JPH06153991A - ホスファターゼ測定試薬 - Google Patents
ホスファターゼ測定試薬Info
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- JPH06153991A JPH06153991A JP4308931A JP30893192A JPH06153991A JP H06153991 A JPH06153991 A JP H06153991A JP 4308931 A JP4308931 A JP 4308931A JP 30893192 A JP30893192 A JP 30893192A JP H06153991 A JPH06153991 A JP H06153991A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2326/00—Chromogens for determinations of oxidoreductase enzymes
- C12Q2326/90—Developer
- C12Q2326/96—4-Amino-antipyrine
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸またはその還元型を有する試薬に、ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドまたはその還元型の酵素的サイク
リングを用いたシグナル増幅系試薬の少なくとも一成分
を配合してなるホスファターゼ測定試薬。 【効果】 従来は用時調整が必要であったシグナル増幅
系試薬を、使用可能な状態で長期間保存することが可能
となり、試薬調整の手間が省ける。
酸またはその還元型を有する試薬に、ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドまたはその還元型の酵素的サイク
リングを用いたシグナル増幅系試薬の少なくとも一成分
を配合してなるホスファターゼ測定試薬。 【効果】 従来は用時調整が必要であったシグナル増幅
系試薬を、使用可能な状態で長期間保存することが可能
となり、試薬調整の手間が省ける。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、ホスファターゼ測定
試薬に関するものである。さらに詳しくは、この発明
は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、Ｎ
ＡＤと略記する）またはその還元型（以下、ＮＡＤＨと
略記する）の酸化還元サイクリングに伴うシグナル増幅
系を用いたホスファターゼの酵素的測定のための試薬に
関するものである。
試薬に関するものである。さらに詳しくは、この発明
は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、Ｎ
ＡＤと略記する）またはその還元型（以下、ＮＡＤＨと
略記する）の酸化還元サイクリングに伴うシグナル増幅
系を用いたホスファターゼの酵素的測定のための試薬に
関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ＮＡＤおよびその還元型であるＮＡＤＨ
は生体含量の最も多い補酵素であり、水素原子の授受を
介して可逆的に変化することにより多くの脱水素酵素の
酸化還元反応に関与している。これらのＮＡＤまたはＮ
ＡＤＨは、その酵素的サイクリングを用いたシグナル増
幅系により高感度に検出することができるが、このシグ
ナル増幅系はまた、免疫測定法や組織染色の分野におけ
るホスフォターゼ検出系に広く応用されている。特にア
ルカリホスファターゼの測定では、比色法にもかかわら
ず蛍光法や発色法と同等の検出感度が得られることか
ら、免疫測定法の分野において、非常にすぐれた方法と
して位置づけられている（石川他編、“免疫測定法 第
３版”第５８−６０頁、医学書院刊）。
は生体含量の最も多い補酵素であり、水素原子の授受を
介して可逆的に変化することにより多くの脱水素酵素の
酸化還元反応に関与している。これらのＮＡＤまたはＮ
ＡＤＨは、その酵素的サイクリングを用いたシグナル増
幅系により高感度に検出することができるが、このシグ
ナル増幅系はまた、免疫測定法や組織染色の分野におけ
るホスフォターゼ検出系に広く応用されている。特にア
ルカリホスファターゼの測定では、比色法にもかかわら
ず蛍光法や発色法と同等の検出感度が得られることか
ら、免疫測定法の分野において、非常にすぐれた方法と
して位置づけられている（石川他編、“免疫測定法 第
３版”第５８−６０頁、医学書院刊）。
【０００３】この測定法は、ホスファターゼの触媒作用
によってニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
（以下、ＮＡＤＰと略記する）またはその還元型（以
下、ＮＡＤＰＨと略記する）を、それぞれＮＡＤまたは
ＮＡＤＨに変化させ、このＮＡＤまたはＮＡＤＨをその
シグナル増幅系により検出することによってホスファタ
ーゼの存在を高感度に測定しようとするものである。
によってニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
（以下、ＮＡＤＰと略記する）またはその還元型（以
下、ＮＡＤＰＨと略記する）を、それぞれＮＡＤまたは
ＮＡＤＨに変化させ、このＮＡＤまたはＮＡＤＨをその
シグナル増幅系により検出することによってホスファタ
ーゼの存在を高感度に測定しようとするものである。
【０００４】たとえば、ホスファターゼの基質としてＮ
ＡＤＰを用いた場合には、以下にその反応式（化１）を
