JP2754486B2 - 糖転移反応を利用した飲食物の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明が属する技術分野】本発明は、糖転移反応を利用
した飲食物の製造方法に関し、より詳細には、特定のア
ミノ酸配列を有し、且つシクロマルトデキストリン グ
ルカノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを
澱粉質に作用させることにより生成する糖転移反応物を
含有せしめることを特徴とする飲食物の製造方法に関す
る。 【０００２】 【従来の技術】シクロマルトデキストリン グルカノト
ランスフェラーゼ（以下、本明細書では「ＣＧＴａｓ
ｅ」と略称する。）は、マセランス アミラーゼとも言
われ、古くからバチルス マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）の産生する酵素として知られて
いる。近年、ＣＧＴａｓｅは、バチルス マセランスだ
けでなく、バチルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ）、バチルス サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃ
ｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス メガテリウム（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス ポリ
ミキサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）、Ｋｌ
ｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などの微生
物によっても産生されることが知られている。 【０００３】しかしながら、これら微生物から産生され
るＣＧＴａｓｅは、一部の酵素的性質しか知られておら
ず、工業的に安心して広範に利用するにはなお不十分で
あり、とりわけ、飲食物の製造に利用するに際しては、
より解明されたＣＧＴａｓｅを利用することが望まれて
いる。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、ＣＧＴ
ａｓｅを工業的に安心して利用するために、より詳細に
解明されたＣＧＴａｓｅ、とりわけアミノ酸配列まで解
明されたＣＧＴａｓｅ活性を有するポリペプチド（以
下、本明細書では、単に「ポリペプチド」と略称す
る。）を飲食物の製造に利用することについて鋭意研究
した。 【０００５】その結果、ポリペプチドは、部分アミノ酸
配列として、配列表における配列番号１乃至５に示すア
ミノ酸配列の１種以上の配列を有していることが判明
し、更に詳細には、前記部分アミノ酸配列がＮ末端側か
ら近い順に配列表における配列番号１乃至５の部分アミ
ノ酸配列を有していることが判明した。 【０００６】そして、その特徴的性質は、可溶性澱粉か
らシクロデキストリンを生成し、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミド電気泳動法で７０，０００±１０，０００の分子
量を示すポリペプチドであって、その比活性は、２００
±３０単位／ｍｇ蛋白質である。 【０００７】また、バチルス ステアロサーモフィラス
由来のポリペプチドは、後に説明するように、配列表に
おける配列番号７に示されるアミノ酸配列を有している
ことが判明した。 【０００８】更に、本発明のアミノ酸配列が解明された
ポリペプチドは、澱粉質に作用して糖転移反応に利用で
きるだけでなく、糖転移反応物とともに飲食物に含有せ
しめ風味を損なうことなくそのまま食用に供し得ること
も判明した。 【０００９】以下、本発明の内容を詳述し、併せて本発
明の効果を説明する。本明細書の記載において、アミノ
酸、ペプチド、その他に関し略号で表記する場合、それ
らは当該分野における慣用略号に基づくものである。そ
れらの例を以下に列記する。アミノ酸に関し、光学異性
体があり得る場合には、特に明示しなければＬ体を示す
ものとする。 【００１０】 ＤＮＡ ： デオキシリボ核酸 ＲＮＡ ： リボ核酸 Ａ ： アデニン Ｔ ： チミン Ｇ ： グアニン Ｃ ： シトシン ｄＮＴＰ ： デオキシヌクレオチド三リン酸 ｄｄＮＴＰ： ジデオキシヌクレオチド三リン酸 ｄＣＴＰ ： デオキシシチジン三リン酸 ＳＤＳ ： ドデシル硫酸ナトリウム Ａｌａ ： アラニン Ａｒｇ ： アルギニン Ａｓｎ ： アスパラギン Ａｓｐ ： アスパラギン酸 Ｃｙｓ ： システイン Ｇｌｎ ： グルタミン Ｇｌｕ ： グルタミン酸 Ｇｌｙ ： グリシン Ｈｉｓ ： ヒスチジン Ｉｌｅ ： イソロイシン Ｌｅｕ ： ロイシン Ｌｙｓ ： リジン Ｍｅｔ ： メチオニン Ｐｈｅ ： フェニルアラニン Ｐｒｏ ： プロリン Ｓｅｒ ： セリン Ｔｈｒ ： スレオニン Ｔｒｐ ： トリプトファン Ｔｙｒ ： チロシン Ｖａｌ ： バリン 【００１１】本発明に於いて、ポリペプチドのアミノ酸
配列は、ＣＧＴａｓｅ産生菌からポリペプチド遺伝子を
クロニーングした後、その塩基配列を解読して決定し
た。 【００１２】一方、ポリペプチドのＮ末端を含有する部
分アミノ酸配列は、ポリペプチドを高純度に精製した
後、気相プロテイン シークエンサーを用いて調べた。 【００１３】〈ポリペプチド遺伝子のクローニング〉本
発明のポリペプチド産生能を有する供与体微生物よりそ
の微生物のＤＮＡを分離し精製した後、例えば、超音
波、制限酵素などで切断し、得られたＤＮＡ断片と、同
様にしてベクターを切断して得られたベクター断片と
を、例えば、ＤＮＡリガーゼなどにより結合させ、ポリ
ペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡを形成する。 【００１４】この際、供与体微生物として、ポリペプチ
ド産生能を有する微生物、例えば、特開昭４７−２０３
７３号公報、特開昭５０−６３１８９号公報、特開昭５
０−８８２９０号公報およびハンス ベンダー（Ｈａｎ
ｓ Ｂｅｎｄｅｒ）、『アーカイブズ・オブ・マイクロ
バイオロジー（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ）』、第１１１巻、２７１〜２８２頁（１
９７７年）などに示されているバチルス マセランス、
バチルス メガテリウム、バチルス サーキュランス、
バチルス ポリミキサ、バチルス ステアロサーモフィ
ラスなどのバチルス属、クレブシーラ ニューモニアエ
などのクレブシーラ属などの細菌の内、バチルス ステ
アロサーモフィラスが使用できる。 【００１５】また、ポリペプチド産生能を遺伝子組換え
により導入した形質転換微生物を供与体微生物として利
用することもできる。 【００１６】供与体微生物由来のＤＮＡは、供与体微生
物を、例えば、液体培地で約１〜３日間通気攪拌培養
し、得られる培養液を遠心分離して集菌し、次いでこれ
を溶菌させることによって調製することができる。溶菌
方法としては、例えば、リゾチームやβ−グルカナーゼ
などの細胞壁溶解酵素による処理や超音波処理などが用
いられる。また、必要によりプロテアーゼなどの他の酵
素剤やラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤を併用
することも、更に凍結融解処理を施すことも自由であ
る。 【００１７】このようにして得られる溶菌物からＤＮＡ
を分離し、精製するには、常法に従って、例えばフェノ
ール抽出、除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレ
アーゼ処理、アルコール沈殿、遠心分離などの方法を適
宜組み合わせることによって行うことができる。 【００１８】ＤＮＡを切断する方法は、例えば、超音波
処理、制限酵素処理などにより行うことができるが、得
られるＤＮＡ断片とベクター断片との結合を容易にする
ためには、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列に
作用する、例えば、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｂ
ａｍＨ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ、Ｓｌａ Ｉ、Ｘｍａ Ｉ、Ｍ
ｂｏ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉなどの
ＩＩ型制限酵素が適している。 【００１９】ベクターとしては、宿主微生物で自律的に
増殖し得るファージまたはプラスミドが適している。 【００２０】ファージとしては、例えば、エッシェリヒ
