KR100192746B1 - 테르무스 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제 유전자, 크실로스 이소머라제 및 그것을 사용한 플락토스의 제조방법 - Google Patents

테르무스 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제 유전자, 크실로스 이소머라제 및 그것을 사용한 플락토스의 제조방법 Download PDF

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Abstract

테르무스 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제 유전자, 테르무스 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소모라제 및 이 크실로스 이소머라제의 제조방법을 제공한다. 또한, 얻어진 크실로스 이소머라제를 사용하여 고농도의 플락토스 용액을 착색시키지 않고 제조하는 방법을 제공한다.
고열성 세균의 일종인 테르무스 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제 유전자의 분리, 동정, 클로닝한다. 클로닝하여 얻은 크실로스 이소머라제 유전자 및 중진자를 가진 플라즈미드로 형질전환한 미생물을 배양하여 얻은 크실로스 이소머라제를 유전자 공학적으로 제조한다. 얻어진 크실로스 이소머라제는 지적온도가 약 95℃이고, 마그네슘에 의하여 열안정되고, 천연의 테르무스 아쿠아티스쿠스의 크실로스 이소머라제와는 다른 것이다. 또한, 이크실로스 이소머라제의 조재하에 75℃이상의 온도로,그리고 5∼7pH로 글루코스를 이성화하여 플락토스 농도가 높은 용액을 제조한다.

Description

테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aqraticus)의 크실로스(xylose) 이소머라제(isomerase)유전자, 크실로스 이소머라제 및 그것을 사용한 플락토스(fructose)의 제조방법
제1도 내지 제3도는 T. 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열의 일부도.
제4도는 크실로스 이소머라제 유전자를 함유한 플라즈미드 PUSTXI의 구축법의 모식도.
제5도는 본 발명의 크실로스 이소머라제를 활성의 PH의 존성도.
제6도는 본 발명의 크실로스 이소머라제의 안정성의 PH의 존성도.
제7도는 본 발명의 크실로스 이소머라제의 열 안정성에 대한 금속의 영향도.
제8도는 크실로스 이소머라제 활성의 온도의 존성도.
제9도는 본 발명의 크실로스 이소머라제를 사용한 글루코스(glucose)의 플락토스에의 이성화 반응결과도.
제10도 플락토스 용액의 착색의 PH의 존성도.
[산업상의 이용분야]
본 발명은 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)(이하, T. 아쿠아티스쿠스라고 약칭한다)의 크실로스 이소머라제 유전자, 이 유전자를 사용하며 유전 공학적으로 제조한 크실로스 이소머라제, 이 크실로스 이소머라제의 제조방법, 및 이 크실로스 이소머라제를 사용한 고농도의 플락토스의 제조방법에 관한 것이다.
[종래의 기술]
크실로스 이소머라제는 D-크실로스와 D-크실로스의 상호변환을 촉매하는 효소이지만, 동시에 글루코스를 플락토스로 변환하는 능력도 가지며, 공업적으로 중요하다. 한편, T. 아쿠아티쿠스는 고열성 세균의 일종이고, ATCC 27634의 기탁번호가 붙여져 있다. 또, T. 아쿠아티쿠스는 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophilus)라고도 불린다. T. 아쿠아티쿠스가 크실로스 이소머라제를 산출하는 것은 종래부터 알려져 있었다. [Journal of General Microbiology(1990), 136, 679-686 참조). T. 아쿠아티쿠스는 고열성 세균이고, 그 크실로스 이소머라제는 뛰어난 내열성을 가지는 크로스트리듐 더모하이드로설퍼리컴(Clostridium thermohydrosulfuricum)의 크실로스 이소머라제보다 더욱 높은 내열성을 가진다. 그러나, T. 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제를 공업적으로 이용할 수 있을만큼 대량 제조하는 방법은 알려져 있지 않다.
그래서, T. 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제 유전자를 입수할수 있으면, 유전자 공학의 숫법에 의하여 T, 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제를 대량으로 제조하느 것이 가능해진다. 그러나, T. 아쿠아티쿠스와 크실로스 이소머라제 유전자는 이제까지 채취, 동정, 클로우닝은 되지 않았다. 그래서, T. 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제의 유전자의 제공이 요망되고 있었다.
그런데, 종래의 고플락토스코온시럽(HFCS)의 생산 온도는 이소머라제의 내열성 때문에 60℃에서 고정화 효소업에서는 42∼45%이다. 그러나, 실용적으로는 플락토스 농도를 55%까지 올릴 수 있으면, 청량음료등의 식품 감미료로서 그대로 사용할 수 있다.