示したようにホスファターゼの触媒作用によりＮＡＤが
生じ、このＮＡＤは、アルコール脱水素酵素（以下、Ａ
ＤＨと略記する）とその基質であるエタノール存在下
で、ＡＤＨによるエタノールからアセトアルデヒドへの
酸化反応に補酵素として作用し、その際にＮＡＤＨへと
還元する。さらにこのＮＡＤＨは、テトラゾリウム系色
素とその還元酵素ジアホラーゼ存在下で再びＮＡＤへと
酸化するが、同時にテトラゾリウム系色素が還元されて
ホルマザンが生じ、発色シグナルが得られる。ＮＡＤ
は、このような条件下で酸化還元を繰り返すため、シグ
ナル強度は徐々に大きくなる（C.H.Self他，Clinica Ac
ta 第１４８巻，第１１９−１２４頁，１９８５年）。
ＡＤＰを用いた場合には、以下にその反応式（化１）を
示したようにホスファターゼの触媒作用によりＮＡＤが
生じ、このＮＡＤは、アルコール脱水素酵素（以下、Ａ
ＤＨと略記する）とその基質であるエタノール存在下
で、ＡＤＨによるエタノールからアセトアルデヒドへの
酸化反応に補酵素として作用し、その際にＮＡＤＨへと
還元する。さらにこのＮＡＤＨは、テトラゾリウム系色
素とその還元酵素ジアホラーゼ存在下で再びＮＡＤへと
酸化するが、同時にテトラゾリウム系色素が還元されて
ホルマザンが生じ、発色シグナルが得られる。ＮＡＤ
は、このような条件下で酸化還元を繰り返すため、シグ
ナル強度は徐々に大きくなる（C.H.Self他，Clinica Ac
ta 第１４８巻，第１１９−１２４頁，１９８５年）。
【０００５】
【化１】
【０００６】なお、以上のような反応系においては、Ｎ
ＡＤ→ＮＡＤＨの還元反応に関与する酵素は、ＮＡＤを
認識して、ＮＡＤＰは認識しない酵素が必要であり、通
常は、その特異性の高さから、上記のＡＤＨが用いられ
ている。また、ホスファターゼの基質としてＮＡＤＰＨ
を用いた場合にも、以下の反応式（化２）に示したよう
に、ＮＡＤＰと同じ原理で発色が生じ、その強度を増幅
させる。この場合に、ＮＡＤＨ→ＮＡＤの酸化反応に関
与する酵素は、ＮＡＤＨのみを認識してＮＡＤＰＨは認
識しない酵素が必要であり、通常は、ＮＡＤＨ依存性ジ
アホラーゼが用いられている（F.J.Dhahir他，Clinical
Chemistry 第３８巻（２），第２２７−２３２頁，１
９９２年）。
ＡＤ→ＮＡＤＨの還元反応に関与する酵素は、ＮＡＤを
認識して、ＮＡＤＰは認識しない酵素が必要であり、通
常は、その特異性の高さから、上記のＡＤＨが用いられ
ている。また、ホスファターゼの基質としてＮＡＤＰＨ
を用いた場合にも、以下の反応式（化２）に示したよう
に、ＮＡＤＰと同じ原理で発色が生じ、その強度を増幅
させる。この場合に、ＮＡＤＨ→ＮＡＤの酸化反応に関
与する酵素は、ＮＡＤＨのみを認識してＮＡＤＰＨは認
識しない酵素が必要であり、通常は、ＮＡＤＨ依存性ジ
アホラーゼが用いられている（F.J.Dhahir他，Clinical
Chemistry 第３８巻（２），第２２７−２３２頁，１
９９２年）。
【０００７】
【化２】
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従来、ＮＡＤまたはＮ
ＡＤＨのシグナル増幅系を利用してホスフォターゼを測
定する場合には、ホスフォターゼの触媒反応に関与する
試薬と、シグナル増幅反応に関与する試薬とが用いられ
ている。すなわち、ホスファターゼの基質となるＮＡＤ
ＰまたはＮＡＤＰＨを主成分とする試薬と、ＮＡＤまた
はＮＡＤＨの酵素的サイクリングおよびシグナル増幅を
促進させるための酵素およびその基質を成分とする試薬
である。
ＡＤＨのシグナル増幅系を利用してホスフォターゼを測
定する場合には、ホスフォターゼの触媒反応に関与する
試薬と、シグナル増幅反応に関与する試薬とが用いられ
ている。すなわち、ホスファターゼの基質となるＮＡＤ
ＰまたはＮＡＤＰＨを主成分とする試薬と、ＮＡＤまた
はＮＡＤＨの酵素的サイクリングおよびシグナル増幅を
促進させるための酵素およびその基質を成分とする試薬
である。
【０００９】しかしながら、シグナル増幅反応試薬は、
その成分を全て混合して保存した場合には非特異的発色
（以下、試薬ブランクと記載することがある）を生じる
ため、通常は、その形態が二つの組成に分けられてお
り、使用の際にそれらを混合し調製しなければならなか
った。この発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされた
ものであり、従来の測定試薬の欠点を解消し、使用可能
な状態で長期間保存することのできる利便性に優れたホ
スファターゼ測定試薬を提供することを目的としてい
る。
その成分を全て混合して保存した場合には非特異的発色
（以下、試薬ブランクと記載することがある）を生じる
ため、通常は、その形態が二つの組成に分けられてお
り、使用の際にそれらを混合し調製しなければならなか
った。この発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされた
ものであり、従来の測定試薬の欠点を解消し、使用可能
な状態で長期間保存することのできる利便性に優れたホ
スファターゼ測定試薬を提供することを目的としてい
る。
【００１０】
【課題を解決するための手段】この発明の発明者等は、
上記の課題を解決するために鋭意検討の結果、シグナル
増幅反応試薬の一成分を、ホスファターゼ反応試薬に添
加することにより、これらの試薬を調製後に保存して
も、試薬ブランクが抑制されることを見い出し、この発
明を完成させた。
上記の課題を解決するために鋭意検討の結果、シグナル
増幅反応試薬の一成分を、ホスファターゼ反応試薬に添
