭意研究を続けた。その結果、ポリ
ペプチドは、部分アミノ配列として、配列表における配
列番号１乃至５に示すアミノ酸配列の１種または２種以
上の配列を有していることが判明し、更に詳細には、こ
れらアミノ酸配列をＮ末端側から配列表における配列番
号１乃至５の順序で有していることが判明した。そし
て、その特徴的性質は、可溶性澱粉からシクロデキスト
リンを生成する蛋白質である。 【０００５】また、バチルス ステアロサーモフィラス
由来のポリペプチドは、後に説明するように、配列表に
おける配列番号８に示されるアミノ酸配列を有している
ことが判明した。更に、バチルス マセランスのポリペ
プチドは、後に説明するように、配列表における配列番
号１２に示されるアミノ酸配列を有していることが判明
した。 【０００６】以下、本発明の内容を詳述し、併せて本発
明の効果を説明する。本明細書の記載において、アミノ
酸、ペプチド、その他に関し略号で表記する場合、それ
らは当該分野における慣用略号に基づくものである。そ
れらの例を以下に列記する。アミノ酸に関し、光学異性
体があり得る場合には、特に明示しなければＬ体を示す
ものとする。 【０００７】 ＤＮＡ ： デオキシリボ核酸 ＲＮＡ ： リボ核酸 Ａ ： アデニン Ｔ ： チミン Ｇ ： グアニン Ｃ ： シトシン ｄＮＴＰ ： デオキシヌクレオチド三リン酸 ｄｄＮＴＰ： ジデオキシヌクレオチド三リン酸 ｄＣＴＰ ： デオキシシチジン三リン酸 ＳＤＳ ： ドデシル硫酸ナトリウム Ａｌａ ： アラニン Ａｒｇ ： アルギニン Ａｓｎ ： アスパラギン Ａｓｐ ： アスパラギン酸 Ｃｙｓ ： システィン Ｇｌｎ ： グルタミン Ｇｌｕ ： グルタミン酸 Ｇｌｙ ： グリシン Ｈｉｓ ： ヒスチジン Ｉｌｅ ： イソロイシン Ｌｅｕ ： ロイシン Ｌｙｓ ： リジン Ｍｅｔ ： メチオニン Ｐｈｅ ： フェニルアラニン Ｐｒｏ ： プロリン Ｓｅｒ ： セリン Ｔｈｒ ： スレオニン Ｔｒｐ ： トリプトファン Ｖａｌ ： バリン 【０００８】本発明に於いて、ポリペプチドのアミノ酸
配列は、ＣＧＴａｓｅ産生菌からポリペプチド遺伝子を
クロニーングした後、その塩基配列を解読して決定し
た。 【０００９】一方、ポリペプチドのＮ末端を含有する部
分アミノ酸配列は、ポリペプチドを高度に精製した後、
気相プロテイン シークエンサーを用いて調べた。 【００１０】〈ポリペプチドのクローニング〉本発明
は、ポリペプチド産生能を有する供与体微生物よりその
微生物のＤＮＡを分離し精製した後、例えば、超音波、
制限酵素などで切断し、得られたＤＮＡ断片と、同様に
してベクターを切断して得られたベクター断片とを、例
えば、ＤＮＡリガーゼなどにより結合させ、ポリペプチ
ド遺伝子を含む組換えＤＮＡを形成する。 【００１１】この際、供与体微生物として、ポリペプチ
ド産生能を有する微生物、例えば、特開昭４７−２０３
７３号公報、特開昭５０−６３１８９号公報、特開昭５
０−８８２９０号公報およびハンス ベンダー（Ｈａｎ
ｓ Ｂｅｎｄｅｒ）、『アーカイブズ・オブ・マイクロ
バイオロジー（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ）』、第１１１巻、第２７１〜２８２頁
（１９７７年）などに示されているバチルス マセラン
ス、バチルス メガテリウム、バチルス サーキュラン
ス、バチルス ポリミキサ、バチルス ステアロサーモ
フィラスなどのバチルス属、クレブシーラ ニューモニ
アエなどのクレブシーラ属などの細菌が適宜選ばれる。 【００１２】また、ポリペプチド産生能を有する遺伝子
組換えにより導入した形質転換微生物を供与体微生物と
して利用することもできる。供与体微生物由来のＤＮＡ
は、供与体微生物を、例えば、液体培地で約１〜３日間
通気攪拌培養し、得られる培養液を遠心分離して集菌
し、次いでこれを溶菌させることによって調製すること
ができる。溶菌方法としては、例えば、リゾチームやβ
−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素による処理や超音
波処理などが用いられる。また、必要によりプロテアー
ゼなどの他の酵素剤やラウリル硫酸ナトリウムなどの界
面活性剤を併用することも、更に凍結融解処理を施すこ
とも自由である。 【００１３】このようにして得られる溶菌物からＤＮＡ
を分離し、精製するには、常法に従って、例えばフェノ
ール抽出、除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレ
アーゼ処理、アルコール沈殿、遠心分離などの方法を適
宜組み合わせることによって行うことができる。 【００１４】ＤＮＡを切断する方法は、例えば、超音波
処理、制限酵素処理などにより行うことができるが、得
られるＤＮＡ断片とベクター断片との結合を容易にする
ためには、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列に
作用する、例えば、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｂ
ａｍＨ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ、Ｓｌａ Ｉ、Ｘｍａ Ｉ、Ｍ
ｂｏ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉなどの
ＩＩ型制限酵素が適している。 【００１５】ベクターとしては、宿主微生物で自律的に
増殖し得るファージまたはプラスミドが適している。フ
ァージとしては、例えば、エッシェリヒア コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場
合には、λｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが、バチルス
ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
を宿主微生物とする場合には、ρ１１、φ１、φ１０５
などが使用できる。また、プラスミドとしては、例え
ば、エッシェリヒア コリを宿主細胞とする場合には、
ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５などが、バチルス ズブチ
リスを宿主微生物とする場合には、ｐＵＢ１１０、ｐＴ
Ｚ４（ｐＴＰ４）、ｐＣ１９４などが使用でき、更に、
例えば、エッシェリヒア コリ、バチルス ズブチリス
などの２種以上の宿主微生物で自律的増殖の可能な、例
えば、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７など
のベクターを利用することも可能である。このようなベ
クターを、先に述べたＤＮＡと同様に制限酵素などで切
断し、ベクター断片を得る。 【００１６】ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合させる
方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよ
く、例えば、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリン
グの後、生体外で適当なＤＮＡリガーゼの作用により組
換えＤＮＡを作製する。必要ならば、アニーリングの
後、宿主微生物に導入して、生体内のＤＮＡリガーゼを
利用して組換えＤＮＡにすることもできる。宿主微生物
としては、組換えＤＮＡが安定かつ自律的増殖が可能で
その形質発現のできるものであればよい。中でも、α−
アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）産生能を欠いてい
る微生物は、ポリペプチド産生量の測定が容易であるだ
けでなく、産生されるポリペプチドの分離、精製も容易
であり有利に利用できる。 【００１７】宿主微生物に組換えＤＮＡを導入する方法
は、公知の方法、例えば、宿主微生物がエッシェリヒア
コリの場合にはカルシウムイオン存在下で行い、バチ
ルス属に属する微生物の場合にはコンピテントセル法ま
たはプロトプラスト法などを採用することができる。組
換えＤＮＡが導入された形質転換微生物の選択方法は、
澱粉を含む平板培地上で生育し、かつ、澱粉からシクロ
デキストリンを生成するものを選択すればよい。 【００１８】このようにして一度選択されたポリペプチ
ド遺伝子を含む組換えＤＮＡは、形質転換微生物から取
り出して、他の宿主微生物に導入することも容易に実施
できることが判明した。またポリペプチド遺伝子を含む
組換えＤＮＡを制限酵素などにより切断してポリペプチ
ド遺伝子を含むＤＮＡ断片とし、これと同様にして得ら
れるベクター断片とを結合させることも容易に実施でき
ることが判明した。 【００１９】〈ポリペプチド遺伝子の塩基配列〉ポリペ
プチドの遺伝子塩基配列は、『ジーン（Ｇｅｎｅ）』、
第９巻、第２５９〜２６８頁（１９８２年）に示されて
いるジデオキシ チェーンターミネーター法で解読すれ
ばよい。この方法は、クローニングにより得られたポリ
ペプチド遺伝子を含むＤＮＡ断片を、プラスミドｐＵＣ
１８などのプラスミドに制限酵素を利用してそのクロー
ニング部位に挿入する。得られた組換えプラスミドは、
形質転換によってエッシェリヒア コリ ＪＭ８３など
に移入し、次いで組換えプラスミドを有する微生物を選
択する。この微生物を増殖させたものを用いて組換えプ
ラスミドを調製する。 【００２０】得られた組換えプラスミドを合プライマー
とアニーリングし、これにクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断
片を働かせてプライマーを伸張させ相補ＤＮＡを生成さ
せる。この反応物をポリアクリルアミドゲル電気泳動、
次いで、ラジオオートグラフィー法を行った後、ポリペ
プチド遺伝子の塩基配列を決定する。また、ポリペプチ
ドを菌体外に分泌させるシグナルペプチド遺伝子の塩基
配列も、同様にして決定する。 【００２１】〈ポリペプチドのアミノ酸配列〉ポリペプ
チドのアミノ酸配列は、塩基配列により決定する。ま
た、ポリペプチドを菌体外に分泌させるシグナルペプチ
ドのアミノ酸配列も、同様に決定する。 【００２２】〈ポリペプチドのＮ末端を含有する部分ア
ミノ酸配列〉ポリペプチド産生能を有するバチルス属に
属する微生物を栄養培地で培養してポリペプチドを産生
させる。培養終了後、遠心分離して上清を採取し、これ
を硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体
クロマトグラフィーにより精製し高純度ポリペプチドと
する。この試料を用いて『ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第２５６
巻、第７９９０〜７９９７頁（１９８１年）の記載に準
じて、気相プロテイン シークエンサーにより分解し、
高速液体クロマトグラフィーで同定して、ポリペプチド
のＮ末端を有する部分アミノ酸配列を決定する。 【００２３】〈形質転換微生物によるポリペプチドの調
製〉以上のようにして得られた形質転換微生物を栄養培
地で培養することにより多量のポリペプチドが安定して
産生し得ることも見い出した。栄養培地には、例えば、
炭素源、窒素源、ミネラル、更に必要ならば、アミノ
酸、ビタミンなどの有機微量栄養素などを含有させると
良い。この際、炭素源としては、澱粉、澱粉部分加水分
解物、グルコース、フラクトース、スクロースなどの糖
質が有利に用いられる。窒素源としては、アンモニアガ
ス、アンモニア水、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機
窒素源、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンステ
ィープリカー、肉エキスなどの有機窒素源が適宜用いら
れる。 【００２４】培養方法は、例えば、液体培地をｐＨ４〜
１０、温度２５〜６５℃の範囲に維持しつつ、通気攪拌
などの好気的条件下で約１〜４日間培養し、ポリペプチ
ドを生成蓄積させればよい。培養物中のポリペプチド
は、そのまま採取し利用することもできるが、一般には
常法に従って、濾過、遠心分離などによりポリペプチド
溶液と微生物菌体とに分離した後に利用される。ポリペ
プチドが菌体中に存在する場合には、細胞を超音波、界
面活性剤、細胞壁溶解酵素などで処理し、次いで濾過、
遠心分離などしてポリペプチド溶液を採取する。 【００２５】このようにして得られるポリペプチド溶液
を、例えば、減圧濃縮し、膜濃縮し、更に、硫安、硫酸
ソーダなどによる塩析、メタノール、エタノール、アセ
トンなどによる分別沈殿法などを適宜組み合わせて精製
し、より高純度のポリペプチドを採取し、工業用ポリペ
プチド剤として有利に利用できる。本発明で言うＣＧＴ
ａｓｅ活性１単位とは、ｐＨ５．５、０．０２Ｍの酢酸
緩衝液および２×１０-3Ｍの塩化カルシウムを含む０．
３ｗ／ｗ％のソリュブルスターチ溶液５ｍｌに適当に希
釈した酵素液０．２ｍｌを加え、４０℃で１０分間反応
した後、その反応液０．５ｍｌをとり、０．０２Ｎ−硫
酸水溶液１５ｍｌに混合して反応を停止させ、更にこの
反応停止液に０．１Ｎヨウ素ヨウ化カリウム溶液０．２
ｍｌを加えて発色させ、次いで６６０ｎｍにおける吸光
度を測定して、４０℃で１０分間反応させることにより
ソリュブルスターチ１５ｍｇのヨウ素の呈色を完全に消
失させる酵素量を言う。 【００２６】以下、実施例で本発明を詳細に説明する。 【００２７】 【実施例１】〈バチルス ステアロサーモフィラスポリ
ペプチド遺伝子のエッシェリヒア コリへのクローニン
グ〉 【００２８】 【実施例１−１】 〈バチルス ステアロサーモフィラスの耐熱性ポリペプ
チド遺伝子を含む染色体ＤＮＡの調製〉バチルス ステ
アロサーモフィラスの耐熱性ポリペプチド遺伝子を含む
染色体ＤＮＡは、斉藤、三浦等の方法、『ビオキミカ・
エト・ビオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ
ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）』、第７２
巻、第６１９〜６２９頁（１９６３年）に準じて調製し