그래서, 생산온도를 85℃로 할 수 있으면 화학평형이 플락토스축으로 이동하여, 플락토스 농도를 55%이하로 하는 것이 가능하게 된다.
[발명이 해결하려는 과제]
그래서, 본 발명의 제1의 목적은 T. 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제 유전자를 제공하는데 있다.
본 발명의 제2의 목적은 T. 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제 유전자를 사용한, 내열성 크실로스 이소머라제의 효율적인 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 제3의 목적은 상기방법으로 얻어진 내열성 크실로스 이소머라제를 사용하여 화학평형이 플락토스 쪽으로 이동하는 비교적 높은 온도로 글루코스를 이성화하여 고농도의 플락토스를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
또한, 글루코스를 이성화하여 고농도의 플락토스를 제조할때에, 이소머라제를 활성을 최적할 목적으로, 통상 반응액의 pH를 조절한다. 그러나, 7을 넘는 pH역에서는 얻어지는 프락토스 용액이 착색한다는 문제가 있었다. 그래서, 본 발명의 제4의 목적은 상기방법으로 얻어진 내열성 크실로스 이소머라제를 사용하여 특정의 pH역에서 글루코스를 이성화하여 착색이 비교적 적은 고농도의 플락토스를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
[과제를 해결하기 위한 수단]
본 발명자들, 먼저 T. 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제 유전자를 채취하여 그 염기서열 및 아미노산 서열을 결정함과 동시에 이 유전자의 클로닝법을 확립하였다.
또한, 클로닝에 의하여 얻어진 크실로스 이소머라제 유전자를 사용하여 내열성 크실로스 이소머라제를 유전자 공학적 숫법에 의하여 효율적으로 제조하는 방법을 발견하였다.
또한, 이 유전자 공학적으로 제조한 크실로스 이소머라제가 예상외로 T. 아쿠아티쿠스에서 얻어진 천연적으로 존재하는 크실로스 이소머라제[Jounrnal of General Microbiology(1990), 136. 679-686참조]와는 다른 그보다 더욱 뛰어난 특성을 가지는 것임음 발견하였다. 또한, 본 발명의 크실로스 이소머라제를 사용함으로써 종래 알려져 있는 온도 이상의 높은 온도로 플락토스를 제조할 수있는 것 및 75℃ 이상의 온도로, 그리고 5∼7의 pH로 이성화를 행함으로써 착색이 매우 적은 pH 영역에서 고농도의 플럭토스를 제조할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 T. 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제 유전자는 예를 들어, 하기 서열 1a 내지 1c(제1도 내지 제3도 참조)로 표시도는 염기서열 및 아미노산 서열을 가진다.
제1∼3도에 도시한 염기서열 및 아미노산 서열은 T. 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제 유전자의 일례로서, 이 유전자와 일정 이상의 상동성을 가지는 유전자를 사용하여도 크실로스 이소머라제를 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서는 이러한 관점에서 제1∼3도에서 도시한 크실로스 이소머라제 유전자의 아미모산 서열과 60%이상의 상동성을 가진 유전자를 크실로스 이소머라제 유전자로서 포함한다. 이 상동성이 높은 유전자를 사용할 경우에만, 원래의 크실로스 이소머라제에 가까운 효소를 얻을 수 있다. 따라서, 바람직하기는 제1도∼제3도에 도시한 크실로스 이소머라제 유전자의 아미노산 서열과 70%이상보다 바람직하기는 80%이상 또한 바람직하기는 90%이상의 상동성을 가진 아미노산 서열의 유전자도 포함한다.
또한, 본 발명의 크실로스 이소머라제 유전자는 T. 아쿠아티쿠스 이외의 테르무스속에 속하는 미생물로 부터 얻어진 유전자를 포함한다. 테르무스속에 속하는 미생물의 예로서는 테르무스 플래부스(Thefmus flavus), 테라무스 락테우스(Thermus lacteus), 테르무스 루벤스(Thermus rubens), 테르무스 에스피(Thermus sp.)를 들 수 있다.