加することにより、これらの試薬を調製後に保存して
も、試薬ブランクが抑制されることを見い出し、この発
明を完成させた。
【００１１】すなわち、この発明は、ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドリン酸またはその還元型を有する
試薬に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは
その還元型の酵素的サイクリングを用いたシグナル増幅
系試薬の少なくとも一成分を配合してなるホスファター
ゼ測定試薬を提供する。以下、この発明の構成および好
ましい態様についてさらに詳しく説明する。
デニンジヌクレオチドリン酸またはその還元型を有する
試薬に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは
その還元型の酵素的サイクリングを用いたシグナル増幅
系試薬の少なくとも一成分を配合してなるホスファター
ゼ測定試薬を提供する。以下、この発明の構成および好
ましい態様についてさらに詳しく説明する。
【００１２】この発明のホスファターゼ測定試薬は、そ
の全成分として、ＮＡＤＰ（またはＮＡＤＰＨ）、脱水
素酵素、脱水素酵素の基質、ジアホラーゼ、テトラゾリ
ウム系色素、界面活性剤、および緩衝液等からなり、そ
の使用前の試薬形態としてこれらの各成分が二分化さ
れ、各々混合されている。これら２種類の試薬組成は、
たとえば次のようにすることができる： （１）緩衝液中にＮＡＤＰ（またはＮＡＤＰＨ）と脱水
素酵素の基質を含有する試薬（Ｉ）と、緩衝液中に脱水
素酵素、テトラゾリウム系色素、ジアホラーゼ、界面活
性剤を含有する試薬（II）； （２）緩衝液中にＮＡＤＰ（またはＮＡＤＰＨ）とジア
ホラーゼを含有する試薬（Ｉ）と、緩衝液中に脱水素酵
素、脱水素酵素の基質、テトラゾリウム系色素、界面活
性剤を含有する試薬（II）。
の全成分として、ＮＡＤＰ（またはＮＡＤＰＨ）、脱水
素酵素、脱水素酵素の基質、ジアホラーゼ、テトラゾリ
ウム系色素、界面活性剤、および緩衝液等からなり、そ
の使用前の試薬形態としてこれらの各成分が二分化さ
れ、各々混合されている。これら２種類の試薬組成は、
たとえば次のようにすることができる： （１）緩衝液中にＮＡＤＰ（またはＮＡＤＰＨ）と脱水
素酵素の基質を含有する試薬（Ｉ）と、緩衝液中に脱水
素酵素、テトラゾリウム系色素、ジアホラーゼ、界面活
性剤を含有する試薬（II）； （２）緩衝液中にＮＡＤＰ（またはＮＡＤＰＨ）とジア
ホラーゼを含有する試薬（Ｉ）と、緩衝液中に脱水素酵
素、脱水素酵素の基質、テトラゾリウム系色素、界面活
性剤を含有する試薬（II）。
【００１３】このような組成からなるこの発明の測定試
薬を用いてホスファターゼを検出、測定する場合には、
上記（１）または（２）に例示した２種類の試薬（Ｉ）
（II）を混合して測定試薬を調製し、これにホスファタ
ーゼを含む検体を混和して、テトラゾリウム系色素の還
元によって生じるホルマザンの吸光度変化を比色定量す
ればよい。比色定量法としては、たとえば、吸光度変化
を経時的に測定するレートアッセイ法、あるいは酵素的
サイクリングを一定時間行なった後、酸を加え反応を停
止させて吸光度を測定するエンドポイントアッセイ法等
が挙げられる。いずれの方法でも、市販の分光光度計を
用いて吸光度測定ができる。
薬を用いてホスファターゼを検出、測定する場合には、
上記（１）または（２）に例示した２種類の試薬（Ｉ）
（II）を混合して測定試薬を調製し、これにホスファタ
ーゼを含む検体を混和して、テトラゾリウム系色素の還
元によって生じるホルマザンの吸光度変化を比色定量す
ればよい。比色定量法としては、たとえば、吸光度変化
を経時的に測定するレートアッセイ法、あるいは酵素的
サイクリングを一定時間行なった後、酸を加え反応を停
止させて吸光度を測定するエンドポイントアッセイ法等
が挙げられる。いずれの方法でも、市販の分光光度計を
用いて吸光度測定ができる。
【００１４】この発明の測定試薬成分のうち、ＮＡＤＰ
またはＮＡＤＰＨは、シグナル増幅反応に関与する酵素
への反応成分を含まないものを用い、その試薬中の濃度
は、０．１〜１０００ｍＭ、より好ましくは１〜１０ｍ
Ｍとする。脱水素酵素としては、たとえば、アミノ酸脱
水素酵素やＡＤＨ等、ＮＡＤ（またはＮＡＤＨ）に対し
て特異性の高いものを使用する。このうち、アミノ酸脱
水素酵素は、たとえばアラニン脱水素酵素（以下、Ａｌ
ａＤＨと略記する）、ロイシン脱水素酵素（以下、Ｌｅ
ｕＤＨと略記する）、グルタミン酸脱水素酵素等であ
る。また、ＡＤＨは、その由来に特段の制限はなく、た
とえばパン酵母やザイモモナス等に由来するものを適宜
に用いることができる。これらの脱水素酵素の試薬中濃
度は、０．０１〜１０００単位／ｍｌ、より好ましくは
０．１〜１００単位／ｍｌとする。なお、脱水素酵素の
活性１単位とはｐＨ９．０、３０℃で１分間あたり相当
する基質を１μｍｏｌ酸化する酵素量と定義されるもの
である。
またはＮＡＤＰＨは、シグナル増幅反応に関与する酵素
への反応成分を含まないものを用い、その試薬中の濃度
は、０．１〜１０００ｍＭ、より好ましくは１〜１０ｍ
Ｍとする。脱水素酵素としては、たとえば、アミノ酸脱
水素酵素やＡＤＨ等、ＮＡＤ（またはＮＡＤＨ）に対し
て特異性の高いものを使用する。このうち、アミノ酸脱
水素酵素は、たとえばアラニン脱水素酵素（以下、Ａｌ
ａＤＨと略記する）、ロイシン脱水素酵素（以下、Ｌｅ
ｕＤＨと略記する）、グルタミン酸脱水素酵素等であ
る。また、ＡＤＨは、その由来に特段の制限はなく、た
とえばパン酵母やザイモモナス等に由来するものを適宜