ア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）を宿主微
生物とする場合には、λｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなど
が、バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ）を宿主微生物とする場合には、ρ１１、φ
１、φ１０５などが使用できる。 【００２１】また、プラスミドとしては、例えば、エッ
シェリヒア コリを宿主細胞とする場合には、ｐＢＲ３
２２、ｐＢＲ３２５などが、バチルス ズブチリスを宿
主微生物とする場合には、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４（ｐ
ＴＰ４）、ｐＣ１９４などが使用でき、更に、例えば、
エッシェリヒア コリ、バチルス ズブチリスなどの２
種以上の宿主微生物で自律的増殖の可能な、例えば、ｐ
ＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのベクタ
ーを利用することも可能である。このようなベクター
を、先に述べたＤＮＡと同様に制限酵素などで切断し、
ベクター断片を得る。 【００２２】ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合させる
方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよ
く、例えば、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリン
グの後、生体外で適当なＤＮＡリガーゼの作用により組
換えＤＮＡを作製する。必要ならば、アニーリングの
後、宿主微生物に導入して、生体内のＤＮＡリガーゼを
利用して組換えＤＮＡにすることもできる。 【００２３】宿主微生物としては、組換えＤＮＡが安定
かつ自律的増殖が可能でその形質発現のできるものであ
ればよい。中でも、α−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．
１．１）産生能を欠いている微生物は、ポリペプチド産
生量の測定が容易であるだけでなく、産生されるポリペ
プチドの分離、精製も容易であり有利に利用できる。 【００２４】宿主微生物に組換えＤＮＡを導入する方法
は、公知の方法、例えば、宿主微生物がエッシェリヒア
コリの場合にはカルシウムイオン存在下で行い、バチ
ルス属に属する微生物の場合にはコンピテントセル法ま
たはプロトプラスト法などを採用することができる。 【００２５】組換えＤＮＡが導入された形質転換微生物
の選択方法は、澱粉を含む平板培地上で生育し、かつ、
澱粉からシクロデキストリンを生成するものを選択すれ
ばよい。 【００２６】このようにして一度選択されたポリペプチ
ド遺伝子を含む組換えＤＮＡは、形質転換微生物から取
り出して、他の宿主微生物に導入することも容易に実施
できることが判明した。またポリペプチド遺伝子を含む
組換えＤＮＡを制限酵素などにより切断してポリペプチ
ド遺伝子を含むＤＮＡ断片とし、これと同様にして得ら
れるベクター断片とを結合させることも容易に実施でき
ることが判明した。また、ポリペプチド遺伝子を含む組
換えＤＮＡを制限酵素などにより切断してポリペプチド
遺伝子を含むＤＮＡ断片とし、これと同様にプラスミド
などのベクターを切断して得られるベクター断片とを結
合させることも容易に実施できることが判明した。 【００２７】また、ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤ
ＮＡは、制限酵素ＰｖｕＩＩ（東洋紡績株式会社製造）
による切断部位を有しており、制限酵素ＰｖｕＩＩの作
用を受けたポリペプチド遺伝子が切断され、その形質発
現能を失うことが判明した。 【００２８】〈ポリペプチド遺伝子の塩基配列〉ポリペ
プチドの遺伝子塩基配列は、『ジーン（Ｇｅｎｅ）』、
第９巻、２５９〜２６８頁（１９８２年）に示されてい
るジデオキシ チェーンターミネーター法で解読すれば
よい。この方法は、クローニングにより得られたポリペ
プチド遺伝子を含むＤＮＡ断片を、プラスミドｐＵＣ１
８などのプラスミドに制限酵素を利用してそのクローニ
ング部位に挿入する。得られた組換えプラスミドは、形
質転換によってエッシェリヒア コリ ＪＭ８３などに
移入し、次いで組換えプラスミドを有する微生物を選択
する。この微生物を増殖させたものを用いて組換えプラ
スミドを調製する。得られた組換えプラスミドを合成プ
ライマーとアニーリングし、これにクレノウ（Ｋｌｅｎ
ｏｗ）断片を働かせてプライマーを伸長させ相補ＤＮＡ
を生成させる。この反応物をポリアクリルアミドゲル電
気泳動、次いで、ラジオオートグラフィー法を行った
後、ポリペプチド遺伝子の塩基配列を決定する。また、
ポリペプチドを菌体外に分泌させるシグナルペプチド遺
伝子の塩基配列も同様にして決定する。 【００２９】〈ポリペプチドのアミノ酸配列〉ポリペプ
チドのアミノ酸配列は、塩基配列により決定する。ま
た、ポリペプチドを菌体外に分泌させるシグナルペプチ
ドのアミノ酸配列も同様に決定する。 【００３０】〈ポリペプチドのＮ末端を含有する部分ア
ミノ酸配列〉ポリペプチド産生能を有するバチルス属に
属する微生物を栄養培地で培養してポリペプチドを産生
させる。培養終了後、遠心分離して上清を採取し、これ
を硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体
クロマトグラフィーにより精製し高純度ポリペプチドと
する。この試料を用いて『ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第２５６
巻、第７９９０〜７９９７頁（１９８１年）の記載に準
じて、気相プロテイン シークエンサーにより分解し、
高速液体クロマトグラフィーで同定して、ポリペプチド
のＮ末端を有する部分アミノ酸配列を決定する。 【００３１】〈形質転換微生物によるポリペプチドの調
製〉以上のようにして得られた形質転換微生物を栄養培
地で培養することにより多量のポリペプチドが安定して
産生し得ることも見い出した。栄養培地には、例えば、
炭素源、窒素源、ミネラル、更に必要ならば、アミノ
酸、ビタミンなどの有機微量栄養素などを含有させると
良い。この際、炭素源としては、澱粉、澱粉部分加水分
解物、グルコース、フラクトース、スクロースなどの糖
質が有利に用いられる。窒素源としては、アンモニアガ
ス、アンモニア水、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機
窒素源、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンステ
ィープリカー、肉エキスなどの有機窒素源が適宜用いら
れる。 【００３２】培養方法は、例えば、液体培地をｐＨ４〜
１０、温度２５〜６５℃の範囲に維持しつつ、通気攪拌
などの好気的条件下で約１〜４日間培養し、ポリペプチ
ドを生成蓄積させればよい。培養物中のポリペプチド
は、そのまま採取し利用することもできるが、一般には
常法に従って、濾過、遠心分離などによりポリペプチド
溶液と微生物菌体とに分離した後に利用される。ポリペ
プチドが菌体中に存在する場合には、細胞を超音波、界
面活性剤、細胞壁溶解酵素などで処理し、次いで濾過、
遠心分離などしてポリペプチド溶液を採取する。 【００３３】このようにして得られるポリペプチド溶液
を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、澱粉吸着・溶出、更
に、硫安、硫酸ソーダなどによる塩析、メタノール、エ
タノール、アセトンなどによる分別沈殿法などを適宜組
み合わせて精製し、より高純度のポリペプチドを採取し
て利用することも、また、このポリペプチドを反応に利
用した後、膜分離により回収し、繰り返し利用すること
も、更に、このポリペプチドを、例えば、特公昭５８−
１９２７６号公報および特公昭６０−１８７９号公報な
どに記載されている固定化方法により固定化し、固定化
酵素として利用することも自由である。 【００３４】本発明で利用するポリペプチドは、本発明
で特定するアミノ酸配列まで解明され、安心して利用し
得るものであればよく、先に述べた遺伝子組換えによる
形質転換微生物からのもののみに限定されるものではな
い。本発明で特定するアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドは、本発明の飲食物の製造方法で用いる糖転移反応方
法に有利に利用できる。 【００３５】即ち、本発明の飲食物の製造方法で用いる