た。即ち、バチルス ステアロサーモフィラス（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−２２２５）をブレインハート インフュージョ
ン培地で５０℃、一夜通気攪拌培養した。培養液を遠心
分離して集菌し、得られた菌体をＴＥＳ緩衝液（ｐＨ
８．０、トリスアミノメタン、塩酸、ＥＤＴＡ、塩化ナ
トリウム含有）に懸濁し、次にリゾチームをｍｌ当たり
２ｍｇの割合で加え、３７℃で３０分間保持した。これ
を、−２０℃で一夜凍結した後、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ
９．０、トリスアミノメタン、ＨＣｌ、ラウリル硫酸ナ
トリウム、塩化ナトリウム含有）を加え、６０℃に加温
した後、ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）１容とフェノール
４容との混合液を加え、氷水中で冷却後、遠心分離し上
清を得た。この上清に２倍容の冷エタノールを加え粗染
色体ＤＮＡを回収し、これをＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．
１、塩化ナトリウム、クエン酸３ナトリウム含有）に溶
解し、リボヌクレアーゼ（シグマ社製造、商品名 ＲＮ
ａｓｅ Ａ）およびプロテアーゼ（科研製薬株式会社製
造、商品名、プロナーゼ Ｅ）を作用させ、次いで、、
ＴＥＳフェノール混液を加え、冷却し遠心分離して、得
られる上清に２培容の冷エタノールを加え精製染色体Ｄ
ＮＡを回収し、緩衝液（ｐＨ７．５、トリスアミノメタ
ン、ＨＣｌ、ＥＤＴＡ含有）に溶解して−２０℃で保存
した。 【００２９】 【実施例１−２】 〈プラスミド ｐＢＲ３２２の調製〉プラスミド ｐＢ
Ｒ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）は、ジェイ メイヤ
ーズ（Ｊ．Ｍｅｙｅｒｓ）等の方法、『ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）』、第１２７巻、第１，５２４〜
１，５３７頁（１９７６年）に準じてエッシェリヒア
コリから分離、調製した。 【００３０】 【実施例１−３】 〈ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡの作製〉実施
例１−１で調製した耐熱性ポリペプチド遺伝子を含む精
製染色体ＤＮＡに対して、制限酵素Ｍｂｏ Ｉ（株式会
社ニッポンジーン製造）を作用させ、ＤＮＡ断片が１〜
２０Ｋｂｐになるように染色体ＤＮＡを部分的に切断し
た。一方、実施例１−２で調製したプラスミドｐＢＲ３
２２に対して、制限酵素ＢａｍＨＩ（株式会社ニッポン
ジーン製造）を作用させ、完全に切断し、次いで、プラ
スミド断片のセルフライゲーションを防止するため、エ
ッシェリヒア コリ由来のアルカリフォスファターゼ
（宝酒造株式会社製造）を作用させ、ｐＢＲ３２２断片
の５´末端を脱リン酸化した。両断片の結合は、Ｔ4Ｄ
ＮＡリガーゼ （株式会社ニッポンジーン製造）を４℃
で一夜反応させて行い、組換えＤＮＡを作製した。 【００３１】 【実施例１−４】 〈組換えＤＮＡのエッシェリヒア コリへの導入〉宿主
細胞として、アミラーゼ産生能を欠いているエッシェリ
ヒア コリＨＢ１０１（ＡＴＣＣ ３３６９４）を用い
た。本微生物をＬ培地で３７℃、４時間培養し集菌した
後、１０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭ塩化マンガンを
含有する１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）に懸濁し、
遠心分離して集菌し、続いて２５ｍＭ塩化カルシウム、
１２５ｍＭ塩化マンガンを含有する１０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．６）に懸濁したものに、実施例１−３で得た
組換えＤＮＡを加え、氷水中で３０分間静置した。更
に、３７℃に加温し、Ｌ培地を加え３７℃で３０分間保
ち、これをアンピシリン（抗生物質）５０μｇ／ｍｌを
含有し、かつ澱粉２ｍｇ／ｍｌを含有するＬ−アガー平
板培地上に拡げ、３７℃で２４時間保ち、コロニーを形
成させた。 【００３２】本平板から、ヨード呈色法により、澱粉を
分解し、サイクロデキストリンを生成しているコロニー
を選択し、ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡが導
入されている形質転換微生物を選択した。本微生物を増
殖させ、実施例１−２のプラスミドの調製方法に準じて
組換えＤＮＡを取り出し、これに各種制限酵素を作用さ
せ、その切断部位を決定した後、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ
（株式会社ニッポンジーン製造）で完全切断し、次い
で、実施例１−３と同様にＴ４ＤＮＡリガーゼを作用さ
せ、組換えＤＮＡを作製し、上記の方法に準じてポリペ
プチド遺伝子を含む小型の組換えＤＮＡを保有する形質
転換微生物を選択した。 【００３３】更に、この小型の組換えＤＮＡを制限酵素
Ｓａｌ Ｉ（株式会社ニッポンジーン製造）で完全切断
し、以後、前記のＥｃｏＲ Ｉの場合と同様に処理し
て、ポリペプチド遺伝子を含む更に小型のＤＮＡを保有
する形質転換微生物を選択した。本微生物の一菌株をエ
ッシェリヒア コリＴＣＨ２０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−２
１０９）と命名し、これが保有する組換えＤＮＡをｐＴ
ＣＨ２０１と命名した。 【００３４】組換えＤＮＡ ｐＴＣＨ２０１について、
バチルス ステアロサーモフィラス由来ＤＮＡ部分の制
限酵素地図を図１に示す。 【００３５】図１から明らかなように、制限酵素Ｐｖｕ
ＩＩ（東洋紡績株式会社製造）、Ｋｐｎ Ｉ、Ｈｉｎ
ｄ ＩＩＩ（株式会社ニッポンジーン）、Ｘｂａ Ｉ
（宝酒造株式会社製造）で切断を受けることが判明し
た。一方、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、Ｐｓ
ｔ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ａｃｃ Ｉ（以
上、株式会社ニッポンジーン製造）では切断されなかっ
た。 【００３６】 【実施例２】 〈バチルス ステアロサーモフィラスポリペプチド遺伝
子のバチルス ズブチリスへのクローニング〉 【００３７】 【実施例２−１】 〈組換えＤＮＡ ｐＴＣＨ２０１の調製〉組換えＤＮＡ
ｐＴＣＨ２０１は、実施例１−２の方法に準じてエッ
シェリヒア コリＴＣＨ２０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１
０９）から分離調製した。 【００３８】 【実施例２−２】 〈プラスミド ｐＵＢ１１０の調製〉プラスミド ｐＵ
Ｂ１１０（ＡＴＣＣ ３７０１５）は、グリッガン（Ｇ
ｒｙｃｚａｎ）等の方法、『ジャーナル・オブ・バクテ
リオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ）』、第１３４巻、第３１８〜３２９頁（１９７
８年）に準じてバチルス ズブチリスから分離、調製し
た。 【００３９】 【実施例２−３】 〈ポリペプチド遺伝子を含む組替えＤＮＡの作製〉実施
例２−１で調製した耐熱性ポリペプチド遺伝子を含む組
換えＤＮＡ ｐＴＣＨ２０１に対して、制限酵素Ｅｃｏ
Ｒ ＩおよびＸｂａ Ｉを同時に作用させ完全に切断し
た。一方、実施例２−２で調製したプラスミドｐＵＢ１
１０に対して、制限酵素ＥｃｏＲ ＩおよびＸｂａ Ｉ
を同様に作用させ完全に切断した。両断片の結合は、Ｔ
4ＤＮＡリガーゼ を用いて、実施例１−３と同様に作用
させ組換えＤＮＡを作製した。 【００４０】 【実施例２−４】 〈組換えＤＮＡのバチルス ズブチリスへの導入〉宿主
微生物として、アミラーゼ産生能を欠いているバチルス
ズブチリス７１５Ａを用いた。本微生物をブレイン
ハート インフュージョン培地で２８℃、５時間培養し
集菌した後、シェーファー（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ）等の
方法、『プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイ
テッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉ
ｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅ
ｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉ
ｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）』、第
７３巻、第２，１５１〜２，１５５頁（１９７６年）に
準じてプロトプラスト懸濁液を調製した。 【００４１】本液に、実施例２−３で調製した組換えＤ
ＮＡを加え、関口等の方法、『アグリカルチュラル・ア
ンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃｕｌ
ｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ）』、第４６巻、第１，６１７〜１，６２１
頁（１９８２年）に準じて形質転換を行った後、ＨＣＰ
培地にカナマイシン（抗生物質）２５０μｇ／ｍｌを含
有し、かつ澱粉１０ｍｇ／ｍｌを含有する寒天平板培地
上に拡げ、２８℃、７２時間保ち、コロニーを形成させ
た。 【００４２】以後、実施例１−４の方法に準じて耐熱性
ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡが導入されてい
る形質転換微生物を選択した。本微生物の一菌株をバチ
ルスズブチリス ＴＣＵ２１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１
１２）と命名し、これが保有する組換えＤＮＡをｐＴＣ
Ｕ２１１と命名した。組換えＤＮＡ ｐＴＣＵ２１１に
ついて、バチルス ステアロサーモフィラス由来ＤＮＡ
部分の制限酵素切断地図を図２に示す。 【００４３】図２から明らかなように、制限酵素Ｐｖｕ
ＩＩ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、で切断を受け
ることが判明した。一方、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ、Ｂａ
ｍＨＩ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ａｃ
ｃ Ｉ、Ｘｂａ Ｉでは切断されなかった。 【００４４】 【実施例３】 〈バチルス ステアロサーモフィラス由来ポリペプチド
のＮ末端を含有した部分アミノ酸配列〉 【００４５】 【実施例３−１】 〈ポリペプチドの調製〉バチルス ステアロサーモフィ
ラス（ＦＥＲＭ Ｐ−２２２５）を、実施例５に示す方
法と同様にして液体培養し、培地中にポリペプチドを産
生させた。遠心分離にて上清を採取し、硫安塩析によ
り、ポリペプチド画分を得、次いで、陰イオン交換体カ
ラムクロマトグラフィー（東洋曹達株式会社製『ＤＥＡ
Ｅ−トヨパール ６５０』）、クロマトフォーカッシン
グ法（ファマシア社製『ＭｏｎｏＰ』）により精製し
て、高度に精製されたポリペプチドを採取した。本品
は、ケイウエーバー アンド エム オズボー（Ｋ．Ｗ
ｅｂｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｏｓｂｏｒｎ）、『ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａ
ｌｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）』、第２４４巻、第４，４０６頁（１９６９年）の
記載に準じて行ったＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法で７０，０００±１０，０００の分子量を示し
た。また、比活性は、２００±３０単位／ｍｇ蛋白質を
示した。 【００４６】 【実施例３−２】 〈Ｎ末端を含有する部分アミノ酸配列〉実施例３−１の
方法で調製したポリペプチドを、気相プロテイン シー
クエンサー、アプライドバイオシステム社製『４７０Ａ
型』にかけ、次いで、高速液体クロマトグラフィーによ
り分析して、Ｎ末端を含有する部分アミノ酸配列を決定
した。結果は、配列表における配列番号６の配列を有し
ていることが判明した。 【００４７】 【実施例４】 〈バチルス ステアロサーモフィラス由来ポリペプチド
遺伝子の塩基配列およびポリペプチドのアミノ酸配列〉 【００４８】 【実施例４−１】 〈プラスミド ｐＵＣ １８の調製〉プラスミド ｐＵ
Ｃ １８は、これを導入したエッシェリヒア コリ Ｊ
Ｍ８３（ＡＴＣＣ ３５６０７）から実施例１−２の方
法に準じて調製した。 【００４９】 【実施例４−２】 〈ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡの作製〉実施
例１−３の方法に準じて組換えＤＮＡを作製した。即
ち、実施例２−３の方法で調製したポリペプチド遺伝子
を含む断片に、更に、各種制限酵素を作用させて切断
し、また、実施例４−１の方法で調製したプラスミド
ｐＵＣ １８を同様に各種制限酵素で切断し、これら両
断片にＴ4ＤＮＡリガーゼ を作用させて組換えＤＮＡを
作製した。 【００５０】 【実施例４−３】 〈組換えＤＮＡのエッシェリヒア コリへの導入〉宿主
微生物として、エッシェリヒア コリ ＪＭ８８を用い
た。この微生物に、実施例１−４の方法に準じて、組換
えＤＮＡを移入し、形質転換させた。次いで、５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド
（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌ
ｙｌ−β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅまたはＸｇａｌ）を
