JPH09168397A - 硫酸抱合型胆汁酸の定量法及びそのキット - Google Patents
硫酸抱合型胆汁酸の定量法及びそのキットInfo
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- Y10S435/81—Packaged device or kit
Abstract
すべく、汎用されている自動分析装置に適した硫酸抱合
型胆汁酸の定量法及びそのキットを提供することを目的
とする。 【解決手段】 硫酸抱合型胆汁酸を胆汁酸硫酸スルファ
ターゼ及び還元系発色試薬を用いて測定する方法におい
て、2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフ
ェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−
テトラゾリウム塩を還元系発色試薬とする硫酸抱合型胆
汁酸の定量法及びそのキットを提供する。
Description
の定量法および硫酸抱合型胆汁酸定量キットに関するも
のであり、特に、このキットは、肝胆道系疾患診断に有
用である。
が著しく増加することは、よく知られており、血液中の
胆汁酸の定量は、臨床検査において肝機能を調べる上で
重要な項目となっている。尿中にあっても胆汁酸は血液
中と類似した動態を示すことが明らかにされているが、
尿中では胆汁酸の多くが水溶性の高い硫酸抱合型(胆汁
酸の3位の水酸基の硫酸エステル型)として存在するよ
うになるため、その測定が容易でなかった。
の3α位の硫酸エステルを効率良く加水分解する酵素:
胆汁酸硫酸スルファターゼ(BSS)を開発し、この酵
素を主剤として生体試料中の硫酸抱合型胆汁酸を酵素法
により簡便に測定する方法を確立した(特開平2−14
5183)。
汁酸の測定が肝胆道系疾患の検査法として、GOT、G
PT、γ−GTP、TBA等の血液化学検査と同等の診
断効率を示し、この方法が尿による非侵襲的肝機能検査
法として有用であることが明らかにされた(肝胆膵、第
31巻(1995年)、第2号、315−326頁)。
合型胆汁酸を、まずBSSによって3β−ヒドロキシ胆
汁酸に変換させ、この胆汁酸へβ−ヒドロキシステロイ
ド脱水素酵素(β−HSD)を該脱水素酵素の補酵素で
あるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)
の存在下に反応させることにより、3−オキソ胆汁酸と
共に生じるNADHを、NADHの高感度発色試薬とし
て汎用されている還元系発色試薬、ニトロテトラゾリウ
ムブルー(NTB)で比色定量する方法に基づいてい
る。しかし、臨床検査法として、多数の検体を人手をか
けずに、迅速に測定するという点では、以下の点で未だ
充分ではなかった。
に比べて個体差が大きく、尿検体の内因性の発色物質に
よるブランク値の継続的な増加があって、その程度が尿
検体によって変動するため、測定値からそのブランク値
を消去するためにBSSを省いたブランク試薬による測
定も行なわなければならず、1検体の測定に、2種類の
測定を並行して行う必要があり、操作が煩雑である。ま
た、還元系発色試薬のニトロテトラゾリウムブルー(N
TB)およびそのホルマザンは、水に溶解しにくく、比
色定量に用いるセルを1度使用すると試薬に汚染され、
再利用するには、非常に綿密な洗浄が必要となり、自動
分析装置への適用が困難になっている。従って、現状で
は測定は用手法とならざるを得ず、そのため、処理検体
数、時間等で制約を受けている。
ず、より簡便に測定できるようにすべく、汎用されてい
る自動分析装置に適した硫酸抱合型胆汁酸の定量法及び
キットを提供することを目的とする。
の条件として、(1)1つの測定反応系で検体ブランク
の消去を可能とする、(2)全反応を短時間で完了す
る、(3)装置の汚染の心配がなく、高感度の測定を可
能とする、を挙げて鋭意検討を重ねた。
(以下、比較試薬aとする。)
発色試薬の使用、例えば、2−(4−ヨードフェニル)
−3−(2,4−ジニトロフェニル)−5−(2,4−
ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウムモノナトリ
ウム塩(以下、比較試薬bとする。)
ボキシ−2−メトキシフェニル)−5−[4−(2−ス
ルホエチルカルバモイル)フェニル]−2H−テトラゾ
リウム塩(以下、比較試薬cとする。)
使用しても、尿中の発色物質の影響を強く受け、ブラン
ク値が安定せず、自動化には適しておらず、本目的を達
成するものではなかった。
(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)
−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾ
リウム塩(以下、本還元系発色試薬という。)
ルカリ土類金属イオンを示す。)を使用することによ
り、初めて上記目的を達成することを見出し、本発明を
完成するに至った。
テトラゾリウム塩の中で、2−(4−ヨードフェニル)
−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスル
ホフェニル)−2H−テトラゾリウム塩が尿又は血液中
の発色物質の影響を受ける程度が極く軽微で、許容範囲
内に納まることを見い出した。即ち、本発明では、この
試薬を用いることにより、同一セルで第1反応として、
第1試薬に含まれる発色試薬を作用させることによって
