JPH10276785A - 組換え型トレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子、その遺伝子を含むベクター、その遺伝子で形質転換された形質転換体及びこの形質転換体を用いて組換え型トレハロースホスホリラーゼを製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規な組換え型トレハロースホスホリラーゼ
の提供。 【解決手段】 トレハロースホスホリラーゼをコードす
る遺伝子を見出し、それを含むベクターを構築し、形質
転換体を作成し、それを用いて組換え型トレハロースホ
スホリラーゼを産生させた。トレハロースホスホリラー
ゼを工業的規模で生産し、この酵素により、D-グルコー
スとα-D- グルコース1-リン酸とからトレハロースを工
業的に有利に製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、組換え型トレハロ
ースホスホリラーゼ、そのアミノ酸配列をコードする遺
伝子、この遺伝子を含む自律複製可能なベクター、この
発現ベクターを導入した形質転換体およびこれを用いて
組換え型トレハロースホスホリラーゼを製造する方法に
関する。

【０００２】トレハロースは、グルコース２分子の還元
性基同士が結合した非還元性二糖類であり、天然には細
菌、真菌、藻類、植物、昆虫、動物など広く生物界に存
在し、生体中のエネルギー貯蔵物質として、又は、低温
や乾燥に対する保護作用を持つ物質として知られてい
る。トレハロースは分子中に還元性基を持たないので、
アミノ酸類の存在下で加熱しても褐変反応を起こすこと
がなく、着色や変質の懸念なく飲食物を甘味付けできる
利点がある。しかしながら、従来の方法では所望量を入
手することが難しく、実際に飲食物の甘味付けに使われ
ることは殆どなかった。

【０００３】これまでのトレハロースの製造方法は、
(1) 主として微生物の菌体を利用する方法、(2) 糖質に
複合酵素系を作用させる方法、(3) 糖質に酵素を作用さ
せる方法に大別される。例えば第一の方法は、酵母菌体
内に蓄積したトレハロースを抽出する方法（特開平5-29
2986号公報）、コリネバクテリウム属等の細菌を培養
し、そのろ液中にトレハロースを蓄積せしめる方法（特
開平5-211882号公報）等が知られている。しかし、これ
らの方法では、不純物の除去が必須であること、収量が
少ないこと等の欠点がある。また、第二の方法は、基質
にマルトースとグルコースを使用し、これにマルトース
ホスホリラーゼとβ型トレハロースホスホリラーゼ（β
-D- グルコース 1- リン酸を基質とするトレハロースホ
スホリラーゼをβ型トレハロースホスホリラーゼとい
う、以下同じ）からなる複合酵素系を作用させ、生成し
たトレハロースを精製する方法（特開昭 58-216695号）
が知られている。この方法は、トレハロースそのものの
分離は比較的容易なものの、反応自体が２種類の酵素に
よる平衡反応であり、しかもその平衡が常時β-D- グル
コース 1- リン酸側に傾いていることから、基質を高濃
度にして反応する必要があり、トレハロースの収量を上
げるのが困難であった。さらに、第三の方法は、特開平
8-149980号公報などにもみられるように、基質にマルト
ースを使用し、新規酵素を作用させ、生成したトレハロ
ースを精製するものである。この方法は、比較的収量が
高いものの、マルトースを得るために馬鈴薯澱粉にα-
アミラーゼ、イソアミラーゼ、β- アミラーゼ、グルコ
アミラーゼ等の種々の酵素を作用させる必要があり、数
段階の反応が必要であり、反応上問題があった。

【０００４】本発明者らは、トレハロースを高効率に変
換する酵素につき鋭意検索したところ、グリフォラ属等
に属するある種の微生物が、D-グルコースとα-D- グル
コース 1- リン酸に作用して、高効率にトレハロースを
生産するα型トレハロースホスホリラーゼ（α-D- グル
コース 1- リン酸を基質とするトレハロースホスホリラ
ーゼをα型トレハロースホスホリラーゼという、以下同
じ）を産生することを見出し、特開平7-255473号公報に
開示した。さらに、サトウキビ、サトウダイコンの貯蔵
糖であり大量且つ廉価に入手し得るスクロースを原料
に、スクロースホスホリラーゼとトレハロースホスホリ
ラーゼを利用すると一つの反応系で、スクロースを90％
以上の効率でトレハロースに変換できることを見出し特
開平7-99988 号公報に示した。これらに示されるよう
に、α型トレハロースホスホリラーゼを利用することに
より、トレハロースに係る前記課題は解決されるものと
期待された。しかしながら、これら微生物は酵素の産生
能が充分でなく、トレハロースを大規模に製造しようと
すると、微生物を大量に培養しなければならないという
問題が生じた。

【０００５】現在まで、トレハロースホスホリラーゼと
しては、β-D- グルコース 1- リン酸を基質とするβ型
トレハロースホスホリラーゼ（特開昭 50-154485号公
報）およびα-D- グルコース 1- リン酸を基質とするα
型トレハロースホスホリラーゼ（特開平7-255473号公
報）が知られている。しかし、いずれのトレハロースホ
スホリラーゼも、アミノ酸配列やＮ末アミノ酸が全く知
られていない。そのため、これらトレハロースホスホリ
ラーゼのｃＤＮＡ配列を決定することは困難であり、か
つ該トレハロースホスホリラーゼの生産微生物が緑藻や
担子菌等の真核生物であることは、その困難さを倍増す
るものである。このような状況にあって、該トレハロー
スホスホリラーゼの遺伝子、特にｃＤＮＡの塩基配列を
明らかにすることは該酵素の供給や物理化学的な性質の
改良を容易にし、該酵素の利用にあたり重要な意義があ
る。つまり異種あるいは同種微生物に該トレハロースホ
スホリラーゼのｃＤＮＡを導入することにより該酵素の
生産性を改良したり、該トレハロースホスホリラーゼの
ｃＤＮＡを保有する微生物を不溶化酵素として利用した
り、該トレハロースホスホリラーゼのｃＤＮＡあるいは
その一部をプローブとして新たなトレハロースホスホリ
ラーゼ生産微生物の探索に利用したり、該トレハロース
ホスホリラーゼのｃＤＮＡの一部の塩基を置換すること
により、該酵素の物理化学的特性、例えば熱安定性また
はpH安定性を改良できる可能性を与えるなど、技術的お
よび経済的に重要な意義がある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、組換
えＤＮＡ技術を応用することにより、D-グルコースとα
-D- グルコース 1- リン酸に作用してトレハロースを生
成する組換え型トレハロースホスホリラーゼを創製する
ことにある。また、本発明の他の目的は、その創製され
た組換え型トレハロースホスホリラーゼをコードする遺
伝子を提供することにある。本発明のさらなる目的は、
かかる遺伝子を含む複製可能な組換え遺伝子を提供する
ことにある。本発明のさらなる目的は、かかる組換え遺
伝子を導入した形質転換体を提供することにある。本発
明のさらなる目的は、かかる形質転換体を利用する、組
換え型トレハロースホスホリラーゼの製造方法を提供す
ることにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、これらの課題
を解決するためになされたものである。すなわち、本発
明は、D-グルコースとα-D- グルコース1-リン酸をトレ
ハロースに変換する作用を有する新規な組換え型トレハ
ロースホスホリラーゼに関する。また、本発明は、この
ような組換え型トレハロースホスホリラーゼのアミノ酸
配列、これをコードする遺伝子、この遺伝子を含んだ自
律複製可能なベクター及びこのベクターを宿主に導入し
た形質転換体に関する。さらに、本発明は、この形質転
換体を培養し、組換え型トレハロースホスホリラーゼを
発現させ、これを培養物から採取することよりなる組換
え型トレハロースホスホリラーゼの製造方法に関する。

【０００８】すなわち、本発明は、まず配列表配列番号
１に示されるアミノ酸配列をＮ−末端とし、配列表配列
番号２で示されるアミノ酸配列を中間フラグメント配列
としてもつトレハロースホスホリラーゼをコードする遺
伝子である。さらに、本発明の遺伝子は、配列表配列番
号３で示されるアミノ酸配列を含むトレハロースホスホ
リラーゼをコードする遺伝子である。これらのトレハロ
ースホスホリラーゼをコードする遺伝子には配列表配列
番号４で示されるゲノムＤＮＡや配列表配列番号５で示
されるｃＤＮＡ等がある。また、合成ＤＮＡも含まれ
る。これらの相同的なアミノ酸配列やＤＮＡ配列には、
アミノ酸や塩基１個又は２個以上を他のアミノ酸または
塩基で置換したり、欠失したりあるいはアミノ酸または
塩基を１個または２個以上付加していても、トレハロー
スホスホリラーゼをコードする限り含まれるものであ
る。これらのアミノ酸配列あるいはＤＮＡ配列は、これ
らの配列と相同的なアミノ酸配列やＤＮＡ配列もトレハ
ロースホスホリラーゼをコードする限り含まれる。本発
明者らが相同性のあるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドについてGENETYX-CD 蛋白質データベース(Ver.32 NB
RF Rel.46 1996年２月ソフトウエア開発株式会社）で検
索したところ、INT. Score : 99 以下、27.6％／134aa
以下の相同性のあるポリペプチドしか得られなかった。
従って、このことからみて相同性のあるアミノ酸配列と
しては、少なくとも50％のアミノ酸配列が同一であり、
トレハロースホスホリラーゼをコードするものも含まれ
る。

【０００９】また、相同性のある塩基配列には、遺伝子
コードの縮重に基づき、あるいは、塩基の１個または２
個以上を他の塩基で置換したり、欠失したりあるいは塩
基を１個または２個以上付加していても、トレハロース
ホスホリラーゼをコードしているものも含まれる。さら
に、配列表配列番号３〜５のアミノ酸配列あるいは塩基
配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチドプローブ
とハイブリダイズする遺伝子も含まれる。このハイブリ
ダイズは実施例３の条件下で行なわれる。また、本発明
における組換え型トレハロースホスホリラーゼのアミノ
酸配列は、部分アミノ酸配列として配列表配列番号１に
示されるアミノ酸配列をＮ−末端とし、配列表配列番号
２で示されるアミノ酸を中間フラグメント配列とするも
のである。このようなアミノ酸配列としては配列表配列
番号３で示されるアミノ酸配列がある。これらのアミノ
酸配列には、これらのアミノ酸配列と相同性のあるアミ
ノ酸配列も含まれる。相同性のあるアミノ酸配列には、
アミノ酸の１個まはた２個以上を他のアミノ酸で置換し
たり、欠失したりあるいはアミノ酸を１個または２個以
上付加していても、それがトレハロースホスホリラーゼ
活性を有する限り含まれるものである。また、本発明の
組換え型トレハロースホスホリラーゼは前記した遺伝子
を用い遺伝子工学的手法によって産生される。また、本
発明は、前記したトレハロースホスホリラーゼをコード
する遺伝子を包含する自律複製可能なベクターであり、
このようなベクターとしてプラスミドベクター pYES2.0
を挙げることができる。

【００１０】さらに本発明は、これらのベクターを宿主
に導入し、組換え型トレハロースホスホリラーゼ発現形
質転換体である。この宿主としては、細菌、放線菌、酵
母、糸状菌、または、その他の真核生物を挙げることが
できる。またさらに、本発明は、このような形質転換体
を培養し、培養物中に組換え型トレハロースホスホリラ
ーゼを発現させ、これを採取することよりなる組換え型
トレハロースホスホリラーゼの製造法である。本発明に
おける採取においては、培養物から酵素を採取するとき
に通常用いられる採取精製手段が用いられる。これらの
手段としては、遠心分離、濾過、濃縮、塩析、透析、分
別沈澱、イオンクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマト
グラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティー
クロマトグラフィー、電気泳動などが挙げられ、本発明
においては、これらの少なくとも１手段以上を用いて組
換え型トレハロースホスホリラーゼを採取する。本発明
の組換え型トレハロースホスホリラーゼは、酵素として
精製されていてもよく、あるいは粗酵素の状態であって
もよい。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明の組換え型トレハロースホ
スホリラーゼは、D-グルコースとα-D- グルコース 1-
リン酸に作用してトレハロースを生成する。本発明の遺
伝子は、自律複製可能なベクターに挿入して複製可能な
組換え遺伝子とし、これを、通常、組換え型トレハロー
スホスホリラーゼを産生しないが、容易に増殖させるこ
とのできる宿主に導入して形質転換体を作成し、これを
培養することにより組換え型トレハロースホスホリラー
ゼを産生することができる。本発明の形質転換体は、こ
れを培養すると、組換え型トレハロースホスホリラーゼ
を産生する。かかる形質転換体を培養すれば、所望量の
組換え型トレハロースホスホリラーゼが容易に得ること
ができる。