含有する培地に生育させ、無色のプラークを形成した微
生物を形質転換微生物として選択した。 【００５１】 【実施例４−４】 〈形質転換微生物からの組換えＤＮＡの調製〉形質転換
微生物を、抗生物質アンビシリン５０μｇ／ｍｌを含む
Ｌ−培地で培養し、得られる菌体からアルカリ溶菌法に
より組換えＤＮＡを調製した。 【００５２】 【実施例４−５】 〈組換えＤＮＡの塩基配列〉ジデオキシ チェーンター
ミネータ法に従って解読した。即ち、実施例４−４で調
製した組換えＤＮＡと合成プライマー（１７塩基）を加
え、６０℃で２０分間アニーリングした後、ｄＮＴＰ、
ｄｄＮＴＰ、〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰおよびクレノウ断片
を加え、３７℃で３０分間反応させ、プライマーを５´
側から３´方向へ伸長させて相補ＤＮＡを生成させた。
これに過剰のｄＮＴＰを加えて、更に３７℃で３０分間
反応させた後、ホルムアミド色素溶液を加えて反応を停
止させた。次いで、３分間煮沸し、これを６％ポリアク
リルアミドゲルを用いて、約２，０００Ｖ、約２５ｍＡ
で電気泳動し、伸長した相補ＤＮＡを分離した。電気泳
動した後、ゲルを固定し乾燥させた。本ゲルを用いて、
オートラジオグラフィーを行い、オートラジオグラム上
の塩基断片のシークエンス解析を行ってポリペプチド遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果は、配列表におけ
る配列番号９に示した。また、それの５´側の上流に続
くシグナルペプチド遺伝子の塩基配列も同様にして調べ
た。その結果は、配列表における配列番号１０に示し
た。 【００５３】 【実施例４−６】 〈ポリペプチドのアミノ酸配列〉配列表における配列番
号９の塩基配列を用いて、ポリペプチドのアミノ酸配列
を決定し、その結果を配列表における配列番号８に示し
た。また、それのＮ末端側の上流に続くシグナルペプチ
ドのアミノ酸配列を決定し、その結果を配列表における
配列番号１１に示した。以上の結果から、バチルス ス
テアロサーモフィラス由来ポリペプチドのアミノ酸配列
は、配列表における配列番号８の配列を有していること
が明らかになった。 【００５４】 【実施例５】 〈形質転換微生物によるポリペプチドとそれを用いた糖
転移反応〉 【００５５】 【実施例５−１】 〈形質転換微生物によるポリペプチドの調製〉バチルス
ステアロサーモフィラス由来の耐熱性ポリペプチド遺
伝子を含む組換えＤＮＡを導入した形質転換微生物エッ
シェリヒア コリ ＴＣＨ２０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−２
１０９）およびバチルス ズブチリス ＴＣＵ２１１
（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１１２）を用いてポリペプチドを
調製した。また、これら形質転換微生物と宿主微生物並
びに供与体微生物バチルス ステアロサーモフィラスの
産生するポリペプチド産生量をその活性で比較した。 【００５６】液体培地は、コーンスティープリカー１．
０ｗ／ｖ％、硫酸アンモニウム０．１ｗ／ｖ％、炭酸カ
ルシウム１．０ｗ／ｖ％、澱粉１ｗ／ｖ％および水から
なり、ｐＨ７．２に調製して１２０℃で２０分間滅菌
し、冷却して調製した。エッシェリヒア コリ ＴＣＨ
２０１の場合には、この培地に、抗生物質アンピシリン
をｍｌ当たり５０μｇの割合で加えて植菌し、また、エ
ッシェリヒア コリ ＨＢ１０１の場合には抗生物質を
加えずに植菌し、それぞれ３７℃、４８時間通気攪拌培
養した。また、バチルス ズブチリス ＴＣＵ２１１の
場合には、前記液体培地に抗生物質カナマイシンをｍｌ
当たり５μｇの割合で加えて植菌し、また、バチルス
ズブチリス ７１５Ａの場合には抗生物質を加えずに植
菌し、それぞれ２８℃で７２時間培養した。また、バチ
ルス ステアロサーモフィラス（ＦＥＲＭ Ｐ−２２２
５）の場合には、前記液体培地に抗生物質を加えること
なく、５０℃で４８時間培養した。各培養液を、遠心分
離し、上清と菌体とに分離し、上清はそのまま活性測定
し、培養液量に換算して活性を求めた。結果は、表１に
示す。 【００５７】 【表１】【００５８】表１の結果から明らかなように、形質転換
微生物からのポリペプチド産生量は向上しており、工業
的生産方法として好都合である。 【００５９】 【実施例５−２】 〈形質転換微生物によるポリペプチドの安定温度〉実施
例５−１で調製したエッシェリヒア コリ ＴＣＨ２０
１の上清を硫安０．６飽和で塩析して粗ポリペプチド剤
を調製し、採取した。このポリペプチド剤を用いて、そ
の安定温度について調べた。５ｍＭのＣａｃｌ2 を含有
する５０ｍＭトリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
中にて、ポリペプチド剤を異なる温度で３０分間インキ
ュベートし、残存するＣＧＴａｓｅ活性を測定し、その
残存活性を相対活性で表した。結果は、表２に示す。 【００６０】 【表２】 【００６１】表２から、形質転換微生物からのポリペプ
チドは、７０℃でも安定であることが判明した。また、
これと同様に、バチルス ズブチリス ＴＣＵ２１１の
安定温度についても調べたところ、エッシェリヒア コ
リ ＴＣＨ２０１と同様の結果を得た。 【００６２】 【実施例５−３】 〈ポリペプチドを用いた糖転移反応〉実施例５−１で調
製したエッシェリヒア コリ ＴＣＨ２０１の上清を硫
安０．６飽和で塩析して粗ポリペプチド剤を調製し、採
取した。このポリペプチド剤を用いて、澱粉に作用さ
せ、糖転移反応を起こさせた。その結果を調べ、澱粉か
らスクロースへの糖転移量、澱粉からのシクロデキスト
リンの生成量、シクロデキストリンα、β、γの生成比
率、ポリペプチドの至適温度、至適ｐＨ、安定温度、安
定ｐＨなどの酵素的性質について、供与体微生物バチル
ス ステアロサーモフィラスのものと比較したところ、
形質転換微生物の酵素的性質は、安定温度を含めて、供
与体微生物バチルス ステアロサーモフィラスのものと
よく一致した。すなわち、このポリペプチドは、供与体
微生物バチルス ステアロサーモフィラス由来のポリペ
プチドと同様に耐熱性のポリペプチドであった。 【００６３】 【実施例６】 〈バチルス マセランス ポリペプチド遺伝子のエッシ
ェリヒア コリへのクローニング〉 【００６４】 【実施例６−１】 〈バチルス マセランスのポリペプチド遺伝子を含む染
色体ＤＮＡの調製〉バチルス マセランスのポリペプチ
ド遺伝子を含む染色体ＤＮＡは、バチルスマセランス
１７Ａを２８℃で培養した以外は、実施例１−１の方法
に準じて調製した。 【００６５】 【実施例６−２】 〈ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡの作製〉実施
例６−１で調製したバチルス マセランス由来のポリペ
プチド遺伝子を含む精製染色体ＤＮＡに対して、制限酵
素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ（株式会社ニッポンジーン製造）を
作用させ、実施例１−３と同様に部分的に切断した。一
方、実施例１−２の方法で調製したプラスミド ｐＢＲ
３２２に対して、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを作用させ、
完全に切断し、次いで、実施例１−３で述べた方法で５
´末端の脱リン酸化を行い、更に両断片の結合を、実施
例１−３の方法に準じて行い組換えＤＮＡを作製した。 【００６６】 【実施例６−３】 〈組換えＤＮＡのエッシェリヒア コリへの導入〉宿主
微生物として、アミラーゼ産生能を欠いているエッシェ
リヒア コリ ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ ３３６９４）を
用いて、実施例１−４の方法に準じて、組換えＤＮＡが
導入されている形質転換微生物を選択した。この微生物
から組換えＤＮＡを取り出し、これに各種制限酵素を作
用させ、その切断部位を決定した後、制限酵素Ｓａｕ３
ＡＩ（株式会社ニッポンジーン社製）で部分切断し、一
方、実施例１−２の方法で得たプラスミドｐＢＲ３２２
を制限酵素ＢａｍＨ Ｉで完全に切断した後、実施例１
−３と同様に５´末端の脱リン酸化を行い、更に、Ｔ4
ＤＮＡリガーゼ を同様に作用させ、組換えＤＮＡを作
製し、実施例１−４の方法に準じてポリペプチド遺伝子
を含む小型の組換えＤＮＡを保有する形質転換微生物を
選択した。 【００６７】本微生物の一菌株をエッシェリヒア コリ
ＭＡＨ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１１０）と命名し、こ
れが保有する組換えＤＮＡをｐＭＡＨ２と命名した。組
換えＤＮＡ ｐＭＡＨ２について、バチルス マセラン
ス由来のＤＮＡ部分の制限酵素切断地図を図３に示す。 【００６８】図３から明らかなように、制限酵素Ｐｖｕ
ＩＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ａｖａ Ｉ（株式会社ニッポンジ
ーン製造）、Ｐｓｔ Ｉ（株式会社ニッポンジーン製）
で切断を受けることが判明した。一方、制限酵素Ｅｃｏ
Ｒ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｋｐｎ Ｉ、ＢａｍＨ
Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｓｍａ Ｉでは切断され
なかった。 【００６９】 【実施例７】 〈バチルス マセランス ポリペプチド遺伝子のバチル
ス ズブチリスへのクローニング〉 【００７０】 【実施例７−１】 〈組換えＤＮＡ ｐＭＡＨ２の調製〉組換えＤＮＡ ｐ
ＭＡＨ２は、実施例１−２の方法に準じてエッシェリヒ
アコリ ＭＡＨ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１１０）から分
離調製した。 【００７１】 【実施例７−２】 〈ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡの作製〉実施
例７−１で調製したポリペプチド遺伝子を含む組換えＤ
ＮＡｐ ＭＡＨ２に対して、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉおよ
びＢａｍＨ Ｉを同時に作用させ完全に切断した。一
方、実施例２−２の方法で調製したプラスミド ｐＵＢ
１１０に対して、制限酵素ＥｃｏＲ ＩおよびＢａｍＨ
Ｉを同時に作用させ完全に切断した。両断片の結合
は、Ｔ4ＤＮＡリガーゼ を用いて実施例１−３と同様に
作用させ組換えＤＮＡを作製した。 【００７２】 【実施例７−３】 〈組換えＤＮＡのバチルス ズブチリスへの導入〉宿主
微生物として、アミラーゼ産生能を欠いているバチルス
ズブチリス７１５Ａを用いて、実施例２−４の方法に
準じて、バチルス マセランス由来のポリペプチド遺伝
子を含む組換えＤＮＡが導入されている形質転換微生物
を選択した。本微生物の一菌株をバチルス ズブチリス
ＭＡＵ２１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１１１）と命名
し、これが保有する組換えＤＮＡをｐＭＡＵ２１０と命
名した。組換えＤＮＡ ｐＭＡＵ２１０について、バチ
ルス マセランス由来ＤＮＡ部分の制限酵素切断地図を
図４に示す。 【００７３】図４から明らかなように、制限酵素Ｐｖｕ
ＩＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ａｖａ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉで切断を
受けることが判明した。一方、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ、
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｋｐｎ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、Ｘｂａ
Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、ＳｍａＩでは切断されなかった。 【００７４】 【実施例８】 〈バチルス マセランス由来ポリペプチドのＮ末端を含
有する部分アミノ酸配列〉 【００７５】 【実施例８−１】 〈ポリペプチドの調製〉バチルス ズブチリス ＭＡＵ
２１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１１１）を、実施例１０に
示す方法と同様に液体培養して培地中にポリペプチドを
産生させた。次いで、実施例４−１の方法に準じて精製
し、極めて高純度のポリペプチドを採取した。本品は、
ＳＤＳ−ポリアクリル電気泳動法で７０，０００±１
０，０００の分子量を示し、比活性２００±３０単位／
ｍｇ蛋白質を示した。 【００７６】 【実施例８−２】 〈Ｎ末端を含有するアミノ酸配列〉実施例８−１の方法
で調製したポリペプチドを用いて、実施例３−２と同様
にしてＮ末端を含有する部分アミノ酸配列を決定した。
その結果は、配列表における配列番号７の配列を有して
いることが判明した。 【００７７】 【実施例９】 〈バチルス マセランス由来ポリペプチド遺伝子の塩基
配列およびポリペプチドのアミノ酸配列〉 【００７８】 【実施例９−１】 〈ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡの作製〉実施
例４−３の方法に準じて組換えＤＮＡを作製した。即
ち、実施例７−２の方法で調製したポリペプチド遺伝子
を含む断片に、更に各種制限酵素を作用させて切断し、
また、実施例４−２の方法で調製したｐＵＣ１８を同様
に制限酵素で切断し、これら両断片にＴ4ＤＮＡリガー
ゼ を作用させて組換えＤＮＡを作製した。 【００７９】 【実施例９−２】 〈組換えＤＮＡのエッシェリヒア コリへの導入〉宿主
微生物として、エッシェリヒア コリ ＪＭ３８を用い
て、実施例４−３の方法に準じて、組換えＤＮＡを移入