検体中の内因性発色物質によるブランク発色反応を行な
わせ、ブランク値として測定後、第2試薬に含まれるB
SSを作用させ、検体中の硫酸抱合型胆汁酸の脱硫酸生
成物による発色反応を測定、両反応の差から硫酸抱合型
胆汁酸を測定することが可能となった。
(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェ
ニル)−2H−テトラゾリウム塩およびそのホルマザン
は、水溶性であることから、セルの洗浄が容易で、装置
の汚染の心配が無く、且つ、そのホルマザンの分子吸光
係数が ε= 3.7×104 (λ= 438nm) と高いことから、
高感度測定が可能であった。
酸硫酸スルファターゼ(BSS)及び還元系発色試薬を
用いて定量する方法において、該還元系発色試薬が2−
(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)
−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾ
リウム塩である硫酸抱合型胆汁酸の定量法及び定量キッ
トを提供する。
せ、(2)次いで、得られた3β−ヒドロキシ胆汁酸に
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)の存
在下、β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素(β−HS
D)を作用させ、(3)3−オキソ胆汁酸と共に生じる
NADHに、電子キャリアー及び2−(4−ヨードフェ
ニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−
ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム塩を作用さ
せることによって生成するホルマザン類を定量すること
を特徴とする定量法を提供するものである。
AD、電子キャリアー及び2−(4−ヨードフェニル)
−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスル
ホフェニル)−2H−テトラゾリウム塩を含む第1試
薬、及びBSSを含む第2試薬を含む硫酸抱合型胆汁酸
定量キットを提供する。
オキソ胆汁酸に作用する脱水素酵素、3−オキソ−5β
−ステロイド−Δ4−脱水素酵素(Δ4−DH)を共役させ
ることにより、脱水素反応の結果生じるH+受容体とし
て2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェ
ニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テ
トラゾリウム塩が反応し、更に1分子のホルマザンが生
成することから、吸光度値が約2倍になり、この酵素を
共役させることにより測定感度は、従来の約2倍にアッ
プすることも見出した。
程において、(i)3−オキソ胆汁酸と共に生じるNAD
Hに、電子キャリアー及び2−(4−ヨードフェニル)
−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスル
ホフェニル)−2H−テトラゾリウム塩を作用させるこ
とによって生成するホルマザン類及び(ii)3−オキソ胆
汁酸にΔ4−DH及び2−(4−ヨードフェニル)−3
−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフ
ェニル)−2H−テトラゾリウム塩を作用させることに
よって生成するホルマザン類の合計量を定量することを
特徴とする定量法、及び、上記キットの第1試薬が、β
−HSD、NAD、電子キャリアー、Δ4−DH及び2
−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニ
ル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テト
ラゾリウム塩を含むキットも提供する。
すむようになり、検体中の夾雑物の影響も減り、より精
密な値が得られるようになった。
抱合型胆汁酸を定量することが可能である。
ャリアーとは、電子供与体から電子受容体へ電子を移動
させる反応を触媒する物質である。
−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5
−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウ
ム塩は、公知物質である。例えば、ナトリウム、カリウ
ム、リチウム等のアルカリ塩、マグネシウム、カルシウ
ム等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。例えば、モ
ノナトリウム塩として、株式会社同人化学研究所から、
WST−1の名称で販売されているものが使用できる。
HSD及びΔ4−DHは、公知物質であり、いずれの生
物由来のものでも用いられ、例えば、いずれも Pseudom
onastestosteroni 由来のものが好適に用いられる。ま
た、遺伝子工学的に製造されたものを使用することもで
きる。
a, K. Adachi, & Y. Tsukada; Biosci.Biotech. Bioche
m., 58, 889-894 (1994) の文献の記載に従って精製し
得ることができる。
tz, Ernest V. Groman and Lewis L. Engel ; J. Biol.