に用いることができる。これらの脱水素酵素の試薬中濃
度は、０．０１〜１０００単位／ｍｌ、より好ましくは
０．１〜１００単位／ｍｌとする。なお、脱水素酵素の
活性１単位とはｐＨ９．０、３０℃で１分間あたり相当
する基質を１μｍｏｌ酸化する酵素量と定義されるもの
である。
【００１５】脱水素酵素としてアミノ酸脱水素酵素を用
いた場合の基質は、その種類に相当するアミノ酸であ
り、またＡＤＨを用いる場合の基質は、エタノール等の
アルコール類である。これらの基質の試薬中濃度は、１
〜１０００ｍＭ、より好ましくは１０〜１００ｍＭとす
る。さらに、緩衝液としては、たとえばリン酸緩衝液、
トリエタノール緩衝液等、中性付近に緩衝作用を有する
ものを使用することができ、そのｐＨは５．０〜１０．
０、より好ましくは７．０〜９．０程度とする。また、
このときの測定試薬中の緩衝液濃度は、１０〜１０００
ｍＭ、より好ましくは５０〜５００ｍＭ程度である。
いた場合の基質は、その種類に相当するアミノ酸であ
り、またＡＤＨを用いる場合の基質は、エタノール等の
アルコール類である。これらの基質の試薬中濃度は、１
〜１０００ｍＭ、より好ましくは１０〜１００ｍＭとす
る。さらに、緩衝液としては、たとえばリン酸緩衝液、
トリエタノール緩衝液等、中性付近に緩衝作用を有する
ものを使用することができ、そのｐＨは５．０〜１０．
０、より好ましくは７．０〜９．０程度とする。また、
このときの測定試薬中の緩衝液濃度は、１０〜１０００
ｍＭ、より好ましくは５０〜５００ｍＭ程度である。
【００１６】テトラゾリウム系色素としては、２−（Ｐ
ニトロフェニル）−３−（Ｐ−ヨードフェニル）−５−
フェニルテトラゾリウムクロライド（以下、ＩＮＴと略
記する）、３，３′−（３，３′−ジメトキシ−４，
４′−ジフェニレン）ビス（２−（Ｐ−ニトロフェニ
ル）−５−フェニル−テトラゾリウムクロライド）、２
−（４′，５′−ジメチル−２′−チアゾリル−３，
５，−ジフェニルテトラゾリウムブロライド等を例示す
ることができ、その測定試薬中の濃度は０．１〜１０ｍ
Ｍ、より好ましくは０．５〜２ｍＭ程度とする。
ニトロフェニル）−３−（Ｐ−ヨードフェニル）−５−
フェニルテトラゾリウムクロライド（以下、ＩＮＴと略
記する）、３，３′−（３，３′−ジメトキシ−４，
４′−ジフェニレン）ビス（２−（Ｐ−ニトロフェニ
ル）−５−フェニル−テトラゾリウムクロライド）、２
−（４′，５′−ジメチル−２′−チアゾリル−３，
５，−ジフェニルテトラゾリウムブロライド等を例示す
ることができ、その測定試薬中の濃度は０．１〜１０ｍ
Ｍ、より好ましくは０．５〜２ｍＭ程度とする。
【００１７】ジアホラーゼについては、その由来に特段
の制限はないが、安定性に富む例えばバチルスステアロ
サーモフィラス由来のものが好ましく、その測定試薬中
の濃度は０．０１〜１０００単位／ｍｌ、より好ましく
は０．１〜１００単位／ｍｌ程度とする。なお、この場
合のジアホラーゼ活性１単位とは、ｐＨ８．０、３０℃
で１分間あたりテトラゾリウム系色素を１μｍｏｌ還元
する酵素量である。
の制限はないが、安定性に富む例えばバチルスステアロ
サーモフィラス由来のものが好ましく、その測定試薬中
の濃度は０．０１〜１０００単位／ｍｌ、より好ましく
は０．１〜１００単位／ｍｌ程度とする。なお、この場
合のジアホラーゼ活性１単位とは、ｐＨ８．０、３０℃
で１分間あたりテトラゾリウム系色素を１μｍｏｌ還元
する酵素量である。
【００１８】界面活性剤としては、非イオン性界面活性
剤またはイオン性界面活性剤を用いることができ、なか
でもトライトン系界面活性剤が好ましく、さらにはトラ
イトンＸ−１００がより好ましい。また、その測定試薬
中の濃度は０．００１ｗ／ｖ％以上、より好ましくは
０．０２〜１ｗ／ｖ％程度とする。以下、実施例を示し
てこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この
発明は以下の実施例に限定されるものではない。
剤またはイオン性界面活性剤を用いることができ、なか
でもトライトン系界面活性剤が好ましく、さらにはトラ
イトンＸ−１００がより好ましい。また、その測定試薬
中の濃度は０．００１ｗ／ｖ％以上、より好ましくは
０．０２〜１ｗ／ｖ％程度とする。以下、実施例を示し
てこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この
発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１９】
【実施例】参考例 アルカリホスファターゼ（仔牛小腸由来、ベーリンガー
マンハイム社製）２ｍｇにスクシニミジル４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト（ジーベンケミカル社製）３ｍｇをｐＨ７．０、３０
℃で１０分間反応させ、アルカリホスファターゼにマレ
イミド基を導入した。ついで、これに抗癌胎児性抗原抗
体（以下、抗ＣＥＡ抗体と記載する）Ｆａｂ′（抗体を
ペプシン消化し、その後還元して調整したもの）１ｍｇ
をｐＨ６で混合し、マレイミド基とチオール基とを架橋
してアルカリホスファターゼ標識抗ＣＥＡ抗体を調整し
た。実施例１ （１）測定試薬の調製 各々、以下の組成からなる試薬（Ｉ）、（II）を調製し
た。
マンハイム社製）２ｍｇにスクシニミジル４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト（ジーベンケミカル社製）３ｍｇをｐＨ７．０、３０
℃で１０分間反応させ、アルカリホスファターゼにマレ
イミド基を導入した。ついで、これに抗癌胎児性抗原抗