し、形質転換微生物を選択した。 【００８０】 【実施例９−３】〈形質転換微生物からの組換えＤＮＡ
の調製〉 実施例４−４の方法に準じて、組換えＤＮＡを調製し
た。 【００８１】 【実施例９−４】 〈組換えＤＮＡの塩基配列〉実施例４−５の方法に準じ
て、ポリペプチド遺伝子の塩基配列を決定した。その結
果は、配列表における配列番号１３に示した。また、そ
れの５´側に続くシグナルペプチド遺伝子の塩基配列
も、同様にして調べた。その結果は、配列表における配
列番号１４に示した。 【００８２】 【実施例９−５】 〈ポリペプチドのアミノ酸配列〉配列表における配列番
号１３の塩基配列を用いて、ポリペプチドのアミノ酸配
列を決定し、その結果を配列表における配列番号１２に
示した。また、それのＮ末端側に続くシグナルペプチド
のアミノ酸配列を決定し、その結果を配列表における配
列番号１５に示した。以上の結果から、バチルス マセ
ランス由来のポリペプチドのアミノ酸配列は、配列表に
おける配列番号１２の配列を示していることが明らかに
なった。なお、配列表における配列番号８と配列表にお
ける配列番号１２の結果から、いずれのポリペプチドに
も共通な部分アミノ酸配列として、配列表における配列
番号１乃至５の配列を有していることが判明し、しか
も、これらアミノ酸配列を、Ｎ末端側から配列表におけ
る配列番号１乃至５の順序で有していることが判明し
た。 【００８３】 【実施例１０】 〈形質転換微生物によるポリペプチドの調製〉バチルス
マセランス由来ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮ
Ａを導入した形質転換微生物エッシェリヒア コリ Ｍ
ＡＨ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１１０）およびバチルス
ズブチリス ＭＡＵ２１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１１
１）を用いてポリペプチドを調製した。また、これら形
質転換微生物と宿主微生物並びに供与対微生物バチルス
マセランスの産生するポリペプチド生産量をその活性
で比較した。液体培地は、実施例５の方法で調製した。 【００８４】エッシェリヒア コリ ＭＡＨ２の場合に
は、この培地に、抗生物質アンピシリンをｍｌ当たり５
０μｇの割合で加えて植菌し、また、エッシェリヒア
コリＨＢ１０１の場合には、抗生物質を加えずに植菌
し、それぞれ３５℃で２４時間通気攪拌培養した。ま
た、バチルス ズブチリス ＭＡＵ２１０の場合には、
前記液体培地に抗生物質カナマイシンをｍｌ当たり５μ
ｇの割合で加えて植菌し、また、バチルス ズブチリス
７１５Ａの場合には抗生物質を加えずに植菌し、それ
ぞれ２８℃、７２時間培養した。また、バチルス マセ
ランス １７Ａの場合には、前記液体培地に抗生物質を
加えることなく、２８℃で７２時間培養した。各培養液
は、実施例５の場合と同様に処理して、活性を測定し
た。結果は、表３に示す。 【００８５】 【表３】 【００８６】表３の結果から明らかなように、形質転換
微生物からのポリペプチド産生量は向上しており、工業
的生産方法として好適である。 【００８７】 【実施例１１】 〈ポリペプチドを用いた糖転移反応〉実施例１０で調製
したエッシェリヒア コリ ＭＡＨ２の上清を硫安０．
６飽和で塩析して粗ポリペプチド剤を調製し、採取し
た。このポリペプチド剤を用いて、実施例５−３と同様
に、澱粉に作用させ、糖転移反応を起こさせた。その結
果を調べ、澱粉からスクロースへの糖転移量、澱粉から
のシクロデキストリンの生成量、シクロデキストリン
α、β、γの生成比率、ポリペプチドの至適温度、至適
ｐＨ、安定温度、安定ｐＨなどの酵素的性質について、
供与体微生物バチルス マセランスのものと比較したと
ころ、形質転換微生物の酵素的性質は、安定温度を含め
て、供与体微生物バチルス マセランスのものとよく一
致した。すなわち、このポリペプチドは、供与体微生物
バチルス マセランス由来のポリペプチドと同様に耐熱
性のポリペプチドであった。 【００８８】 【発明の効果】上記から明らかなように、本発明は、シ
クロマルトデキストリン グルカノトランスフェラーゼ
を用いる糖転移方法において、微生物由来のＤＮＡを適
宜宿主中で発現させて得ることのできる、部分アミノ酸
配列として配列表における配列番号１乃至５に示すアミ
ノ酸配列の１種または２種以上を含んでなるシクロマル
トデキストリン グルカノトランスフェラーゼ活性を有
するポリペプチドを用いて糖転移をおこなうものであ
る。本発明によれば、糖転移物を安定かつ容易に製造で
きることから、その工業的意義は大きい。 【００８９】 【配列表】 配列番号：1 配列の長さ：9 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：中間部フラグメント 配列 Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr 1 5 【００９０】配列番号：2 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：中間部フラグメント 配列 Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu 1 5 10 【００９１】配列番号：3 配列の長さ：12 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：中間部フラグメント 配列 Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe 1 5 10 【００９２】配列番号：4 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：中間部フラグメント 配列 Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Arg 1 5 10 15 【００９３】配列番号：5 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：中間部フラグメント 配列 Asn Pro Ala Leu Ala Tyr Gly 1 5 【００９４】配列番号：6 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：Ｎ末端フラグメント 配列 Ala Gly Asn Leu Asn Lys Val Asn Phe Thr 1 5 10 【００９５】配列番号：7 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：Ｎ末端フラグメント 配列 Ser Pro Asp Thr Ser Val Asn Asn Lys Leu 1 5 10 【００９６】配列番号：8 配列の長さ：680 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Gly Asn Leu Asn Lys Val Asn Phe Thr Ser Asp Val Val Tyr Gln Ile 1 5 10 15 Val Val Asp Arg Phe Val Asp Gly Asn Thr Ser Asn Asn Pro Ser Gly Ala 20 25 30 Leu Phe Ser Ser Gly Cys Thr Asn Leu Arg Lys Tyr Cys Gly Gly Asp Trp 35 40 45 50 Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr Asp Met Gly Val 55 60 65 Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Val Phe Ser Val Met Asn 70 75 80 85 Asp Ala Ser Gly Ser Ala Ser Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys 90 95 100 Lys Pro Asn Pro Phe Phe Gly Thr Leu Ser Asp Phe Gln Arg Leu Val Asp 105 110 115 Ala Ala His Ala Lys Gly Ile Lys Val Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His 120 125 130 135 Thr Ser Pro Ala Ser Glu Thr Asn Pro Ser Tyr Met Glu Asn Gly Arg Leu 140 145 150 Tyr Asp Asn Gly Thr Leu Leu Gly Gly Tyr Thr Asn Asp Ala Asn Met Tyr 155 160 165 170 Phe His His Asn Gly Gly Thr Thr Phe Ser Ser Leu Glu Asp Gly Ile Tyr 175 180 185 Arg Asn Leu Phe Asp Leu Ala Asp Leu Asn His Gln Asn Pro Val Ile Asp 190 195 200 Arg Tyr Leu Lys Asp Ala Val Lys Met Trp Ile Asp Met Gly Ile Asp Gly 205 210 215 220 Ile Arg Met Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys Ser Leu 225 230 235 Met Asp Glu Ile Asp Asn Tyr Arg Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe 240 245 250 255 Leu Ser Glu Asn Glu Val Asp Ala Asn Asn His Tyr Phe Ala Asn Glu Ser 260 265 270 Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Gly Gln Lys Leu Arg Gln Val Leu 275 280 285 Arg Asn Asn Ser Asp Asn Trp Tyr Gly Phe Asn Gln Met Ile Gln Asp Thr 290 295 300 305 Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Val Leu Asp Gln Val Thr Phe Ile Asp Asn His 310 315 320 Asp Met Asp Arg Phe Met Ile Asp Gly Gly Asp Pro Arg Lys Val Asp Met 325 330 335 340 Ala Leu Ala Val Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro Asn Ile Tyr Tyr Gly 345 350 355 Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Arg Lys Met Met 360 365 370 Ser Ser Phe Asn Lys Asn Thr Arg Ala Tyr Gln Val Ile Gln Lys Leu Ser 375 380 385 390 Ser Leu Arg Arg Asn Asn Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Asp Thr Glu Gln Arg 395 400 405 Trp Ile Asn Gly Asp Val Tyr Val Tyr Glu Arg Gln Phe Gly Lys Asp Val 410 415 420 425 Val Leu Val Arg Val Asn Arg Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ser Ile Thr Gly 430 435 440 Leu Phe Thr Ala Leu Pro Ala Gly Thr Tyr Thr Asp Gln Leu Gly Gly Leu 445 450 455 Leu Asp Gly Asn Thr Ile Gln Val Gly Ser Asn Gly Ser Val Asn Ala Phe 460 465 470 475 Asp Leu Gly Pro Gly Glu Val Gly Val Trp Ala Tyr Ser Ala Thr Glu Ser 480 485 490 Thr Pro Ile Ile Gly His Val Gly Pro Met Met Gly Gln Val Gly His Gln 495 500 505 510 Val Thr Ile Asp Gly Glu Gly Phe Gly Thr Asn Thr Gly Thr Val Lys Phe 515 520 525 Gly Thr Thr Ala Ala Asn Val Val Ser Trp Ser Asn Asn Gln Ile Val Val 530 535 540 Ala Val Pro Asn Val Ser Pro Gly Lys Tyr Asn Ile Thr Val Gln Ser Ser 545 550 555 560 Ser Gly Gln Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Asn Phe Glu Val Leu Thr Asn Asp 565 570 575 Gln Val Ser Val Arg Phe Val Val Asn Asn Ala Thr Thr Asn Leu Gly Gln 580 585 590 595 Asn Ile Tyr Ile Val Gly Asn Val Tyr Glu Leu Gly Asn Trp Asp Thr Ser 600 605 610 Lys Ala Ile Gly Pro Met Phe Asn Gln Val Val Tyr Ser Tyr Pro Thr Trp 615 620 625 Tyr Ile Asp Val Ser