Chem 252, 3775-3783 (1977)の文献の記載に従って精
製し得ることができる。あるいは、市販されている例え
ばSigma Chemical Co. から購入したものを使用するこ
とも可能である。
y; J. Biol. Chem.,241, 906-915(1966) の文献の記載
に従って精製し得ることができる。
れているものを使用することができる。
は、例えば、ジアホラーゼやNADHオキシダーゼなど
の酵素、及びフェナジンメトサルフェート(PMS)、
1−メトキシフェナジニウムメチルサルフェート(1−
メトキシPMS)、9−ジメチルアミノベンゾ−α−フ
ェナゾキソニウムクロライド(メルドラブルー)等の物
質から選ばれ、1種又は2種以上使用することができ
る。好ましくは、ジアホラーゼ、1−メトキシフェナジ
ニウムメチルサルフェート及び9−ジメチルアミノベン
ゾ−α−フェナゾキソニウムクロライドからなる群から
選ばれる少なくとも1種である。これら、電子キャリア
ーは、市販されているものを使用することができ、例え
ば、ジアホラーゼはオリエンタル酵母工業株式会社、1
−メトキシPMS、メルドラブルーは株式会社同人化学
研究所のものが使用できる。
て説明する。
まず、検体、例えば尿又は血液に、NAD、β−HS
D、電子キャリアー及び2−(4−ヨードフェニル)−
3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホ
フェニル)−2H−テトラゾリウム塩を含む第1試薬を
作用させる反応を第1反応として、検体中の内因性発色
物質を所定時間内で反応、発色させ、ブランク値(図1
における測定値A)として測定する。所要時間として
は、約5分程度である。
Sを含む第2試薬を添加し、検体中に含まれる硫酸抱合
型胆汁酸を3β−ヒドロキシ胆汁酸に変換し、該3β−
ヒドロキシ胆汁酸を、所定時間内にセル内に存在してい
るβ−HSDで酸化し、同時に生成するNADHを発色
させて吸光度を測定する(測定値B)。その所要時間
は、約2分から5分程度である。得られた測定値Bから
ブランク値(測定値A)を差引いた値から、目的の尿中
硫酸抱合型胆汁酸値を算出する。
応生成物である3−オキソ胆汁酸に作用する脱水素酵
素、Δ4−DHを共役させることにより、脱水素反応の
結果生じるH+受容体として2−(4−ヨードフェニ
ル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジ
スルホフェニル)−2H−テトラゾリウム塩が反応し、
更に1分子のホルマザンが生成することから、吸光度値
が約2倍になり、この酵素を共役させることにより測定
感度は従来法の約2倍にアップすることも可能となっ
た。
体、例えば尿又は血液に、NAD、β−HSD、Δ4−
DH、電子キャリアー及び2−(4−ヨードフェニル)
−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスル
ホフェニル)−2H−テトラゾリウム塩を含む第1試薬
を作用させる反応を第1反応として、検体中の内因性発
色物質を所定時間内で、反応、発色させ、ブランク値
(図1における測定値A)として測定する。所要時間と
しては、約5分程度である。
Sを含む第2試薬を添加し、検体中に含まれる硫酸抱合
型胆汁酸を3β−ヒドロキシ胆汁酸に変換し、該3β−
ヒドロキシ胆汁酸を、所定時間内にセル内に存在してい
るβ−HSDで酸化し、同時に生成するNADH及び3
−オキソ胆汁酸を、電子キャリアー及び2−(4−ヨー
ドフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−
(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム
塩、又は、Δ4−DH及び2−(4−ヨードフェニル)
−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスル
ホフェニル)−2H−テトラゾリウム塩で発色させて吸
光度を測定する(測定値B)。その所要時間は、約2分
から5分程度である。得られた測定値Bからブランク値
(測定値A)を差引いた値から、目的の尿中硫酸抱合型
胆汁酸値を算出する。
は上記の通りであるが、本発明は、生成するNADH
(及び3−オキソ胆汁酸)の比色測定法の発色試薬とし
て、2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフ
ェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−
テトラゾリウム塩を特定し、この試薬を使用した時、始
めて目的とする1つの測定反応系で検体ブランクの消去
が可能となることを見出した。
であった。
試薬としては、基本的にはβ−HSD、NAD、電子キ
ャリアー及び2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−
ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)
−2H−テトラゾリウム塩(本還元系発色試薬)を含ん
でいる。更に、感度を倍増させるために、第1試薬にΔ
4−DHを含有させることもできる。第2試薬として
は、BSSを含んでいる。
及び干渉物質の影響を除くため、第1試薬及び第2試薬
に、界面活性剤やアスコルビン酸酸化酵素(ASOD)、
及び緩衝剤を含有させることができる。
