JPWO2006038647A1 - 補酵素の安定化方法およびその組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
これら試薬においても補酵素の安定性に問題を抱えており、生化学検査薬同様、試薬を長期間保存するために、補酵素を冷凍あるいは冷蔵などのなるべく低い温度条件下に保存し、補酵素を凍結乾燥状態で保存させてきた。また、緩衝液の種類を選択することで安定化させる試みも行われてきた。
また、検査薬の分野においては、微量の対象物質を測定するために、測定の高感度化が望まれている。ALPは、酵素免疫測定法で汎用される標識酵素としてよく知られているため、高感度にALPを検出する手法が望まれている。また、高感度化させる技術は、微量を測定する目的にとどまらず、検体の微量化あるいは測定の短時間化のために有効であり、この分野において最も望まれている技術である。
(1)リン酸化補酵素の安定化方法であって、少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素を共存させることを特徴とする安定化方法、
(2)乾燥状態でのリン酸化補酵素の安定化方法であって、少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素を溶液中に共存させた後に、該溶液を乾燥させることを特徴とする安定化方法、
(3)脱リン酸化反応を抑制する物質が、糖類及び/又は糖アルコールであることを特徴とする前記(1)又は(2)記載の安定化方法、
(4)脱リン酸化反応を抑制する物質が、グルコースを構成成分として含有する多糖類であることを特徴とする前記(1)又は(2)記載の安定化方法、
(5)脱リン酸化反応を抑制する物質が、グルコースを構成成分として含有する2糖類であることを特徴とする前記(4)記載の安定化方法、
(6)脱リン酸化反応を抑制する物質が、ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロースからなる群より選ばれた1種又は2種以上の組み合わせであることを特徴とする前記(5)記載の安定化方法、
(7)乾燥させる方法が風乾であることを特徴とする上記(2)記載の安定化方法、
(8)リン酸化補酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)であることを特徴とする前記(1)〜(7)記載の安定化方法、
(9)リン酸化補酵素の安定化組成物であって、少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素を含有することを特徴とする安定化組成物、
(10)乾燥されたリン酸化補酵素の安定化組成物であって、少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素を含有することを特徴とする乾燥された安定化組成物、
(11)脱リン酸化反応を抑制する物質が、糖類及び/又は糖アルコールであることを特徴とする前記(9)又は(10)記載の安定化組成物、
(12)脱リン酸化反応を抑制する物質が、グルコースを構成成分として含有する多糖類であることを特徴とする前記(9)又は(10)記載の安定化組成物、
(13)脱リン酸化反応を抑制する物質が、グルコースを構成成分として含有する2糖類であることを特徴とする前記(12)記載の安定化組成物、
(14)脱リン酸化反応を抑制する物質が、ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロースからなる群より選ばれた1種又は2種以上の組み合わせであることを特徴とする前記(13)記載の安定化組成物、
(15)リン酸化補酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)であることを特徴とする前記(9)〜(14)記載の安定化組成物、
(16)リン酸化補酵素を長期間安定化するための、脱リン酸化反応を抑制する物質の使用、
(17)少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制するための、グルコースを構成成分として含有する多糖類の使用、
(18)少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質を用いた、リン酸化補酵素の長期安定な保存方法、
に関する。
また、
(19)リン酸化補酵素、少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質を共存させることを特徴とする酵素サイクリング用のリン酸化補酵素の安定化方法、
(20)リン酸化補酵素、少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質のみを共存させることを特徴とする酵素サイクリング用のリン酸化補酵素の安定化方法、