Val Pro Glu Gly Lys Thr Ile Glu Phe Lys Phe Ile 630 635 640 645 Lys Lys Asp Ser Gln Gly Asn Val Thr Trp Glu Ser Gly Ser Asn His Val 650 655 660 Tyr Thr Thr Pro Thr Asn Thr Thr Gly Lys Ile Ile Val Asp Trp Gln Asn 665 670 675 680 【００９７】配列番号：9 配列の長さ：2040 配列の型：核酸 配列 GCTGGAAATC TTAATAAGGT AAACTTTACA TCAGATGTTG TCTATCAAAT TGTAGTGGAT 60 CGATTTGTGG ATGGAAATAC ATCCAATAAT CCGAGTGGAG CATTATTTAG CTCAGGATGT 120 ACGAATTTAC GCAAGTATTG CGGTGGAGAT TGGCAAGGCA TCATCAATAA AATTAACGAT 180 GGGTATTTAA CAGATATGGG TGTGACAGCG ATATGGATTT CTCAGCCTGT AGAAAATGTA 240 TTTTCTGTGA TGAATGATGC AAGCGGTTCC GCATCCTATC ATGGTTATTG GGCGCGCGAT 300 TTCAAAAAGC CAAACCCGTT TTTTGGTACC CTCAGTGATT TCCAACGTTT AGTTGATGCC 360 GCACATGCAA AAGGAATAAA GGTAATTATT GACTTTGCCC CCAACCATAC TTCTCCTGCT 420 TCAGAAACGA ATCCTTCTTA TATGGAAAAC GGACGACTGT ACGATAATGG GACATTGCTT 480 GGCGGTTACA CAAATGATGC CAACATGTAT TTTCACCATA ACGGTGGAAC AACGTTTTCC 540 AGCTTAGAGG ATGGGATTTA TCGAAATCTG TTTGACTTGG CGGACCTTAA CCATCAGAAC 600 CCTGTTATTG ATAGGTATTT AAAAGATGCA GTAAAAATGT GGATAGATAT GGGGATTGAT 660 GGTATCCGTA TGGATGCGGT GAAGCACATG CCGTTTGGAT GGCAAAAATC TCTGATGGAT 720 GAGATTGATA ACTATCGTCC TGTCTTTACG TTTGGGGAGT GGTTTTTGTC AGAAAATGAA 780 GTGGACGCGA ACAATCATTA CTTTGCCAAT GAAAGTGGAA TGAGTTTGCT CGATTTTCGT 840 TTCGGACAAA AGCTTCGTCA AGTATTGCGC AATAACAGCG ATAATTGGTA TGGCTTTAAT 900 CAAATGATTC AAGATACGGC ATCAGCATAT GACGAGGTTC TCGATCAAGT AACATTCATA 960 GACAACCATG ATATGGATCG GTTTATGATT GACGGAGGAG ATCCGCGCAA GGTGGATATG 1020 GCACTTGCTG TATTATTGAC ATCCCGTGGC GTACCGAATA TTTACTATGG TACAGAGCAA 1080 TACATGACCG GTAACGGCGA TCCAAACAAT CGTAAGATGA TGAGTTCATT CAATAAAAAT 1140 ACTCGCGCGT ATCAAGTGAT TCAAAAACTA TCTTCTCTCC GACGAAACAA TCCGGCGTTA 1200 GCTTATGGTG ATACGGAACA GCGTTGGATC AATGGCGATG TGTATGTGTA TGAGCGACAG 1260 TTTGGCAAAG ATGTTGTGTT AGTTCGGGTT AATCGTAGTT CAAGCAGTAA TTACTCGATT 1320 ACTGGCTTAT TTACAGCTTT ACCAGCAGGA ACATATACGG ATCAGCTTGG CGGTCTTTTA 1380 GACGGAAATA CAATTCAAGT CGGTTCAAAT GGATCAGTTA ATGCATTTGA CTTAGGACCG 1440 GGGGAAGTCG GTGTATGGGC ATACAGTGCA ACAGAAAGCA CGCCAATTAT TGGTCATGTT 1500 GGACCGATGA TGGGGCAAGT CGGTCATCAA GTAACCATTG ATGGCGAAGG ATTCGGAACA 1560 AATACGGGCA CTGTGAAGTT CGGAACGACA GCTGCCAATG TTGTGTCTTG GTCTAACAAT 1620 CAAATCGTTG TGGCTGTACC AAATGTGTCA CCAGGAAAAT ATAATATTAC CGTCCAATCA 1680 TCAAGCGGTC AAACGAGTGC GGCTTATGAT AACTTTGAAG TACTAACAAA TGATCAAGTG 1740 TCAGTGCGGT TTGTTGTTAA TAACGCGACT ACCAATCTAG GGCAAAATAT ATACATTGTT 1800 GGCAACGTAT ATGAGCTCGG CAACTGGGAC ACTAGTAAGG CAATCGGTCC AATGTTCAAT 1860 CAAGTGGTTT ACTCCTATCC TACATGGTAT ATAGATGTCA GTGTCCCAGA AGGAAAGACA 1920 ATTGAGTTTA AGTTTATTAA AAAAGACAGC CAAGGTAATG TCACTTGGGA AAGTGGTTCA 1980 AATCATGTTT ATACGACACC AACGAATACA ACCGGAAAAA TTATAGTGGA TTGGCAGAAC 2040 【００９８】配列番号：10 配列の長さ：93 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 シグナルペプチド遺伝子の塩基
配列 配列 ATGAGAAGAT GGCTTTCGCT AGTCTTGAGC ATGTCATTTG TATTTAGTGC AATTTTTATA 60 GTATCTGATA CGCAGAAAGT CACCGTTGAA GCA 93 【００９９】配列番号：11 配列の長さ：31 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を示す記号：sig peptide 配列 Met Arg Arg Trp Leu Ser Leu Val Leu Ser Met Ser Phe Val Phe Ser Ala -30 -25 -20 -15 Ile Phe Ile Val Ser Asp Thr Gln Lys Val Thr Val Glu Ala -10 -5 【０１００】配列番号：12 配列の長さ：686 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Pro Asp Thr Ser Val Asn Asn Lys Leu Asn Phe Ser Thr Asp Thr Val 1 5 10 15 Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Val Asp Gly Asn Ser Ala Asn Asn Pro 20 25 30 Thr Gly Ala Ala Phe Ser Ser Asp His Ser Asn Leu Lys Leu Tyr Phe Gly 35 40 45 50 Gly Asp Trp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr Gly 55 60 65 Met Gly Ile Thr Ala Leu Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Ile Thr Ala 70 75 80 85 Val Ile Asn Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ala Tyr His Gly Tyr Trp Pro 90 95 100 Arg Asp Phe Lys Lys Thr Asn Ala Ala Phe Gly Ser Phe Thr Asp Phe Ser 105 110 115 Asn Leu Ile Ala Ala Ala His Ser His Asn Ile Lys Val Val Met Asp Phe 120 125 130 135 Ala Pro Asn His Thr Asn Pro Ala Ser Ser Thr Asp Pro Ser Phe Ala Glu 140 145 150 Asn Gly Ala Leu Tyr Asn Asn Gly Thr Leu Leu Gly Lys Tyr Ser Asn Asp 155 160 165 170 Thr Ala Gly Leu Phe His His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Thr Glu 175 180 185 Ser Gly Ile Tyr Lys Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Ile Asn Gln Asn Asn 190 195 200 Asn Thr Ile Asp Ser Tyr Leu Lys Glu Ser Ile Gln Leu Trp Leu Asn Leu 205 210 215 220 Gly Val Asp Gly Ile Arg Phe Asp Ala Val Lys His Met Pro Gln Gly Trp 225 230 235 Gln Lys Ser Tyr Val Ser Ser Ile Tyr Ser Ser Ala Asn Pro Val Phe Thr 240 245 250 255 Phe Gly Glu Trp Phe Leu Gly Pro Asp Glu Met Thr Gln Asp Asn Ile Asn 260 265 270 Phe Ala Asn Gln Ser Gly Met His Leu Leu Asp Phe Ala Phe Ala Gln Glu 275 280 285 Ile Arg Glu Val Phe Arg Asp Lys Ser Glu Thr Met Thr Asp Leu Asn Ser 290 295 300 305 Val Ile Ser Ser Thr Gly Ser Ser Tyr Asn Tyr Ile Asn Asn Met Val Thr 310 315 320 Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Gln Gln Ala Gly Ala Ser Thr 325 330 335 340 Arg Pro Thr Glu Gln Ala Leu Ala Val Thr Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro 345 350 355 Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly Asn Gly Asp Pro Asn 360 365 370 Asn Arg Gly Met Met Thr Gly Phe Asp Thr Asn Lys Thr Ala Tyr Lys Val 375 380 385 390 Ile Lys Ala Leu Ala Pro Leu Arg Lys Ser Asn Pro Ala Leu Ala Tyr Gly 395 400 405 Ser Thr Thr Gln Arg Trp Val Asn Ser Asp Val Tyr Val Tyr Glu Arg Lys 410 415 420 425 Phe Gly Ser Asn Val Ala Leu Val Ala Val Asn Arg Ser Ser Thr Thr Ala 430 435 440 Tyr Pro Ile Ser Gly Ala Leu Thr Ala Leu Pro Asn Gly Thr Tyr Thr Asp 445 450 455 Val Leu Gly Gly Leu Leu Asn Gly Asn Ser Ile Thr Val Asn Gly Gly Thr 460 465 470 475 Val Ser Asn Phe Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr 480 485 490 Thr Thr Glu Ser Ser Pro Ile Ile Gly Asn Val Gly Pro Thr Met Gly Lys 495 500 505 510 Pro Gly Asn Thr Ile Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Thr Thr Lys Asn 515 520 525 Lys Val Thr Phe Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ala Asn Ile Val Ser Trp 530 535 540 Glu Asp Thr Glu Ile Lys Val Lys Val Pro Asn Val Ala Ala Gly Asn Thr 545 550 555 560 Ala Val Thr Val Thr Asn Ala Ala Gly Thr Thr Ser Ala Ala Phe Asn Asn 565 570 575 Phe Asn Val Leu Thr Ala Asp Gln Val Thr Val Arg Phe Lys Val Asn Asn 580 585 590 595 Ala Thr Thr Ala Leu Gly Gln Asn Val Tyr Leu Thr Gly Asn Val Ala Glu 600 605 610 Leu Gly Asn