試薬及び第2試薬中に、ソルビトール、マンニトール、
グリセロール、サッカロース、トレハロースなどの糖
類、血清アルブミン等を配合しても良い。また、エチレ
ンジアミン四酢酸(EDTA)、アジ化ナトリウム、オ
キサミド酸を配合していても良い。
品)の状態で、使用時に緩衝液や水を加えることによっ
て調製しても良いし、溶液の状態であっても良い。添加
する水又は緩衝液を、キット中に、試薬として含んでい
ても良い。
(好ましくはグリコリトコール酸−3−硫酸等)を含む
試薬を、キット中の試薬としても良い。濃度としては、
特に限定されないが、例えば、標準液中の濃度として1
0μM〜100μM程度になるような濃度がよい。この
試薬は粉末(凍結乾燥品)の状態で、使用時に上記に記
載の緩衝液や水を加えることによって調製しても良い
し、溶液の状態であっても良い。添加する水又は緩衝液
を、キット中に、試薬として含んでいても良い。
る試薬を、本発明のキットに含んでいても良い。
含まれ、当業者であればその各成分の有効量を設定する
ことができる。具体例として、以下のように例示する。
れた最終的な反応液中での各成分の濃度としては、以下
の範囲で使用できる: β−HSD :100〜1,000 U/l NAD :0.3〜5g/l 本還元系発色試薬:0.1〜 2g/l。
としては、反応液中のNADHから電子を移動するのに
十分な濃度であれば、特に限定されない。例えば、ジア
ホラーゼの場合、1,000〜20,000 U/l、1−メトキシP
MS及びメルドラブルーの場合、0.01〜0.5mMの範囲で
使用できる。他の電子キャリアーについては、これらの
値を参考して濃度を設定することができる。
は、上記反応液中100〜3,000U/l程度である。
の通りである。
具体的には、HEPES、MOPS、TAPS、HEP
PSO、TES、TAPSO、POPSO、EPPS、
PIDES等が使用できる。反応液中での濃度として
は、pH 7 〜 8 の 50〜200 mMグッド緩衝液になるよう
な量配合されているのがよく、これらは、緩衝剤として
第1試薬及び/又は第2試薬に配合し、調整時に水を添
加して、上記濃度になるように調製しても良いし、調整
時に上記濃度の反応液になるように緩衝液を添加しても
良い。この添加する水又は緩衝液も、キット中の試薬と
して、含まれていても良い。
度で含有されていてもよく、好ましい濃度としては50
〜 200U/lである。
n系界面活性剤が挙げられ、具体的にはTween 20が反応
液中に0.2〜1.5重量%含まれていてもよい。
当な濃度で配合することができる。
ある。例えば、尿検体の場合、検体10〜20μlに対し、
第1試薬を添加、混合して 37℃下所定時間(例えば約
5分間)反応した時点の吸光度を読み取り、この値をブ
ランク値とし、続いて第2試薬を添加、混合して更に所
定時間(例えば2〜5分間)反応を継続した時点の吸光
度を読み取って、この値からブランク値を差し引き、得
られる吸光度の増加値を求めることにより行われる。尿
検体中の硫酸抱合型胆汁酸値は、同様の操作から得た標
準物質を含む標準液での吸光度増加値を標準値として比
例計算により求めることができる。
とができる。
査用自動分析装置を用いて硫酸抱合型胆汁酸の定量が1
反応系でできるようになり、測定の操作性が大幅に改善
され、人手を要さない自動分析装置での測定が可能とな
り、検体の測定処理性能の改善も可能となった。
が、本発明はこれらに制限されるものではない。本明細
書において、特に記載がない限り、%は、重量%を示
す。
トラゾリウムブルー(NTB)(比較試薬a)を使用し
た時の吸光度の経時的変化 還元系発色試薬としてNTBを使用して、下記組成の第
1試薬及び第2試薬を用いて、自動分析装置COBAS
MIRAにより10種類の尿を検体として測定を行
い、吸光度の経時的変化を観測した。反応温度は37℃
で、検体20μl、精製水30μl及び第1試薬 160μl添加
し5分間反応後、同一セルに第2試薬40μl及び精製水1
0μl添加し、25秒ごとに550nmの吸光度を測定し
た。第1試薬及び第2試薬中の各成分濃度は以下の通り
である。
0 U/l β−HSD(J. Biol. Chem 252, 3775-3783 (1977)の
記載に従って精製):500 U/l β−NAD(オリエンタル酵母工業株式会社):1 g/l NTB(ナカライテスク株式会社):0.5g/l ASOD(オリエンタル酵母工業株式会社):200 U/l Tween20(ナカライテスク株式会社):0.5 重量% ソルビトール(ナカライテスク株式会社):20 重量% HEPES(ナカライテスク株式会社):100 mM 第2試薬 (pH7.5) BSS(Biosci.Biotech. Biochem., 58, 889-894 (199
4) の記載に従って精製):2,000 U/l Tween20 :0.5 重量% ソルビトール:20 重量% HEPES :100 mM 結果を図3に示した。第1反応のブランク値が直線的に
増加し、所定時間の5分間で完結せず、第2反応に移行
しても同様の傾向が継続した。また、尿検体によってブ
ランク値の増加傾向に差があった。
いた場合、前述のブランク反応を別のセルで並行して行
なう方法を取らざるを得ない状況にあった。
発色試薬として使用したときの吸光度の経時的変化 以下の各種テトラゾリウム塩を還元系発色試薬として使
用したときの吸光度の経時的変化を観測した。
ル)−2,5−ジフェニル−2H テトラゾリウムブロ
ミド(Sigma chemical Co.)