【００１２】次に本発明者らが、組換え型トレハロース
ホスホリラーゼを製造するために、Grifola frondosa
(グリフォラ・フロンドーサ CM-236、微工研条寄第35
号）が産生するトレハロースホスホリラーゼ遺伝子のク
ローン化を行ない、その塩基配列を解明すべく行なった
実験について説明する。

【００１３】

【実験例１ アミノ酸配列】

【実験例１−１ Ｎ末端アミノ酸配列】シークエンシン
グ用のタンパク質およびペプチド（特開平7-255473号公
報 実施例６で得られた精製酵素）を60μl の水に溶解
し、あらかじめポリブレン処理したグラスフィルターデ
ィスクにそれぞれ20μl をアプライし、乾燥後にタンパ
ク質一次構造分析装置PSQ-1(島津製作所社製）にセット
してシークエンシングを行なった。予めPTH-アミノ酸溶
離液により平衡化させておいた Wakopak WS-PTH(和光純
薬社製) に負荷し、1.0ml/min の流速で通液して分析し
た。検出は、269nm の波長で行なった。その結果、精製
酵素はＮ末端に配列表配列番号１に示すアミノ酸配列を
有していた。

【００１４】

【実験例１−２ 部分アミノ酸配列】凍結乾燥した精製
酵素（特開平7-255473号公報 実施例６で得られた精製
酵素) 2mg に、8M尿素、50mMトリス- 塩酸緩衝液（pH9.
0) 200μl を加え、37℃で１時間インキュベートした
後、リシルエンドペプチダーゼ５μg と50mMトリス- 塩
酸緩衝液（pH9.0) 600μl を加え、37℃で12時間インキ
ュベートして酵素を部分加水分解した。加水分解物は凍
結乾燥により反応を停止し、適量の 0.1％（v/v)トリフ
ルオロ酢酸に溶解した。溶解させた加水分解物は、予め
0.1％（v/v)トリフルオロ酢酸により平衡化させておい
た逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム (MCI GEL
ODS IMU 三菱化成製) に負荷し分取した。通液開始から
約56分後に溶出したペプチド断片を含む画分を分取し、
真空乾燥した。以後実験例1-1 と同様に分析したとこ
ろ、ペプチド断片は配列表配列番号２に示すアミノ酸配
列を有していた。

【００１５】次に、実験例1-1 及び実験例1-2 で明らか
にした部分アミノ酸配列にもとづき、ＤＮＡシンセサイ
ザー (アプライドバイオシステムズジャパン社製モデル
381A) により化学合成したオリゴヌクレオチドをプロー
ブにし、グリフォラ・フロンドーサのゲノムＤＮＡに市
販のＤＮＡポリメラーゼ (ＤＮＡポリメラーゼＩ、T4Ｄ
ＮＡポリメラーゼ等) を作用させて作成した二重鎖ＤＮ
Ａを鋭意検索したところ、配列表配列番号４示す塩基配
列を含む、合計約 8,200塩基対からなる３つのＤＮＡ断
片が得られた。次に、実施例３で明らかにしたシグナル
ペプチド配列とポリA テールにもとづき化学合成したオ
リゴヌクレオチドをプローブにし、グリフォラ・フロン
ドーサ(CM-236、微工研条寄第35号) の mＲＮＡに市販
の逆転写酵素等（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩ、T4ＤＮＡポリメラーゼ等) を作用
させて作成した二重鎖 cＤＮＡを鋭意検索したところ、
配列表配列番号５に示す塩基配列を含む、約 2,200塩基
対からなるｃＤＮＡ断片が得られた。その塩基配列を解
読したところ、同微生物が産生するトレハロースホスホ
リラーゼは 707個のアミノ酸からなる、配列表配列番号
３に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。さ
らに、ｃＤＮＡとゲノムＤＮＡの塩基配列を比較検討し
たところ数個のイントロンを有していることが判明し
た。

【００１６】配列表配列番号３、４および５に示すアミ
ノ酸配列及び塩基配列を解明するに到った一連の工程を
要約すると、次のようになる。 (1) 供与体微生物の培養物からトレハロースホスホリラ
ーゼを単離し、高度に精製後、Ｎ末端アミノ酸配列を決
定した。一方、その精製酵素をリシルエンドペプチダー
ゼにより部分加水分解後、加水分解物よりペプチド断片
を単離し、そのアミノ酸配列を決定した。 (2) グリフォラ・フロンドーサの濾過物に液体窒素を加
え手早くホモジナイズし、 SDS溶液を加え、その遠心上
澄みより全ＤＮＡを抽出した。 (3) 上記(1) で得られたアミノ酸配列を基に、Hind II
I、Pst I 等の適当な制限酵素切断部位を持つリンカー
のついたオリゴヌクレオチドのプローブを作成し、上記
(2) で得られたＤＮＡに、市販のＤＮＡ合成酵素 (ＤＮ
ＡポリメラーゼI、T4DNA ポリメラーゼ等、宝酒造等)
を作用させてトレハロースホスホリラーゼの一部と推定
されるＤＮＡを得た。 (4) 上記(3) で得られたＤＮＡを pUC18プラスミド、バ
クテリオファージλ等の適当なベクターに組み込んだ
後、大腸菌 JM109株等の適当な菌株に形質転換させた。
形質転換体からアルカリ法により組換えＤＮＡを取得
し、プライマーとともにアニーリング後、ＤＮＡポリメ
ラーゼを作用させてプライマーを伸長し、得られた相補
鎖ＤＮＡをサンガー法により塩基配列を決定した。その
塩基配列から推定されるアミノ酸配列と前記Ｎ末アミノ
酸配列および部分アミノ酸配列と比較し、その塩基配列
がトレハロースホスホリラーゼをコードしていることを
確認した。

【００１７】(5) 上記(4) で得られた形質転換体を、ア
ルカリ法により組換えＤＮＡを抽出し、Hind III、Pst
I 等の適当な制限酵素で組換えＤＮＡを切断し、ゲル電
気泳動を行ない目的とするトレハロースホスホリラーゼ
の一部のＤＮＡ断片を得た。 (6) 上記(2) で得られたＤＮＡを適当な制限酵素で切断
し、ゲル電気泳動を行なった後、 (5)で得たＤＮＡ断片
をプローブとするサザンハイブリダイゼーション法を行
なった。制限酵素 SacI で切断することにより約4500塩
基のトレハロースホスホリラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断
片が得られることが判明した。 (7) 上記(2) で得られたＤＮＡを制限酵素SacIで切断
し、ゲル電気泳動を行なった後、4500bp付近のＤＮＡを
抽出し、 pUC18プラスミド、バクテリオファージλ等の
適当なベクターに組み込んだ。該ＤＮＡを保有するこの
ベクターを用いて、大腸菌 JM109株等の適当な菌株を形
質転換した。目的とするＤＮＡを含むコロニーの選別
は、上記(5) で得られたＤＮＡ断片をプローブとするコ
ロニーハイブリダイゼーションにより行い、トレハロー
スホスホリラーゼをコードするＤＮＡを含む形質転換体
を選択した。

【００１８】(8) 上記(7) の形質転換体から組換えＤＮ
Ａを取得し、プライマーとともにアニーリング後、ＤＮ
Ａポリメラーゼを作用させてプライマーを伸長し、得ら
れた相補鎖ＤＮＡをサンガー法により分析して塩基配列
を決定した。その塩基配列から推定されるアミノ酸配列
と前記Ｎ末アミノ酸配列および部分アミノ酸配列とを比
較し、その塩基配列がトレハロースホスホリラーゼをコ
ードしていること、およびＣ末側の配列が欠けているこ
とを確認した。 (9) 上記(8) で得られた組換えＤＮＡを、Sac I 、Sma
I 等の適当な制限酵素で切断し、ゲル電気泳動を行ない
トレハロースホスホリラーゼのＣ末側のＤＮＡ断片を得
た。 (10) 上記(2) で得られたＤＮＡを適当な制限酵素で切
断し、ゲル電気泳動を行なった後、 (9)で得たＤＮＡ断
片をプローブとするサザンハイブリダイゼーション法を
行なった。制限酵素 PstI で切断することにより約1700
塩基のトレハロースホスホリラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ
断片が得られることが判明した。

【００１９】(11) 上記(2) で得られたＤＮＡを制限酵
素 PstI で切断し、ゲル電気泳動を行なった後、1700bp
付近のＤＮＡを抽出し、 pUC18プラスミド、バクテリオ
ファージλ等の適当なベクターに組み込んだ。該ＤＮＡ
を保有するベクターを用いて、大腸菌 JM109株等の適当
な菌株を形質転換した。目的とするＤＮＡを含むコロニ
ーの選別は、(9) で得られたＤＮＡ断片をプローブとす
るコロニーハイブリダイゼーションにより行い、トレハ
ロースホスホリラーゼＣ末側をコードするＤＮＡを含む
形質転換体を選択した。

【００２０】(12) 上記(11)の形質転換体から組換えＤ
ＮＡを取得し、プライマーとともにアニーリング後、Ｄ
ＮＡポリメラーゼを作用させてプライマーを伸長し、得
られた相補鎖ＤＮＡをサンガー法により分析して塩基配
列を決定した。その塩基配列と上記(8) の塩基配列とを
比較し、その塩基配列がトレハロースホスホリラーゼを
コードしていることを確認した。しかし、該酵素の全塩
基配列として不十分であることが予想されたため、さら
にＣ末側のＤＮＡ断片を取得する必要があった。 (13) 上記(12)で得られた組換えＤＮＡを、Sac I 、Ps
t I 等の適当な制限酵素で切断し、ゲル電気泳動を行な
いトレハロースホスホリラーゼのＣ末側のＤＮＡ断片を
得た。 (14) 上記(2) で得られたＤＮＡを適当な制限酵素で切
断し、ゲル電気泳動を行なった後、上記(13)で得たＤＮ
Ａ断片をプローブとするサザンハイブリダイゼーション
法を行なった。制限酵素SacIで切断することにより約30
00塩基のトレハロースホスホリラーゼ遺伝子を含むＣ末
側ＤＮＡ断片が得られることが判明した。

【００２１】(15) 上記(2) で得られたＤＮＡを制限酵
素SacIで切断し、ゲル電気泳動を行なった後、3000bp付
近のＤＮＡを抽出し、pUC18 プラスミド、バクテリオフ
ァージλ等の適当なベクターに組み込んだ。該ベクター
を用いて、大腸菌 JM109株等の適当な菌株を形質転換し
た。目的とするＤＮＡを含むコロニーの選別は、上記(1
3)で得られたＤＮＡ断片をプローブとするコロニーハイ
ブリダイゼーションにより行い、トレハロースホスホリ
ラーゼＣ末側をコードするＤＮＡを含む形質転換体を選
択した。 (16) 上記(15)の形質転換体から組換えＤＮＡを取得
し、プライマーとともにアニーリング後、ＤＮＡポリメ
ラーゼを作用させてプライマーを伸長し、得られた相補
鎖ＤＮＡをサンガー法により塩基配列を決定した。その
塩基配列と上記(12)の塩基配列とを比較し、その塩基配
列がトレハロースホスホリラーゼのストップコドンを含
むＣ末側をコードしていることを確認した。

【００２２】(17) 次にグリフォラ・フロンドーサのろ
過物に液体窒素を加え手早くホモジナイズし、グアニジ
ンチオシアネート及びフェノール溶液を加え、その遠心
した水層より全ＲＮＡを抽出し、ビオチン化されたオリ
ゴ(dT)プローブを利用してポリＡを有する mＲＮＡ画分
を分取した。 (18) 上記(17)で得られたmRNAに、BamH I等の適当な制
限酵素サイトを持つ特異的上流プライマーおよび特異的
下流プライマー、市販の逆転写酵素及びＤＮＡ合成酵素
(RNA依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼI
、T4ＤＮＡポリメラーゼ等、宝酒造等) を作用させて
二重鎖cDNAを得た。 (19) 上記(18)で得られたcDNAを pUC18プラスミド、バ
クテリオファージλ等の適当なベクターに組み込んだ
後、該ベクターを用いて大腸菌 JM109株等の適当な菌株
を形質転換した。目的とするｃＤＮＡを含むコロニーの
選別は、上記(13)をプローブとするコロニーハイブリダ
イゼーションにより行い、トレハロースホスホリラーゼ
をコードするcDNAを含む形質転換体を選択した。

【００２３】(20) 形質転換体から組換えＤＮＡを取得
し、プライマーとともにアニーリング後、ＤＮＡポリメ
ラーゼを作用させてプライマーを伸長し、得られた相補
鎖DNA をサンガー法により塩基配列を決定した。その塩
基配列から推定されるアミノ酸配列と上記Ｎ末アミノ酸
配列及び部分アミノ酸配列とを比較し、その塩基配列が
トレハロースホスホリラーゼをコードしていることを確
認した。また、トレハロースホスホリラーゼのＤＮＡ
は、数個のイントロンを有していることが判明した。