(21)酵素サイクリング用のリン酸化補酵素の安定化方法が、32℃、3ヶ月後のリン酸化補酵素が70%以上残存し、且つ、残存リン酸化補酵素中の脱リン酸化補酵素割合が1%未満となる安定化方法である上記(19)又は(20)に記載の安定化方法、
(22)酵素サイクリング用のリン酸化補酵素の安定化方法が、32℃、6ヶ月後のリン酸化補酵素が70%以上残存し、且つ、残存リン酸化補酵素中の脱リン酸化補酵素割合が1%未満となる安定化方法である上記(19)又は(20)に記載の安定化方法、
(23)酵素サイクリング用のリン酸化補酵素の安定化方法が、32℃、1年後のリン酸化補酵素が70%以上残存し、且つ、残存リン酸化補酵素中の脱リン酸化補酵素割合が1%未満となる安定化方法である上記(19)又は(20)に記載の安定化方法、
(24)リン酸化補酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸類である
上記(19)〜(23)のいずれか1つに記載の安定化方法、
(25)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸類が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸及び/又はチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸である上記(24)に記載の安定化方法、
(26)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸及び/又はチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸である上記(25)に記載の安定化方法、
(27)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸及び/又はチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸が、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸である上記(25)に記載の安定化方法、
(28)少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質が、グルコースを構成成分として含有する多糖類である上記(19)〜(27)のいずれか1つに記載の安定化方法、
(29)グルコースを構成成分として含有する多糖類が、グルコースを構成成分として含有する2糖類である上記(28)に記載の安定化方法、
(30)グルコースを構成成分として含有する2糖類が、マルトース、スクロース、ラクトース、及びトレハロースからなる群より選ばれる1種または2種以上の組み合わせである上記(29)に記載の安定化方法、
(31)グルコースを構成成分として含有する2糖類が、マルトース、トレハロース、及びラクトースからなる群より選ばれる1種または2種以上の組み合わせである上記(30)に記載の安定化方法、
(32)グルコースを構成成分として含有する2糖類が、マルトース及び/又はラクトースである上記(30)に記載の安定化方法、
(33)グルコースを構成成分として含有する2糖類が、ラクトース及び/又はトレハロースである上記(30)に記載の安定化方法、
(34)グルコースを構成成分として含有する2糖類が、マルトース及び/又はトレハロースである上記(30)に記載の安定化方法、
(35)グルコースを構成成分として含有する2糖類が、ラクトース及び/又はスクロースである上記(30)に記載の安定化方法、
(36)グルコースを構成成分として含有する2糖類が、マルトース及び/又はスクロースである上記(30)に記載の安定化方法、
(37)グルコースを構成成分として含有する2糖類が、ラクトースである上記(30)に記載の安定化方法、
(38)グルコースを構成成分として含有する2糖類が、マルトースである上記(30)に記載の安定化方法、
(39)グルコースを構成成分として含有する2糖類が、スクロースである上記(30)に記載の安定化方法、
(40)グルコースを構成成分として含有する2糖類が、トレハトースである上記(30)に記載の安定化方法、
(41)上記(9)〜(15)に記載の安定化組成物を用いるアルカリフォスファターゼ活性測定法、
(42)酵素標識試薬が抗体または抗原が固定化された膜を透過した後に、酵素基質が自動的に添加されるように送液装置を設けたフロースルー型の簡易免疫測定装置。
(43)送液装置が水溶性フィルターを用いることを特徴とする上記(42)に記載の簡易免疫測定装置、
(44)送液装置がサイフォンを用いることを特徴とする上記(42)〜(43)に記載の簡易免疫測定装置、