ル)−3−(2,4−ジニトロフェニル)−5−(2,
4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム モノ
ナトリウム塩(株式会社同人化学研究所、WST−3) (比較試薬c)2−ベンゾチアゾリル−3−(4−カル
ボキシ−2−メトキシフェニル)−5−[4−(2−ス
ルホエチルカルバモイル)フェニル]−2H−テトラゾ
リウム塩(株式会社同人化学研究所、WST−4) (本還元系発色試薬)2−(4−ヨードフェニル)−3
−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフ
ェニル)−2H−テトラゾリウム モノナトリウム塩
(株式会社同人化学研究所、WST−1) 下記組成の第1試薬及び第2試薬を用いて、自動分析装
置COBAS MIRAにより尿を検体として測定を行
い、吸光度の経時的変化を観測した。反応温度は37℃
で、検体20μl、精製水30μl及び第1試薬 160μl添加
し5分間反応後、同一セルに第2試薬40μl及び精製水1
0μl添加し、25秒ごとに吸光度を測定した。比較試薬
a、比較試薬c及び比較試薬dを用いた場合は550n
mの吸光度、比較試薬b及び本還元系発色試薬を用いた
場合は450nmの吸光度を測定した。第1試薬及び第
2試薬中の各成分濃度は以下の通りである。
薬c及び比較試薬dではブランク値の継続的増加がある
のに反して、本還元系発色試薬では反応が速やかに進行
し、且つ、尿の内因性発色物質の影響を受けにくいた
め、ブランク値が許容範囲内で安定していた。
−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5
−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウ
ム塩(本還元系発色試薬)を使用したときの吸光度の経
時的変化 還元系発色試薬として2−(4−ヨードフェニル)−3
−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフ
ェニル)−2H−テトラゾリウム モノナトリウム塩
(株式会社同人科学研究所、WST−1)を使用して、
10種類の尿検体での吸光度の経時的変化を実施例1と
同様の方法によって観測した。結果を図5に示した。
ほぼ安定化し、反応は速やかに進行して、第2試薬添加
後、2〜3分の測定で、ブランク値の変動の影響を殆ど
受けることなく、硫酸抱合型胆汁酸の測定が可能であっ
た。
相関 還元系発色試薬としてNTB(比較試薬a)及び2−
(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)
−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾ
リウム モノナトリウム塩(本還元系発色試薬)を使用
した本発明の方法での測定値と従来の方法の測定値との
相関関係を、尿を検体として調べた。
(マルキン醤油株式会社製)を用いて測定した。具体的
には以下の通りである。
各試験管に尿を200μlを加えた。測定用試験管に以下
に記載の第1’試薬酵素液を400μl、検体盲検用試験
管に第1’試薬ブランク液を400μl加え混和し、37
℃で10分間加温した。各試験管に第2’試薬発色液を
500μl加え混和し、更に37℃で10分間加温した。
その後各試験管に2Mクエン酸水溶液を100μl加え反
応を停止し、それぞれを水を対照として波長540nm
で、第1’試薬酵素液を加えた反応液の吸光度
(A’)、第1’試薬ブランク液を加えた反応液の吸光
度(B’)を測定し、(A’−B’)を求め、標準液
(グリコリトコール酸−3−硫酸、50μmol/l)
での測定値から各尿中の硫酸抱合型胆汁酸の濃度を定量
した。
て、日立7070型自動分析装置により各種尿を検体として
測定を行った。反応温度は37℃で、検体 20μl及び第1
試薬 240μl添加し5分間反応後第2試薬50μl添加、第
2試薬添加2分後の450nmの吸光度から第2試薬添加前
の450nmの吸光度をブランクとして差し引き、その吸光
度差を測定値とした。標準液(グリコリトコール酸−3
−硫酸、50μmol/l、(Sigma chemical Co.))