【００２４】本発明のトレハロースホスホリラーゼ遺伝
子は、これに更にプロモ−ター等の該遺伝子の発現に必
要な各種の調節因子を連結させる処理等を行なうことに
より、トレハロースホスホリラーゼ発現ベクターとする
ことができ、該ベクターを利用して適当な宿主細胞を形
質転換させて該宿主細胞によるトレハロースホスホリラ
ーゼの生産を行なうことができ、かくして、遺伝子工学
的手法によるトレハロースホスホリラーゼの大量生産技
術が確立される。

【００２５】本発明の遺伝子を導入してなる上記トレハ
ロースホスホリラーゼ発現ベクターの構築に際しては、
遺伝子組換え技術における通常の操作、方法等を採用で
きる．これには各種の制限酵素、Slヌクレアーゼ等によ
るＤＮＡの切断処理、T4ＤＮＡリガーゼ等を用いたＤＮ
Ａの連結処理、アガロースゲル電気泳動法、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法等によるＤＮＡの単離精製処
理、フェノール抽出法等によるＤＮＡの回収精製処理等
が包含される．またプラスミドベクターが宿主細胞中に
存在することの確認は、アルカリー SDS抽出法（H. C.
Birnboim, and J. Doly, Nucletic Acids Res., 7,
1513(1979)) 等に従いプラスミドＤＮＡを分取後、種々
の制限酵素で処理し、これら制限酵素認識部位の存在の
有無乃至生成ＤＮＡ断片の長さを検討することにより行
ない得る．更に例えば遺伝子の塩基配列をサンガー法
(F. Sanger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U. S.
A.,74,5463(1977))等で解析することによっても上記確
認を行ない得る．尚、組換え体の構築のために利用され
る起源ベクターとしては、pUC18 やこれに由来する各種
プラスミドべクターが好適であるが、特にこれらに限定
されず従来公知の各種のベクター、例えばバクテリオフ
アージおよび動植物ウイルスを含む各種ウイルスベクタ
ー、各種プラスミド、コスミド等であってもよい。

【００２６】本発明の遺伝子を保有するベクターは、こ
れを導入して得られる形質転換体が目的のトレハロース
ホスホリラーゼを発現するために、本発明遺伝子の他
に、その発現に必要な各種の調節因子、例えばプロモー
ター、転写終結信号、ポリ A鎖付加信号（真核細胞を宿
主細胞とする場合）等の転写のための因子やリボゾーム
結合部位等の翻訳のための因子等を有する必要がある。
かかる調節因子は宿主細胞に応じてそれぞれよく知られ
ており、例えばプロモーターとしては、大腸菌において
trpプロモーター、 lacプロモーター、recAプロモータ
ー、λPLプロモーター、 lppプロモーター、 tacプロモ
ーター等、枯草菌においては、SP01プロモーター、SP02
プロモーター、 penプロモーター等、酵母その他の真核
細胞においては、PH05プロモーター、GAL1プロモータ
ー、GAL7プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモ
ーター、ADHlプロモーター、SV40由来プロモーター等を
例示できる。これら調節因子は、発現ベクターの構築に
当り、これらを含むプラスミドを選択して起源ベクター
とすることにより、又はこれらを含むプラスミドから常
法に従い単離するか化学合成した後、適当なベクターに
組込むことにより、それぞれベクターに存在させること
ができ、かくして所望のトレハロースホスホリラーゼ発
現ベクターを取得できる．大腸菌を宿主細胞とする場
合、上記発現系ベクターには、目的とするトレハロース
ホスホリラーゼを菌体内に直接発現させる系及びペリプ
ラズム層に分泌発現させる系の両者が包含される。

【００２７】上記において用いられる宿主細胞として
は、特に限定はなく、例えば大腸菌等のグラム陰性細
菌、枯草菌等のグラム陽性細菌、放線菌、酵母および動
植物細胞等のいずれでもよいが、特に酵母が好ましく、
その中でも Saccharomyces cerevisiae (サッカロミセ
スセレビシエ）のYPH250(IFO 10502、ATCC96519)は好ま
しい。上記宿主細胞への発現ベクターの導入、これによ
る形質転換法としては、一般に用いられている方法、例
えば宿主細胞をリチウムを含む水溶液中で処理し、該溶
液中にベタターを添加する方法 (H.Ito,Y.Fukuda,K.Mur
ata,A.Kimura:J.Bacteriol.,153,163(1983))等を例示で
きる。

【００２８】上記形質転換体は、通常の細胞培養用培地
を用いて培養できる。培養に利用できる培地としては、
例えば YPD培地、 L-broth培地、 E培地、 M−9 培地等
を例示できる．またこれらの培地にはさらに通常知られ
ている各種の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン類、天
然物抽出物および生理活性物質等を添加することもでき
る。培養は宿主細胞の生育に適したpH、温度、通気およ
び撹拌等の条件を採用した各種方法により実施できる。
例えば酵母の場合pH約 5〜7.5 の範囲、好ましくはpH約
6.0〜7.0 の範囲が適当であり、約16〜37℃の温度、好
ましくは約25〜35℃の範囲で、通気撹拌条件で培養する
のが望ましい。尚、目的とするタンパク質の発現量を高
めるためあるいは目的タンパク質の分泌を促進乃至抑制
する等のために、目的に応じて上記培地組成や培養条件
等は適宜変更可能である。

【００２９】かくして、生産、蓄積されるトレハロース
ホスホリラーゼは、これを常法に従い分離、精製でき
る。本発明の遺伝子の利用によれば、遺伝子組換え技術
により、トレハローホスホリラーゼを効率よく大量に製
造でき、得られるトレハロースホスホリラーゼは例えば
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法（PAGE）等により確認でき、通常の
ポリペプチド乃至タンパク質の構造解析と同様の手段、
例えば SDS−PAGEによる分子量分析、等電点電気泳動に
よる等電点測定、アミノ酸分析機によるアミノ酸組成の
測定、アミノ酸シークエンサーによるアミノ酸配列の解
析等によりその同定を行ない得る。

【００３０】培養物から組換え型トレハロースホスホリ
ラーゼの採取は、培養物を遠心分離、濾過、濃縮、塩
析、透析、分別沈澱、イオンクロマトグラフィー、ゲル
濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、電気泳動等、通常培
養物から酵素を採取する手段の少なくとも１種を用いて
行ない、採取後、必要に応じてこれらの手段を用いて精
製する。

【００３１】次に本発明の実施例を示して本発明を具体
的に説明する。これら実施例で用いる手法自体は公知で
あり、例えば、ジェー・サムブルック等「モレキュラー
・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル」、第
２版、1989年コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー発行などにも詳述されている。

【００３２】

【実施例１ ゲノムＤＮＡの調製】グルコース４％、酵
母エキス0.75％、麦芽エキス 0.2％、リン酸二水素カリ
ウム 0.5％、硫酸マグネシウム0.05％（pH5.5)にグリフ
ォラ・フロンドーサ（CM-236、微工研条寄第35号）を接
種し、常法により25℃で２週間回転振盪培養した。培養
液50mlを遠心分離後、水で洗浄し、吸引ろ過により取得
した菌体に液体窒素を入れ乳鉢で摩砕した。摩砕物は、
塩化ナトリウム 100mM、SDS 5 ％(w/w) およびEDTA 5mM
を含有する50mMトリス塩酸緩衝液 (pH7.6)に溶解し、遠
心した。遠心上清に最終濃度0.5Mとなるように塩化ナト
リウムを添加し、さらに遠心を行なった。遠心上清10ml
に2-プロパノール6ml を重層し室温で30分インキュベー
トした。析出したＤＮＡをピンセットで70％エタノール
（v/v)の入っているチューブに移し洗浄と脱塩を行な
い、さらにＤＮＡをピンセットでエタノールの入ってい
るチューブに移し洗浄と脱塩を行なった。エタノールは
ピペットで吸い取り、ＤＮＡを約１分間真空乾燥した。
この粗ゲノムＤＮＡに、EDTA 1mMを含有する10mMトリス
塩酸緩衝液(pH8.0)(以下、TEと略記) 2ml を加え溶解
し、さらにリボヌクレアーゼ２μg を加え、37℃で15分
インキュベートして反応させた。反応物にクロロホルム
2mlを加え、緩く撹拌し遠心した。さらに、遠心上清を
新たなチューブに入れ、クロロホルム2ml を加え、緩く
撹拌し遠心し、上清を新たなチューブに移し、最終濃度
0.5Mとなるように塩化ナトリウムを添加した。これに2-
プロパノール1.2 mlを重層し室温で30分インキュベート
した。析出したＤＮＡをピンセットで70％エタノール
（v/v)の入っているチューブに移し洗浄と脱塩を行な
い、さらにＤＮＡをピンセットでエタノールの入ってい
るチューブに移し洗浄と脱塩を行なった。エタノールは
ピペットで吸い取り、ＤＮＡを約１分間真空乾燥した。
このようにして得た精製ゲノムＤＮＡに、TE 200μl を
加え溶解し、この溶液を−80℃で凍結保存した。

【００３３】

【実施例２ プローブＤＮＡの合成】配列表配列番号１
に示す部分アミノ酸配列のGly-Tyr-Thr-Ser-Leu-Thr-Pr
o-Met-Trp-Ala で表される配列に基づき 5′-GGGTACACC
AGCCTGCAGCCCATGTGGGC-3′で表される塩基配列のプロー
ブ１および配列番号２に示す部分アミノ酸配列のThr-Tr
p-Asn-Ser-Val-Ile-Lys で表される塩基配列に基づき、
その相補鎖 5'-GGCAAGCTTGATGACCGAGTTCCAAGT-3'で表さ
れる塩基配列のプローブ２を合成した。これらプローブ
１および２を用いポリメラーゼチェーンリアクション(P
CR) 法によりＤＮＡの増幅を行った。実施例１で調製し
たゲノムＤＮＡ溶液１μl(約 0.2μg)、プローブ各１μ
l(約 20pmol/μl)、TaKaRa Taq 0.5μl 、10×PCR Buff
er(500mM塩化カリウム、および15mM塩化マグネシウムを
含有する100mM トリス塩酸緩衝液(pH8.3))10 μl 、dNT
P ミクスチャー（各2.5mM)８μl および滅菌蒸留水78.
5μl を容量0.2ml のマイクロチューブ加え、 PCRシス
テム2400 (パーキンエルマー社製) を用い、以下の温度
で反応した。94℃で５分反応した後、95℃ 1分、50℃ 1
分、72℃ 2分を25サイクル実行した。得られた反応物５
μl は、アガロース電気泳動に供し、800bp 程度のＤＮ
Ａ増幅物を確認した。

【００３４】このＤＮＡはアガロースゲルより切り出
し、ジンクリーンキット (バイオ 101社製) を用いて以
下の通り回収した。切り出したゲルの３倍量のNaI 溶液
を加え、55℃で５分間インキュベートすることでゲルを
溶解し、５μl のグラスミルクを加え転倒混和した。氷
上で10分間インキュベートした後、15000 ×g で５秒間
遠心し、上清を除き 500μl のニューウオシュ溶液を加
え転倒混和した後、再び15000×g で５秒間遠心した。
同操作を３回行ない、得られた沈殿物に10μl のTEを加
え転倒混和し、55℃で15分間インキュベートした。次に
15000×g で30秒間遠心し、得られた上清を回収ＤＮＡ
溶液とした。回収ＤＮＡ溶液５μl(約 0.1μg)に、制限
酵素Hind IIIおよびPst I を各々約10単位を加え、37℃
で１時間反応させてＤＮＡを切断した後、 0.1倍容3M酢
酸ナトリウム溶液（pH5.2)と 2.5倍容エタノールを加
え、−80℃で凍結した。凍結物は、遠心し沈殿物を取得
した。別途、プラスミドベクター pUC18（宝酒造社製）
を 0.1μg 取り、常法により制限酵素Hind IIIおよびPs
t I を作用させて切断した後、上記で得たＤＮＡ断片
0.1μg とT4ＤＮＡリガーゼ20単位を加え、４℃で１晩
静置することによりＤＮＡ断片に連結した。得られた組
換えＤＮＡに宝酒造社製コンピテントセルJM109 を100
μl 加え、氷冷下で30分間静置後、42℃に加温し、２×
YTブロス(pH7.0) を加え、振盪下、37℃で１時間インキ
ュベートして組換えＤＮＡを大腸菌に導入した。