(45)酵素基質が上記(9)〜(15)に記載の安定化組成物を含有する溶液であることを特徴とする上記(42)〜(44)に記載の簡易免疫測定装置、
(46)酵素標識試薬が抗体または抗原が固定化された膜を透過した後と、酵素基質が自動的に添加される前に洗浄液を添加しないことを特徴とする上記(42)〜(45)に記載の簡易免疫測定装置、
(47)微生物のリボソーム蛋白質に対する抗体を用いることを特徴とする上記(41)記載のアルカリフォスファターゼ活性測定法を利用した酵素免疫測定法、
(48)微生物がマイコプラズマニューモニア、へモフィルスインフルエンザ、ストレプトコッカスニューモニア、クラミジアニューモニア、クラミジアトラコマーティスレジオネラニューモフィラより選ばれる1種以上である上記(47)に記載の酵素免疫測定法、
(49)リボソームタンパクがL7/L12である上記(47)〜(48)に記載の酵素免疫測定法、
(50)微生物のリボソーム蛋白質に対する抗体を用いることを特徴とする上記(42)から(46)に記載の簡易免疫測定装置、
(51)微生物がマイコプラズマニューモニア、へモフィルスインフルエンザ、ストレプトコッカスニューモニア、クラミジアニューモニア、クラミジアトラコマーティスレジオネラニューモフィラより選ばれる1種以上である上記、上記(48)記載の酵素免疫測定法を利用した、(50)に記載の簡易免疫測定装置、
(52)リボソームタンパクがL7/L12である、上記(49)記載の酵素免疫測定法を利用した、上記(50)〜(51)記載の酵素免疫測定法、
(53)上記(1)〜(8)において、さらにクエン酸塩を共存させることを特徴とする安定化方法、
(54)クエン酸塩が、クエン酸ナトリウムである上記(53)に記載の安定化方法、
(55)上記(9)〜(15)において、さらにクエン酸塩を共存させることを特徴とする安定化組成物、
(56)クエン酸塩が、クエン酸ナトリウムである上記(55)に記載の安定化組成物、
(57)上記(16)、又は(17)において、さらにクエン酸塩の使用、
(58)クエン酸塩が、クエン酸ナトリウムである上記(57)に記載の使用、
(59)上記(18)において、さらにクエン酸塩を用いる、リン酸化補酵素の長期安定な保存方法、
(60)上記(19)〜(40)において、さらにクエン酸塩を共存させることを特徴とする安定化方法、
(61)クエン酸塩が、クエン酸ナトリウムである上記(60)に記載の安定化方法、
(62)上記(55)又は(56)に記載の安定化組成物を用いるアルカリフォスファターゼ活性測定法、
(63)酵素基質が、上記(55)又は(56)に記載の安定化組成物を含有する溶液であることを特徴とする上記(42)〜(44)に記載の簡易免疫測定装置、
(64)酵素標識試薬が抗体または抗原が固定化された膜を透過した後と、酵素基質が自動的に添加される前に洗浄液を添加しないことを特徴とする上記(63)に記載の簡易免疫測定装置、
(65)微生物のリボソーム蛋白質に対する抗体を用いることを特徴とする上記(62)記載のアルカリフォスファターゼ活性測定法を利用した酵素免疫測定法、
(66)微生物がマイコプラズマニューモニア、へモフィルスインフルエンザ、ストレプトコッカスニューモニア、クラミジアニューモニア、クラミジアトラコマーティスレジオネラニューモフィラより選ばれる1種以上である上記(65)に記載の酵素免疫測定法、
(67)リボソームタンパクがL7/L12である上記(66)又は(67)に記載の酵素免疫測定法、
(68)微生物のリボソーム蛋白質に対する抗体を用いることを特徴とする上記(63)又は(64)に記載の簡易免疫測定装置、
(69)微生物がマイコプラズマニューモニア、へモフィルスインフルエンザ、ストレプトコッカスニューモニア、クラミジアニューモニア、クラミジアトラコマーティスレジオネラニューモフィラより選ばれる1種以上である上記(68)に記載の簡易免疫測定装置、
(70)リボソームタンパクがL7/L12である上記(50)〜(51)に記載の酵素免疫測定法、
に関する。
また、
(71)少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素のみを共存させることを特徴とする上記(1)に記載の安定化方法、
(72)少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素のみを共存させることを特徴とする上記(2)に記載の安定化方法、
(73)脱リン酸化反応を抑制する物質が、糖類及び/又は糖アルコールであることを特徴とする前記(71)又は(72)に記載の安定化方法、
(74)脱リン酸化反応を抑制する物質が、グルコースを構成成分として含有する多糖類であることを特徴とする前記(71)又は(72)に記載の安定化方法、
(75)脱リン酸化反応を抑制する物質が、グルコースを構成成分として含有する2糖類であることを特徴とする前記(74)に記載の安定化方法、