体（以下、抗ＣＥＡ抗体と記載する）Ｆａｂ′（抗体を
ペプシン消化し、その後還元して調整したもの）１ｍｇ
をｐＨ６で混合し、マレイミド基とチオール基とを架橋
してアルカリホスファターゼ標識抗ＣＥＡ抗体を調整し
た。実施例１ （１）測定試薬の調製 各々、以下の組成からなる試薬（Ｉ）、（II）を調製し
た。
【００２０】 試薬（Ｉ）： ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８） ５００ｍＭ ＭｇＣｌ2 １ｍＭ ＮＡＤＰ １ｍＭ エタノール １００ｍＭ 試薬（II）： リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５） ２５０ｍＭ ＩＮＴ ０．５ｍＭ トライトンＸ−１００ ０．０２％ ジアホラーゼ（ユニチカ社製） １単位／ｍｌ ＡＤＨ（ユニチカ社製） １単位／ｍｌ また、比較例１として、以下の組成からなる試薬
（Ｉ′）（II′）を調製した。
（Ｉ′）（II′）を調製した。
【００２１】 試薬（Ｉ′）： ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８） ５００ｍＭ ＭｇＣｌ2 １ｍＭ ＮＡＤＰ １ｍＭ 試薬（II′）： リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５） ２５０ｍＭ ＩＮＴ ０．５ｍＭ トライトンＸ−１００ ０．０２％ エタノール １００ｍＭ ジアホラーゼ（ユニチカ社製） １単位／ｍｌ ＡＤＨ（ユニチカ社製） １単位／ｍｌ （２）測定方法 癌胎児性抗原（以下、ＣＥＡと略記する）５０μｌを、
０、１．２５、２．５、５．０、１０．０、２０．０ｎ
ｇ／ｍｌの各濃度で、抗ＣＥＡ抗体固定化マイクロタイ
タープレート（メディックス社製）の各ウェルに添加
し、さらにこれらの各ウェルに参考例で調整したアルカ
リホスファターゼ標識抗ＣＥＡ抗体５０μｌを１μｇ／
ｍｌの濃度で添加して室温で２時間静置し、抗原抗体反
応を行った。次いで、０．２％ツウィーン２０、０．２
％牛血清アルブミン、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む
２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）でプレート
を洗浄し、１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸、１ｍＭ塩化マグネシウムを含む０．５Ｍジエ
タノールアミン（ｐＨ９．８）５０μｌを各ウェルに加
え、室温で正確に１０分間反応させた。そしてこの反応
溶液に、上記（１）で調製した試薬（Ｉ）を５０μｌ添
加し、室温にて１０分間反応させたのち、試薬（II）を
１００μｌ添加し、同じく室温で１０分間反応させ、１
Ｎ塩酸５０μｌを加えて反応を停止させて、各々の吸光
度（△Ａ490 ）をマイクロタイタープレート自動分析装
置バイオメック−１０００（ベックマン社製）を用いて
測定した。また、比較例１として調製した試薬（Ｉ′）
（II′）についても同様の手続きにより吸光度を測定し
た。
０、１．２５、２．５、５．０、１０．０、２０．０ｎ
ｇ／ｍｌの各濃度で、抗ＣＥＡ抗体固定化マイクロタイ
タープレート（メディックス社製）の各ウェルに添加
し、さらにこれらの各ウェルに参考例で調整したアルカ
リホスファターゼ標識抗ＣＥＡ抗体５０μｌを１μｇ／
ｍｌの濃度で添加して室温で２時間静置し、抗原抗体反
応を行った。次いで、０．２％ツウィーン２０、０．２
％牛血清アルブミン、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む
２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）でプレート
を洗浄し、１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸、１ｍＭ塩化マグネシウムを含む０．５Ｍジエ
タノールアミン（ｐＨ９．８）５０μｌを各ウェルに加
え、室温で正確に１０分間反応させた。そしてこの反応
溶液に、上記（１）で調製した試薬（Ｉ）を５０μｌ添
加し、室温にて１０分間反応させたのち、試薬（II）を
１００μｌ添加し、同じく室温で１０分間反応させ、１
Ｎ塩酸５０μｌを加えて反応を停止させて、各々の吸光
度（△Ａ490 ）をマイクロタイタープレート自動分析装
置バイオメック−１０００（ベックマン社製）を用いて
測定した。また、比較例１として調製した試薬（Ｉ′）
（II′）についても同様の手続きにより吸光度を測定し
た。
【００２２】さらに、試薬（II）および（II′）につい
ては、これらの調製後から１０日毎に５０日後まで、各
々の吸光度を測定した。 （３）結果 ＣＥＡ測定の結果は表１および図１に示した通りであ
る。これらの結果から明らかなように、実施例１の試薬
と比較例１の試薬は、ホスフォターゼの測定において
は、同等の検出感度を示した。
ては、これらの調製後から１０日毎に５０日後まで、各
々の吸光度を測定した。 （３）結果 ＣＥＡ測定の結果は表１および図１に示した通りであ
る。これらの結果から明らかなように、実施例１の試薬
と比較例１の試薬は、ホスフォターゼの測定において
は、同等の検出感度を示した。
【００２３】しかしながら、各々の試薬（II）および
（II′）の試薬ブランクの程度を比較した場合には、表
２および図２からも明らかなように、比較例の試薬（I
I′）がその保存期間に依存して非特異的発色を示すの
に対して、この発明の試薬（II）は、５０日間の保存に