【００３５】このようにして得た形質転換体を5-ブロモ
-4- クロロ-3- インドリル -β-D-ガラクトピラノシド4
0μg/ml、イソプロピル -β-D- チオガラクトシド10μg
/mlおよびアンピシリン50μg/ml含む寒天平板培地(pH7.
0) に接種し、37℃で18時間培養後、形質転換された白
いコロニーを採取し、アンピシリン 100μg/mlを含む2
×YTブロス(pH7.0)2mlに接種した。37℃で18時間回転振
盪培養し、培養終了後、 15000×g 、20秒間の遠心分離
により培養物から菌体を採取した。上清を除き100μl
の溶液1(グルコース50mMおよび EDTA10mM を含有する25
mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0))を加えボルテックスにより
混和し、氷上に５分間静置した。さらに200μl の溶液
２(SDS 1％(w/w) を含有する0.2N水酸化ナトリウム水溶
液) を加え転倒混和し、氷上に５分間静置した。次に 5
M 酢酸カリウム60ml、氷酢酸11.5mlと水28.5mlを混合し
た溶液 150μlを加え、転倒混和し氷上に10分間静置し
た後、 15000×g で５分間遠心した。上清を回収し、 4
50μl のフェノール：クロロフォルム=1：1(v:v)を加
え、激しく撹拌した後、 15000×g で５分間遠心して上
清を回収した。この上清に1ml のエタノールを加え、−
80℃のフリザーで30分間静置し、再び 15000×g で５分
間遠心して沈殿物を回収した。沈殿物は70％(v/v) エタ
ノールで洗浄後風乾し、RNase 0.5 μg を含む50μl の
TEに溶解し、37℃で30分間インキュベートした。インキ
ュベートした溶液は、ポリエチレングリコール 6000 20
％(w/w) を含む2.5M塩化ナトリウム溶液30μl を加え氷
上で１時間静置した。 15000×g で10分間遠心し、沈殿
を70％エタノールで洗浄した後風乾させ、50μl のTEに
溶解した。この溶液に50μl のフェノール：クロロフォ
ルム=1：1(v/v)を加え、激しく撹拌した後、 15000×g
で５分間遠心して上清を回収し、 0.1倍容3M酢酸ナトリ
ウム溶液(pH5.2) および 2.5倍容エタノールを加え、−
80℃で凍結した。凍結物は、遠心し沈殿物を取得した。

【００３６】沈殿物を50μl のTEに溶解し、宝酒造社発
行「タカラTaq サイクルシークエンシングキットfor シ
マズＤＮＡシークエンサーVer.2 説明書」第１乃至４頁
（1995年）に記載されている方法に準じて以下の反応を
行なった。マイクロ遠心チューブにA 、G 、C 、T の d
/ddNTP混合液をそれぞれ２μl ずつ分注する。ＤＮＡ断
片が挿入されている pUC18溶液 1μl 、M13-フォワード
蛍光プライマーまたはM-13リバース蛍光プライマー 1μ
l 、TaKaRa Taq 1μl 、 5×サイクルバッファー 5.4μ
l および滅菌水 9.6μl を混合し、上記チューブに４μ
l ずつ分注する。各チューブは、パーキンエルマー社製
PCRシステム2400上で、以下の温度で反応した。94℃で
３分反応した後、94℃ 30 秒、50℃ 30 秒、72℃ 1分を
15サイクル行ない、次に94℃30秒、72℃１分を15サイク
ル実行した。反応終了後ストップ溶液を４μl ずつ加
え、94℃５分間熱変性を行なった後、急冷した。泳動
は、４％ロングレンジャーＴＭゲル（ATバイオケム）で
作成し、熱変性済みサンプルを３μl ずつロードした。
このとき両端のサンプルの隣にはエッジコントロール溶
液を同時にロードし、島津蛍光式シークエンサDSQ-1000
(島津社製) により塩基配列を決定した。ＤＮＡ断片
は、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列をコ
ードしていたことから、トレハロースホスホリラーゼの
ＤＮＡと断定した。このＤＮＡは、内部にPst I 認識部
位が存在し、ＤＮＡを含むプラスミドベクターを制限酵
素Hind III、Pst I で処理すると、600bp と200bp 程度
の２つの断片が得られることが判明した。次に、制限酵
素Hind IIIおよびPst I を各々約10単位を加え常法によ
り処理し、アガロース電気泳動に供した。600bp と200b
p 程度のＤＮＡ増幅物をアガロースゲルより切り出し、
常法により得られたＤＮＡ断片をプローブとして使用し
た。

【００３７】

【実施例３ トレハロースホスホリラーゼＤＮＡの調
製】実施例１で調製した精製ゲノムＤＮＡ溶液５μl(約
1μg)を取り、これに制限酵素SacIを約20単位加え、室
温で一晩反応させてゲノムＤＮＡを部分切断した後、
0.1倍容酢酸ナトリウム溶液(pH5.2) および 2.5倍容エ
タノールを加え、−80℃で凍結した。凍結物は、遠心し
沈殿物を取得した。このようにして得られた沈殿物は10
μl のTEに溶解し、アガロースゲル電気泳動に供した。
アガロースゲルは、アマシャム社発行「 ECLキットプロ
トコール」第23乃至28頁（1993年）に記載されている方
法に準じてナイロン膜上に以下の方法で固定した。0.25
N の塩酸にゲルを10分静置し水洗後、0.4Nの水酸化ナト
リウム溶液中で20分間振盪した。振盪後、0.4Nの水酸化
ナトリウム溶液を使用し、毛細管現象によりゲルからナ
イロン膜上にＤＮＡを吸着させた。ナイロン膜は、 2×
SSC 溶液で５秒洗浄した後、塩化ナトリウム（0.5M）お
よびブロッキング剤(5％w/v)を含むハイブリダイゼーシ
ョンバッファーに浸し１時間、42℃で振盪した。別途、
アマシャム社発行「ECLキットプロトコール」第11乃至2
2頁（1993年）に記載されている方法に準じて以下の方
法でラベリングを行った。実施例２で調製したプローブ
ＤＮＡ約 0.2μg を取り、５分間煮沸後、氷上で急冷
し、５分間静置した。 15000×g で２秒遠心し溶液を底
に落とした。ラベリング試薬20μl を加え撹拌し、さら
にグルタルアルデヒド溶液20μl を加え撹拌した後、37
℃で10分間反応後、氷上で保存した。前記ナイロン膜を
含むバッファーにラベリングしたプローブを加え42℃で
一晩振盪した後、ナイロン膜を取りだしプライマリーウ
オシュバッファー（ウレア6M、SDS 0.4 ％(w/v) 、 0.5
×SSC)に浸し、42℃で20分間振盪し、バッファーを捨て
た後、再びプライマリーウオシュバッファーに浸し、42
℃で20分間振盪した。バッファーを捨て、 2×SSC に浸
し、室温で５分間振盪した。バッファーを捨てた後、再
び 2×SSC に浸し、室温で５分間振盪した。バッファー
を捨て、クレラップ（商標名）上にナイロン膜を置き検
出試薬１と２を2ml ずつ混合した溶液をナイロン膜に掛
け、１分間静置し、溶液を捨て、クレラップで包み固定
したゲノムＤＮＡ面とX-線フィルムをコンタクトし３分
間静置した。現像した結果、4500bp付近に顕著な会合を
示すバンドを認めた。そこで次に、実施例１で調製した
ゲノムＤＮＡ溶液10μl(約 2μg)を前述の方法に準じて
制限酵素 SacI で切断した後、アガロースゲル電気泳動
に供した。4500bp付近のこのＤＮＡはアガロースゲルよ
り切り出し回収した。別途、プラスミドベクターpUC18
(宝酒造社製) を 0.1μg 取り、常法により制限酵素Sac
I を作用させて切断した後、上記で得たＤＮＡ断片 0.
1μg とT4ＤＮＡリガーゼ20単位を加え、４℃で１晩静
置することによりＤＮＡ断片に連結した。得られた組換
えＤＮＡに宝酒造社製コンピテントセルJM109 を 100μ
l 加え、氷冷下で30分間静置後、42℃に加温し、 2×YT
ブロス(pH7.0) を加え、振盪下、37℃で１時間インキュ
ベートして組換えＤＮＡを大腸菌に導入した。

【００３８】このようにして得た形質転換体を5-ブロモ
-4- クロロ-3- インドリル -β-D-ガラクトピラノシド4
0μg/ml、イソプロピル -β-D- チオガラクトシド10μg
/ml、アンピシリン50μg/ml含む寒天平板培地(pH7.0)
に接種し、37℃で18時間培養後、約3000個の白いコロニ
ーをアマシャム社発行「 ECLキットプロトコール」第31
乃至34頁（1993年）に記載されている方法に準じて以下
の方法でコロニーブロッティングを行った。適当な大き
さのナイロン膜をブランク用の寒天培地上に置き両面を
濡らし、コロニーの形成している寒天培地上に注意深く
置いた。ナイロン膜と培地の両方に殺菌済みの針で印を
付け、コロニーの方向性が分かるようにした。１分間
後、ナイロン膜をはがし、コロニー側を上にして、変性
溶液（塩化ナトリウム1.5M、水酸化ナトリウム0.5M）に
浸したろ紙上に置き７分間静置した。ナイロン膜をコロ
ニーのある面を上にして、中和溶液（塩化ナトリウム1.
5M、および EDTA 1mM を含有する0.5Mトリス塩酸緩衝液
(pH7.2))を含むろ紙上に置き、３分間放置後、新たに中
和溶液でしめらせた新しいろ紙を用い、同操作を繰り返
した。ナイロン膜を 2×SSC で洗浄し、コロニー側を上
にし、乾いたろ紙上に置き風乾した。次に水酸化ナトリ
ウム0.4Mを染み込ませたろ紙の上に20分間静置し、 5×
SSC で10〜60秒間振盪洗浄し、ナイロン膜上に固定し
た。別途、実施例２で調製したプローブＤＮＡ約 0.1μ
g を、「 ECLキット」 (アマシャム社製)でラベリング
を行ない、前記ナイロン膜上に固定した形質転換株のコ
ロニーにハイブリダイズさせ、顕著な会合を示した１つ
の形質転換体を選択した。

【００３９】この形質転換体は、アンピシリン 100μg/
mlを含む 2×YTブロス(pH7.0) に接種し、37℃で18時間
回転振盪培養し、培養終了後、遠心分離により培養物か
ら菌体を採取し、通常のアルカリ法により組換えＤＮＡ
を菌体外に溶出させた。処理物は種々の制限酵素（EcoR
I、Sac I 、Kpn I 、Sma I 、BamH I、Xba I 、SalI
、Acc I 、Hinc II 、Pst I 、Sph I 、Hind III、Spe
I 、Bln I 、Fba I 、Eco T22I、Bgl II、Xho I)で常
法により切断し、プラスミドpUC18 及びpUC19 に挿入し
直し、精製、分析したところ、クローニングしたＤＮＡ
は約4500bpからなっていた。4500bpＤＮＡは、3'側にト
レハロースホスホリラーゼのＮ末端から約2100bpのＤＮ
Ａをコードしていた。

【００４０】さらにＣ末側のＤＮＡを得るため4500bpを
含む組換えＤＮＡ１μg を制限酵素Sac I 、Sma I 各々
約10単位を加え、30℃で２時間反応させてＤＮＡを切断
した後、アガロースゲル電気泳動に供した。500bp 付近
のSac I 、Sma I 切断ＤＮＡを常法によりアガロースゲ
ルより精製しプローブとした。

【００４１】実施例１で調製した精製ゲノムＤＮＡ溶液
5μl(約 1μg)を取り、これに制限酵素Pst I を約20単
位を加え、室温で一晩反応させてゲノムＤＮＡを部分切
断した後、 0.1倍容酢酸ナトリウム溶液(pH5.2) および
2.5倍容エタノールを加え、−80℃で凍結した。凍結
後、遠心し沈殿物を取得した。このようにして得られた
沈殿物は10μl のTEに溶解し、アガロースゲル電気泳動
に供した。アガロースゲルは、常法によりナイロン膜上
に固定した。別途、Sac I 、Sma I 切断プローブＤＮＡ
約 0.1μg を取り、「 ECLキット」（アマシャム社製）
でラベリングを行い、前記ナイロン膜上に固定した染色
体ＤＮＡにハイブリダイズさせた結果、1700bp付近に顕
著な会合を示すバンドを認めた。そこで次に、実施例１
で調製したゲノムＤＮＡ溶液10μl(約 2μg)を前述の方
法に準じて制限酵素 PstI で切断した後、アガロースゲ
ル電気泳動に供した。1700bp付近のこのＤＮＡはアガロ
ースゲルより切り出し回収した。別途、プラスミドベク
ターpUC18(宝酒造社製) を 0.1μg 取り、常法により制
限酵素Pst I を作用させて切断した後、上記で得たＤＮ
Ａ断片 0.1μg とT4ＤＮＡリガーゼ20単位を加え、４℃
で１晩静置することによりＤＮＡ断片に連結した。得ら
れた組換えＤＮＡにコンピテントセルJM109(宝酒造社
製) を 100μl 加え、氷冷下で30分間静置後、42℃に加
温し、 2×YTブロス(pH7.0) を加え、振盪下、37℃で 1
時間インキュベートして組換えＤＮＡを大腸菌に導入し
た。