(76)脱リン酸化反応を抑制する物質が、ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロースからなる群より選ばれた1種又は2種以上の組み合わせであることを特徴とする前記(75)記載の安定化方法、
(77)乾燥させる方法が風乾であることを特徴とする(72)記載の安定化方法、
(78)リン酸化補酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)であることを特徴とする前記(71)から(77)記載の安定化方法、
(79)少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素のみを含有することを特徴とする上記(9)記載の安定化組成物、
(80)少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素をのみ含有することを特徴とする上記(10)記載の安定化組成物、
(81)脱リン酸化反応を抑制する物質が、糖類及び/又は糖アルコールであることを特徴とする前記(79)又は(80)記載の安定化組成物、
(82)脱リン酸化反応を抑制する物質が、グルコースを構成成分として含有する多糖類であることを特徴とする前記(79)又は(80)記載の安定化組成物、
(83)脱リン酸化反応を抑制する物質が、グルコースを構成成分として含有する2糖類であることを特徴とする前記(82)記載の安定化組成物、
(84)脱リン酸化反応を抑制する物質が、ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロースからなる群より選ばれた1種又は2種以上の組み合わせであることを特徴とする前記(83)記載の安定化組成物、
(85)リン酸化補酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)であることを特徴とする前記(79)〜(84)記載の安定化組成物、
(86)上記(79)〜(85)記載の安定化組成物を用いるアルカリフォスファターゼ活性測定法、
(87)酵素基質が上記(79)〜(85)記載の安定化組成物を含有する溶液であることを特徴とする上記(42)〜(44)記載の簡易免疫想定装置、
(88)上記(71)〜(78)において、さらにクエン酸塩のみを共存させることと特徴とする安定化方法、
(89)クエン酸塩が、クエン酸ナトリウムである上記(88)に記載の安定化方法、
(90)上記(79)〜(85)において、さらにクエン酸塩のみを共存させることと特徴とする安定化組成物、
(91)クエン酸塩が、クエン酸ナトリウムである上記(90)に記載の安定化組成物、
(92)リン酸化補酵素を長期間安定化するための、脱リン酸化反応を抑制する物質、及びクエン酸のみの使用、
(93)少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制するための、グルコースを構成成分として含有する多糖類、及びクエン酸のみの使用、
(94)クエン酸塩が、クエン酸ナトリウムである上記(92)又は(93)に記載の使用、
(95)少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質のみを用いた、リン酸化補酵素の長期安定な保存方法、
(96)少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びクエン酸塩のみを用いた、リン酸化補酵素の長期安定な保存方法、
に関する。
保存する際の脱リン酸化反応を抑制する物質の濃度範囲は特に規定されず、上限値としては飽和溶解濃度以下であれば何でも良い。下限値としては、0.1%以上が好ましく、0.5%以上がさらに好ましく、1%以上が特に好ましい。
本発明のリン酸化補酵素の安定化組成物としては、前記の安定化方法に従って、少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素を含有する組成物とした調製したものであればよい。該組成物に、さらに前記緩衝液、前記防腐剤等を含有させた組成物も好ましい。該組成物は液状であっても乾燥状であってもよいが、乾燥状が好ましい。乾燥状組成物は、乾燥品を混合して得てもよいが、一度溶液状に調製した後、これを乾燥させたものが好ましい。乾燥方法は特に規定されるものではないが、例えば凍結乾燥、風乾、加熱乾燥、減圧乾燥等が挙げられ、好ましくは凍結乾燥、風乾が挙げられ、特に好ましくは風乾が挙げられる。乾燥時の温度はリン酸化補酵素が分解しない条件下であれば特に規定されず、−80℃から100℃であれば良く、好ましくは−50℃から80℃が良く、最適には、−50℃から70℃が良い。また、乾燥時間は、乾燥条件に応じて、水分の乾燥度合いを指標として適宜設定すればよい。水分の乾燥度合いの指標としては、その含水量が低ければ低いほど良いが、好ましくは10%以下であるのが良く、さらに好ましくは5%以下が良く、最適には3%以下が良く、1%以下が大変に好ましい。