糖転移反応方法は、ポリペプチドを糊化澱粉、液化澱
粉、アミロースなどの澱粉質に作用させて分子内転移反
応を起こさせ、例えば、α−シクロマルトデキストリ
ン、β−シクロマルトデキストリン、γ‐シクロマルト
デキストリンなどを生成せしめるか、または、澱粉質な
どの糖供与体と澱粉質以外の糖類、配糖体などの糖受容
体との混合物に作用させて分子間転移反応を起こさせ、
各種糖転移反応物を生成せしめる方法である。 【００３６】また、分子内転移反応で得られる各種シク
ロデキストリンは、香料、色素、調味料、油溶性物質な
どと包摂化合物を形成させることにより、飲食物、化粧
品、医薬品、日用品などに有利に利用できる。 【００３７】前記ポリペプチドを分子間転移反応に利用
する場合には、例えば、澱粉、液化澱粉、デキストリ
ン、シクロデキストリン、アミロースなどの澱粉質を糖
供与体とし、例えば、キシロース、ソルボース、フラク
トースなどの単糖類、シュクロース、マルチュロース、
イソマルチュロースなどの二等類から選ばれる糖質甘味
料を糖受容体との混合物に当該ポリペプチドを作用さ
せ、α−グルコシル、α−マルトシル、α−マルトトリ
オシルなどのα−グリコシル化された糖質甘味料を調製
することは、極めて有利に実施できる。得られるα−グ
リコシル化された糖質甘味料は、原料の糖質甘味料と比
較して呈味がまろやかに改善されており、その水溶性が
増大し、結晶析出が防止され、その糖質甘味料の用途を
著しく拡大し、各種飲食物に有利に利用できる。 【００３８】また、分子間転移反応に於いて、糖受容体
として、例えば、ステビオシド、レバウディオサイド、
ルブソサイドなどのステビオール配糖体、グリチルリチ
ン、ソヤサポニン、茶サポニン、ジンセノサイド、ルチ
ン、エスクリンなどの配糖体を用いる際には、前記澱粉
糖質などの糖供与体と配糖体との混合物にポリペプチド
を作用させることにより、α−グルコシル、α−マルト
シル、α−マルトトリオシルなどのα−グリコシル化さ
れた配糖体を調製することもまた有利に実施できる。 【００３９】得られるα−グリコシル化された配糖体
は、原料の配糖体と比較して、苦味、渋味などの嫌味が
解消し、水溶液が増大するなどの物性が改善され、その
配糖体の用途を著しく拡大することができる。特に、α
−グリコシル化されたステビオール配糖体やα−グリコ
シル化されたグリチルリチンなどの場合には、その呈味
の改善が著しく、砂糖に近い甘味質になることにより、
各種飲食物、経口医薬品などに有利に利用できる。 【００４０】前記糖転移反応方法は、飲食物の製造に際
し、ポリペプチドを澱粉質に作用させ、生成する糖転移
反応物を含有せしめて品質の向上した飲食物を製造する
方法として有利に利用できる。 【００４１】本発明で言う澱粉質とは、ポリペプチドが
作用して分子内または分子間転移反応を起こし得る澱粉
質であればよく、例えば、澱粉、アミロース、アミロペ
クチンまたはこれらを酸または酵素で部分加水分解した
デキストリンなどの澱粉質、およびこれら澱粉質を多量
に含有している米、大麦、小麦、トウモロコシ、アズ
キ、ササゲなどの穀類、サツマイモ、ジャガイモなどの
イモ類、またはこれらのチップ、グリッツ、粉末などを
いう。 【００４２】飲食物の製造に際して、澱粉質にポリペプ
チドを作用させ、生成する糖転移反応物を含有せしめる
方法は、本発明の目的が達成できればよく、例えば、予
め糊化分散させた澱粉質溶液にポリペプチドを作用させ
て、これをそのまま若しくは必要に応じて濃縮し、乾燥
させた後、飲食物に配合してもよい。 【００４３】また、バチルス ステアロサーモフィラス
由来のポリペプチドのように好熱性の場合には、予め澱
粉質とポリペプチドとを共存させて、澱粉質の糊化と糖
転移反応とを同時に行って飲食物を製造してもよい。ま
た、ポリペプチドとともに他の酵素、例えば、アミラー
ゼ、プロテアーゼ、リパーゼなどを併用することも自由
である。このようにして得られる飲食物は、ポリペプチ
ドの作用により澱粉質の老化を抑制し、飲食物の口当
り、呈味改良、風味向上をもたらすだけでなく、結晶析
出防止、乳化性、保湿性などの物性をも改善し、しか
も、これらの性質が変化しにくく、高品質を長期間維持
できるので、得られる飲食物の商品価値は極めて高い。 【００４４】本発明の製造方法が適用できる飲食物とし
ては、澱粉質を含有しているか、または、澱粉質を原料
とする飲食物が好適であって、例えば、クッキー、ビス
ケット、おかき、スポンジケーキ、ういろう、求肥、餅
などの菓子類、菓子パン、食パンなどのパン類、うど
ん、そば、ラーメン、マカロニなどの麺類、カマボコ、
魚肉ソーセージなどの魚肉練製品、焼肉のタレ、カレー
ルウ、シチューの素、スープの素、α−グリコシル ス
テビオサイド、α−グリコシル レバウディオサイド、
α−グリコシル ジンセノサイド、α−グリコシル ル
ブソサイドなどのα−グリコシル ステビオール配糖
体、α−グリコシル グリチルリチンなどの調味料、甘
酒、ビール、酢、味噌などの発酵飲食物などが好適であ
る。 【００４５】以下、実験で本発明を詳細に説明する。 【００４６】 【実験１】 〈バチルス ステアロサーモフィラスのポリペプチド遺
伝子のエッシェリヒアコリへのクローニング〉 【００４７】 【実験１−１】 〈バチルス ステアロサーモフィラスの耐熱性ポリペプ
チド遺伝子を含む染色体ＤＮＡの調製〉バチルス ステ
アロサーモフィラスの耐熱性ポリペプチド遺伝子を含む
染色体ＤＮＡは、斉藤、三浦等の方法、『ビオキミカ・
エト・ビオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ
ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）』、第７２
巻、６１９〜６２９頁（１９６３年）に準じて調製し
た。即ち、バチルス ステアロサーモフィラス（ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ Ｎｏ．２２２５）をブレインハート インフュ
ージョン培地で５０℃、一夜通気攪拌培養した。培養液
を遠心分離して集菌し、得られた菌体をＴＥＳ緩衝液
（ｐＨ８．０、トリスアミノメタン、塩酸、ＥＤＴＡ、
塩化ナトリウム含有）に懸濁し、次にリゾチームをｍｌ
当たり２ｍｇの割合で加え、３７℃で３０分間保持し
た。これを、−２０℃で一夜凍結した後、ＴＳＳ緩衝液
（ｐＨ９．０、トリスアミノメタン、ＨＣｌ、ラウリル
硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム含有）を加え、６０℃
に加温した後、ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）１容とフェ
ノール４容との混合液を加え、氷水中で冷却後、遠心分
離し上清を得た。この上清に２倍容の冷エタノールを加
え粗染色体ＤＮＡを回収し、これをＳＳＣ緩衝液（ｐＨ
７．１、塩化ナトリウム、クエン酸３ナトリウム含有）
に溶解し、リボヌクレアーゼ（シグマ社製造、商品名
ＲＮａｓｅ Ａ）およびプロテアーゼ（科研製薬株式会
社製造、商品名、プロナーゼ Ｅ）を作用させ、次い
で、ＴＥＳフェノール混液を加え、冷却し遠心分離し
て、得られる上清に２培容の冷エタノールを加え精製染
色体ＤＮＡを回収し、緩衝液（ｐＨ７．５、トリスアミ
ノメタン、ＨＣｌ、ＥＤＴＡ含有）に溶解して−２０℃
で保存した。 【００４８】 【実験１−２】 〈プラスミド ｐＢＲ３２２の調製〉プラスミド ｐＢ
Ｒ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）は、ジェイ メイヤ
ーズ（Ｊ．Ｍｅｙｅｒｓ）等の方法、『ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）』、第１２７巻、１，５２４〜
１，５３７頁（１９７６年）に準じてエッシェリヒア
コリから分離、調製した。 【００４９】 【実験１−３】 〈ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡの作製〉実施
例１−１で調製した耐熱性ポリペプチド遺伝子を含む精
製染色体ＤＮＡに対して、制限酵素Ｍｂｏ Ｉ（株式会
社ニッポンジーン製造）を作用させ、ＤＮＡ断片が１〜
２０Ｋｂｐになるように染色体ＤＮＡを部分的に切断し
た。一方、実験１−２で調製したプラスミドｐＢＲ３２
２に対して、制限酵素ＢａｍＨ Ｉ（株式会社ニッポン
ジーン製造）を作用させ、完全に切断し、次いで、プラ
スミド断片のセルフライゲーションを防止するため、エ
ッシェリヒア コリ由来のアルカリフォスファターゼ
（宝酒造株式会社製造）を作用させ、ｐＢＲ３２２断片
の５´末端を脱リン酸化した。両断片の結合は、Ｔ₄Ｄ
ＮＡリガーゼ（株式会 社ニッポンジーン製造）を４℃