よっても、全く試薬ブランクが発生せず、その優れた保
存性、安定性が実証された。
（II′）の試薬ブランクの程度を比較した場合には、表
２および図２からも明らかなように、比較例の試薬（I
I′）がその保存期間に依存して非特異的発色を示すの
に対して、この発明の試薬（II）は、５０日間の保存に
よっても、全く試薬ブランクが発生せず、その優れた保
存性、安定性が実証された。
【００２４】
【表１】
【００２５】
【表２】
【００２６】実施例２ （１）測定試薬の調製 各々、以下の組成からなる試薬（Ｉ）（II）を調製し
た。 試薬（Ｉ）： ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８） ５００ｍＭ ＭｇＣｌ2 １ｍＭ ＮＡＤＰ １ｍＭ ジアホラーゼ（ユニチカ社製） １単位／ｍｌ 試薬（II）： リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５） ２５０ｍＭ ＩＮＴ ０．５ｍＭ トライトンＸ−１００ ０．０２％ エタノール １００ｍＭ ＡＤＨ（ユニチカ社製） １単位／ｍｌ また、比較例２として、以下の組成からなる試薬
（Ｉ′）（II′）を調製した。
た。 試薬（Ｉ）： ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８） ５００ｍＭ ＭｇＣｌ2 １ｍＭ ＮＡＤＰ １ｍＭ ジアホラーゼ（ユニチカ社製） １単位／ｍｌ 試薬（II）： リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５） ２５０ｍＭ ＩＮＴ ０．５ｍＭ トライトンＸ−１００ ０．０２％ エタノール １００ｍＭ ＡＤＨ（ユニチカ社製） １単位／ｍｌ また、比較例２として、以下の組成からなる試薬
（Ｉ′）（II′）を調製した。
【００２７】 試薬（Ｉ′）： ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８） ５００ｍＭ ＭｇＣｌ2 １ｍＭ ＮＡＤＰ １ｍＭ 試薬（II′）： リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５） ２５０ｍＭ ＩＮＴ ０．５ｍＭ トライトンＸ−１００ ０．０２％ ＥｔＯII １００ｍＭ ジアホラーゼ（ユニチカ社製） １単位／ｍｌ ＡＤＨ（ユニチカ社製） １単位／ｍｌ （２）方法 実施例１と同様の方法で、ＣＥＡの測定および試薬ブラ
ンクの測定を行なった。 （３）結果 ＣＥＡ測定の結果は、表３および図３に示した通りであ
り、この発明の試薬と比較例２の試薬は、ほぼ同等のホ
スファターゼ検出感度を示した。
ンクの測定を行なった。 （３）結果 ＣＥＡ測定の結果は、表３および図３に示した通りであ
り、この発明の試薬と比較例２の試薬は、ほぼ同等のホ
スファターゼ検出感度を示した。
【００２８】しかしながら、各々の試薬（II）および
（II′）の試薬ブランクの程度を比較した場合には、表
４および図４からも明らかなように、比較例の試薬（I
I′）がその保存期間に依存して非特異的発色を示すの
に対して、この発明の試薬（II）は、５０日間の保存に
よっても、全く試薬ブランクが発生せず、その優れた保
存性、安定性が実証された。
（II′）の試薬ブランクの程度を比較した場合には、表
４および図４からも明らかなように、比較例の試薬（I
I′）がその保存期間に依存して非特異的発色を示すの
に対して、この発明の試薬（II）は、５０日間の保存に
よっても、全く試薬ブランクが発生せず、その優れた保
存性、安定性が実証された。
【００２９】
【表３】
【００３０】
【表４】
【００３１】実施例３ （１）測定試薬の調製 各々、以下の組成からなる試薬（Ｉ）（II）を調製し
た。 試薬（Ｉ）： ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８） ５００ｍＭ ＭｇＣｌ2 １ｍＭ ＮＡＤＰ １ｍＭ アラニン ５０ｍＭ ジアホラーゼ（ユニチカ社製） １単位／ｍｌ 試薬（II）： リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５） ２５０ｍＭ ＩＮＴ ０．５ｍＭ トライトンＸ−１００ ０．０２％ アラニン脱水素酵素（ユニチカ社製） １単位／ｍｌ また、比較例３として、以下の組成からなる試薬
（Ｉ′）（II′）を調製した。
た。 試薬（Ｉ）： ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８） ５００ｍＭ ＭｇＣｌ2 １ｍＭ ＮＡＤＰ １ｍＭ アラニン ５０ｍＭ ジアホラーゼ（ユニチカ社製） １単位／ｍｌ 試薬（II）： リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５） ２５０ｍＭ ＩＮＴ ０．５ｍＭ トライトンＸ−１００ ０．０２％ アラニン脱水素酵素（ユニチカ社製） １単位／ｍｌ また、比較例３として、以下の組成からなる試薬
（Ｉ′）（II′）を調製した。
【００３２】 試薬（Ｉ′）： ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８） ５００ｍＭ ＭｇＣｌ2 １ｍＭ ＮＡＤＰ １ｍＭ 試薬（II′）： リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５） ２５０ｍＭ ＩＮＴ ０．５ｍＭ トライトンＸ−１００ ０．０２％ アラニン ５０ｍＭ ジアホラーゼ（ユニチカ社製） １単位／ｍｌ アラニン脱水素酵素（ユニチカ社製） １単位／ｍｌ （２）方法 実施例１と同様の方法でＣＥＡ測定および試薬ブランク