Trp Thr Ala Ala Asn Ala Ile Gly Pro Met Tyr Asn Gln Val 615 620 625 Glu Ala Ser Tyr Pro Thr Trp Tyr Phe Asp Val Ser Val Pro Ala Asn Thr 630 635 640 645 Ala Leu Gln Phe Lys Phe Ile Lys Val Asn Gly Ser Thr Val Thr Trp Glu 650 655 660 Gly Gly Asn Asn His Thr Phe Thr Ser Pro Ser Ser Gly Val Ala Thr Val 665 670 675 680 Thr Val Asp Trp Gln Asn 685 【０１０１】配列番号：13 配列の長さ：2058 配列の型：核酸 配列 TCCCCGGATA CGAGCGTGAA CAACAAGCTC AATTTTAGCA CGGATACGGT TTACCAGATT 60 GTAACCGACC GGTTTGTGGA CGGCAATTCC GCCAACCACC CGACCGGAGC AGCCTTCAGC 120 AGCGATCATT CCAACCTGAA GCTGTATTTC GGGGGCGACT GGCAGGGGAT CACGAACAAA 180 ATCAACGACG GCTATCTGAC CGGAATGGGC ATCACCGCCC TCTGGATCTC GCAGCCGGTT 240 GAGAACATCA CCGCCGTCAT CAAATATTCG GGCGTCAACA ATACAGCTTA CCACGGTTAC 300 TGGCCTCGCG ACTTCAAGAA GACCAATGCC GCGTTCGGCA GCTTCACCGA CTTCTCCAAT 360 TTGATCGCCG CAGCGCATTC ACACAATATC AAGGTAGTTA TGGACTTTGC ACCTAATCAC 420 ACCAACCCGG CTTCGAGTAC GGACCCCTCG TTCGCCGAGA ACGGCGCGCT CTACAACAAC 480 GGAACGCTGC TCGGCAAGTA TAGCAACGAT ACCGCCGGCC TGTTCCACCA CAATGGCGGC 540 ACCGATTTCT CGACGACTGA AAGCGGTATC TACAAGAACC TGTACGATCT CGCGGATATC 600 AATCAGAACA ACAACACCAT CGACTCGTAT CTCAAGGAAT CGATCCAGCT GTGGCTGAAT 660 CTCGGAGTCG ACGGCATCCG CTTCGACGCC GTGAAGCATA TGCCTCAGGG CTGGCAGAAG 720 AGCTACGTCT CGTCGATCTA CAGCAGCGCC AATCCGGTGT TCACCTTCGG TGAATGGTTC 780 CTCGGCCCCG ACGAAATGAC CCAGGACAAC ATCAACTTCG CGAATCAGAG CGGCATGCAC 840 CTGCTGGACT TTGCGTTTGC GCAGGAAATC CGTGAAGTGT TCCGCGACAA GTCGGAGACG 900 ATGACCGACC TGAACTCGGT GATCTCCAGC ACCGGCTCCA GCTATAATTA CATCAACAAC 960 ATGGTTACGT TCATCGACAA CCATGACATG GACCGCTTCC AGCAAGCCGG AGCGAGCACT 1020 CGCCCGACCG AGCAGGCTCT TGCGGTAACG CTGACTTCCC GCGGCGTTCC GGCAATCTAC 1080 TACGGTACAG AGCAATATAT GACCGGCAAC GGCGACCCGA ACAACCGCGG CATGATGACC 1140 GGCTTCGATA CGAACAAGAC AGCGTACAAA GTGATCAAGG CGCTGGCTCC GCTTCGCAAG 1200 TCCAACCCGG CTCTCGCCTA CGGCTCGACG ACCCAGCGTT GGGTGAACAG CGACGTCTAC 1260 GTATATGAAC GCAAGTTCGG AAGCAACGTA GCTCTCGTTG CCGTCAACCG CAGCTCGACG 1320 ACTGCCTATC CGATATCGGG AGCGCTTACT GCTCTGCCAA ACGGAACGTA TACCGACGTT 1380 CTCGGCGGCC TGCTTAATGG CAATTCAATT ACCGTTAACG GCGGCACGGT CAGCAACTTT 1440 ACACTTGCAG CGGGCGGTAC GGCAGTCTGG CAGTACACGA CGACGGAATC CTCGCCGATT 1500 ATCGGCAACG TCGGCCCGAC TATGGGCAAG CCCGGCAACA CCATCACGAT CGACGGACGC 1560 GGCTTCGGTA CTACGAAGAA CAAAGTTACT TTCGGTACGA CAGCCGTTAC CGGCGCGAAC 1620 ATCGTGAGCT GGGAAGATAC CGAAATCAAG GTCAAAGTTC CGAACGTGGC CGCCGGCAAC 1680 ACGGCCGTTA CGGTAACGAA CGCCGCCGGC ACTACCAGCG CAGCGTTCAA CAACTTTAAC 1740 GTACTGACTG CCGATCAGGT CACTGTCCGC TTCAAAGTCA ACAATGCCAC CACGGCCCTG 1800 GGACAAAACG TCTACCTGAC CGGTAACGTC GCCGAGCTTG GCAACTGGAC AGCCGCCAAC 1860 GCAATCGGTC CGATGTACAA CCAGGTAGAA GCCAGCTATC CGACTTGGTA CTTCGACGTC 1920 AGCGTTCCGG CCAACACGGC GCTGCAATTC AAGTTCATCA AAGTGAACGG CTCGACAGTG 1980 ACTTGGGAAG GCGGCAACAA CCACACCTTC ACCTCGCCTT CGAGCGGCGT TGCGACCGTA 2040 ACGGTCGATT GGCAGAAC 2058 【０１０２】配列番号：14 配列の長さ：81 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 シグナルペプチド遺伝子の塩基
配列 配列 ATGAAAAAGC AAGTCAAATG GTTGACGTCG GTGTCGATGT CCGTAGGGAT CGCACTCGGC 60 GCGGCGCTGC CTGTATGGGC A 81 【０１０３】配列番号：15 配列の長さ：27 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を示す記号：sig peptide 配列 Met Lys Lys Gln Val Lys Trp Leu Thr Ser Val Ser Met Ser Val Gly Ile -25 -20 -15 Ala Leu Gly Ala Ala Leu Pro Val Trp Ala -10 -5 【０１０４】配列番号：16 配列の長さ：2040 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 起源 生物名：バチルス ステアロサーモフィラス 株名：ＦＥＲＭ Ｐ−２２２５ 配列 GCT GGA AAT CTT AAT AAG GTA AAC TTT ACA TCA GAT GTT GTC TAT CAA 48 Ala Gly Asn Leu Asn Lys Val Asn Phe Thr Ser Asp Val Val Tyr Gln 1 5 10 15 ATT GTA GTG GAT CGA TTT GTG GAT GGA AAT ACA TCC AAT AAT CCG AGT 96 Ile Val Val Asp Arg Phe Val Asp Gly Asn Thr Ser Asn Asn Pro Ser 20 25 30 GGA GCA TTA TTT AGC TCA GGA TGT ACG AAT TTA CGC AAG TAT TGC GGT 144 Gly Ala Leu Phe Ser Ser Gly Cys Thr Asn Leu Arg Lys Tyr Cys Gly 35 40 45 GGA GAT TGG CAA GGC ATC ATC AAT AAA ATT AAC GAT GGG TAT TTA ACA 192 Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr 50 55 60 GAT ATG GGT GTG ACA GCG ATA TGG ATT TCT CAG CCT GTA GAA AAT GTA 240 Asp Met Gly Val Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Val 65 70 75 80 TTT TCT GTG ATG AAT GAT GCA AGC GGT TCC GCA TCC TAT CAT GGT TAT 288 Phe Ser Val Met Asn Asp Ala Ser Gly Ser Ala Ser Tyr His Gly Tyr 85 90 95 TGG GCG CGC GAT TTC AAA AAG CCA AAC CCG TTT TTT GGT ACC CTC AGT 336 Trp Ala Arg Asp Phe Lys Lys Pro Asn Pro Phe Phe Gly Thr Leu Ser 100 105 110 GAT TTC CAA CGT TTA GTT GAT GCC GCA CAT GCA AAA GGA ATA AAG GTA 384 Asp Phe Gln Arg Leu Val Asp Ala Ala His Ala Lys Gly Ile Lys Val 115 120 125 ATT ATT GAC TTT GCC CCC AAC CAT ACT TCT CCT GCT TCA GAA ACG AAT 432 Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala Ser Glu Thr Asn 130 135 140 CCT TCT TAT ATG GAA AAC GGA CGA CTG TAC GAT AAT GGG ACA TTG CTT 480 Pro Ser Tyr Met Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn Gly Thr Leu Leu 145 150 155 160 GGC GGT TAC ACA AAT GAT GCC AAC ATG TAT TTT CAC CAT AAC GGT GGA 528 Gly Gly Tyr Thr Asn Asp Ala Asn Met Tyr Phe His His Asn Gly Gly 165 170 175 ACA ACG TTT TCC AGC TTA GAG GAT GGG ATT TAT CGA AAT CTG TTT GAC 576 Thr Thr Phe Ser Ser Leu Glu Asp Gly Ile Tyr Arg Asn Leu Phe Asp 180 185 190 TTG GCG GAC CTT AAC CAT CAG AAC CCT GTT ATT GAT AGG TAT TTA AAA 624 Leu Ala Asp Leu Asn His Gln Asn Pro Val Ile Asp Arg Tyr Leu Lys 195 200 205 GAT GCA GTA AAA ATG TGG ATA GAT ATG GGG ATT GAT GGT ATC CGT ATG 672 Asp Ala Val Lys Met Trp Ile Asp Met Gly Ile Asp Gly Ile Arg Met 210 215 220 GAT GCG GTG AAG CAC ATG CCG TTT GGA TGG CAA AAA TCT CTG ATG GAT 720 Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys Ser Leu Met Asp 225 230 235 240 GAG ATT GAT AAC TAT CGT CCT GTC TTT ACG TTT GGG GAG TGG TTT TTG 768 Glu Ile Asp Asn Tyr Arg Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu 245 250 255 TCA GAA AAT GAA GTG GAC GCG AAC AAT CAT TAC TTT GCC AAT GAA AGT 816 Ser Glu Asn Glu Val Asp Ala Asn Asn His Tyr Phe Ala Asn Glu Ser 260 265 270 GGA ATG AGT TTG CTC GAT TTT CGT TTC GGA CAA AAG CTT CGT CAA GTA 864 Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Gly Gln Lys Leu Arg Gln Val 275 280 285 TTG CGC AAT AAC AGC GAT AAT TGG TAT GGC TTT AAT CAA ATG ATT CAA 912 Leu Arg Asn Asn Ser Asp Asn Trp Tyr Gly Phe Asn Gln Met Ile Gln 290 295 300 GAT ACG GCA TCA GCA TAT GAC GAG GTT CTC GAT CAA GTA ACA TTC ATA 960 Asp Thr Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Val Leu Asp Gln Val Thr Phe Ile 305 310 315 320 GAC