T. 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제 유전자는 예컨대 실시예에 기재한 방법으로 대장균에 클로닝 함으로써 조제할 수 있다.
T. 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제는 상기 크실로스 이소머라제 유전자를 적당한 증진자(pormotor)와 함께 플라즈미드에 삽입하여, 미생물을 형질 전환한다. 미생물에 특히 한정은 없으나, 대장균, 바실루스 브레비스(Bacillus brevis), 싸카로미세스 세르비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 스트렙토미세스 리비던스(streptomyces lividans) 또는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtillis)를 예시할 수 있다. 또, 증진자는 이들 미생물에 적합한 것을 사용하면 된다.
대장균에서는 예컨대 tac-증진자(Agric. Biol. Chem., 52(4), 983-988, 1988), 파아지 T7증진자(F. W. Studier et al. Method in Enzymol., 185, 60-84, 1989)를 예시할 수 있다. 구체적으로는 상기 크실로스 이소머라제 유전자를 플라즈미드 pUS12에 삽입하여 이 플라지미드로 형질전환한 대장균을 배양하고, 생성하는 크실로스 이소머라제를 채취함으로써 제조할 수 있다. 프라즈미드 pUS12는 시부이 들에 의하여 개발된 플라즈미드로서, 강력하고 또한 발현제어가 가능한 tac-증진자를 가지는 플라즈미드이다(Agric Biol. Chem., 52(4), 983-988, 1988).
바실루스 브레비스로는 CWP 증진자(Adachi, T, Yamagata, H. et al. J. Bacteriol., 171, 1010-1016, 1989)를 사용하고, 형질전환체를 예컨대 비프엑스트랙트, 글루코스, 펩톤배지(pH 7.0)에서 30℃로 배양하고 생성하는 크실로스 이소머라제를 채취함으로써 제조할 수 있다.
싸카로미세스 세레비시아에로는 PGK(포스포글리셀레이트키나제 유전자의 증진자), ADC(알콜데히드로 게나제의 증진자), GAP(글리세로 알데히드린산 데히드로 게나제의 증진자)(L. Guarente, M. ptashue, Proc, Natl. Acad. USA, 78, 2199-2203, 1988)를 사용하여, 형질전환체를 예컨대 0.3% 효모엑스트랙트, 2% 슈크로즈, 0.5% 펩톤, 0.1% 무기염류 KH2PO4, 0.05% MgSO4·7H2의 배지(pH5.5)에서 30℃로 배양하고 생성하는 크실로스 이소머라제를 채취함으로써 제조할 수 있다.
스트렙토미세스 리비던스(streptomyces lividans) 66으로는 gylpl(글리세롤 키나제 Pl유전자) 증진자(E. T. Seno et al. Mol. Gen. Genet., 193, 119-125, 1984), erm EP1(에리스로 마이신내성 유전자 EP1)증진자(C. J. Thompson et al., al. Bioteriol, 151, 578-587, 1983)를 사용하여 , 형질전환체를 C. J. 톰프슨(Thopson)들의 방법에 의하여 배양하고 생성하는 크실로스 이소머라제를 채취함으로써 제조할 수 있다.
이와 같이 하여 유전자 공학적 숫법에 의하여 얻어진 본 발명의 크실로스 이소머라제는 예상외로 종래에 알려져 있었던 천연의 크실로스 이소머라제[Jouranl of General Microbiology(1990), 136, 679-686]와는 다른 것이고, 신규의 크실로스 이소머라제인 것이 판명되었다.
본 발명의 크실로스 이소머라제의 특징은 지적 pH가 약 7이고, 안정 pH 범위가 약 6∼8.5이며, 망간 또는 마그네슘에서 열안정화되고, 코발트에서 열분안정되며, 약 95℃에 지적 온도가 있고, 분자량이 약 44000이다.
한편, 상기한 천연의 크실로스 이소머라제 지적 pH가 5.5∼8.5인 넓은 범위에 있고, 안정 pH 범위도 6∼9이다. 또, 금속에 대하여는 망간 또는 코발트에서 열안정화된다.
그러나, 마그네슘에서는 열안정화되지 않고, 오히려 불안정하게 되며, 본 발명의 크실로스 이소머라제와 같이 마그네슘에 의하여 열안정화되는 일이 없다. 지적 온도는 약 85℃로서, 본 발명의 크실로스 이소머라제 보다 약 10℃낮다. 분자량은 50000으로서, 본 발명의 크실로스 이소머라제보다 분명히 크다.