このとき、膜上に酵素標識抗体を含む複合体を効率よく形成させるために、酵素標識抗体液が膜との接触時間は長いほど良く、一方洗浄液や酵素基質液は操作性の観点から、より短い時間にて膜を透過するのが望ましい。そのため、測定対象物質、酵素標識抗体は一定の時間をおいて添加し、洗浄液、酵素基質液等は余り時間をおかずに順に添加する方法が普通で、この方法は操作性の観点から問題があった。
水溶性の性質を持つフィルム状のものとしてはポリビニルアルコール膜、プルラン膜、ヒドロキシプロピルセルロース膜などが挙げられ、好ましくはポリビニルアルコール膜が良い。これら水溶性フィルターを筒状の酵素基質溶液添加槽下部に設け、酵素基質溶液が添加されると、水溶性フィルターを溶解させながら、一定時間は液が流れず、その後に液が流れ出す。液の流れない時間は10秒から10分の間が良く、好ましくは30秒から5分の間が望ましい。
これらを用いることで、酵素基質液が確認窓へ添加される前に洗浄液を同様に添加することも簡単であるが、必ずしも必要ではなく、測定対象物質が存在しないときに認められるバックグラウンドと必要とされる感度に合わせて設定すると良いが、操作性やコストの面から洗浄液を添加しないで用いるのが好ましい。
インフルエンザ抗原浮遊液を簡易型免疫測定装置の確認窓へ適当量滴下し、間を置かずに酵素サイクリング反応液を酵素基質溶液添加槽へ添加し、数分後に確認窓にて抗原の有無を色素の沈着にて目視判定するだけでよく、インフルエンザ抗原浮遊液と酵素サイクリング反応液の添加以後、特別の操作が無くとも判定できる。
[実施例1]
5%ラクトースを含有する20mMのクエン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)中に、補酵素としてNADP(オリエンタル酵母社製)を1.25mMとなるように溶解させて調製した溶液を調製した。またコントロールとして、20mMのクエン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)中に、NADPを1.25mMとなるように溶解させて調製した溶液を調製し、合計5種類の溶液を調製した。この溶液をマイクロチューブ中にて20μlずつ分注し、30℃湿度15%の条件下で5時間乾燥させた。乾燥後、マイクロチューブごと、乾燥剤を入れたアルミ袋にて、4℃、25℃、32℃、37℃、42℃にて保存した。
酵素サイクリング反応液として、100mMジエタノールアミン−HCl(pH9.5)、0.0125%ニトロブルーテトラゾリウム、1mMコール酸、50mM塩化ナトリウム、1mM塩化マグネシウム、Bacillus megaterium由来ジアフォラーゼ(旭化成ファーマ株式会社製)6.6U/mlを含む溶液を調製した。この溶液1mlをNADPが乾燥保存されていたマイクロチューブに添加し、NADPを攪拌して再溶解させた。再溶解させたNADPを含むサイクリング反応液500μlを試験管中にて37℃3分間加温し、10mM PIPES (pH8.5)に溶解した1777.6U/mlのBacillus sphaericus由来12αハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(旭化成ファーマ株式会社製)を5μl添加して37℃5分間反応させた。0.5%のドデシル硫酸ナトリウム溶液を250μl添加して反応を停止させ、反応液を550nmの吸光度を測定した。
(2)にて再溶解させたNADPを含むサイクリング反応液500μlを試験管中にて37℃3分間加温し、10mM PIPES (pH8.5)に溶解した1777.6U/mlのBacillus sphaericus由来12αハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(旭化成ファーマ株式会社製)を5μlと50mU/mlの小牛小腸由来のアルカリフォスファターゼ(ロシュ社製)5μlを同時に添加して37℃5分間反応させた。0.5%のドデシル硫酸ナトリウム溶液を250μl添加して反応を停止させ、反応液の550nmの吸光度を測定した。得られた測定値からそれぞれの実験条件で得られた(2)でのバックグランドの値を差し引き、アルカリフォスファターゼ反応によって得られた活性値とした。
乾燥させて保存したNADPに、10mMのPIPES(pH8)1mlを添加して再溶解させ、このうちの一部をとり蒸留水にて10倍希釈した。(2)で調製した酵素サイクリング反応液に小牛小腸由来のアルカリフォスファターゼを8U/mlとなるように調製した溶液1mlに、先に調製しておいた希釈したNADPの再溶解液20μlを添加し37℃5分間反応させた。0.5%のドデシル硫酸ナトリウム溶液を250μl添加して反応を停止させ、反応液を550nmの吸光度を測定し、NADPの保存開始時の測定値を100%として、残存%を計算した。