で一夜反応させて行い、組換えＤＮＡを作製した。 【００５０】 【実験１−４】 〈組換えＤＮＡのエッシェリヒア コリへの導入〉宿主
細胞として、アミラーゼ産生能を欠いているエッシェリ
ヒア コリ ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ ３３６９４）を用
いた。本微生物をＬ培地で３７℃、４時間培養し集菌し
た後、１０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭ塩化マンガン
を含有する１０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．６）に懸濁
し、遠心分離して集菌し、続いて２５ｍＭ塩化カルシウ
ム、１２５ｍＭ塩化マンガンを含有する１０ｍＭ酢酸塩
緩衝液（ｐＨ５．６）に懸濁したものに、実験１−３で
得た組換えＤＮＡを加え、氷水中で３０分間静置した。
更に、３７℃に加温し、Ｌ培地を加え３７℃で３０分間
保ち、これをアンピシリン（抗生物質）５０μｇ／ｍｌ
を含有し、かつ澱粉２ｍｇ／ｍｌを含有するＬ−アガー
平板培地上に拡げ、３７℃で２４時間保ち、コロニーを
形成させた。 【００５１】本平板から、ヨード呈色法により、澱粉を
分解し、シクロデキストリンを生成しているコロニーを
選択し、ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡが導入
されている形質転換微生物を選択した。本微生物を増殖
させ、実施例１−２のプラスミドの調製方法に準じて組
換えＤＮＡを取り出し、これに各種制限酵素を作用さ
せ、その切断部位を決定した後、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ
（株式会社ニッポンジーン製造）で完全切断し、次い
で、実験１−３と同様にＴ₄ＤＮＡリガーゼを作用させ、
組換えＤＮＡを作製し、上記の方法に準じてポリペプチ
ド遺伝子を含む小型の組換えＤＮＡを保有する形質転換
微生物を選択した。 【００５２】更に、この小型の組換えＤＮＡを制限酵素
Ｓａｌ Ｉ（株式会社ニッポンジーン製造）で完全切断
し、以後、前記のＥｃｏＲ Ｉの場合と同様に処理し
て、ポリペプチド遺伝子を含む更に小型のＤＮＡを保有
する形質転換微生物を選択した。本微生物の一菌株をエ
ッシェリヒア コリＴＣＨ２０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−２
１０９）と命名し、これが保有する組換えＤＮＡをｐＴ
ＣＨ２０１と命名した。 【００５３】組換えＤＮＡ ｐＴＣＨ２０１について、
バチルス ステアロサーモフィラス由来ＤＮＡ部分の制
限酵素地図を図１に示す。 【００５４】 【図１】 【００５５】図１から明らかなように、制限酵素Ｐｖｕ
ＩＩ（東洋紡績株式会社製造）、Ｋｐｎ Ｉ、Ｈｉｎ
ｄ ＩＩＩ（株式会社ニッポンジーン）、Ｘｂａ Ｉ
（宝酒造株式会社製造）で切断を受けることが判明し
た。一方、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、Ｐｓ
ｔ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ａｃｃ Ｉ（以
上、株式会社ニッポンジーン製造）では切断されなかっ
た。 【００５６】 【実験２】 〈バチルス ステアロサーモフィラスのポリペプチド遺
伝子のバチルス ズブチリスへのクローニング〉 【００５７】 【実験２−１】 〈組換えＤＮＡ ｐＴＣＨ２０１の調製〉組換えＤＮＡ
ｐＴＣＨ２０１は、実験１−２の方法に準じてエッシ
ェリヒアコリＴＣＨ２０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１０
９）から分離調製した。 【００５８】 【実験２−２】 〈プラスミド ｐＵＢ１１０の調製〉プラスミド ｐＵ
Ｂ１１０（ＡＴＣＣ ３７０１５）は、グリッガン（Ｇ
ｒｙｃｚａｎ）等の方法、『ジャーナル・オブ・バクテ
リオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ）』、第１３４巻、３１８〜３２９頁（１９７８
年）に準じてバチルス ズブチリスから分離、調製し
た。 【００５９】 【実験２−３】 〈ポリペプチド遺伝子を含む組替えＤＮＡの作製〉実験
２−１で調製した耐熱性ポリペプチド遺伝子を含む組換
えＤＮＡ ｐＴＣＨ２０１に対して、制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびＸｂａ Ｉを同時に作用させ完全に切断した。
一方、実験２−２で調製したプラスミド ｐＵＢ１１０
に対して、制限酵素ＥｃｏＲ ＩおよびＸｂａ Ｉを同様
に作用させ完全に切断した。両断片の結合は、Ｔ₄ＤＮＡ
リガーゼを用いて、実験１−３と同様に作用させ組換え
ＤＮＡを作製した。 【００６０】 【実験２−４】 〈組換えＤＮＡのバチルス ズブチリスへの導入〉宿主
微生物として、アミラーゼ産生能を欠いているバチルス
ズブチリス７１５Ａを用いた。本微生物をブレイン
ハート インフュージョン培地で２８℃、５時間培養し
集菌した後、シェーファー（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ）等の
方法、『プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイ
テッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉ
ｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅ
ｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉ
ｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）』、第
７３巻、２，１５１〜２，１５５頁（１９７６年）に準
じてプロトプラスト懸濁液を調製した。 【００６１】本液に、実験２−３で調製した組換えＤＮ
Ａを加え、関口等の方法、『アグリカルチュラル・アン
ド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔ
ｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）』、第４６巻、１，６１７〜１，６２１頁
（１９８２年）に準じて形質転換を行った後、ＨＣＰ培
地にカナマイシン（抗生物質）２５０μｇ／ｍｌを含有
し、かつ澱粉１０ｍｇ／ｍｌを含有する寒天平板培地上
に拡げ、２８℃、７２時間保ち、コロニーを形成させ
た。 【００６２】以後、実験１−４の方法に準じて耐熱性ポ
リペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡが導入されている
形質転換微生物を選択した。本微生物の一菌株をバチル
スズブチリス ＴＣＵ２１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１１
２）と命名し、これが保有する組換えＤＮＡをｐＴＣＵ
２１１と命名した。組換えＤＮＡ ｐＴＣＵ２１１につ
いて、バチルス ステアロサーモフィラス由来ＤＮＡ部
分の制限酵素切断地図を図２に示す。 【００６３】 【図２】 【００６４】図２から明らかなように、制限酵素Ｐｖｕ
ＩＩ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、で切断を受け
ることが判明した。一方、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ、Ｂａ
ｍＨＩ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ａｃ
ｃ Ｉ、Ｘｂａ Ｉでは切断されなかった。 【００６５】 【実験３】 〈バチルス ステアロサーモフィラス由来ポリペプチド
のＮ末端を含有した部分アミノ酸配列〉 【００６６】 【実験３−１】 〈ポリペプチドの調製〉バチルス ステアロサーモフィ
ラス（ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎｏ．２２２５）を、実験５に示
す方法と同様にして液体培養し、培地中にポリペプチド
を産生させた。遠心分離にて上清を採取し、硫安塩析に
より、ポリペプチド画分を得、次いで、陰イオン交換体
カラムクロマトグラフィー（東洋曹達株式会社製『ＤＥ
ＡＥ−トヨパール ６５０』）、クロマトフォーカッシ
ング法（ファマシア社製『Ｍｏｎｏ Ｐ』）により精製
して、高度に精製されたポリペプチドを採取した。本品
は、ケイウエーバー アンド エム オズボー（Ｋ．Ｗ
ｅｂｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｏｓｂｏｒｎ）、『ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａ
ｌｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）』、第２４４巻、４，４０６頁（１９６９年）の記
載に準じて行ったＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法で７０，０００±１０，０００の分子量を示し
た。また、比活性は、２００±３０単位／ｍｇ蛋白質を
示した。 【００６７】 【実験３−２】 〈Ｎ末端を含有する部分アミノ酸配列〉実験３−１の方
法で調製したポリペプチドを、気相プロテインシークエ
ンサー、アプライドバイオシステム社製『４７０Ａ型』
にかけ、次いで、高速液体クロマトグラフィーにより分
析して、Ｎ末端を含有する部分アミノ酸配列を決定し
た。結果は、配列表における配列番号６の配列を有して
いることが判明した。 【００６８】 【実験４】 〈バチルス ステアロサーモフィラスのポリペプチド遺
伝子の塩基配列およびポリペプチドのアミノ酸配列〉 【００６９】 【実験４−１】 〈プラスミド ｐＵＣ １８の調製〉プラスミド ｐＵ
Ｃ １８は、これを導入したエッシェリヒア コリ Ｊ
Ｍ８３（ＡＴＣＣ ３５６０７）から実験１−２の方法
に準じて調製した。 【００７０】 【実験４−２】 〈ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡの作製〉実験
１−３の方法に準じて組換えＤＮＡを作製した。即ち、
実験２−３の方法で調製したポリペプチド遺伝子を含む
断片に、更に、各種制限酵素を作用させて切断し、ま
た、実験４−１の方法で調製したプラスミド ｐＵＣ
１８を同様に各種制限酵素で切断し、これら両断片にＴ
₄ＤＮＡリガーゼを作用させて 組換えＤＮＡを作製し
た。 【００７１】 【実験４−３】 〈組換えＤＮＡのエッシェリヒア コリへの導入〉宿主
微生物として、エッシェリヒア コリ ＪＭ８８を用い
た。この微生物に、実験１−４の方法に準じて、組換え
ＤＮＡを移入し、形質転換させた。次いで、５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド（５
−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ
−β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅまたはＸｇａｌ）を含有
する培地に生育させ、無色のプラークを形成した微生物
を形質転換微生物として選択した。 【００７２】 【実験４−４】 〈形質転換微生物からの組換えＤＮＡの調製〉形質転換
微生物を、抗生物質アンビシリン５０μｇ／ｍｌを含む
Ｌ−培地で培養し、得られる菌体からアルカリ溶菌法に
より組換えＤＮＡを調製した。 【００７３】 【実験４−５】 〈組換えＤＮＡの塩基配列〉ジデオキシ チェーンター
ミネータ法に従って解読した。即ち、実験４−４で調製
した組換えＤＮＡと合成プライマー（１７塩基）を加
え、６０℃で２０分間アニーリングした後、ｄＮＴＰ、
ｄｄＮＴＰ、〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰおよびクレノウ断片
を加え、３７℃で３０分間反応させ、プライマーを５´
側から３´方向へ伸長させて相補ＤＮＡを生成させた。
これに過剰のｄＮＴＰを加えて、更に３７℃で３０分間
反応させた後、ホルムアミド色素溶液を加えて反応を停
止させた。次いで、３分間煮沸し、これを６％ポリアク
リルアミドゲルを用いて、約２，０００Ｖ、約２５ｍＡ
で電気泳動し、伸長した相補ＤＮＡを分離した。電気泳
動した後、ゲルを固定し乾燥させた。本ゲルを用いて、
オートラジオグラフィーを行い、オートラジオグラム上
の塩基断片のシークエンス解析を行ってポリペプチド遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果は、配列表におけ
る配列番号８に示した。また、それの５´側の上流に続
くシグナルペプチド遺伝子の塩基配列も同様にして調べ
た。その結果は、配列表における配列番号９に示した。 【００７４】 【実験４−６】 〈ポリペプチドのアミノ酸配列〉配列表における配列番
号８の塩基配列を用いて、ポリペプチドのアミノ酸配列
を決定し、その結果を配列表における配列番号７に示し
た。また、それのＮ末端側の上流に続くシグナルペプチ
ドのアミノ酸配列を決定し、その結果を配列表における
配列番号１０に示した。以上の結果から、バチルス ス
テアロサーモフィラス由来ポリペプチドのアミノ酸配列
は、配列表における配列番号７の配列を有していること
が明らかになった。 【００７５】 【実験５】 〈形質転換微生物によるポリペプチド〉 【００７６】 【実験５−１】 〈形質転換微生物によるポリペプチドの調製および活性
測定〉バチルス ステアロサーモフィラス由来の耐熱性
ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡを導入した形質
転換微生物エッシェリヒア コリ ＴＣＨ２０１（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−２１０９）およびバチルス ズブチリス
ＴＣＵ２１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１１２）を用いてポ
リペプチドを調製した。また、これら形質転換微生物と
宿主微生物並びに供与体微生物バチルス ステアロサー
モフィラスの産生するポリペプチド産生量をその活性で
比較した。 【００７７】液体培地は、コーンスティープリカー１．
０ｗ／ｖ％、硫酸アンモニウム０．１ｗ／ｖ％、炭酸カ
ルシウム１．０ｗ／ｖ％、澱粉１ｗ／ｖ％および水から
なり、ｐＨ７．２に調製して１２０℃で２０分間滅菌
し、冷却して調製した。エッシェリヒア コリ ＴＣＨ
２０１の場合には、この培地に、抗生物質アンピシリン
をｍｌ当たり５０μｇの割合で加えて植菌し、また、エ
ッシェリヒア コリ ＨＢ１０１の場合には抗生物質を
加えずに植菌し、それぞれ３７℃、４８時間通気攪拌培
養した。また、バチルス ズブチリス ＴＣＵ２１１の
場合には、前記液体培地に抗生物質カナマイシンをｍｌ
当たり５μｇの割合で加えて植菌し、また、バチルス
ズブチリス ７１５Ａの場合には抗生物質を加えずに植
菌し、それぞれ２８℃で７２時間培養した。また、バチ
ルス ステアロサーモフィラス（ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎｏ．
２２２５）の場合には、前記液体培地に抗生物質を加え
ることなく、５０℃で４８時間培養した。各培養液を、
遠心分離し、上清と菌体とに分離し、上清はそのまま活
性測定し、培養液量に換算して活性を求めた。結果は、
表１に示す。 【００７８】 【表１】 【００７９】表１の結果から明らかなように、形質転換
微生物からのポリペプチド産生量は向上しており、工業
的生産方法として好都合である。また、このポリペプチ
ドは、供与体微生物バチルス ステアロサーモフィラス
由来の耐熱性のポリペプチド同様、耐熱性のポリペプチ
ドであった。 【００８０】 【実験５−２】 〈ポリペプチドの理化学的性質〉実験５−１で得たエッ
シェリヒア コリ ＴＣＨ２０１の上清を硫安０．６飽
和で塩析して粗ポリペプチド剤を調製し、これを採取し
た。このポリペプチド剤を用いて、エヌ カッシンプー
ラス（Ｎ． Ｃａｔｓｉｍｐｏｏｌａｓ）の方法［アナ
リティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａ
ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２６巻、４８０〜
４８２頁（１９６８年）］に準じて、ポリペプチドの等
電点を調べた。具体的には、等電点電気泳動用ゲル（Ｌ
ＫＢ社製、商品名「アンフォライン」）を充填した長さ
６５ｍｍのガラス製カラムを用いて、２００Ｖの定電圧
で１６時間、更に、４００Ｖの定電圧で１時間という通
電条件にて等電点電気泳動を行った。通電終了後、ガラ
ス製かラムからゲルを取り出し、これを５ｍｍ間隔に切
断し、水抽出して、そのｐＨを測定することにより、ゲ
ル全体のｐＨ勾配を求めた。これとは別に、ガラス製カ
ラムから取り出したゲルをクーマシー・ブルーで染色
し、脱色処理を行った後、波長６００ｎｍにてクロマト
スキャナー（島津製作所製、商品名「Ｍｏｄｅｌ ＣＳ
−９３０」）にかけた。結果は、図３に示す。 【００８１】 【図３】 【００８２】本実験結果から、エッシェリヒア コリ