또한, 천연의 크실로스 이소머라제의 N-말단아미노산 서열은 Ser-Phe-Pro-Asp-Ileu-Gly-Lyo-Ileu-Ala-Tyr-Glu-Gly-Pro-Glu-Ser-Arg-Asn-Pro-Lys-이고, 본 발명의 크실로스 이소머라제의 N-말단아미노산 서열과 전혀 다르다.
본 발명의 크실로스 이소머라제와 천연의 크실로스 이소머라제는 같은 T. 아쿠아티쿠스를 기원으로 하는데도 불구하고, 다른 효소이다. 그 이유는 어디까지나 추론이나, 다음과 같이 생각된다. 천연의 크실로스 이소머라제는 T. 아쿠아티쿠스로 부터 직접 채취한 것이다. 이에 대하여 본 발명의 크실로스 이소머라제는 T. 아쿠아티쿠스로 부터 채취한 유전자 공학적으로 얻은 것이다. 그때문에 T. 아쿠아티쿠스가 2종 이상의 크실로스 이소머라제 유전자를 보존하고, 본 발명에서는 천연의 크실로스 이소머라제와는 다른 크실로스 이소머라제의 유전자를 채취할 가능성이 있다.
본 발명의 신규의 크실로스 이소머라제느 플락토스의 글루코스의 이성화를 촉매하고, 활성은 예컨대 다음의 방법에 의하여 측정된다. 즉, 0.1∼0.4U의 크실로스 이소머라제를 85℃에서 1㎖의 100mM헤페스, pH7, 400mM플락토스, 10mMMnCl2수용액 중에서 배양한다. 글루코스의 생성량은 글루코스 옥시더제 분석법(글루코스 B-테스트, 와꼬오샤제)에 의하여 20㎕의 시료를 분석하여 구한다. 1유니트는 상기 조건하에서 1분간 1μ㏖의 글루코스를 생성하는 효소량으로 정의 한다.
본 발명의 크실로스 이소머라제의 정제는 실시예에서도 기재되어 있는 바와 같이, 다음과 같이 행하여 진다.
본 발명의 크실로스 이소머라제 유전자를 함유한 플라즈마로 형질전환한 형질전환제를 배양하여 얻어진 균체를 원심분리에 의하여 모아서, 2㎖의 10mM의 MnCl2및 400mM의 플락토스를 함유하는 100mM 트리 에탄올아민완충액(pH7)에 용해하여, 초음파에 의하여 분해하고, 잔사를 원심분리로 제거한다. 균추출물은 85℃에서 10분간 가열하고, 변성한 단백지른 원심분리에 의하여 제거한다. 윗물은 500용량의 50mM헤페스, pH 7.5mM EDTA완충액에 2회 및 EDTA를 함유하지 않은 완충액에 2회 각각 한외 여과함으로써 정제한다.
본 발명의 크실로스 이소머라제는 분자량의 약 44000이고, 그유전자는 387개이며 아미노산으로 된 폴리펩티드이다. 이 크실로스 이소머라제 망간 또는 마그네슘에 의하여 효소의 열안정성이 금속을 첨가하지 않는 경우에 비하여 향상되고, 그것에 대하여 코발트를 첨가하면 금속을 첨가하지 않은 경우에 비하여 효소의 열안정성은 악화된다. 본 발명의 크실로스 이소머라제는 약 95℃에 최적온도를 가진다.
본 발명에서는 상기 크실로스 이소머라제를 사용하여 75℃이상, 바람직하기는 80℃이상의 온도로 글루코스를 이성화시켜 고농도의 플락토스를 제조한다. 반응온도는 화학 평형의 관점에서 높으면 그만큼 플락토스 농도도 높아지므로, 가능한한 높게 하는 것이 좋다. 상기 유전자 공학의 숫법을 사용하여 제작한 T. 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제는 약 95℃에 이소머라제 활성의 최적온도를 가진다.
따라서, 효소의 활성의 점에서는 95℃부근에서 반응시키는 것이 바람직하나, 실용적으로는 100℃이하의 온도, 바람직하기는 80℃∼95℃의 범위로 하는 것이 적당하다.
한편, 반응액의 pH는 5∼7, 바람직하기는 5∼6.5로 하는 것이 프락토스용액의 착색을 억제한다는 관점에서 효과적이다.
그리고, 크실로스 이소머라제에 의한 글루코스의 이성화 반응은 뱃치(batch)식 또는 고정화 효소법에 의한 연속식으로 행할 수 있다. 반응시간은 배치식(batch)식 또는 고정화 효소법에 의한 연속식으로 행할 수 있다. 반응시간은 뱃치식의 경우 반응의 규모에도 의하나, 예컨대 약 1∼24시간으로 할 수 있다. 또, 고정화 효소법에 의한 연속식의 경우에는 체류 시간을 예컨대 약 1분∼24시간, 바람직하기는 약 5분∼3시간으로 할 수 있다.