AAC CAT GAT ATG GAT CGG TTT ATG ATT GAC GGA GGA GAT CCG CGC 1008 Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Met Ile Asp Gly Gly Asp Pro Arg 325 330 335 AAG GTG GAT ATG GCA CTT GCT GTA TTA TTG ACA TCC CGT GGC GTA CCG 1056 Lys Val Asp Met Ala Leu Ala Val Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro 340 345 350 AAT ATT TAC TAT GGT ACA GAG CAA TAC ATG ACC GGT AAC GGC GAT CCA 1104 Asn Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly Asn Gly Asp Pro 355 360 365 AAC AAT CGT AAG ATG ATG AGT TCA TTC AAT AAA AAT ACT CGC GCG TAT 1156 Asn Asn Arg Lys Met Met Ser Ser Phe Asn Lys Asn Thr Arg Ala Tyr 370 375 380 CAA GTG ATT CAA AAA CTA TCT TCT CTC CGA CGA AAC AAT CCG GCG TTA 1200 Gln Val Ile Gln Lys Leu Ser Ser Leu Arg Arg Asn Asn Pro Ala Leu 385 390 395 400 GCT TAT GGT GAT ACG GAA CAG CGT TGG ATC AAT GGC GAT GTG TAT GTG 1248 Ala Tyr Gly Asp Thr Glu Gln Arg Trp Ile Asn Gly Asp Val Tyr Val 405 410 415 TAT GAG CGA CAG TTT GGC AAA GAT GTT GTG TTA GTT CGG GTT AAT CGT 1296 Tyr Glu Arg Gln Phe Gly Lys Asp Val Val Leu Val Arg Val Asn Arg 420 425 430 AGT TCA AGC AGT AAT TAC TCG ATT ACT GGC TTA TTT ACA GCT TTA CCA 1344 Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ser Ile Thr Gly Leu Phe Thr Ala Leu Pro 435 440 445 GCA GGA ACA TAT ACG GAT CAG CTT GGC GGT CTT TTA GAC GGA AAT ACA 1392 Ala Gly Thr Tyr Thr Asp Gln Leu Gly Gly Leu Leu Asp Gly Asn Thr 450 455 460 ATT CAA GTC GGT TCA AAT GGA TCA GTT AAT GCA TTT GAC TTA GGA CCG 1440 Ile Gln Val Gly Ser Asn Gly Ser Val Asn Ala Phe Asp Leu Gly Pro 465 470 475 480 GGG GAA GTC GGT GTA TGG GCA TAC AGT GCA ACA GAA AGC ACG CCA ATT 1488 Gly Glu Val Gly Val Trp Ala Tyr Ser Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ile 485 490 495 ATT GGT CAT GTT GGA CCG ATG ATG GGG CAA GTC GGT CAT CAA GTA ACC 1536 Ile Gly His Val Gly Pro Met Met Gly Gln Val Gly His Gln Val Thr 500 505 510 ATT GAT GGC GAA GGA TTC GGA ACA AAT ACG GGC ACT GTG AAG TTC GGA 1584 Ile Asp Gly Glu Gly Phe Gly Thr Asn Thr Gly Thr Val Lys Phe Gly 515 520 525 ACG ACA GCT GCC AAT GTT GTG TCT TGG TCT AAC AAT CAA ATC GTT GTG 1632 Thr Thr Ala Ala Asn Val Val Ser Trp Ser Asn Asn Gln Ile Val Val 530 535 540 GCT GTA CCA AAT GTG TCA CCA GGA AAA TAT AAT ATT ACC GTC CAA TCA 1680 Ala Val Pro Asn Val Ser Pro Gly Lys Tyr Asn Ile Thr Val Gln Ser 545 550 555 560 TCA AGC GGT CAA ACG AGT GCG GCT TAT GAT AAC TTT GAA GTA CTA ACA 1728 Ser Ser Gly Gln Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Asn Phe Glu Val Leu Thr 565 570 575 AAT GAT CAA GTG TCA GTG CGG TTT GTT GTT AAT AAC GCG ACT ACC AAT 1776 Asn Asp Gln Val Ser Val Arg Phe Val Val Asn Asn Ala Thr Thr Asn 580 585 590 CTA GGG CAA AAT ATA TAC ATT GTT GGC AAC GTA TAT GAG CTC GGC AAC 1824 Leu Gly Gln Asn Ile Tyr Ile Val Gly Asn Val Tyr Glu Leu Gly Asn 595 600 605 TGG GAC ACT AGT AAG GCA ATC GGT CCA ATG TTC AAT CAA GTG GTT TAC 1872 Trp Asp Thr Ser Lys Ala Ile Gly Pro Met Phe Asn Gln Val Val Tyr 610 615 620 TCC TAT CCT ACA TGG TAT ATA GAT GTC AGT GTC CCA GAA GGA AAG ACA 1920 Ser Tyr Pro Thr Trp Tyr Ile Asp Val Ser Val Pro Glu Gly Lys Thr 625 630 635 640 ATT GAG TTT AAG TTT ATT AAA AAA GAC AGC CAA GGT AAT GTC ACT TGG 1968 Ile Glu Phe Lys Phe Ile Lys Lys Asp Ser Gln Gly Asn Val Thr Trp 645 650 655 GAA AGT GGT TCA AAT CAT GTT TAT ACG ACA CCA ACG AAT ACA ACC GGA 2016 Glu Ser Gly Ser Asn His Val Tyr Thr Thr Pro Thr Asn Thr Thr Gly 660 665 670 AAA ATT ATA GTG GAT TGG CAG AAC 2040 Lys Ile Ile Val Asp Trp Gln Asn 675 680 【０１０５】配列番号：17 配列の長さ：2058 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 起源 生物名：バチルス マセランス 株名：バチルス マセランス １７Ａ 配列 TCC CCG GAT ACG AGC GTG AAC AAC AAG CTC AAT TTT AGC ACG GAT ACG 48 Ser Pro Asp Thr Ser Val Asn Asn Lys Leu Asn Phe Ser Thr Asp Thr 1 5 10 15 GTT TAC CAG ATT GTA ACC GAC CGG TTT GTG GAC GGC AAT TCC GCC AAC 96 Val Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Val Asp Gly Asn Ser Ala Asn 20 25 30 CAC CCG ACC GGA GCA GCC TTC AGC AGC GAT CAT TCC AAC CTG AAG CTG 144 Asn Pro Thr Gly Ala Ala Phe Ser Ser Asp His Ser Asn Leu Lys Leu 35 40 45 TAT TTC GGG GGC GAC TGG CAG GGG ATC ACG AAC AAA ATC AAC GAC GGC 192 Tyr Phe Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Ile Asn Asp Gly 50 55 60 TAT CTG ACC GGA ATG GGC ATC ACC GCC CTC TGG ATC TCG CAG CCG GTT 240 Tyr Leu Thr Gly Met Gly Ile Thr Ala Leu Trp Ile Ser Gln Pro Val 65 70 75 80 GAG AAC ATC ACC GCC GTC ATC AAA TAT TCG GGC GTC AAC AAT ACA GCT 288 Glu Asn Ile Thr Ala Val Ile Asn Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ala 85 90 95 TAC CAC GGT TAC TGG CCT CGC GAC TTC AAG AAG ACC AAT GCC GCG TTC 336 Tyr His Gly Tyr Trp Pro Arg Asp Phe Lys Lys Thr Asn Ala Ala Phe 100 105 110 GGC AGC TTC ACC GAC TTC TCC AAT TTG ATC GCC GCA GCG CAT TCA CAC 384 Gly Ser Phe Thr Asp Phe Ser Asn Leu Ile Ala Ala Ala His Ser His 115 120 125 AAT ATC AAG GTA GTT ATG GAC TTT GCA CCT AAT CAC ACC AAC CCG GCT 432 Asn Ile Lys Val Val Met Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Asn Pro Ala 130 135 140 TCG AGT ACG GAC CCC TCG TTC GCC GAG AAC GGC GCG CTC TAC AAC AAC 480 Ser Ser Thr Asp Pro Ser Phe Ala Glu Asn Gly Ala Leu Tyr Asn Asn 145 150 155 160 GGA ACG CTG CTC GGC AAG TAT AGC AAC GAT ACC GCC GGC CTG TTC CAC 528 Gly Thr Leu Leu Gly Lys Tyr Ser Asn Asp Thr Ala Gly Leu Phe His 165 170 175 CAC AAT GGC GGC ACC GAT TTC TCG ACG ACT GAA AGC GGT ATC TAC AAG 576 His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Thr Glu Ser Gly Ile Tyr Lys 180 185 190 AAC CTG TAC GAT CTC GCG GAT ATC AAT CAG AAC AAC AAC ACC ATC GAC 624 Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Ile Asn Gln Asn Asn Asn Thr Ile Asp 195 200 205 TCG TAT CTC AAG GAA TCG ATC CAG CTG TGG CTG AAT CTC GGA GTC GAC 672 Ser Tyr Leu Lys Glu Ser Ile Gln Leu Trp Leu Asn Leu Gly Val Asp 210 215 220 GGC ATC CGC TTC GAC GCC GTG AAG CAT ATG CCT CAG GGC TGG CAG AAG 720 Gly Ile Arg Phe Asp Ala Val Lys His Met Pro Gln Gly Trp Gln Lys 225 230 235 240 AGC TAC GTC TCG TCG ATC TAC AGC AGC GCC AAT CCG GTG TTC ACC TTC 768 Ser Tyr Val Ser Ser Ile Tyr Ser Ser Ala Asn Pro Val Phe Thr Phe 245 250 255 GGT GAA TGG TTC CTC GGC CCC GAC GAA ATG ACC CAG GAC AAC ATC AAC 816 Gly Glu Trp Phe Leu Gly Pro Asp Glu Met Thr Gln Asp Asn Ile Asn 260 265 270 TTC GCG AAT CAG AGC GGC ATG CAC CTG CTG GAC TTT GCG TTT GCG CAG 864 Phe Ala Asn Gln Ser Gly Met His Leu Leu Asp Phe Ala Phe Ala Gln 275 280 285 GAA ATC CGT GAA GTG TTC CGC GAC AAG TCG GAG ACG ATG ACC GAC CTG 912 Glu Ile