での測定値から各尿中の硫酸抱合型胆汁酸の濃度を定量
した。
値の増加が加算されるため、その分従来法に比べ高値
(1.3 倍程度)になり、相関係数も悪くなる傾向にあっ
た。
相関係数は r=0.995 と極めて良好で、測定値もほぼ1
対1の関係にあって、従来法と同等の正確度の測定法で
あることが示された。 実施例4 ジアホラーゼを含む第1試薬を用いての本発
明の効果 下記組成の第1試薬及び第2試薬を用いて、日立7070型
自動分析装置により各濃度(20〜200μmol/l)に調製し
たグリコリトコール酸−3−硫酸(GLCA-S)溶液及び、
5段階に希釈した3種類の尿を検体として測定を行っ
た。還元系発色試薬として、実施例1に記載の2−(4
−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5
−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウ
ム モノナトリウム塩(本還元系発色試薬)を使用し
た。反応温度は37℃で、検体 20μl及び第1試薬 240μ
l添加し5分間反応後第2試薬50μl添加、第2試薬添加
2分後の450nmの吸光度から第2試薬添加前の450nmの吸
光度をブランクとして差し引き、その吸光度差を測定値
とした。
度と測定値の間には、原点を通る良好な直線性が得られ
た。図9に示す様に、5段階に希釈した3種類の尿につ
いても直線性が得られた。
む第1試薬を用いての本発明の効果 下記組成の第1試薬及び第2試薬を用いて、日立7070型
自動分析装置により各濃度(20〜200μmol/l)に調製し
たグリコリトコール酸−3−硫酸(GLCA-S)溶液及び、
5段階に希釈した3種類の尿を検体として測定を行っ
た。還元系発色試薬として、実施例1に記載の2−(4
−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5
−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウ
ム モノナトリウム塩(本還元系発色試薬)を使用し
た。反応温度は37℃で、検体 20μl及び第1試薬 240μ
l添加し5分間反応後第2試薬50μl添加、第2試薬添加
2分後の450nmの吸光度から第2試薬添加前の450nmの吸
光度をブランクとして差し引き、その吸光度差を測定値
とした。
906-915 (1966) の記載に従って精製) β−NAD :1 g/l 本還元系発色試薬 :0.5 g/l ASOD :200 U/l Tween20 :0.5 重量% ソルビトール :20 重量% HEPES :100 mM 第2試薬 (pH7.5) BSS :2,000 U/l Tween20 :0.5 重量% ソルビトール :20 重量% HEPES :100 mM 結果を図10及び図11に示す。図10に示す様に、GL
CA-S濃度と測定値の間には、原点を通る良好な直線性が
得られた。図11に示す様に、5段階に希釈した3種類
の尿についても直線性が得られた。
第1試薬を用いての本発明の効果 下記組成の第1試薬及び第2試薬を用いて、日立7070型
自動分析装置により各濃度(20〜200μmol/l)に調製し
たグリコリトコール酸−3−硫酸(GLCA-S)溶液を検体
として測定を行った。還元系発色試薬として、実施例1
に記載の2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニト
ロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2
H−テトラゾリウム モノナトリウム塩(本還元系発色
試薬)を使用した。反応温度は37℃で、検体 20μl及び
第1試薬 240μl添加し5分間反応後第2試薬50μl添
加、第2試薬添加2分後の450nmの吸光度から第2試薬
添加前の450nmの吸光度をブランクとして差し引き、そ
の吸光度差を測定値とした。
測定値の間には、原点を通る良好な直線性が得られた。
試薬として各種尿検体(No.1〜10)を測定した時の吸光度
の経時的変化(1ポイント: 25秒)を示す図である。
還元系発色試薬の種類による吸光度の経時的変化(1ポ
イント: 25秒)を示す図である。
用いて、各種尿検体(No.1〜10)を測定した時の吸光度の
経時的変化(1ポイント: 25秒)を示す図である。
試薬として測定した値と従来法(用手法)の測定値との相
関性を示す図である。
分析)と従来法 (用手法)の測定値間の相関性を示す図で
ある。
における吸光度変化量の結果を示す図である。
ける吸光度変化量の結果を示す図である。
mにおける吸光度変化量の結果を示す図である。
おける吸光度変化量の結果を示す図である。
mにおける吸光度変化量の結果を示す図である。
せ、(2)次いで、得られた3β−ヒドロキシ胆汁酸に
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)の存
在下、β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素(β−HS
D)を作用させ、(3)3−オキソ胆汁酸と共に生じる
NADHに、電子キャリアー及び2−(4−ヨードフェ
ニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−
ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム塩を作用さ
せることによって生成するホルマザン類を定量すること
を特徴とする定量法を提供するものである。
オキソ胆汁酸に作用する脱水素酵素、3−オキソ−5β