[실시예 1]
균주 :
테르무스 아쿠아티쿠스 HB8 : ATCC 27634
대장균 JM109 : recAlsupE44endAlhsdR17gyrA9 6reAlthi△(1ac-proAB)F' 〔traD36proAB+lacIlacZ△M15〕
생육조건
T. 아쿠아티쿠스균은 나가하리들의 방법(Nagahari et al. Gene, 10, 137-145, 1980)에 의하여 생육시켰다.
대중균 세포는 비에이다르의 방법(Vieira et al. Meth. Sur. 1987, 153(3-11)에 의하여 2배 농도의 이스트엑스 ·트립톤배지(Difco)중에서 37℃로 생육시켰다.
클로닝 및 서열(sequencing)조작
게놈 DNA는 사이또오의 방법 〔Saito, H. 및 Miura, K. Preparation of transforming DNA by phenol treatment. Biochim. Biophys. Acta 1963, 72(619-629)〕에 의하여, T. 아쿠아티쿠스 세포로 부터 추출하였다. 동결펠릿(0.45g)을 200mMNacl, 100mM EDTA, 50mM 트리스-HCl(pH8.0) 4.5㎖에 용해하였다. 10% SDS 0.5㎖을 가하고, 혼합물을 60℃ 1분간 천천히 회전시키고, 이어서 60℃ 30분간 RNAseA(0.05㎎/㎖)로 처리하였다. 다음에 60℃로 60분간 프로티나제 K(0.5㎎/㎖)로 처리하였다. 본 용균액에 등량의 페놀액(트리스완충액으로 포화한 것)을 가하고, 변성단백질을 제거하였다. 이 처리를 3회 행하였다. 잔사를 원심분리(10분간, 15000rpm)로 제거하였다. 0.8용량의 이소프로판올을 첨가한 후, DNA를 감고, 1mM EDTA를 함유한 10mM 트리스 - HCl(pH8.0) 1.5㎖에 용해하였다. 최후에 DNA를 DEAE셀루로우스 컬럼(세정완충액 : 50mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA, 0.15M NaCl : 용출완충액 : 50mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA, 1MNaCl)을 사용한 음이온 교환체에 의하여 정제하였다.
게놈 DNA는 Sacl을 사용하여 소화하였다. 단편(fragment)는 0.4% 아가로스겔 전기영동으로 분획하였다. Scal을 사용하여 소화하였다. 단편은 0.04% 아가로스겔 전기영동으로 분획하엿다. DNA는 25분간 1.5MNaCl, 0.5MNaOH중에 겔을 담금으로써 변성하였다. 겔은 3M아세트산 나트륨(pH 5.5)으로 중화시켰다. DNA는 일렉트로브로팅(3시간, 2mA/㎠)에 의하여 나일론막(Biodyne)에 옮겨, 80℃로 1시간 처리하였다. 이 블로트를 스트렙토미세스 그리세오프스쿠스(Streptomyces griseofuscus) S-41 크실로스 이소머라제 유전자로 부터 유래한32P 표지된 287 뉴클레오티드 Bg11단편(106cpm/㎖)을 사용하여 54℃로 하이브리다이즈시켰다. 이 단편은 바실루스 서브틸리스, 대장균 스트렙토미세스 비올라세오니거(Streptomyces violaceoniger) 및 암플라리엘라(Ampullariella)로부터 얻은 크실로스 이소머라제 아미노산 서열과 비교하면 알 수 있는 바와 같이, 2개의 비교적 높은 상동성 영역을 포함한다. 하이브리다이제이션 후, 1.8Kb부근에 단일한 띠(band)가 나타났다.
Sacl로 소화한 테르무스 DNA의 1.8Kb±0.5Kb의 단편는 글래스 밀크(grassmilk)를 사용한 추출에 의하여 단리되고, Sacl 소화된 대장균 벡터 pUC118과 연결시켰다. 콘피텐트 대장균 JM109 세포를 연결한 DNA로 형질 전환하였다. 바라는 테르무스 DNA를 가진 콜로니를 S. 그리세오푸스쿠스프루브와 형질전환체의 콜리니와의 하이브리다이제이션에 의하여 검출하였다. 포지티브한 시그널을주는 콜로니로 부터 알칼리 용해법에 의하여 플라즈미드 DNA를 추출하여, 제한효소에 의한 소화 및 사잔 하이브리다이제이션에 의하여 분석하였다. S. 그리세오푸스쿠스 크실로스 이소머라제 유전자로 부터 얻은 프로브와 강력히 하이브리다이즈하는 1.8KbSacl 단편을 얻었다.