ＴＣＨ２０１からのポリペプチドの等電点は５．０±
０．１（Ｘ±ＳＤ、ｎ＝８）であることが判明した。ま
た、これと同様に、バチルスズブチリス ＴＣＵ２１１
からのポリペプチドの等電点についても調べたところ、
エッシェリヒア コリ ＴＣＨ２０１と同様の結果を得
た。更に、実験５−１で得たエッシェリヒアコリ ＴＣ
Ｈ２０１およびバチルスズブチリス ＴＣＵ２１１の上
清を硫安０．６飽和で塩析して調製して採取した粗ポリ
ペプチド剤を用いて、澱粉からのスクロースの糖転移
量、澱粉からのシクロデキストリン生成量、シクロデキ
ストリンα、βおよびγの生成比率、至適温度、至適ｐ
Ｈ、安定ｐＨなどの酵素的性質について調べたところ、
形質転換体のポリペプチドは、供与体微生物バチルスス
テアロサーモフィラスのそれと類似する性質を示した。 【００８３】また、実験５−１で得たエッシェリヒア
コリ ＴＣＨ２０１の上清を硫安０．６飽和で塩析して
粗ポリペプチド剤を調製し、これを採取した。このポリ
ペプチド剤を用いて、その熱安定性について調べた。５
ｍＭのＣａＣｌ₂ を含有する５０ｍＭトリス−マレイン
酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）中にて、ポリペプチド剤を異
なる温度で３０分間インキュベートした。その後、残存
するＣＧＴａｓｅ活性を測定し、その残存活性を相対活
性で表した。結果は、表２に示す。 【００８４】 【表２】 【００８５】表２の結果から、エッシェリヒア コリ
ＴＣＨ２０１からのポリペプチドの熱安定性は、７０℃
以上であることが判明した。また、これと同様に、バチ
ルスズブチリス ＴＣＵ２１１からのポリペプチドの熱
安定性についても調べたところ、エッシェリヒア コリ
ＴＣＨ２０１からのポリペプチドと同様の結果を得
た。 【００８６】更に、実験５−１で得たエッシェリヒア
コリ ＴＣＨ２０１およびバチルスズブチリス ＴＣＵ
２１１の上清を硫安０．６飽和で塩析して粗ポリペプチ
ド剤を調製し、採取したポリペプチド剤を用いて、澱粉
からのスクロースへの糖転移量、澱粉からのシクロデキ
ストリン生成量、シクロデキストリンα、βおよびγの
生成比率、至適温度、至適ｐＨ、安定ｐＨなどの酵素的
性質について比較したところ、形質転換微生物のポリペ
プチドは、供与体微生物バチルス ステアロサーモフィ
ラスのそれと類似する性質を示した。 【００８７】以下、本発明の実施例について述べる。 【００８８】 【実施例１】 〈食パン〉小麦粉６５０ｇに、実験３−１の方法に準じ
てバチルス ステアロサーモフィラスから調製したポリ
ペプチドを３，０００単位加え、次いで、砂糖２０ｇ、
食塩１１ｇを少量の水に溶解して加え、よくかき混ぜ、
更に圧搾酵母１３ｇ、ショートニングオイル１３ｇ、イ
ーストフード２ｇを加えると共に、適量の水を追加して
よく練ってドウを調製した。以後は常法に従って２６℃
で２時間発酵させ、熟成時間１５分、次いでオーブン温
度約２００℃で約４０分間焼いて、食パンを製造した。
本品は、風味良好で、適度の弾性を有し、経日変化も少
なかった。 【００８９】 【実施例２】 〈甘酒〉米飯１ｋｇに、実験５−１の方法で調製したポ
リペプチドを２，０００単位加え、７０℃で３時間反応
させた後、５５℃に下げ、市販の麹３００ｇを加えて２
４時間反応させて甘酒を製造した。本品は、風味、口当
りとも良好であった。 【００９０】 【実施例３】 〈蒸しようかん〉小麦粉６００ｇ、かたくり粉２５０
ｇ、食塩２０ｇ、さらしあん４００ｇ、砂糖１ｋｇ、マ
ルトース１．４ｋｇおよび実験３−１の方法で製造した
ポリペプチド１，０００単位を含有する水２．４Ｌをよ
く混合した後、これを成形し、常法に従って約４０分間
蒸し上げた。本品は、老化を起こしにくく、口当り、風
味が良好で、長期間高品質を維持した。 【００９１】 【実施例４】 〈シクロデキストリン含有水飴〉１０ｗ／ｗ％馬鈴薯澱
粉に、実験５の方法で得たバチルス ズブチリス ＴＣ
Ｕ２１１から調製したポリペプチドを澱粉グラム当り２
単位となるように加え、ｐＨ６．５、温度８５℃で液化
し、７０℃に冷却してポリペプチドを同量添加し、４０
時間反応させ、常法に従って、活性炭で脱色し、イオン
交換樹脂で脱塩して精製し、濃縮してシクロデキストリ
ンを含有する水飴を固形物当り収率９２％で得た。本水
飴は保香性の良好な水飴で、風味良好な飲食物の原材料
に、また香気を大切にする香料、化粧品などの配合材と
して有利に利用できる。 【００９２】また、この水飴を、トルエン、トリクロロ
エタンなどの有機沈殿剤を使用する方法、カラムクロマ
トグラフィーなどの公知の方法によってα−シクロデキ
ストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキス
トリンを分離し採取することも有利に実施できる。 【００９３】このシクロデキストリン含有水飴の製造工
程中に於いて、ポリペプチド反応後、β−アミラーゼお
よびイソアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６８）を作用
させ、シクロデキストリンおよびマルトース高含有物と
し、これに、プルラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４１）
を作用させ、精製し、濃縮してマルトシクロデキストリ
ン高含有水飴を製造することも、更に、これから高純度
のマルトシクロデキストリンを分離し、採取することも
有利に実施できる。 【００９４】 【実施例５】 〈α−グリコシル ステビオサイド〉スデビオサイド２
００ｇとデキストリン（ＤＥ８）６００ｇとを水３Ｌに
加熱溶解した後、７０℃に冷却し、これに実験５の方法
でバチルス ズブチリス ＴＣＵ２１１から調製したポ
リペプチドをデキストリングラム当り５単位になるよう
に加え、ｐＨ６．０、温度６５℃に３５時間反応させ
た。反応終了後、９５℃に１５分間熱し、濾過精製し、
濃縮し、乾燥し、粉末化して、α−グリコシルステビオ
サイドを含有する粉末甘味料を固形物当り収率９２％で
得た。 【００９５】本甘味料は、ステビオサイドの嫌味を解消
した砂糖に近い甘味質を有し、その甘味度は砂糖の約１
００倍であった。本甘味料は、虫歯の心配もなく、ほと
んどカロリーもないのでダイエット甘味料として、また
他の甘味料に自由に利用できる。 【００９６】 【発明の効果】上記したことから明らかなように、本発
明は、ポリペプチドのアミノ酸配列を解明し、その解明
されたポリペプチドを用いる糖転移反応により飲食物を
製造する方法である。本発明は、特待のアミノ酸配列を
有するポリペプチドを用いることにより、安心して糖転
移反応させることができるのみならず、この糖転移反応
がそのまま風味良好な飲食物の製造方法に利用し得るこ
とが判明した。この工業的意義は極めて大きい。更に、
飲食物の製造に際して、澱粉質に含有せしめたポリペプ
チドが、飲食物の風味を損なうことなく、しかも安心し
てそのまま飲食に供し得ることも大きな特徴である。 【００９７】 【配列表】 配列番号：1 配列の長さ：9 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：中間部フラグメント 配列 Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr 1 5 【００９８】配列番号：2 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：中間部フラグメント 配列 Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu 1 5 10 【００９９】配列番号：3 配列の長さ：12 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：中間部フラグメント 配列 Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe 1 5 10 【０１００】配列番号：4 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：中間部フラグメント 配列 Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Arg 1 5 10 15 【０１０１】配列番号：5 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：中間部フラグメント 配列 Asn Pro Ala Leu Ala Tyr Gly 1 5 【０１０２】配列番号：6 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：Ｎ末端フラグメント 