実施例1記載の5%ラクトースの代わりに10%トレハロース、10%マルトース、10%スクロースをそれぞれ含有する20mMのクエン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)中に、補酵素としてNADP(オリエンタル酵母社製)を1.25mMとなるように溶解させて調製した溶液3種を調製し、同様に実験した。
実施例1記載の5%ラクトースの代わりに、0.1%、1%、5%、10%、30%、60%の濃度で調製したトレハロースをそれぞれ含有する20mMのクエン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)中に、補酵素としてNADP(オリエンタル酵母社製)を1.25mMとなるように溶解させて調製した溶液6種を調製し、同様に実験した。
その結果、表3−1から表3−3に示すように、トレハロースの濃度が0.1%から60%の間において、実験コントロールと比較して良好な安定性が得られた。
実施例1記載の5%ラクトースの代わりに、0.1%、0.5%、1%、5%、15%の濃度で調製したラクトースをそれぞれ含有する20mMのクエン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)中に、補酵素としてNADP(オリエンタル酵母社製)を1.25mMとなるように溶解させて調製した溶液5種を調製し、同様に実験した。
その結果、表4−1から表4−3に示すように、ラクトースの濃度が、0.1%から15%の間において、実験コントロールと比較して良好な安定性が得られた。
実施例1記載の5%ラクトースの代わりに、条件1:10%ラクトースと20%トレハロース、条件2:10%ラクトースと20%マルトース、条件3:20%トレハロースと20%マルトース、条件4:10%ラクトースと20%トレハロースと20%マルトース、をそれぞれ含有する20mMのクエン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)中に、補酵素としてNADP(オリエンタル酵母社製)を1.25mMとなるように溶解させて調製した溶液4種を調製し、同様に実験した。
その結果、表5−1から表5−3に示すように、いずれの組み合わせ条件においても、実験コントロールと比較して良好な安定性が得られた。
実施例1記載の5%ラクトース、実施例2記載の10トレハロースをそれぞれ含有する20mMのクエン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)中に、補酵素としてNADP(オリエンタル酵母社製)を1.25mMとなるように溶解させて調製した溶液を2種調製し、この溶液をμチューブ中にて20μlずつ分注し、30℃湿度15%の条件下で5時間乾燥させた。乾燥後、マイクロチューブごと、乾燥剤を入れたアルミ袋にて、4℃、25℃、35℃にて6ヶ月間保管した後のバックグラウンド、ALP活性、及びNADP残存量を測定した。
その結果、表6−1から表6−3に示すように、5%ラクトース、10%トレハロースともにいずれの条件も実験コントロールに比較して良好な安定性を示した。
抗A型インフルエンザウイルスモノクロナル抗体(Fitzgerald社製)2種類のうち1種類を25mm × 30mmのニトロセルロース膜(ワットマン社製)に2mg/mlの抗
体溶液1μlをスポットし、42℃30分乾燥させた。乾燥させたニトロセルロース膜を吸水パッド上にのせ、スポット部が蓋に予め開口させておいた確認窓と一致するように上蓋をした。図1に示すポリビニルアルコールを材質とした水溶性フィルターKC40(アイセロ化学社製)を酵素基質溶液添加槽の下部に取り付け、酵素基質注入口を簡易免疫測定装置の上蓋開口部に取り付け簡易免疫測定装置を作成した。
抗A型インフルエンザウイルスモノクロナル抗体の別の1種類0.15mgを市販のアルカリフォスファターゼ標識キットにて標識し、抗A型インフルエンザウイルス酵素標識抗体を得た。この標識抗体を、2%BSAを含むTris−HCl緩衝液(pH7.5)にて4000倍希釈し、酵素標識抗体希釈液を調製した。
A型インフルエンザウイルス抗原H3N2型0.75mg/ml(HyTest社製)を0.2%BSA、0.1%TritonX−100を含有するPBSにて0.1μg/mlとなるように希釈し、この50μLを綿棒に染み込ませて模擬的な検体とした。実験対照として希釈液50μLを染み込ませた綿棒を用いた。
結果
目視判定
H3N2抗原添加 +
実験対照 −
以上のとおり、インフルエンザ抗原を添加した場合にのみ陽性と判定され、図1に示す簡易免疫測定装置を用いて簡便に検査できることが実証された。