이 1.8Kb 단편을 제한효소를 사용하여 작은 단편으로 분리하였다. 이들의 단편은 pUC118 및 pUC119 를 사용하여 대장균 JM109에 서브클론화하였다. 1본쇄 DNA를 전술한 비에이라(Vieira)의 방법에 따라 제조하여, Taq DNA폴리머라제(AmplitaqTM서열 키트:보주조) 및 7-디아자 dGTP를 사용하여 뉴클레오티드 배열을 결정하였다.
T. 아쿠아티쿠의 크실로스 이소머라제 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 제1도∼제3도에 도시하였다.
그리고, 상기 T. 아쿠아티쿠스 이외의 균에서 얻어진 크실로스 이소머라제와 본 발명의 T. 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제와의 아미노산 서열의 상동성은 표1에 표시한 바와 같다.
[실시예 2]
T. 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제 유전자를 다음과 같이 하여 대장균 발현 벡터 pUS12〔Agric. Biol. Chem., 52(4), 983-988, 1988〕에 삽입하였다.
(a) 먼저, 크실로스 이소머라제 C말단쪽을 코드하는 690bpSmal단편(제1도∼제3도, 847번째부터 1536번째까지의 염기)를 pUS12의 Smal부위에 삽입하였다. 이것을 pUC12C로 한다.
(b) 크실로스 이소머라제의 N말단쪽을 코드하는 1150 bpBbel단편(제1도∼제3도, 236번째부터 1385번째 까지의 염기)의 말단을 T4DNA폴리머라제에 의하여 평활화하여, pUC118의 Smal부위에 삽입하였다. 이것을 pUC118N으로 한다.
(c) pUC118N의 삽입부위 상류의 BamHI 부위부터 삽입단편의 BamHI절단부위(제1도∼제3도, 1250번째의 염기)까지를 포함한 1024bp의 BamHI 단편을 (a)로 구축한 pUS12C 의 삽입부 상류의 BamHI부위와 삽입단편중의 BamHI절단부위(제1도∼제3도, 1250번째의 염기)와의 사이의 단편과 치환하였다.
이와같이 하여 구축된 플라즈미드 pUSTXI는 pUS12의 BamHI 부위와 Smal절단부위와의 사이에 번역 개시부위를 포함한 크실로스 이소머라제 유전자 자체가 삽입되어 있다.
얻어진 플라즈미드 pUSTXI에 의하여 대장균 JM109를 형질 전환한 형질 전환체를 비에라들의 방법 〔Vieira et al. Meth. Enz. 1987, 153(3-11)〕에 의하여 3㎖의 2배 농도의 이스트엑스·크립톤 배지(Difco)중에서 37℃로 대수증식기 증기(A660 ca. 1.0)까지 생육시켰다. 이어서, tac-증진자를 1mM이소프로필-티오가락트사이드(1PTG)의 첨가에 의하여 활성화하고, 다시 2.5시간 생육시켰다.
균은 원심분리에 의하여 모아서, 2㎖의 10mM의 MnCl및 400mM의 플락토스를 함유하는 100mM트레에탄올아민완충액(pH7)에 용해하여, 초음파에 의하여 분해하고, 잔사를 원심분리로 제거하였다. 균추출물은 85℃로 10분간 가열하고, 변성한 단백질은 원심분리에 의하여 제거하였다.
열처리균 추출물 200μ중의 크실로스 이소머라제 활성의 분석은 10mM의 MnCl및 400mM의 플락토스를 함유하는 100mM트리에탄올아민완충액(pH7) 1㎖중 85℃에서 생성글로코스(글루코스 B-테스트, 와코오)를 결정함으로써 행하였다. 크실로스 이소머라제의 활성 및 배양액중의 수율을 표2에 표시하였다.
비교를 위하여 이소머라제 유전자를 갖지 않는 벡터 pUC119 를 운반하는 대장균을 사용하여 얻은 열처리균 추출물 200㎕중의 크실로스 이소머라제 활성배양액주의 수율을 표 2에 표시하였다.