配列 Ala Gly Asn Leu Asn Lys Val Asn Phe Thr 1 5 10 【０１０３】配列番号：7 配列の長さ：680 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Gly Asn Leu Asn Lys Val Asn Phe Thr Ser Asp Val Val Tyr Gln Ile 1 5 10 15 Val Val Asp Arg Phe Val Asp Gly Asn Thr Ser Asn Asn Pro Ser Gly Ala 20 25 30 Leu Phe Ser Ser Gly Cys Thr Asn Leu Arg Lys Tyr Cys Gly Gly Asp Trp 35 40 45 50 Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr Asp Met Gly Val 55 60 65 Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Val Phe Ser Val Met Asn 70 75 80 85 Asp Ala Ser Gly Ser Ala Ser Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys 90 95 100 Lys Pro Asn Pro Phe Phe Gly Thr Leu Ser Asp Phe Gln Arg Leu Val Asp 105 110 115 Ala Ala His Ala Lys Gly Ile Lys Val Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His 120 125 130 135 Thr Ser Pro Ala Ser Glu Thr Asn Pro Ser Tyr Met Glu Asn Gly Arg Leu 140 145 150 Tyr Asp Asn Gly Thr Leu Leu Gly Gly Tyr Thr Asn Asp Ala Asn Met Tyr 155 160 165 170 Phe His His Asn Gly Gly Thr Thr Phe Ser Ser Leu Glu Asp Gly Ile Tyr 175 180 185 Arg Asn Leu Phe Asp Leu Ala Asp Leu Asn His Gln Asn Pro Val Ile Asp 190 195 200 Arg Tyr Leu Lys Asp Ala Val Lys Met Trp Ile Asp Met Gly Ile Asp Gly 205 210 215 220 Ile Arg Met Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys Ser Leu 225 230 235 Met Asp Glu Ile Asp Asn Tyr Arg Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe 240 245 250 255 Leu Ser Glu Asn Glu Val Asp Ala Asn Asn His Tyr Phe Ala Asn Glu Ser 260 265 270 Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Gly Gln Lys Leu Arg Gln Val Leu 275 280 285 Arg Asn Asn Ser Asp Asn Trp Tyr Gly Phe Asn Gln Met Ile Gln Asp Thr 290 295 300 305 Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Val Leu Asp Gln Val Thr Phe Ile Asp Asn His 310 315 320 Asp Met Asp Arg Phe Met Ile Asp Gly Gly Asp Pro Arg Lys Val Asp Met 325 330 335 340 Ala Leu Ala Val Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro Asn Ile Tyr Tyr Gly 345 350 355 Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Arg Lys Met Met 360 365 370 Ser Ser Phe Asn Lys Asn Thr Arg Ala Tyr Gln Val Ile Gln Lys Leu Ser 375 380 385 390 Ser Leu Arg Arg Asn Asn Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Asp Thr Glu Gln Arg 395 400 405 Trp Ile Asn Gly Asp Val Tyr Val Tyr Glu Arg Gln Phe Gly Lys Asp Val 410 415 420 425 Val Leu Val Arg Val Asn Arg Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ser Ile Thr Gly 430 435 440 Leu Phe Thr Ala Leu Pro Ala Gly Thr Tyr Thr Asp Gln Leu Gly Gly Leu 445 450 455 Leu Asp Gly Asn Thr Ile Gln Val Gly Ser Asn Gly Ser Val Asn Ala Phe 460 465 470 475 Asp Leu Gly Pro Gly Glu Val Gly Val Trp Ala Tyr Ser Ala Thr Glu Ser 480 485 490 Thr Pro Ile Ile Gly His Val Gly Pro Met Met Gly Gln Val Gly His Gln 495 500 505 510 Val Thr Ile Asp Gly Glu Gly Phe Gly Thr Asn Thr Gly Thr Val Lys Phe 515 520 525 Gly Thr Thr Ala Ala Asn Val Val Ser Trp Ser Asn Asn Gln Ile Val Val 530 535 540 Ala Val Pro Asn Val Ser Pro Gly Lys Tyr Asn Ile Thr Val Gln Ser Ser 545 550 555 560 Ser Gly Gln Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Asn Phe Glu Val Leu Thr Asn Asp 565 570 575 Gln Val Ser Val Arg Phe Val Val Asn Asn Ala Thr Thr Asn Leu Gly Gln 580 585 590 595 Asn Ile Tyr Ile Val Gly Asn Val Tyr Glu Leu Gly Asn Trp Asp Thr Ser 600 605 610 Lys Ala Ile Gly Pro Met Phe Asn Gln Val Val Tyr Ser Tyr Pro Thr Trp 615 620 625 Tyr Ile Asp Val Ser Val Pro Glu Gly Lys Thr Ile Glu Phe Lys Phe Ile 630 635 640 645 Lys Lys Asp Ser Gln Gly Asn Val Thr Trp Glu Ser Gly Ser Asn His Val 650 655 660 Tyr Thr Thr Pro Thr Asn Thr Thr Gly Lys Ile Ile Val Asp Trp Gln Asn 665 670 675 680 【０１０４】配列番号：8 配列の長さ：2040 配列の型：核酸 配列 GCTGGAAATC TTAATAAGGT AAACTTTACA TCAGATGTTG TCTATCAAAT TGTAGTGGAT 60 CGATTTGTGG ATGGAAATAC ATCCAATAAT CCGAGTGGAG CATTATTTAG CTCAGGATGT 120 ACGAATTTAC GCAAGTATTG CGGTGGAGAT TGGCAAGGCA TCATCAATAA AATTAACGAT 180 GGGTATTTAA CAGATATGGG TGTGACAGCG