の測定を行なった。 （３）結果 ＣＥＡ測定の結果は、表５および図５に示した通りであ
り、この発明の試薬と比較例３の試薬は、ほぼ同等のホ
スファターゼ検出感度を示した。
の測定を行なった。 （３）結果 ＣＥＡ測定の結果は、表５および図５に示した通りであ
り、この発明の試薬と比較例３の試薬は、ほぼ同等のホ
スファターゼ検出感度を示した。
【００３３】しかしながら、各々の試薬（II）および
（II′）の試薬ブランクの程度を比較した場合には、表
６および図６からも明らかなように、比較例の試薬（I
I′）がその保存期間に依存して非特異的発色を示すの
に対して、この発明の試薬（II）は、５０日間の保存に
よっても、全く試薬ブランクが発生せず、その優れた保
存性、安定性が実証された。
（II′）の試薬ブランクの程度を比較した場合には、表
６および図６からも明らかなように、比較例の試薬（I
I′）がその保存期間に依存して非特異的発色を示すの
に対して、この発明の試薬（II）は、５０日間の保存に
よっても、全く試薬ブランクが発生せず、その優れた保
存性、安定性が実証された。
【００３４】
【表５】
【００３５】
【表６】
【００３６】
【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によ
って、２種類の反応試薬のうち、シグナル増幅反応試薬
を２成分に分離する必要のないホスファターゼ測定試薬
が提供される。これにより、従来は用時調整が必要であ
ったシグナル増幅反応試薬を、使用可能な状態で長期間
保存することが可能となる。
って、２種類の反応試薬のうち、シグナル増幅反応試薬
を２成分に分離する必要のないホスファターゼ測定試薬
が提供される。これにより、従来は用時調整が必要であ
ったシグナル増幅反応試薬を、使用可能な状態で長期間
保存することが可能となる。
【図１】この発明の測定試薬（●）と従来の測定試薬
（○）を用いた場合の、ＣＥＡ濃度毎の吸光度を示した
相関図である。
（○）を用いた場合の、ＣＥＡ濃度毎の吸光度を示した
相関図である。
【図２】この発明（●）と従来（○）のシグナル増幅反
応試薬の各々の保存日数毎の吸光度を示した相関図であ
る。
応試薬の各々の保存日数毎の吸光度を示した相関図であ
る。
【図３】この発明の測定試薬（▲）と従来の測定試薬
（△）を用いた場合の、ＣＥＡ濃度毎の吸光度を示した
相関図である。
（△）を用いた場合の、ＣＥＡ濃度毎の吸光度を示した
相関図である。
【図４】この発明（▲）と従来（△）のシグナル増幅反
応試薬の各々の保存日数毎の吸光度を示した相関図であ
る。
応試薬の各々の保存日数毎の吸光度を示した相関図であ
る。
【図５】この発明の測定試薬（■）と従来の測定試薬
（□）を用いた場合の、ＣＥＡ濃度毎の吸光度を示した
相関図である。
（□）を用いた場合の、ＣＥＡ濃度毎の吸光度を示した
相関図である。
【図６】この発明（■）と従来（□）のシグナル増幅反
応試薬の各々の保存日数毎の吸光度を示した相関図であ
る。
応試薬の各々の保存日数毎の吸光度を示した相関図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 鈴木 直生 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
リン酸またはその還元型を有する試薬に、ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドまたはその還元型の酵素的サ
イクリングを用いたシグナル増幅系試薬の少なくとも一
成分を配合してなるホスファターゼ測定試薬。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4308931A JPH06153991A (ja) | 1992-11-18 | 1992-11-18 | ホスファターゼ測定試薬 |
| EP93309203A EP0598620A3 (en) | 1992-11-18 | 1993-11-18 | Analytical system and kit for phosphatase. |
| US08/154,354 US5529906A (en) | 1992-11-18 | 1993-11-18 | Analytical system or kit for phosphatase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4308931A JPH06153991A (ja) | 1992-11-18 | 1992-11-18 | ホスファターゼ測定試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06153991A true JPH06153991A (ja) | 1994-06-03 |
Family
ID=17987001
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4308931A Pending JPH06153991A (ja) | 1992-11-18 | 1992-11-18 | ホスファターゼ測定試薬 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5529906A (ja) |
| EP (1) | EP0598620A3 (ja) |
| JP (1) | JPH06153991A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005304483A (ja) * | 2004-03-24 | 2005-11-04 | Asahi Kasei Pharma Kk | アルカリフォスファターゼ測定法 |