또, 85℃로 10분간 가열하여, 변성한 당백질은 원심분리에 의하여 제거한 균 추출물의 윗물은 500용량의 50mM헤페스, pH7, 5mM EDTA완충액에 2회 및 EDTA를 함유하지 않은 완충액에 2회 각각 한외 여과함으로써 정제하여 본 발명의 크실로스 이소머라제를 얻었다.
[실시예 3]
본 발명의 크실로스 이소머라제의 지적 pH, 안정 pH범위, 금속에의한 열안정화, 지적온도 및 분자량을 측정하였다.
지 적 pH
본 발명의 크실로스 이소머라제의 85℃에 있어서의 지적 pH를 50mM 아세트산, 50mM 피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산), 50mMN-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산, 50mM글리신, 400mM플락토스, 10mMMGCl의 완충액중 85℃에서 0, 8 및 16분간 배양하여 구하였다. 각 시료의 pH는 NaOH로 조절하고, 80℃에서 결정하였다. 글루코스 생성량은 클루코스B-테스트(오꼬오사제)를 사용하여 결정하였다. 결과를 제5도에 도시하였다.
pH 안정성
본 발명의 크실로스 이소머라제의 90℃에 있어서의 pH 안정성을 25mM 아세트산, 25mMv피페라진-N-N'-비스(2-에탄설폰산), 25mMN-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산, 2mM글리신, 5mMMGCl의 완충액중 90℃로 30분간 배양하여 구하였다. 각 시료의 pH는 NaOH로 조절하고, 80℃에서 결정하였다. 상기 배양 후, 시료 40㎕dmf 760㎕의 100mM트리에틴올아민, pH 7, 400mM플락토스, 10mMMgCl의 반응혼합액과 함께 85℃에서 0, 8 및 16분간 배양하여 잔존활성을 측정하였다. 글루코스 생성량은 글루코스B-테스트(와꼬오샤제)를 사용하여 결정하였다. 결과를 제6도에 도시하였다.
금속에 의한 안정화
본 발명의 크실로스 이소머라제의 열안정성에 대한 금속(망간, 마그네슘, 코발트, 각 5㎖)의 효과를 측정하기 위하여, 본 발명의 크실로스 이소머라제를 100mM헤레스, pH7, 400mM플락토스, 5mM의 각 금속염(MnCl, MgCl, CoCl)를 가한 완충액중 90℃로 30분간, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간 및 6시간 배양하였다. 상기 배양 후 시료 40㎕을 1㎕의 100mM트리에탄올아민, pH7, 400mM플락토스, 10mMMgCl의 반응혼합액과 함께 85℃에서 8및 16분간 배양하여 잔존활성을 측정하였다. 글로코스 생성량은 클루코스옥시다제를 사용하는 글루코스B-테스트(와꼬오사제)를 사용하여 결정하였다. 결과는 제7도에 도시하였다.
지 적 온 도(이소머라제 활성의 온도의존성)
플락토스 400mM, 100mM트리에탄올아민완충액(pH7), Mg 50mM, Co 0.5mM의 혼합액에 본 발명의 크실로스 이소머라제를 첨가한 반응 혼합액을 65, 70, 75, 80, 85, 90 및 95℃로 배양한 후, 글로코스에의 전화율을 글루코스-B-테스트(와꼬오샤제)를 사용하여 결정하였다. 결과는 바실루스 및 크리스트리듐의 크실로스 이소머라제의 이소머라제 활성의 온도의존성의 결과와 함께 제8도에 도시하였다. 그리고, 바실루스 및 크로스트리듐의 크실로스 이소머라제의 이소머라제 활성의 온도의존성은 플락토스 400mM, 100mM트리엔탄올아민완충액(pH7), Mg 50mM의 혼합액에 크실로스 이소머라제를 첨가하여, 상기와 똑같이 행하였다.
분자량
본 발명의 크실로스 이소머라제의 분자량을 SDS-PAGE에 의하여 측정하였다. 그결과 분자량은 44200임을 표시하였다. 이 결과는 크실로스 이소머라제 유전자의 아미노산 서열로 부터 산출되는 이론분자량 43900에 거이 합치된다.
[실시예 4]
본 발명의 크실로스 이소머라제를 사용하여 글루코스의 폴락토스에의 이성화를 행하였다.