【００４２】このようにして得た形質転換体を5-ブロモ
-4- クロロ-3- インドリル -β-D-ガラクトピラノシド4
0μg/ml、イソプロピル -β-D- チオガラクトシド10μg
/mlおよびアンピシリン50μg/ml含む寒天平板培地（pH
7.0)に接種し、37℃で18時間培養後、約2000個の白いコ
ロニーをナイロン膜上に固定した。別途、Sac I 、Sma
I 切断プローブＤＮＡ約 0.1μg を、「 ECLキット」
（アマシャム社製）でラベリングを行ない、前記ナイロ
ン膜上に固定した形質転換株のコロニーとハイブリダイ
ズさせ、顕著な会合を示した１つの形質転換体を選択し
た。

【００４３】この形質転換体は、アンピシリン 100μg/
mlを含む 2×YTブロス(pH7.0) に接種し、37℃で18時間
回転振盪培養し、培養終了後、遠心分離により培養物か
ら菌体を採取し、通常のアルカリ法により組換えＤＮＡ
を菌体外に溶出させた。処理物を常法により精製し分析
したところ、クローニングしたＤＮＡは約1700塩基対か
らなっており、完全なＣ末端までの塩基配列を含んでい
なかった。

【００４４】さらにＣ末側のＤＮＡを得るため1700bpを
含む組換えＤＮＡ１μg を制限酵素Sac I 、Pst I 各々
約10単位を加え、37℃で１時間ずつ反応させてＤＮＡを
切断した後、アガロースゲル電気泳動に供した。500bp
付近のSac I 、Pst I 切断ＤＮＡを常法によりアガロー
スゲルより精製しプローブとした。

【００４５】実施例１で調製した精製ゲノムＤＮＡ溶液
5μl(約 1μg)を取り、これに制限酵素Sac I を約20単
位を加え、室温で一晩反応させてゲノムＤＮＡを部分切
断した後、 0.1倍容酢酸ナトリウム溶液（pH5.2)、 2.5
倍容エタノールを加え、−80℃で凍結した。凍結物は、
遠心し沈殿物を取得した。このようにして得られた沈殿
物は10μl のTEに溶解し、アガロースゲル電気泳動に供
した。アガロースゲルは、常法によりナイロン膜上に固
定した。別途、Sac I 、Pst I 切断プローブＤＮＡ約
0.1μg を取り、「 ECLキット」 (アマシャム社製) で
ラベリングを行い、前記ナイロン膜上に固定したゲノム
ＤＮＡにハイブリダイズさせた結果、3000bp付近に顕著
な会合を示すバンドを認めた。そこで次に、実施例１で
調製したゲノムＤＮＡ溶液10μl(約 2μg)を前述の方法
に準じて制限酵素 Sac Iで切断した後、アガロースゲル
電気泳動に供した。3000bp付近のこのＤＮＡはアガロー
スゲルより切り出し回収した。別途、プラスミドベクタ
ーpUC18(宝酒造社製) を 0.1μg 取り、常法により制限
酵素Sac I を作用させて切断した後、上記で得たＤＮＡ
断片 0.1μg とT4ＤＮＡリガーゼ20単位を加え、４℃で
１晩静置することによりＤＮＡ断片に連結した。得られ
た組換えＤＮＡにコンピテントセルJM109(宝酒造社製)
を 100μl 加え、氷冷下で30分間静置後、42℃に加温
し、 2×YTブロス(pH7.0) を加え、振盪下、37℃で１時
間インキュベートして組換えＤＮＡを大腸菌に導入し
た。

【００４６】このようにして得た形質転換体を5-ブロモ
-4- クロロ-3- インドリル -β-D-ガラクトピラノシド4
0μg/ml、イソプロピル -β-D- チオガラクトシド10μg
/mlおよびアンピシリン50μg/ml含む寒天平板培地(pH7.
0) に接種し、37℃で18時間培養後、約2500個の白いコ
ロニーをナイロン膜上に固定した。別途、Sac I 、Pst
I 切断プローブＤＮＡ約 0.1μg を、「 ECLキット」
(アマシャム社製) でラベリングを行ない、前記ナイロ
ン膜上に固定した形質転換株のコロニーにハイブリダイ
ズさせ、顕著な会合を示した１つの形質転換体を選択し
た。

【００４７】この形質転換体は、アンピシリン 100μg/
mlを含む 2×YTブロス(pH7.0) に接種し、37℃で18時間
回転振盪培養し、培養終了後、遠心分離により培養物か
ら菌体を採取し、通常のアルカリ法により組換えＤＮＡ
を菌体外に溶出させた。処理物を常法により精製し分析
したところ、クローニングしたＤＮＡは約3000塩基対か
らなり、Ｃ末端塩基配列を含んでいた。トレハロースホ
スホリラーゼのゲノムＤＮＡは、約2750bpよりなり、ト
レハロースホスホリラーゼ開始コドンATG から約50〜60
bp上流にTATAボックス(RNAポリメラーゼ結合サイト）が
あり、酵母、糸状菌に存在し転写開始点を決定するのに
重要なCTボックスは開始コドンから約10〜45bp上流に存
在し、数カ所にイントロンが挿入されていることが判明
した。また配列表配列番号４で示される塩基配列からBa
m HIサイトがないことが明らかになり、以下の実験に利
用した。

【００４８】

【実施例４ トレハロースホスホリラーゼmRNAの調製】
グルコース 4％、酵母エキス0.75％、麦芽エキス 0.2
％、リン酸二水素カリウム 0.5％および硫酸マグネシウ
ム0.05％(pH5.5) からなる培地にグリフォラ・フロンド
ーサを接種し、常法により25℃で３日間回転振盪培養し
た。培養液300mlを遠心分離後、滅菌水で洗浄し、吸引
ろ過により取得した菌体6gに液体窒素を入れ乳鉢で摩砕
した。摩砕物は、プロメガ社発行「RNAgentsトータルRN
A アイソレーションシステムTechnical Bulletin 」第
３乃至７頁（1993年）に記載されている方法に準じて以
下の方法で抽出を行なった。摩砕物に4ml の冷えたグア
ニジンチオシアネート変性溶液を加え、１分間撹拌し、
さらに2M酢酸ナトリウム溶液（pH4.0) 400μl およびフ
ェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝25：
24：1(v:v:v)からなる溶液 4mlを加え転倒混和、10秒間
撹拌した後、 15000×g 、４℃で10分間遠心分離し、水
層4ml を回収した。再度フェノール：クロロホルム：イ
ソアミルアルコール＝25：24：1 からなる溶液 4mlを加
え30秒間撹拌した後、 15000×g 、４℃で10分間遠心分
離し、回収した水層3.8ml に3.8ml のイソプロパノール
を加え−20℃で１時間静置した。静置後 15000×g 、４
℃で１分遠心してペレットを回収し、70％エタノールに
て洗浄後、ペレットを乾燥し 100μl の水に溶解した。
約1mg のRNA を得た。

【００４９】次に、80μl の RNA溶液に、 420μl の滅
菌水を加えた。溶液は、プロメガ社発行「PolyAT tract
mRNA アイソレーションシステムTechnical Manual 」
第４乃至７頁（1992年）に記載されている方法に準じて
以下の方法で精製を行なった。溶液を65℃で10分間加熱
後、ビオチン化されたオリゴ（dT）プローブ(50pmol/μ
l)３μl と20×SSC 13μl を加え転倒混和し、10分間室
温で静置させた。この溶液をStreptavidin MagneSpher
e Particles（以下、SA-PMPs という) を含む、 0.5×
SSC 0.1mlに加え、転倒混和し、室温で10分間インキュ
ベートした。インキュベート後、マグネチックスタンド
でSA-PMPs を捕まえ、SA-PMPs ペレットを乱すことなく
上清を除いた。洗浄のためSA-PMPs に 0.1×SSC 0.3ml
を加え転倒混和し完全に分散させた後、マグネチックス
タンドでSA-PMPs を捕まえ、SA-PMPs ペレットを乱すこ
となく上清を除く操作を４回行なった。次にSA-PMPs ペ
レットに 100μl の滅菌水を加え、転倒混和することで
完全に分散させ、マグネチックスタンドでSA-PMPs を捕
まえ、SA-PMPs ペレットを乱すことなく上清を回収し
た。さらに滅菌水 150μl を加え同じ操作を繰り返し行
ない、トータル 250μl の mＲＮＡ溶液を得た。この溶
液に3M酢酸ナトリウム溶液25μl および 275μl のイソ
プロパノールを加え、−20℃で一晩静置し、 15000×g
、５分間４℃で遠心を行ないペレットを回収し、70％
エタノールにて洗浄後、ペレットを乾燥し10μl の滅菌
水に溶解した。内 1μl をエチジウムブロマイドの入っ
た寒天プレートに乗せ、紫外線を照射し、mRNAの存在を
確認した。

【００５０】

【実施例５ トレハロースホスホリラーゼ二重鎖 cＤＮ
Ａの合成】二重鎖 cＤＮＡは宝酒造社発行「RNA LA PCR
キット説明書」第２乃至11頁（1995年）に記載されてい
る方法に準じて合成した。即ち、容量0.2ml のマイクロ
チューブに25mM 塩化マグネシウム 4μl 、10×RNA P
CRバッファー 2μl 、2.5mM dNTPミクスチャー 8μl 、
RNase インヒビター 0.5μl 、特異的下流 PCRプライマ
ー(5′-CGGGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′polyA の相補
鎖にトレハロースホスホリラーゼＤＮＡ中に存在しない
Bam HIサイトを結合)1μl (50pmol/μl)、実施例４で精
製したmRNA 1μl 及び滅菌水 2.5μl を順次加えて全量
を19μl とした。そこへ逆転写酵素 5単位(1μl)を加
え、42℃で30分間インキュベートしてファーストストラ
ンドを合成した。

【００５１】次に上記反応液に25mM塩化マグネシウム12
μl 、10×LA PCRバッファー 8μl、特異的上流 PCRプ
ライマー(5'-CACTGGATCCATGGCTCCTCCCCACCAGTTCCAGTCC-
3'配列表配列番号４に示すゲノムＤＮＡ配列の遺伝子
5'-ATGGCTCCTCCCCACCAGTTCCAGTCC-3'で表される塩基配
列のプローブにトレハロースホスホリラーゼＤＮＡ中に
存在しないBam HIサイトを結合)1μl (20pmol/μl)およ
び滅菌水58.5μl を加えて全量で99.5μl とした。TaKa
Ra LA Taq 2.5単位(0.5μl)を順次加え、95℃で2分間
インキュベートした後、次のステップ 1〜3 を40サイク
ル繰り返し、セカンドストランドおよび cＤＮＡの増幅
を行なった。ステップ 1：95℃、30秒 ステップ 2：67
℃、30秒 ステップ 3：72℃、３分30秒。反応溶液20μ
l をアガロースゲル電気泳動に供したところ2200bp付近
に１本のバンドを得た。

【００５２】2200bp付近のこの cＤＮＡはアガロースゲ
ルより切り出し回収し、常法により制限酵素Bam HIを作
用させて切断した。別途、プラスミドベクターpUC18(宝
酒造社製）を 0.1μg 取り、常法により制限酵素Bam HI
を作用させて切断した後、上記で得た cＤＮＡ断片とT4
ＤＮＡリガーゼ20単位を加え、４℃で１晩静置すること
により cＤＮＡ断片に連結した。得られた組換え cＤＮ
ＡにコンピテントセルJM109(宝酒造社製) を 100μl 加
え、氷冷下で30分間静置後、42℃に加温し、 2×YTブロ
ス(pH7.0) を加え、振盪下、37℃で１時間インキュベー
トして組換えＤＮＡを大腸菌に導入した。

【００５３】このようにして得られた形質転換体を5-ブ
ロモ-4- クロロ-3- インドリル -β-D- ガラクトピラノ
シド40μg/ml、イソプロピル -β-D- チオガラクトシド
10μg/mlおよびアンピシリン50μg/ml含む寒天平板培地
(pH7.0) に接種し、37℃で18時間培養後、約20個の白い
コロニーをナイロン膜上に固定した。別途、Sac I 、Ps
t I 切断プローブＤＮＡ約 0.1μg を、「 ECLキット」
（アマシャム社製）でラベリングを行ない、前記ナイロ
ン膜上に固定した形質転換株のコロニーにハイブリダイ
ズさせ、顕著な会合を示した18個の形質転換体を選択し
た。