ATATGGATTT CTCAGCCTGT AGAAAATGTA 240 TTTTCTGTGA TGAATGATGC AAGCGGTTCC GCATCCTATC ATGGTTATTG GGCGCGCGAT 300 TTCAAAAAGC CAAACCCGTT TTTTGGTACC CTCAGTGATT TCCAACGTTT AGTTGATGCC 360 GCACATGCAA AAGGAATAAA GGTAATTATT GACTTTGCCC CCAACCATAC TTCTCCTGCT 420 TCAGAAACGA ATCCTTCTTA TATGGAAAAC GGACGACTGT ACGATAATGG GACATTGCTT 480 GGCGGTTACA CAAATGATGC CAACATGTAT TTTCACCATA ACGGTGGAAC AACGTTTTCC 540 AGCTTAGAGG ATGGGATTTA TCGAAATCTG TTTGACTTGG CGGACCTTAA CCATCAGAAC 600 CCTGTTATTG ATAGGTATTT AAAAGATGCA GTAAAAATGT GGATAGATAT GGGGATTGAT 660 GGTATCCGTA TGGATGCGGT GAAGCACATG CCGTTTGGAT GGCAAAAATC TCTGATGGAT 720 GAGATTGATA ACTATCGTCC TGTCTTTACG TTTGGGGAGT GGTTTTTGTC AGAAAATGAA 780 GTGGACGCGA ACAATCATTA CTTTGCCAAT GAAAGTGGAA TGAGTTTGCT CGATTTTCGT 840 TTCGGACAAA AGCTTCGTCA AGTATTGCGC AATAACAGCG ATAATTGGTA TGGCTTTAAT 900 CAAATGATTC AAGATACGGC ATCAGCATAT GACGAGGTTC TCGATCAAGT AACATTCATA 960 GACAACCATG ATATGGATCG GTTTATGATT GACGGAGGAG ATCCGCGCAA GGTGGATATG 1020 GCACTTGCTG TATTATTGAC ATCCCGTGGC GTACCGAATA TTTACTATGG TACAGAGCAA 1080 TACATGACCG GTAACGGCGA TCCAAACAAT CGTAAGATGA TGAGTTCATT CAATAAAAAT 1140 ACTCGCGCGT ATCAAGTGAT TCAAAAACTA TCTTCTCTCC GACGAAACAA TCCGGCGTTA 1200 GCTTATGGTG ATACGGAACA GCGTTGGATC AATGGCGATG TGTATGTGTA TGAGCGACAG 1260 TTTGGCAAAG ATGTTGTGTT AGTTCGGGTT AATCGTAGTT CAAGCAGTAA TTACTCGATT 1320 ACTGGCTTAT TTACAGCTTT ACCAGCAGGA ACATATACGG ATCAGCTTGG CGGTCTTTTA 1380 GACGGAAATA CAATTCAAGT CGGTTCAAAT GGATCAGTTA ATGCATTTGA CTTAGGACCG 1440 GGGGAAGTCG GTGTATGGGC ATACAGTGCA ACAGAAAGCA CGCCAATTAT TGGTCATGTT 1500 GGACCGATGA TGGGGCAAGT CGGTCATCAA GTAACCATTG ATGGCGAAGG ATTCGGAACA 1560 AATACGGGCA CTGTGAAGTT CGGAACGACA GCTGCCAATG TTGTGTCTTG GTCTAACAAT 1620 CAAATCGTTG TGGCTGTACC AAATGTGTCA CCAGGAAAAT ATAATATTAC CGTCCAATCA 1680 TCAAGCGGTC AAACGAGTGC GGCTTATGAT AACTTTGAAG TACTAACAAA TGATCAAGTG 1740 TCAGTGCGGT TTGTTGTTAA TAACGCGACT ACCAATCTAG GGCAAAATAT ATACATTGTT 1800 GGCAACGTAT ATGAGCTCGG CAACTGGGAC ACTAGTAAGG CAATCGGTCC AATGTTCAAT 1860 CAAGTGGTTT ACTCCTATCC TACATGGTAT ATAGATGTCA GTGTCCCAGA AGGAAAGACA 1920 ATTGAGTTTA AGTTTATTAA AAAAGACAGC CAAGGTAATG TCACTTGGGA AAGTGGTTCA 1980 AATCATGTTT ATACGACACC AACGAATACA ACCGGAAAAA TTATAGTGGA TTGGCAGAAC 2040 【０１０５】配列番号：9 配列の長さ：93 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 シグナルペプチド遺伝子の塩基
配列 配列 ATGAGAAGAT GGCTTTCGCT AGTCTTGAGC ATGTCATTTG TATTTAGTGC AATTTTTATA 60 GTATCTGATA CGCAGAAAGT CACCGTTGAA GCA 93 【０１０６】配列番号：10 配列の長さ：31 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を示す記号：sig peptide 配列 Met Arg Arg Trp Leu Ser Leu Val Leu Ser Met Ser Phe Val Phe Ser Ala -30 -25 -20 -15 Ile Phe Ile Val Ser Asp Thr Gln Lys Val Thr Val Glu Ala -10 -5

【図面の簡単な説明】 【図１】組換えＤＮＡ ｐＴＣＨ２０１について、バチ
ルス ステアロサーモフィラス由来ＤＮＡ部分の制限酵
素切断地図を示す図である。 【図２】組換えＤＮＡ ｐＴＣＵ２１１について、バチ
ルス ステアロサーモフィラス由来ＤＮＡ部分の制限酵
素切断地図を示す図である。 【図３】形質転換微生物エッシェリヒア コリ ＴＣＨ
２０１からのポリペプチドの等電点を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 19/18 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．以下に示す（ａ）〜（ｃ）の工程からなる、飲食物
   の製造方法： （ａ） 部分アミノ酸配列として、Ｎ末端側から近い順
   に、配列表における配列番号１乃至５に示すアミノ酸配
   列を有し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
   で７０，０００±１０，０００の分子量を有し、７０℃
   以上の熱安定性を有し、且つシクロマルトデキストリン
   グルカノトランスフェラーゼ活性を有するバチルス
   ステアロサーモフィラス由来のポリペプチドの産生能を
   有する微生物を栄養培地中で培養する工程、 （ｂ）（ａ）の工程で得られた ポリペプチドを澱粉質に
   作用させる工程、 （ｃ）（ｂ）の工程で得られた 糖転移反応物を飲食物に
   含有せしめる工程。 ２．ポリペプチドが、そのＮ末端を有する部分アミノ酸
   配列として、配列表における配列番号６に示すアミノ酸
   配列を有していることを特徴とする請求項１に記載の飲
   食物の製造方法。 ３．ポリペプチドが、アミノ酸配列として、配列表にお
   ける配列番号７に示すアミノ酸配列を有していることを
   特徴とする請求項１または２に記載の飲食物の製造方
   法。 ４．糖転移反応物が分子内転移反応物または分子間転移
   反応物であることを特徴とする請求項１、２または３に
   記載の飲食物の製造方法。 ５．分子内転移反応物が、シクロデキストリンであるこ
   とを特徴とする請求項４に記載の飲食物の製造方法。 ６．分子間転移反応物が、澱粉質と澱粉質以外の糖受容
   体とから生成したものであることを特徴とする請求項４
   に記載の飲食物の製造方法。 ７．分子間転移反応物が、α−グリコシル シュクロー
   ス、α−グリコシル ステビオール配糖体、α−グリコ
   シル グリチルリチン、α−グリコシル ルチンまたは
   α−グリコシル ジンセノサイドであることを特徴とす
   る請求項４または６に記載の飲食物の製造方法。 ８．飲食物が、澱粉質含有飲食物、醗酵飲食物または甘
   味料であることを特徴とする請求項１、２、３、４、
   ５、６または７に記載の飲食物の製造方法。