플락토스 25%(W/V), 글루코스 25%(WV), MnCl5mM, 100mMMOPS(3-(몰포리노)프로판설폰산) 완충액(pH6.5, 25℃로)의 반응혼압액을 제조하였다. 콘트롤에는 이 반응 혼압액을 사용하며, 실시예에는 이 반응 혼합액에 1㎎/㎖의 클론내열성 크실로스 이소머라제를 첨가하였다. 이들의 용액을 80℃로 배양하여 0, 20, 60, 180분에 시료화하였다. 시료는 고속액// 크로마토그래피(컬럼 ULTRON PS8ON(Shiwa kako제), 온도 50℃, 유속 0.9㎖/분, 이동상 HO)로 분석하였다. 결과를 제9도에 도시하였다.
[실시예 5]
플락토스 용액의 착색의 pH 의존성
플락토스 25%(W/L), 글루코스 25%(W/L), 100mM 트리에탄올아민완충액(pH5, 6, 7 및 8)의 혼합액을 각각 80℃로 3시간 배양한 후 200㎚에 있어서의 자외선 흡수(A200)를 분광광도계를 사용하여 측정하여, 착색을 조사하였다. 결과는 제10도에 도시하였다. 제10도에서 pH5∼7의 범위에서 착색이 적은 것을 알 수 있다.
[발명의 효과]
본 발명의 T. 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제 유전자를 사용함으로써 신규의 내열성 크실로스 이소머라제를 대량으로 생산할 수 있다.
또한, 이 크실로스 이소머라제는 공지의 천연의 T. 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제와는 다르며, 특히 식품첨가물로서 허가되어 있는 마그네슘에 의하여 열안정성을 향상시킬 수 있고, 식품감미료로서 사용하는 플락토스의 제조에 사용하는데 있어서 실용상 매우 유용하다. 또한, 본 발명의 크실로스 이소머라제는 최적 온도가 공지의 천연의 T. 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제보다 높은 약 95℃에 있어서, 플락토스의 생산에 더욱 유리하다.
또 발명의 내열성의 크실로스 이소머라제를 사용하는 본 발명의 방법에 의하면, 고농도의 플락토스 용액을 거의 거치지 않고 생산할 수 있다.

Claims (11)

  1. 하기 서열 1a 내지 1c로 표시되는 염기서열 및 아미노산 서열을 갖는 테스무르 아쿠아티쿠스로부터 유래된 크실로스 이소머라제 유전자.
  2. 제1항에 있어서, 테르무스 아쿠아티쿠스가 ATCC27634의 기탁번호를 가진 유전자.
  3. 제1항에 따른 크실로스 이소머라제 유전자로부터 얻어지며, 지적 pH가 약 7이고, 안정 pH 범위가 약 6∼8.5이고, 망간 또는 마그네슘으로 열안정화되며, 약 95℃에 지적온도가 있고, 분자량이 약 44000인 테르무르 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제.
  4. 제1항에 기재된 유전자 및 증진자를 가진 플라즈미드로 형질 전환한 미생물을 배양하고 생성하는 크실로스 이소머라제를 채취하는 것을 포함한 크실로스 이소머라제의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 미생물이 대장균, 바실루스 프레비스, 싸카로 미세스세레비시아에, 스트렙토미세스리비던스 또는 바실루스스프티리 스인크실로스 이소머라제의 제조방법.
  6. 제4항에 있어서, 미생물이 대장균이고, 또한 증진자가 tac-증진자 또는 크실로스 이소머라제의 제조방법.
  7. 제4항에 있어서, 미생물이 바실루스프레비스이고, 또한 증진자가 CWP 증진자인 크실로스 이소머라제의 제조방법.
  8. 제4항에 있어서, 미생물이 싸카로미세스 세레비시아에이고, 또한 증진자가 포스포그리세레이크 키나제 유전자의 증진자, 알콜데히드로게나제의 증진자 또는 글리세롤알데히드린산데히드로게나제의 증진자의 크실로스 이소머라제의 제조방법.
  9. 제4항에 있어서, 미생물이 스트렙토미세스 리비던스이고, 또한 증진자가 글리세롤키나제 P1유전자의 증진자인 크실로스 이소머라제의 제조방법.
  10. 제3항에 기재된 크실로스 이소머라제의 존재하에 글로코스를 이성화하여 플락토스 생성시키는 것을 포함하는 플락토스의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 글로코스 이성화를 75℃이상의 온도로, 그리고 5∼7pH 로 행하는 플락토스의 제조방법.
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