【００５４】この形質転換体は、アンピシリン 100μg/
mlを含む 2×YTブロス(pH7.0) に接種し、37℃で18時間
回転振盪培養し、培養終了後、遠心分離により培養物か
ら菌体を採取し、通常のアルカリ法により組換えＤＮＡ
を菌体外に溶出させた。処理物を常法により精製し分析
した。その結果は配列表配列番号３および５に示した通
りであり、塩基配列の１〜75（アミノ酸配列１から25）
までがシグナルペプチドを示し、同76〜2196（アミノ酸
配列26から732)までが成熟トレハロースホスホリラーゼ
ポリペプチドをコードするものであった。

【００５５】

【実施例６ 発現ベクターの構築】実施例５で得られた
トレハロースホスホリラーゼ cＤＮＡがクローニングさ
れたpUC18 1μg に制限酵素Bam HIを約12単位を加え、
30℃で１時間反応させて切断した後、 0.1倍容酢酸ナト
リウム溶液（pH5.2)、 2.5倍容エタノールを加え、−80
℃で凍結した。凍結物は、遠心し沈殿物を取得した。こ
のようにして得られた沈殿物は10μl のTEに溶解し、ア
ガロースゲル電気泳動に供した。約2200bp程度のバンド
をアガロースゲルより切り出し、常法により回収した。

【００５６】別途、のpYES2.0(インビトロジン社製)1μ
g に制限酵素Bam HIを約12単位を加え、30℃で１時間反
応させて切断した後、 0.1倍容酢酸ナトリウム溶液(pH
5.2）、 2.5倍容エタノールを加え、−80℃で凍結し
た。凍結物は、遠心し沈殿物を取得し、上記で得たＤＮ
Ａ断片約 0.3μg とT4ＤＮＡリガーゼ12単位を加え、 4
℃で１晩静置することによりＤＮＡ断片に連結した。得
られた組換えＤＮＡを「pYGT1 」（図１）と命名し、コ
ンピテントセルSaccharomyces cerevisiae（サッカロ
ミセスセレビシエ）YPH250（IFO 10502 、ATCC96519)を
100μl 加え、30℃で30分間静置後、チオシアン酸リチ
ウム0.1M、30％(w/v) ポリエチレングリコール3350を含
む 700μl のTEを加え、振盪下、30℃で１時間インキュ
ベートして「pYGT1 」を酵母に導入した。

【００５７】このようにして得た形質転換体をリシン30
μg/ml、トリプトファン 100μg/ml、アデニン30μg/m
l、ロイシン30μg/mlおよびヒスチジン30μg/mlを含む
寒天平板培地に接種し、30℃で72時間培養後、７個のコ
ロニー選択した。

【００５８】

【実施例７ 形質転換体による組換え型酵素の産生】長
さ20cm、内径1.8cm 試験管にグルコース 2.5％、酵母エ
キス 1％、バクトペプトン 2％および水からなる液体培
地10mlを入れ、 121℃で20分間オートクレーブして滅菌
した。冷却後、この培地に上記形質転換体を接種し、常
法により30℃で２日間振盪培養した。培養液10mlは、遠
心分離で集菌した。次に、長さ20cm、内径1.8cm 試験管
にガラクトース 3％、酵母エキス 1％、バクトペプトン
2％および水からなる液体培地10mlを入れ、 121℃で20
分間オートクレーブして滅菌、冷却後、集菌した形質転
換体を再懸濁し、常法により30℃で２日間振盪培養し
た。培養液10mlは、遠心分離で集菌した。この菌体を、
トレハロース200mM 、グルタチオン10mMおよびEDTA0.16
mMを含有する40mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)300μl
に懸濁後、グラスビーズ約100mg を加え、オートマチッ
クミキサーS-10 (大洋科学工業製) により破砕した。破
砕物は、 15000×g で10分間遠心し、沈殿物を除いた上
清を粗酵素液とした。

【００５９】

【実施例８ 粗酵素液の活性測定法】トレハロースホス
ホリラーゼ活性測定用に以下の反応液を調製した。リン
酸カリウム40mM(pH7.0) 、トレハロース200mM 、グルタ
チオン10mM、EDTA0.16mM、NADP1mM 、塩化マグネシウム
1.3mM 、α- グルコース-1, 6 二リン酸0.067mM 、ホス
フォグルコムターゼ (ベーリンガーマンハイム社製) 1.
55units/ml、グルコース-6- リン酸脱水素酵素 (ベーリ
ンガーマンハイム社製) 1.75units/mlおよび滅菌水から
なる反応液1900μl に、粗酵素液 100μl を加え、30℃
で反応し、１分間に生成するNADPH を340nm の波長で測
定した。トレハロースは、トレハロースホスホリラーゼ
によりグルコースとα- グルコース-1- リン酸に変換さ
れる。生成したα- グルコース-1- リン酸は添加したα
- グルコース-1,6二リン酸と共に添加したホスフォグル
コムターゼによりα- グルコース-6- リン酸とα- グル
コース-1,6二リン酸に変換される。生成したα- グルコ
ース-6- リン酸と添加したNADPは、添加したグルコース
-6- リン酸脱水素酵素により6-ホスホグルコノラクトン
とNADPH となる。

【００６０】コントロールは、トレハロースホスホリラ
ーゼ cＤＮＡを含まないpYES2.0 のみを持つ酵母YPH250
を上記と同一組成の液体培地を使用し、上記と同様に培
養処理した。コントロールの菌株 NADPH生成量は、1.12
×10^-3μmol/ml/minであった。一方形質転換体７菌株
は、4.00×10^-3、4.61×10^-3、4.29×10^-3、3.68×1
0^-3、3.20×10^-3、4.81×10^-3、2.80×10^-3μmol/ml/mi
nであり、コントロールの約3.5倍と有意に高いものであ
った。これら菌株の比活性は4.10×10^-3, 4.55×10^-3,
4.34×10^-3, 3.96×10^-3, 3.25×10^-3, 6.44×10^-3, 2.
74×10^-3U/mg-proteinであった（表１）。

【００６１】以上説明したようにD-グルコースとα-D-
グルコース 1- リン酸をトレハロースに変換し、トレハ
ロースをD-グルコースとα-D- グルコース 1- リン酸に
変換する酵素の遺伝子が見出された。本発明は組み換え
ＤＮＡ技術を応用することにより、この酵素を創製した
ものである。本発明でいう組換え型酵素とは、組換えＤ
ＮＡ技術により創製され、D-グルコースとα-D- グルコ
ース 1- リン酸をトレハロースに変換し、トレハロース
をD-グルコースとα-D- グルコース 1- リン酸に変換す
る酵素全般を意味する。本発明の組換え型酵素は、通
常、本発明者らが解明したアミノ酸配列を有しており、
例えば、配列表配列番号３に示すアミノ酸配列又はそれ
に相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列番号３に示
すアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体
は、所期の性質を実質的に変えることなく、配列番号３
のアミノ酸配列における構成アミノ酸の１個又は２個以
上を他のアミノ酸で置換、欠失あるいは付加することに
より得ることができる。なお、同じＤＮＡであっても、
それを導入する宿主により、そのＤＮＡを含む形質転換
体の培養に使用する栄養培地の成分、培養温度あるいは
pHなどの培養条件により、あるいは宿主内酵素によるＤ
ＮＡ発現後の修飾などにより、所期の性質は保持してい
るものの、配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末
端およびＣ末端付近のアミノ酸が１個又は２個以上が欠
失したり、Ｎ末端に１個又は２個以上のアミノ酸が新た
に付加した変異体を産生することがある。かかる変異体
も、それが所期の性質を具備しているかぎり、本発明の
組換え型酵素に包含される。

【００６２】本発明による組換え型酵素は、特定のＤＮ
Ａを含む形質転換体の培養物から採取することができ
る。この発明で使用する形質転換体は、例えば、配列表
配列番号５に示す塩基配列若しくはそれに相同的な塩基
配列又はそれらに相補的な塩基配列のＤＮＡを適宜宿主
に導入することにより得ることができる。なお、斯かる
塩基配列は、遺伝子コードの縮重を利用して、コードす
るアミノ酸配列を変えることなく、塩基の１個又は２個
以上を他の塩基に置換えても良い。また、ＤＮＡが宿主
中で実際に当該組換え型酵素の産生を発現するために、
当該組換え型酵素又はその相同変異体をコードする塩基
配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で適宜
置換し得ることは言うまでもない。

【００６３】本発明で使用するＤＮＡは、それが前述の
ような配列を有するかぎり、それが天然に由来するもの
か人為的に合成されたものであるかは問わない。天然の
給源としては、例えば、グリフォラ・フロンドーサ（CM
-236、微工研条寄第35号）を含むグリフォラ属の微生物
が挙げられる。これら微生物の菌体からは、例えば、配
列表配列番号３に示すアミノ酸配列をコードする mＲＮ
Ａが得られる。すなわち、かかる微生物を栄養培地に接
種し、好気的条件下で約１日乃至１カ月間培養後、培養
物から菌体を採取し、リゾチームやβ- グルカナーゼな
どの細胞壁溶解酵素、摩砕や超音波で処理することによ
り mＲＮＡを菌体外に溶出させる。このとき、細胞壁溶
解酵素にプロテアーゼなどのタンパク質加水分解酵素を
併用したり、菌体を超音波処理する際、SDS などの界面
活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯くして得
られる処理物から常法により mＲＮＡを精製し、逆転写
酵素などを使用すれば目的のＤＮＡが得られる。一方、
ＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表配列番
号５に示す塩基配列に基づいて化学合成するか、配列番
号３に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを自律複製
可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これ
を適宜宿主に導入して得られる形質転換体を培養し、培
養物から菌体を採取し、その菌体から当該ＤＮＡを含む
プラスミドを採取すれば良い。

【００６４】ＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形態で宿
主に導入される。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律
複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手できれ
ば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調
製することができる。かかるベクターの例としては、pB
R322、pUC18 、Bluescript II SK(+) 、pkk223-3、pET
16b 、pUB110、pTZ4、pC194 、HV14、TRp7、YEp7、pBS
7、pYES2.0 などのプラスミドベクターやλgt・λC 、
λgt・λB 、ρ11、φ1 、φ105 などのファージベクタ
ーが挙げられる。このうち、本発明のＤＮＡを大腸菌で
発現させるにはpBR322、pUC18 、luescript II SK(+)、
pkk223-3、pET16b、λgt・λC 、λgt・λB が好適であ
り、枯草菌で発現させるには、pUB110、pTZ4、pC194 、
ρ11、φ1およびφ105 が好適であり、一方酵母で発現
させるには、pYES2.0 が好適である。pHV14 、TRp7、YE
p7および pBS7 は、組換えＤＮＡを２種類以上の宿主内
で複製させる場合に有用である。

【００６５】ＤＮＡをかかるベクターに挿入するには、
斯界において通常利用されている一般の方法が採用され
る。具体的には、先ず、ＤＮＡを含む遺伝子と自律複製
可能なベクターとを制限酵素又は超音波により切断し、
次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片を連結する。
遺伝子およびベクターの切断にヌクレオチドに特異的に
作用るす制限酵素、とりわけII型の制限酵素、詳細には
Sau3A I、EcoR I、Hind III、BamH I、SalI、Xba I 、
Sac I 、Pst I あるいはBgl IIなどを使用すれば、ＤＮ
Ａ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮ
Ａ断片とベクター断片を連結するには，必要に応じて、
両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡ
リガーゼを作用させればよい。かくして得られる組換え
ＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを
培養することにより無限に複製可能である。

【００６６】このようにして得られる複製可能な組換え
ＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母を始めとする
適宜の宿主微生物に導入することができる。宿主が大腸
菌の場合には、宿主を組換えＤＮＡとカルシウムイオン
の存在下で培養すればよく、一方、宿主が酵母の場合に
はコンピテントセル法、プロトプラスト法やエレクトロ
ポレーション法を適用すればよい。また、宿主が枯草菌
の場合には、コンピテントセル法、プロトプラスト法や
エレクトロポレーション法を適用すればよい。

【００６７】かくして得られる形質転換体は、栄養培地
で培養すると、菌体内外に当該組換え酵素を産生する。
栄養培地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラルさらに
は必要に応じてアミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を
補足した通常一般の液体培地が使用され、個々の炭素源
としては、例えば、デンプン、デンプン加水分解物、グ
ルコース、フルクトース、スクロースやトレハロースな
どの糖源が、また、窒素源としては、例えば、アンモニ
ア、アンモニア塩、尿素、硝酸塩、ペプトン、酵母エキ
ス、脱脂ダイズ、コーンスティープリカーや肉エキスな
どの含窒素無機乃至有機物が挙げられる。形質転換体を
かかる栄養培地に接種し、栄養培地を温度20乃至50℃、
pH２乃至９に保ちつつ、通気攪拌などによる好気的条件
下で約１乃至６日間培養すれば、当該組換え型酵素を含
む培養物が得られる。この培養物は、酵素剤としてその
まま使用可能ではあるが、通常は使用に先立ち、必要に
応じて、超音波、ボルテックスや細胞溶解酵素等により
菌体を粉砕した後、濾過、遠心分離などにより酵素を菌
体又は菌体破砕物から分離し、精製する。精製には酵素
を精製するための通常の方法が採用でき、例えば、菌体
又は菌体破砕物を除去した培養物に濃縮、塩析、透析、
分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気
泳動などの１種又は２種以上を適宜組合せて適用すれば
よい。