Arg Glu Val Phe Arg Asp Lys Ser Glu Thr Met Thr Asp Leu 290 295 300 AAC TCG GTG ATC TCC AGC ACC GGC TCC AGC TAT AAT TAC ATC AAC AAC 960 Asn Ser Val Ile Ser Ser Thr Gly Ser Ser Tyr Asn Tyr Ile Asn Asn 305 310 315 320 ATG GTT ACG TTC ATC GAC AAC CAT GAC ATG GAC CGC TTC CAG CAA GCC 1008 Met Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Gln Gln Ala 325 330 335 GGA GCG AGC ACT CGC CCG ACC GAG CAG GCT CTT GCG GTA ACG CTG ACT 1056 Gly Ala Ser Thr Arg Pro Thr Glu Gln Ala Leu Ala Val Thr Leu Thr 340 345 350 TCC CGC GGC GTT CCG GCA ATC TAC TAC GGT ACA GAG CAA TAT ATG ACC 1104 Ser Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr 355 360 365 GGC AAC GGC GAC CCG AAC AAC CGC GGC ATG ATG ACC GGC TTC GAT ACG 1152 Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Arg Gly Met Met Thr Gly Phe Asp Thr 370 375 380 AAC AAG ACA GCG TAC AAA GTG ATC AAG GCG CTG GCT CCG CTT CGC AAG 1200 Asn Lys Thr Ala Tyr Lys Val Ile Lys Ala Leu Ala Pro Leu Arg Lys 385 390 395 400 TCC AAC CCG GCT CTC GCC TAC GGC TCG ACG ACC CAG CGT TGG GTG AAC 1248 Ser Asn Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Ser Thr Thr Gln Arg Trp Val Asn 405 410 415 AGC GAC GTC TAC GTA TAT GAA CGC AAG TTC GGA AGC AAC GTA GCT CTC 1296 Ser Asp Val Tyr Val Tyr Glu Arg Lys Phe Gly Ser Asn Val Ala Leu 420 425 430 GTT GCC GTC AAC CGC AGC TCG ACG ACT GCC TAT CCG ATA TCG GGA GCG 1344 Val Ala Val Asn Arg Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Ile Ser Gly Ala 435 440 445 CTT ACT GCT CTG CCA AAC GGA ACG TAT ACC GAC GTT CTC GGC GGC CTG 1392 Leu Thr Ala Leu Pro Asn Gly Thr Tyr Thr Asp Val Leu Gly Gly Leu 450 455 460 CTT AAT GGC AAT TCA ATT ACC GTT AAC GGC GGC ACG GTC AGC AAC TTT 1440 Leu Asn Gly Asn Ser Ile Thr Val Asn Gly Gly Thr Val Ser Asn Phe 465 470 475 480 ACA CTT GCA GCG GGC GGT ACG GCA GTC TGG CAG TAC ACG ACG ACG GAA 1488 Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Thr Thr Glu 485 490 495 TCC TCG CCG ATT ATC GGC AAC GTC GGC CCG ACT ATG GGC AAG CCC GGC 1536 Ser Ser Pro Ile Ile Gly Asn Val Gly Pro Thr Met Gly Lys Pro Gly 500 505 510 AAC ACC ATC ACG ATC GAC GGA CGC GGC TTC GGT ACT ACG AAG AAC AAA 1584 Asn Thr Ile Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Thr Thr Lys Asn Lys 515 520 525 GTT ACT TTC GGT ACG ACA GCC GTT ACC GGC GCG AAC ATC GTG AGC TGG 1632 Val Thr Phe Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ala Asn Ile Val Ser Trp 530 535 540 GAA GAT ACC GAA ATC AAG GTC AAA GTT CCG AAC GTG GCC GCC GGC AAC 1680 Glu Asp Thr Glu Ile Lys Val Lys Val Pro Asn Val Ala Ala Gly Asn 545 550 555 560 ACG GCC GTT ACG GTA ACG AAC GCC GCC GGC ACT ACC AGC GCA GCG TTC 1728 Thr Ala Val Thr Val Thr Asn Ala Ala Gly Thr Thr Ser Ala Ala Phe 565 570 575 AAC AAC TTT AAC GTA CTG ACT GCC GAT CAG GTC ACT GTC CGC TTC AAA 1776 Asn Asn Phe Asn Val Leu Thr Ala Asp Gln Val Thr Val Arg Phe Lys 580 585 590 GTC AAC AAT GCC ACC ACG GCC CTG GGA CAA AAC GTC TAC CTG ACC GGT 1824 Val Asn Asn Ala Thr Thr Ala Leu Gly Gln Asn Val Tyr Leu Thr Gly 595 600 605 AAC GTC GCC GAG CTT GGC AAC TGG ACA GCC GCC AAC GCA ATC GGT CCG 1872 Asn Val Ala Glu Leu Gly Asn Trp Thr Ala Ala Asn Ala Ile Gly Pro 610 615 620 ATG TAC AAC CAG GTA GAA GCC AGC TAT CCG ACT TGG TAC TTC GAC GTC 1920 Met Tyr Asn Gln Val Glu Ala Ser Tyr Pro Thr Trp Tyr Phe Asp Val 625 630 635 640 Ser Val Pro Ala Asn Thr Ala Leu Gln Phe Lys Phe Ile Lys Val Asn AGC GTT CCG GCC AAC ACG GCG CTG CAA TTC AAG TTC ATC AAA GTG AAC 1968 645 650 655 GGC TCG ACA GTG ACT TGG GAA GGC GGC AAC AAC CAC ACC TTC ACC TCG 2016 Gly Ser Thr Val Thr Trp Glu Gly Gly Asn Asn His Thr Phe Thr Ser 660 665 670 CCT TCG AGC GGC GTT GCG ACC GTA ACG GTC GAT TGG CAG AAC 2058 Pro Ser Ser Gly Val Ala Thr Val Thr Val Asp Trp Gln Asn 675 680 685
【図面の簡単な説明】
【図１】組換えＤＮＡ ｐＴＣＨ２０１について、バチ
ルス ステアロサーモフィラス由来ＤＮＡ部分の制限酵
素切断地図を示す図である。 【図２】組換えＤＮＡ ｐＴＣＵ２１１について、バチ
ルス ステアロサーモフィラス由来ＤＮＡ部分の制限酵
素切断地図を示す図である。 【図３】組換えＤＮＡ ｐＭＡＨ２についてバチルス
マセランス由来ＤＮＡ部分の制限酵素切断地図を示す図
である。 【図４】組換えＤＮＡ ｐＭＡＵ２１０について、バチ
ルス マセランス由来ＤＮＡ部分の制限酵素切断地図を
示す図である。
ルス ステアロサーモフィラス由来ＤＮＡ部分の制限酵
素切断地図を示す図である。 【図２】組換えＤＮＡ ｐＴＣＵ２１１について、バチ
ルス ステアロサーモフィラス由来ＤＮＡ部分の制限酵
素切断地図を示す図である。 【図３】組換えＤＮＡ ｐＭＡＨ２についてバチルス
マセランス由来ＤＮＡ部分の制限酵素切断地図を示す図
である。 【図４】組換えＤＮＡ ｐＭＡＵ２１０について、バチ
ルス マセランス由来ＤＮＡ部分の制限酵素切断地図を
示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
(Ｃ１２Ｎ 9/10
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｎ 9/10
Ｃ１２Ｒ 1:125）
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
C12N 15/54
C12N 9/10
C12P 19/18
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．シクロマルトデキストリン グルカノトランスフェ
ラーゼを澱粉質に作用させる糖転移方法において、バチ
ルス属に属する微生物から得ることのできる、シクロマ
ルトデキストリン グルカノトランスフェラーゼ活性を
有し、部分アミノ酸配列として、配列表における配列番
号１乃至５に示すアミノ酸配列の１種または２種以上を
有し、分子量がＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法で７０，０００±１０，０００および７０℃で安定
であるポリペプチドをコードするＤＮＡであって、制限
酵素Ｐｖｕ ＩＩによる切断部位を有するＤＮＡを適宜
宿主微生物に導入して形質転換微生物を得、この形質転
換微生物を栄養培地中で培養した後、培地中に産生され
たシクロマルトデキストリン グルカノトランスフェラ
ーゼ活性を有するポリペプチドを、シクロマルトデキス
トリングルカノトランスフェラーゼとして用いることを
特徴とする糖転移方法。 ２．澱粉質が糊化澱粉、液化澱粉または可溶性澱粉であ
ることを特徴とする請求項１に記載の糖転移方法。 ３．糖転移方法により得られる糖転移物が、シクロデキ
ストリンであることを特徴とする請求項１または２に記
載の糖転移方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8265074A JP2787437B2 (ja) | 1996-09-17 | 1996-09-17 | 糖転移方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8265074A JP2787437B2 (ja) | 1996-09-17 | 1996-09-17 | 糖転移方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60228169A Division JP2612687B2 (ja) | 1984-12-03 | 1985-10-14 | シクロマルトデキストリングルカノトランスフエラーゼ活性を有するポリペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09107968A JPH09107968A (ja) | 1997-04-28 |
| JP2787437B2 true JP2787437B2 (ja) | 1998-08-20 |
Family
ID=17412241
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8265074A Expired - Lifetime JP2787437B2 (ja) | 1996-09-17 | 1996-09-17 | 糖転移方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2787437B2 (ja) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5933360B2 (ja) * | 1980-03-11 | 1984-08-15 | 株式会社林原生物化学研究所 | α−グリコシルステビオ−ル配糖体の製造方法 |
| JP2612687B2 (ja) * | 1985-10-14 | 1997-05-21 | 株式会社 林原生物化学研究所 | シクロマルトデキストリングルカノトランスフエラーゼ活性を有するポリペプチド |
| JP2657801B2 (ja) * | 1986-03-30 | 1997-09-30 | 株式会社 林原生物化学研究所 | 糖転移反応方法 |
-
1996
- 1996-09-17 JP JP8265074A patent/JP2787437B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 第７回分子生物学会年会プログラム・講演要旨集 （昭和５９年１１月１６日 日本分子生物学会発行） Ｐ．４７ Ｂ−７８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09107968A (ja) | 1997-04-28 |
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