| US7879567B2 (en) | 2004-10-05 | 2011-02-01 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Method for stabilizing coenzyme and composition therefor |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2110910B1 (es) * | 1995-11-27 | 1998-10-01 | Univ Murcia | Metodo para la amplificacion de reacciones enzimaticas basado en el acoplamiento a sistemas enzimaticos ciclicos (sec). |
| US6368818B1 (en) * | 2000-10-12 | 2002-04-09 | Qingzhong Kong | Methods and compositions for the visualization of cellular organelles using tetrazolium salts |
| US7524872B2 (en) * | 2000-09-15 | 2009-04-28 | Qingzhong Kong | Method and composition for treating cancer using cellular organelle crystallizing agents |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2059421A (en) * | 1979-10-03 | 1981-04-23 | Self C H | Assay method and reagents therefor |
| EP0060123B1 (en) * | 1981-03-07 | 1986-10-29 | Colin Henry Self | Assay and use |
| DE3211167A1 (de) * | 1982-03-26 | 1983-09-29 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Testsystem und verfahren zur bestimmung von substanzen in fluessigkeiten |
| AU577577B2 (en) * | 1984-06-25 | 1988-09-29 | Warner-Lambert Company | Isolation and quantitation of alkaline phosphatase |
| JPH02234698A (ja) * | 1989-03-08 | 1990-09-17 | Toyobo Co Ltd | 細菌ルシフェラーゼ系によるｄｎａプローブの検出法 |
| JP3076361B2 (ja) * | 1990-08-29 | 2000-08-14 | 株式会社京都第一科学 | 一体型多層分析要素 |
| US5272054A (en) * | 1992-03-26 | 1993-12-21 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Assay by enzyme-catalyzed isotopic exchange |
-
1992
- 1992-11-18 JP JP4308931A patent/JPH06153991A/ja active Pending
-
1993
- 1993-11-18 US US08/154,354 patent/US5529906A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-11-18 EP EP93309203A patent/EP0598620A3/en not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005304483A (ja) * | 2004-03-24 | 2005-11-04 | Asahi Kasei Pharma Kk | アルカリフォスファターゼ測定法 |
| US7879567B2 (en) | 2004-10-05 | 2011-02-01 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Method for stabilizing coenzyme and composition therefor |
| US8026075B2 (en) | 2004-10-05 | 2011-09-27 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Method for stabilizing coenzyme and composition thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0598620A2 (en) | 1994-05-25 |
| EP0598620A3 (en) | 1995-05-03 |
| US5529906A (en) | 1996-06-25 |
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