【００６８】前述のとおり、本発明による組換え型酵素
は、D-グルコースとα-D- グルコース1-リン酸をトレハ
ロースに変換し、トレハロースをD-グルコースとα-D-
グルコース1-リン酸に変換するという作用を有する。ト
レハロースはまろやかで上品な甘味を有し、分子中に還
元性基を有しないので、着色や変質の懸念なく飲食物を
甘味付けできるという大きな利点がある。当該組換え型
酵素のこの性質を利用することにより、付加価値の高い
トレハロースに変換できることとなる。

【００６９】

【発明の効果】以上、説明したように、本発明は、D-グ
ルコースとα-D- グルコース1-リン酸をトレハロースに
変換し、トレハロースをD-グルコースとα-D- グルコー
ス1-リン酸に変換する酵素を、組換えＤＮＡ技術によ
り、かかる酵素を大規模かつ効率的に生産する道を拓く
ものである。トレハロースはまろやかで上品な甘味を有
し、分子中に還元性基を有しないので、着色や変質の懸
念なく飲食物を甘味付けできる。加えて本発明の組換え
型酵素はアミノ酸配列まで明らかにされた酵素であり、
飲食物や医薬品等への配合使用を前提とするトレハロー
スの製造に安心して使用し得るものである。

【００７０】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：21 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：N 末端フラグメント 配列 Lys Arg Pro Asn Ile Pro Gly Tyr Thr Ser Leu Thr Pro Met Trp Ala 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ala 20

【００７１】配列番号：2 配列の長さ：9 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列 Lys Gly Thr Trp Asn Ser Val Ile Lys 1 5

【００７２】配列番号：3 配列の長さ：732 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド シグナルペプチド： 1のMet 〜25のSer まで 配列 Met Ala Pro Pro His Gln Phe Gln Ser Lys Pro Ser Asp Val Ile Arg 1 5 10 15 Arg Arg Leu Ser Ser Ala Val Ser Ser Lys Arg Pro Asn Ile Pro Gly 20 25 30 Tyr Thr Ser Leu Thr Pro Met Trp Ala Gly Ile Ala Gly Ala Val Val 35 40 45 Asn Asn Asn Thr Gln Phe Glu Val Ala Ile Ser Ile His Asp Ser Val 50 55 60 Tyr Asn Thr Asp Phe Ala Ser Ser Val Val Pro Tyr Ser Pro Asn Glu 65 70 75 80 Pro Glu Ala Gln Ala Gly Ile Ile Glu Lys His Val Leu Glu Thr Leu 85 90 95 Arg Lys Phe Ser Thr Glu His Met Cys Lys Phe Leu Gly Ala Gly Val 100 105 110 Thr Val Ile Leu Leu Arg Glu Ala Pro Asn Leu Cys Thr Arg Leu Trp 115 120 125 Leu Asp Met Asp Ile Val Pro Ile Val Phe Asn Ile Lys Pro Phe His 130 135 140 Thr Asp Ser Ile Thr Arg Pro Asn Val Arg His Arg Ile Ser Ser Thr 145 150 155 160 Thr Gly Ser Tyr Val Pro Ser Gly Ala Glu Thr Pro Thr Val Tyr Tyr 165 170 175 Asp Pro Ala Gln Leu Gln Asp Pro Asn Lys Leu Ser Ala Asn Val Gln 180 185 190 Thr Arg Leu Pro Ile Pro Arg Thr Val Asp Glu Gln Ala Asp Ser Ala 195 200 205 Ala Arg Lys Cys Ile Met Tyr Phe Gly Pro Gly Asn Asn Pro Arg Leu 210 215 220 Gln Ile Gly Pro Arg Asn Gln Val Ala Val Asp Ala Gly Gly Lys Ile 225 230 235 240 His Leu Ile Asp Asp Ile Asp Glu Tyr Arg Lys Thr Val Gly Lys Gly 245 250 255 Thr Trp Asn Ser Val Ile Lys Leu Ala Asp Glu Leu Arg Glu Lys Lys 260 265 270 Ile Lys Ile Gly Phe Phe Ser Ser Thr Pro Gln Gly Gly Gly Val Ala 275 280 285 Leu Met Arg His Ala Ile Ile Arg Phe Phe Thr Ala Leu Asp Val Asp 290 295 300 Ala Ala Trp Tyr Val Pro Asn Pro Ser Pro Ser Val Phe Arg Thr Thr 305 310 315 320 Lys Asn Asn His Asn Ile Leu Gln Gly Val Ala Asp Pro Ser Leu Arg 325 330 335 Leu Thr Lys Glu Ala Ala Asp Asn Phe Asp Ser Trp Ile Leu Lys Asn 340 345 350 Gly Leu Arg Trp Thr Ala Glu Gly Gly Pro Leu Ala Pro Gly Gly Val 355 360 365 Asp Ile Ala Phe Ile Asp Asp Pro Gln Met Pro Gly Leu Ile Pro Leu 370 375 380 Ile Lys Arg Ile Arg Pro Asp Leu Pro Ile Ile Tyr Arg Ser His Ile 385 390 395 400 Glu Ile Arg Ser Asp Leu Val His Val Lys Gly Ser Pro Gln Glu Glu 405 410 415 Val Trp Asn Tyr Leu Trp Asn Asn Ile Gln His Ser Asp Leu Phe Ile 420 425 430 Ser His Pro Val Asn Lys Phe Val Pro Ser Asp Val Pro Leu Glu Lys 435 440 445 Leu Ala Leu Leu Gly Ala Ala Thr Asp Trp Leu Asp Gly Leu Ser Lys 450 455 460 His Leu Asp Ala Trp Asp Ser Gln Tyr Tyr Met Gly Glu Phe Arg Asn 465 470 475 480 Leu Cys Val Lys Glu Lys Met Asn Glu Leu Gly Trp Pro Ala Arg Glu 485 490 495 Tyr Ile Val Gln Ile Ala Arg Phe Asp Pro Ser Lys Gly Ile Pro Asn 500 505 510 Val Ile Asp Ser Tyr Ala Arg Phe Arg Lys Leu Cys Val Asp Lys Val 515 520 525 Met Glu Asp Asp Ile Pro Gln Leu Leu Leu Cys Gly His Gly Ala Val 530 535 540 Asp Asp Pro Asp Ala Ser Ile Ile Tyr Asp Gln Val Leu Gln Leu Ile 545 550 555 560 His Ala Lys Tyr Lys Glu Tyr Ala Pro Asp Ile Val Val Met Arg Cys 565 570 575 Pro Pro Ser Asp Gln Leu Leu Asn Thr Leu Met Ala Asn Ala Lys Phe 580 585 590 Ala Leu Gln Leu Ser Thr Arg Glu Gly Phe Glu Val Lys Val Ser Glu 595 600 605 Ala Leu His Ala Gly Lys Pro Val Ile Ala Cys Arg Thr Gly Gly Ile 610 615 620 Pro Leu Gln Ile Glu His Gly Lys Ser Gly Tyr Leu Cys Glu Pro Gly 625 630 635 640 Asp Asn Ala Ala Val Ala Gln His Met Leu Asp Leu Tyr Thr Asp Glu 645 650 655 Asp Leu Tyr Asp Thr Met Ser Glu Tyr Ala Arg Thr His Val Ser Asp 660 665 670 Glu Val Gly Thr Val Gly Asn Ala Ala Ala Trp Met Tyr Leu Ala Val 675 680 685 Met Tyr Val Ser Arg Gly Val Lys Leu Arg Pro His Gly Ala Trp Ile 690 695 700 Asn Asp Leu Met Arg Thr Glu Met Gly Glu Pro Tyr Arg Pro Gly Glu 705 710 715 720 Pro Arg Leu Pro Arg Gly Glu Leu His Val Gln Gly 732 725 730

【００７３】配列番号：4 配列の長さ：2817 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムDNA 配列 TGTCCCTATA TAACGTCCGT TATCTCCCCT TTCCCCTCCT CTCCCTCTCC CTCCGCACTT 60 TCAAGATGGC TCCTCCCCAC CAGTTCCAGT CCAAACCCTC CGATGTCATC CGCCGCAGGC 120 TCTCCAGCGC AGTCTCAAGC AAGCGTCCCA ATATCCCAGG GTACACCAGC CTCACTGTGA 180 GTCAATCTCC CACACATCGA GCCGCATCGT CGATCCATCT CACATCCGAT TGCTGCTAGC 240 CCATGTGGGC GGGTATCGCT GGAGCCGTGG TCAACAACAA TACCCAATTC GAAGTTGCTA 300 TCTCCATCCA CGACTCCGTT TACAACACGG ACTTTGCGTC GTCCGTTGTC CCGTACTCTC 360 CCAATGAGCC GGAGGCGCAG GCCGGTATCA TCGAGAAGCA TGTCCTCGAG ACTCTCCGCA 420 AGTTCTCCAC GGAGCATATG TGCAAGTTCC TGGGCGCCGG TGTTACTGTG ATCCTTCTCA 480 GAGAGGTGCG CAGTCTGACG TTCTTCCCTG TAACCATTGT TTGACATCCT GATGCCCCTC 540 GCACCAGGCC CCGAATCTGT GCACTCGTCT CTGGCTAGAC ATGGATATCG TTCCCATCGT 600 GTTCAACATC AAGCCTTTCC ACACAGACTC GATTACCAGG CCCAATGTCA GGCACCGCAT 660 CTCTTCCACC ACTGGTTCTT ACGTCCCGTC TGGAGCCGAG ACGCCGACTG TGTATTATGA 720 CCCCGCGCAG CTGCAAGACC CCAACAAACT GTCGGCCAAC GTGCAGACGC GGCTGCCGAT 780 ACCTCGCACA GTCGACGAAC AGGCAGACTC GGCAGCACGG AAGTGCATCA TGTATTTTGG 840 TCCTGGAAAC AACCCGCGCC TGCAGATCGG CCCGCGCAAC CAAGTTGCGG TCGACGCTGG 900 CGGGAAGATC CACCTCATCG ACGACATCGA CGAGTACCGC AAGACGGTGG GCAAGGGCAC 960 TTGGAACTCG GTCATCAAGC TTGCCGACGA ACTGCGCGAG AAGAAAATCA AGATTGGCTT 1020 CTTCTCCTCG ACGCCGCAAG GAGGTAAGCG CCGTCCCGTT TTGGATGCGG GGTAGCTCGG 1080 CTTCCCCACA TCGTCGTGCG GAGTTTGATT GCTTCTTTTC TTTCTCATTG GACGGTCGGA 1140 CCTATTATCG GCCTTTTCAG GAGGAGTTGC CCTTGTGAGT GTTCTCGTCC GGCCGGCTCT 1200 ACCTCCGGAG ATGCTGAATA TTTGACAGAT GCGTCATGCG ATCATCCGTT TCTTCACCGC 1260 GCTCGATGTC GATGCCGCCT GGTCAGTTCT TTCTTCTCTC CGTACTCTGC GGAGGTCGAG 1320 ATATCCGTGT TAACCGTCCC GATGTGGCAG GTATGTGCCG AACCCTTCAC CGTCCGTCTT 1380 CCGGACGACC AAGAACAACC ACAACATCCT CCAGGGTGTG GCTGATCCGA GTCTTCGCCT 1440 CACCAAGGAG GCGGCAGACA ACTTCGATTC CTGGATTCTC AAGAATGGGC TCCGTTGGAC 1500 TGCGGAAGGC GGACCTCTTG CCCCGGGCGG GGTCGATATT GCCTTCATTG GTTAGTCCGT 1560 TCTGCAAGCT CAGGATTTAG GTTAGCTTCC GTGTCGTGCG GTGTTGATTG CCCCGCAGAT 1620 GACCCTCAAA TGCCGGGCCT TATCCCGCTC ATCAAGCGCA TCCGGCCGGA CCTCCCGATC 1680 ATATACCGCT CGCACATCGA GATCCGAAGC GATCTTGTCC ATGTAAAGGG CTCGCCACAG 1740 GAGGAGGTGT GGAACTATCT CTGGAACAAC ATCCAACATT CGGATCTCTT CATCAGCCAC 1800 CCCGTCAACA AATTTGTTCC AAGCGATGTC CCGCTCGAGA AGCTTGCCCT CCTGGGTGCT 1860 GCTACCGACT GGTGTGTCCT ATCTATTGAC TTCTTACCTT GACGTGATAG CTAAACATGC 1920 TGTCGCAGGT TGGATGGACT GAGCAAGCAT CTCGACGCAT GGGACTCGCA GTACTACATG 1980 GGGGAGTTCC GCAACTTGTG CGTAAAAGAG AAGATGAACG AGCTCGGATG GCCTGCACGC 2040 GAATATATCG TGCAGATCGC TCGCTTCGAC CCGTCCAAGG GTATCCCGAA CGTGATCGAC 2100 TCGTACGCGC GCTTCCGGAA GCTCTGCGTC GACAAGGTCA TGGAAGACGA CATCCCACAG 2160 CTCCTGCTCT GTGGTCACGG CGCCGTGGAC GACCCCGACG CGAGCATCAT CTATGACCAG 2220 GTCTTGCAGC TGATCCACGC TAAATATAAG GAGTACGCGC CCGACATCGT CGTGATGCGC 2280 TGTCCGCCGA GTGATCAGTG TAAGTAGACT TACCCCAAGT TCGGAATGAT ACTGATGTTC 2340 TCTGTTTTGT ATACAGTACT GAACACACTC ATGGCCAATG CGAAGTTCGC GCTACAGCTC 2400 TCGACGCGTG AGGGCTTCGA AGTAAAGGTT TCAGAGGCCT TGCACGCAGG CAAGCCCGTC 2460 ATCGCATGTC GCACGGGCGG CATCCCGCTG CAGATTGAGC ATGGAAAGAG CGGATACCTC 2520 TGCGAGCCGG GCGACAACGC AGCAGTTGCG CAGCACATGC TCGACTTGTA CACGGACGAG 2580 GACCTGTATG ACACGATGAG CGAGTACGCG CGCACGCACG TCAGCGACGA GGTGGGCACC 2640 GTGGGCAACG CGGCTGCGTG GATGTACCTC GCTGTCATGT ACGTGAGTCG CGGCGTCAAG 2700 CTCCGCCCGC ACGGCGCGTG GATCAACGAC CTGATGCGTA CGGAGATGGG CGAGCCATAC 2760 CGGCCTGGAG AGCCCCGCCT CCCGCGCGGC GAACTGCATG TGCAGGGATG AGAATAG 2817