−ステロイド−Δ4−脱水素酵素(Δ4−DH)を共役させ
ることにより、脱水素反応の結果生じるH +の受容体と
して2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフ
ェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−
テトラゾリウム塩が反応し、更に1分子のホルマザンが
生成することから、吸光度値が約2倍になり、この酵素
を共役させることにより測定感度は、従来の約2倍にア
ップすることも見出した。
−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5
−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウ
ム塩は、公知物質である。例えば、ナトリウム、カリウ
ム、リチウム等のアルカリ塩、マグネシウム、カルシウ
ム等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。例えば、モ
ノナトリウム塩として、株式会社同仁化学研究所から、
WST−1の名称で販売されているものが使用できる。
は、例えば、ジアホラーゼやNADHオキシダーゼなど
の酵素、及びフェナジンメトサルフェート(PMS)、
1−メトキシフェナジニウムメチルサルフェート(1−
メトキシPMS)、9−ジメチルアミノベンゾ−α−フ
ェナゾキソニウムクロライド(メルドラブルー)等の物
質から選ばれ、1種又は2種以上使用することができ
る。好ましくは、ジアホラーゼ、1−メトキシフェナジ
ニウムメチルサルフェート及び9−ジメチルアミノベン
ゾ−α−フェナゾキソニウムクロライドからなる群から
選ばれる少なくとも1種である。これら、電子キャリア
ーは、市販されているものを使用することができ、例え
ば、ジアホラーゼはオリエンタル酵母工業株式会社、1
−メトキシPMS、メルドラブルーは株式会社同仁化学
研究所のものが使用できる。
Sを含む第2試薬を添加し、検体中に含まれる硫酸抱合
型胆汁酸を3β−ヒドロキシ胆汁酸に変換し、該3β−
ヒドロキシ胆汁酸を、所定時間内にセル内に存在してい
るβ−HSDで酸化し、同時に生成するNADHを発色
させて吸光度を測定する(測定値B)。その所要時間
は、約2分から5分程度である。得られた測定値Bから
ブランク値(測定値A)を差引いた値から、目的の検
体、例えば尿又は血液中の硫酸抱合型胆汁酸値を算出す
る。
応生成物である3−オキソ胆汁酸に作用する脱水素酵
素、Δ4−DHを共役させることにより、脱水素反応の
結果生じるH +の受容体として2−(4−ヨードフェニ
ル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジ
スルホフェニル)−2H−テトラゾリウム塩が反応し、
更に1分子のホルマザンが生成することから、吸光度値
が約2倍になり、この酵素を共役させることにより測定
感度は従来法の約2倍にアップすることも可能となっ
た。
Sを含む第2試薬を添加し、検体中に含まれる硫酸抱合
型胆汁酸を3β−ヒドロキシ胆汁酸に変換し、該3β−
ヒドロキシ胆汁酸を、所定時間内にセル内に存在してい
るβ−HSDで酸化し、同時に生成するNADH及び3
−オキソ胆汁酸を、電子キャリアー及び2−(4−ヨー
ドフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−
(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム
塩、及び、Δ4−DH及び2−(4−ヨードフェニル)
−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスル
ホフェニル)−2H−テトラゾリウム塩で発色させて吸
光度を測定する(測定値B)。その所要時間は、約2分
から5分程度である。得られた測定値Bからブランク値
(測定値A)を差引いた値から、目的の検体、例えば尿
又は血液中の硫酸抱合型胆汁酸値を算出する。
抱合型胆汁酸の測定原理は上記の通りであるが、本発明
は、生成するNADH(及び3−オキソ胆汁酸)の比色
測定法の発色試薬として、2−(4−ヨードフェニル)
−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスル
ホフェニル)−2H−テトラゾリウム塩を特定し、この
試薬を使用した時、始めて目的とする1つの測定反応系
で検体ブランクの消去が可能となることを見出した。
た最終的な反応液中での各成分の濃度としては、以下の
範囲で使用できる: β−HSD :100〜1,000 U/l NAD :0.3〜5g/l 本還元系発色試薬:0.1〜 2g/l。
具体的には、HEPES、MOPS、TAPS、HEP
PSO、TES、TAPSO、POPSO、EPPS、
PIPES等が使用できる。反応液中での濃度として
は、pH 7 〜 8 の 50〜200 mMグッド緩衝液になるよう
な量配合されているのがよく、これらは、緩衝剤として
第1試薬及び/又は第2試薬に配合し、調製時に水を添
加して、上記濃度になるように調製しても良いし、調製
時に上記濃度の反応液になるように緩衝液を添加しても
良い。この添加する水又は緩衝液も、キット中の試薬と
して、含まれていても良い。
ル)−3−(2,4−ジニトロフェニル)−5−(2,
4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム モノ
ナトリウム塩(株式会社同仁化学研究所、WST−3) (比較試薬c)2−ベンゾチアゾリル−3−(4−カル
ボキシ−2−メトキシフェニル)−5−[4−(2−ス