実施例6に従い、抗A型インフルエンザウイルスモノクロナル抗体をニトロセルロースメンブランへ固定化し上蓋をした。酵素基質溶液添加槽として、図2に示すサイフォン構造の上流部に、40%スクロース溶液を染み込ませて乾燥させた濾紙を取り付け、酵素基質注入口を簡易免疫測定装置の上蓋開口部に取り付け簡易免疫測定装置を作成した。以後の操作を実施例6と同様に行い、ニトロセルロースメンブラン上に青い色素の有無を目視にて確認した。
結果
目視判定
H3N2抗原添加 +
実験対照 −
以上のとおり、インフルエンザ抗原を添加した場合にのみ陽性と判定され、図2に示 す簡易免疫測定装置を用いて簡便に検査できることが実証された。
Claims (23)
- リン酸化補酵素の安定化方法であって、少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素を共存させることを特徴とする安定化方法。
- 乾燥状態でのリン酸化補酵素の安定化方法であって、少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素を溶液中に共存させた後に、該溶液を乾燥させることを特徴とする安定化方法。
- 脱リン酸化反応を抑制する物質が、糖類及び/又は糖アルコールであることを特徴とする請求項1又は2記載の安定化方法。
- 脱リン酸化反応を抑制する物質が、グルコースを構成成分として含有する多糖類であることを特徴とする請求項1又は2記載の安定化方法。
- 脱リン酸化反応を抑制する物質が、グルコースを構成成分として含有する2糖類であることを特徴とする請求項4記載の安定化方法。
- 脱リン酸化反応を抑制する物質が、ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロースからなる群より選ばれた1種又は2種以上の組み合わせであることを特徴とする請求項5記載の安定化方法。
- 乾燥させる方法が風乾であることを特徴とする請求項2記載の安定化方法。
- リン酸化補酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)であることを特徴とする請求項1〜7記載の安定化方法。
- リン酸化補酵素の安定化組成物であって、少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素を含有することを特徴とする安定化組成物。
- 乾燥されたリン酸化補酵素の安定化組成物であって、少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素を含有することを特徴とする乾燥された安定化組成物。
- 脱リン酸化反応を抑制する物質が、糖類及び/又は糖アルコールであることを特徴とする請求項9又は10記載の安定化組成物。
- 脱リン酸化反応を抑制する物質が、グルコースを構成成分として含有する多糖類であることを特徴とする請求項9又は10記載の安定化組成物。
- 脱リン酸化反応を抑制する物質が、グルコースを構成成分として含有する2糖類であることを特徴とする請求項12記載の安定化組成物。
- 脱リン酸化反応を抑制する物質が、ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロースからなる群より選ばれた1種又は2種以上の組み合わせであることを特徴とする請求項13記載の安定化組成物。
- リン酸化補酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)であることを特徴とする請求項9〜14記載の安定化組成物。
- リン酸化補酵素を長期間安定化するための、脱リン酸化反応を抑制する物質の使用。
- 少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制するための、グルコースを構成成分として含有する多糖類の使用。
- 少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質を用いた、リン酸化補酵素の長期安定な保存方法。
- 酵素標識試薬が抗体または抗原が固定化された膜を透過した後に、酵素基質が自動的に添加されるように送液装置を設けたフロースルー型の簡易免疫測定装置。
- 送液装置が水溶性フィルターを用いることを特徴とする請求項19記載の簡易免疫測定装置。
- 送液装置がサイフォンを用いることを特徴とする請求項19〜20記載の簡易免疫測定装置。
- 酵素基質が請求項9〜15記載の安定化組成物を含有する溶液であることを特徴とする請求項19〜21記載の簡易免疫測定装置。
- 酵素標識試薬が抗体または抗原が固定化された膜を透過した後と、酵素基質が自動的に添加される前に洗浄液を添加しないことを特徴とする請求項19〜22記載の簡易免疫測定装置。
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