【００７４】配列番号：5 配列の長さ：2199 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 開始コドン： 1〜3 のATG ストップコドン：2197〜2199のTGA 配列 ATGGCTCCTC CCCACCAGTT CCAGTCCAAA CCCTCCGATG TCATCCGCCG CAGGCTCTCC 60 AGCGCAGTCT CAAGCAAGCG TCCCAATATC CCAGGGTACA CCAGCCTCAC TCCCATGTGG 120 GCGGGTATCG CTGGAGCCGT GGTCAACAAC AATACCCAAT TCGAAGTTGC TATCTCCATC 180 CACGACTCCG TTTACAACAC GGACTTTGCG TCGTCCGTTG TCCCGTACTC TCCCAATGAG 240 CCGGAGGCGC AGGCCGGTAT CATCGAGAAG CATGTCCTCG AGACTCTCCG CAAGTTCTCC 300 ACGGAGCATA TGTGCAAGTT CCTGGGCGCC GGTGTTACTG TGATCCTTCT CAGAGAGGCC 360 CCGAATCTGT GCACTCGTCT CTGGCTAGAC ATGGATATCG TTCCCATCGT GTTCAACATC 420 AAGCCTTTCC ACACAGACTC GATTACCAGG CCCAATGTCA GGCACCGCAT CTCTTCCACC 480 ACTGGTTCTT ACGTCCCGTC TGGAGCCGAG ACGCCGACTG TGTATTATGA CCCCGCGCAG 540 CTGCAAGACC CCAACAAACT GTCGGCCAAC GTGCAGACGC GGCTGCCGAT ACCTCGCACA 600 GTCGACGAAC AGGCAGACTC GGCAGCACGG AAGTGCATCA TGTATTTTGG TCCTGGAAAC 660 AACCCGCGCC TGCAGATCGG CCCGCGCAAC CAAGTTGCGG TCGACGCTGG CGGGAAGATC 720 CACCTCATCG ACGACATCGA CGAGTACCGC AAGACGGTGG GCAAGGGCAC TTGGAACTCG 780 GTCATCAAGC TTGCCGACGA ACTGCGCGAG AAGAAAATCA AGATTGGCTT CTTCTCCTCG 840 ACGCCGCAAG GAGGAGGAGT TGCCCTTATG CGTCATGCGA TCATCCGTTT CTTCACCGCG 900 CTCGATGTCG ATGCCGCCTG GTATGTGCCG AACCCTTCAC CGTCCGTCTT CCGGACGACC 960 AAGAACAACC ACAACATCCT CCAGGGTGTG GCTGATCCGA GTCTTCGCCT CACCAAGGAG 1020 GCGGCAGACA ACTTCGATTC CTGGATTCTC AAGAATGGGC TCCGTTGGAC TGCGGAAGGC 1080 GGACCTCTTG CCCCGGGCGG GGTCGATATT GCCTTCATTG ATGACCCTCA AATGCCGGGC 1140 CTTATCCCGC TCATCAAGCG CATCCGGCCG GACCTCCCGA TCATATACCG CTCGCACATC 1200 GAGATCCGAA GCGATCTTGT CCATGTAAAG GGCTCGCCAC AGGAGGAGGT GTGGAACTAT 1260 CTCTGGAACA ACATCCAACA TTCGGATCTC TTCATCAGCC ACCCCGTCAA CAAATTTGTT 1320 CCAAGCGATG TCCCGCTCGA GAAGCTTGCC CTCCTGGGTG CTGCTACCGA CTGGTTGGAT 1380 GGACTGAGCA AGCATCTCGA CGCATGGGAC TCGCAGTACT ACATGGGGGA GTTCCGCAAC 1440 TTGTGCGTAA AAGAGAAGAT GAACGAGCTC GGATGGCCTG CACGCGAATA TATCGTGCAG 1500 ATCGCTCGCT TCGACCCGTC CAAGGGTATC CCGAACGTGA TCGACTCGTA CGCGCGCTTC 1560 CGGAAGCTCT GCGTCGACAA GGTCATGGAA GACGACATCC CACAGCTCCT GCTCTGTGGT 1620 CACGGCGCCG TGGACGACCC CGACGCGAGC ATCATCTATG ACCAGGTCTT GCAGCTGATC 1680 CACGCTAAAT ATAAGGAGTA CGCGCCCGAC ATCGTCGTGA TGCGCTGTCC GCCGAGTGAT 1740 CAGTTACTGA ACACACTCAT GGCCAATGCG AAGTTCGCGC TACAGCTCTC GACGCGTGAG 1800 GGCTTCGAAG TAAAGGTTTC AGAGGCCTTG CACGCAGGCA AGCCCGTCAT CGCATGTCGC 1860 ACGGGCGGCA TCCCGCTGCA GATTGAGCAT GGAAAGAGCG GATACCTCTG CGAGCCGGGC 1920 GACAACGCAG CAGTTGCGCA GCACATGCTC GACTTGTACA CGGACGAGGA CCTGTATGAC 1980 ACGATGAGCG AGTACGCGCG CACGCACGTC AGCGACGAGG TGGGCACCGT GGGCAACGCG 2040 GCTGCGTGGA TGTACCTCGC TGTCATGTAC GTGAGTCGCG GCGTCAAGCT CCGCCCGCAC 2100 GGCGCGTGGA TCAACGACCT GATGCGTACG GAGATGGGCG AGCCATACCG GCCTGGAGAG 2160 CCCCGCCTCC CGCGCGGCGA ACTGCATGTG CAGGGATGA 2199

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例６の発現ベクターpYGT1 の制限
酵素地図を示す。

【表１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:865） (54)【発明の名称】 組換え型トレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子、その遺伝子を含むベクター、その遺 伝子で形質転換された形質転換体及びこの形質転換体を用いて組換え型トレハロースホスホリラ ーゼを製造する方法

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 部分アミノ酸配列として配列表配列番号
   １および配列番号２に示すアミノ酸配列または該アミノ
   酸配列に相同的なアミノ酸配列を含むトレハロースホス
   ホリラーゼをコードする遺伝子。
2. 【請求項２】 配列表配列番号３に示すアミノ酸配列ま
   たは該アミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を含むトレ
   ハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子。
3. 【請求項３】 配列表配列番号４に示す塩基配列、該塩
   基配列に相同的な塩基配列または該塩基配列に相補的な
   塩基配列を含んでなる請求項１または２に記載の遺伝
   子。
4. 【請求項４】 配列表配列番号５に示す塩基配列、該塩
   基配列に相同的な塩基配列または該塩基配列に相補的な
   塩基配列を含んでなる請求項１または２に記載の遺伝
   子。
5. 【請求項５】 遺伝子コードの縮重に基づき、配列表配
   列番号３に示すアミノ酸配列をコードし、配列表配列番
   号４に示す塩基配列の塩基の１個または２個以上を他の
   塩基で置換した請求項３に記載の遺伝子。
6. 【請求項６】 遺伝子コードの縮重に基づき、配列表配
   列番号３に示すアミノ酸配列をコードし、配列表配列番
   号５に示す塩基配列の塩基の１個または２個以上を他の
   塩基で置換した請求項４に記載の遺伝子。
7. 【請求項７】 配列表配列番号４または配列番号５で示
   される塩基配列を基にしてあるいは配列番号３で示され
   るアミノ酸配列を基にして調製されたオリゴヌクレオチ
   ドプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイ
   ズする請求項１または２に記載の遺伝子。
8. 【請求項８】 配列表配列番号３で示されるアミノ酸配
   列を有するポリペプチドと少なくとも50％同一であるポ
   リペプチドをコードする請求項１または２に記載の遺伝
   子。
9. 【請求項９】 遺伝子配列が、mRNA由来の cＤＮＡ配
   列、ゲノムＤＮＡ配列、合成ＤＮＡ配列または、これら
   の遺伝子配列を組み合わせなる遺伝子配列よりなるもの
   である請求項１〜８のいずれかに記載の遺伝子。
10. 【請求項１０】 部分アミノ酸配列として配列表配列番
    号１または２に示すアミノ酸配列または該アミノ酸配列
    に相同的なアミノ酸配列を含む組換え型トレハロースホ
    スホリラーゼ。
11. 【請求項１１】 アミノ酸配列として配列表配列番号３
    に示すアミノ酸配列または該アミノ酸配列に相同的なア
    ミノ酸配列を含む請求項10に記載の組換え型トレハロー
    スホスホリラーゼ。
12. 【請求項１２】 請求項１〜９のいずれかに記載の遺伝
    子によりコードされている組換え型トレハロースホスホ
    リラーゼ。
13. 【請求項１３】 請求項１０または１１に記載の組換え
    型トレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子を包
    含する自律複製可能なベクター。
14. 【請求項１４】 請求項１２に記載の組換え型トレハロ
    ースホスホリラーゼをコードする遺伝子を包含する自律
    複製可能なベクター。
15. 【請求項１５】 自律複製可能なベクターがプラスミド
    ベクターpYES2.0 である請求項１３または１４に記載の
    自律複製可能なベクター。
16. 【請求項１６】 請求項１３に記載の組換え型トレハロ
    ースホスホリラーゼをコードする遺伝子を包含する自律
    複製可能なベクターを宿主に導入してなる形質転換体。
17. 【請求項１７】 請求項１４に記載の組換え型トレハロ
    ースホスホリラーゼをコードする遺伝子を包含する自律
    複製可能なベクターを宿主に導入してなる形質転換体。
18. 【請求項１８】 自律複製可能なベクターがプラスミド
    ベクターpYES2.0 である請求項16または17に記載の形質
    転換体。
19. 【請求項１９】 宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌ま
    たはその他の真核生物である請求項１６、１７または１
    ８に記載の形質転換体。
20. 【請求項２０】 請求項１６〜１９のいずれかに記載の
    形質転換体を培養し、培養物中に組換え型トレハロース
    ホスホリラーゼを発現させ、これを採取することを特徴
    とする組換え型トレハロースホスホリラーゼの製造法。
21. 【請求項２１】 培養物中の組換え型トレハロースホス
    ホリラーゼを遠心分離、ろ過、濃縮、塩析、透析、分別
    沈殿、イオンクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグ
    ラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティーク
    ロマトグラフィーおよび電気泳動の少なくとも１手段を
    用いて採取する請求項２０に記載の組換え型トレハロー
    スホスホリラーゼの製造方法。