ルホエチルカルバモイル)フェニル]−2H−テトラゾ
リウム塩(株式会社同仁化学研究所、WST−4) (本還元系発色試薬)2−(4−ヨードフェニル)−3
−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフ
ェニル)−2H−テトラゾリウム モノナトリウム塩
(株式会社同仁化学研究所、WST−1) 下記組成の第1試薬及び第2試薬を用いて、自動分析装
置COBAS MIRAにより尿を検体として測定を行
い、吸光度の経時的変化を観測した。反応温度は37℃
で、検体20μl、精製水30μl及び第1試薬 160μl添加
し5分間反応後、同一セルに第2試薬40μl及び精製水1
0μl添加し、25秒ごとに吸光度を測定した。比較試薬
a、比較試薬c及び比較試薬dを用いた場合は550n
mの吸光度、比較試薬b及び本還元系発色試薬を用いた
場合は450nmの吸光度を測定した。第1試薬及び第
2試薬中の各成分濃度は以下の通りである。
−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5
−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウ
ム塩(本還元系発色試薬)を使用したときの吸光度の経
時的変化 還元系発色試薬として2−(4−ヨードフェニル)−3
−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフ
ェニル)−2H−テトラゾリウム モノナトリウム塩
(株式会社同仁化学研究所、WST−1)を使用して、
10種類の尿検体での吸光度の経時的変化を実施例1と
同様の方法によって観測した。結果を図5に示した。
測定値の間には、原点を通る良好な直線性が得られた。
Claims (7)
- 【請求項1】 硫酸抱合型胆汁酸を胆汁酸硫酸スルファ
ターゼ及び還元系発色試薬を用いて定量する方法におい
て、還元系発色試薬が2−(4−ヨードフェニル)−3
−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフ
ェニル)−2H−テトラゾリウム塩である硫酸抱合型胆
汁酸の定量法。 - 【請求項2】 請求項1に記載の方法であって、(1)
被検体に胆汁酸硫酸スルファターゼを作用させ、(2)
次いで、得られた3β−ヒドロキシ胆汁酸にニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドの存在下、β−ヒドロキシ
ステロイド脱水素酵素を作用させ、(3)3−オキソ胆
汁酸と共に生じるNADHに、電子キャリアー及び2−
(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)
−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾ
リウム塩を作用させることによって生成するホルマザン
類を定量することを特徴とする定量法。 - 【請求項3】 請求項1に記載の方法であって、 (1)被検体に胆汁酸硫酸スルファターゼを作用させ、 (2)次いで、得られた3β−ヒドロキシ胆汁酸にニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下、β−ヒド
ロキシステロイド脱水素酵素を作用させ、 (3)(i)3−オキソ胆汁酸と共に生じるNADHに、
電子キャリアー及び2−(4−ヨードフェニル)−3−
(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェ
ニル)−2H−テトラゾリウム塩を作用させることによ
って生成するホルマザン類及び(ii)3−オキソ胆汁酸
に、3−オキソ−5β−ステロイド−Δ4−脱水素酵素
及び2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフ
ェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−
テトラゾリウム塩を作用させることによって生成するホ
ルマザン類の合計量を定量することを特徴とする定量
法。 - 【請求項4】 電子キャリアーが、ジアホラーゼ、1−
メトキシフェナジニウムメチルサルフェート及び9−ジ
メチルアミノベンゾ−α−フェナゾキソニウムクロライ
ドからなる群から選ばれる少なくとも1種である請求項
1〜3のいずれかに記載の定量法。 - 【請求項5】 第1試薬及び第2試薬を含む硫酸抱合型
胆汁酸定量キットであって、(I)第1試薬が、β−ヒ
ドロキシステロイド脱水素酵素、ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド、電子キャリアー及び2−(4−ヨー
ドフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−
(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム
塩を含み、(II)第2試薬が胆汁酸硫酸スルファターゼ
を含む硫酸抱合型胆汁酸定量キット。 - 【請求項6】 請求項5に記載のキットであって、第1
試薬が、更に3−オキソ−5β−ステロイド−Δ4−脱
水素酵素を含むことを特徴とするキット。 - 【請求項7】 電子キャリアーが、ジアホラーゼ、1−
メトキシフェナジニウムメチルサルフェート及び9−ジ
メチルアミノベンゾ−α−フェナゾキソニウムクロライ
ドからなる群から選ばれる少なくとも1種である請求項
5又は6に記載のキット。
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