WO1997023643A1

WO1997023643A1 - Methode pour determiner les acides biliaires conjugues avec l'acide sulfurique et kit prevu a cet effet

Info

Publication number: WO1997023643A1
Application number: PCT/JP1996/003678
Authority: WO
Inventors: Kenichi Adachi; Yasuhiko Tazuke; Yoji Tsukada
Original assignee: Marukin Shoyu Co., Ltd.
Priority date: 1995-12-21
Filing date: 1996-12-17
Publication date: 1997-07-03
Also published as: DE69620874T2; US5919644A; DE69620874D1; JPH09168397A; JP3760250B2; EP0811692A4; EP0811692B1; EP0811692A1

Description

明細書

硫酸抱合型胆汁酸の定量法及びそのキット

技術分野

本発明は、硫酸抱合型胆汁酸の定量法および硫酸抱合型胆汁酸定量キットに関するものであり、特に、このキットは、肝胆道系疾患診断に有用である。

背景技術

肝胆道系疾患によって、血液中の胆汁酸が著しく増加することは、よく知られており、血液中の胆汁酸の定量は、臨床検査において肝機能を調べる上で重要な項目となっている。尿中にあっても胆汁酸は血液中と類似した動態を示すことが明らかにされているカ、尿中では胆汁酸の多くが水溶性の高い硫酸抱合型（胆汁酸の 3位の水酸基の硫酸エステル型）として存在するようになるため、その測定が容易でなかった。

本発明者等は、先にこの硫酸抱合型胆汁酸の 3 位の硫酸エステルを効率良く加水分解する酵素：胆汁酸硫酸スルファターゼ（ B S S ) を開発し、この酵素を主剤として生体試料中の硫酸抱合型胆汁酸を酵素法により簡便に測定する方法を確立した（特開平 2 — 1 4 5 1 8 3 ) ₍ 続いて、この方法による尿中硫酸抱合型胆汁酸の測定が肝胆道系疾患の検査法として、 G O T、 G P T、ァ — G T P、 T B A等の血液化学検査と同等の診断効率を示し、この方法が尿による非侵襲的肝機能検査法として有用であることが明らかにされた（肝胆脬、第 3 1 巻（ 1 9 9 5年）、第 2号、 3 1 5 - 3 2 6頁）。

この方法（従来法）の測定原理は、硫酸抱合型胆汁酸を、まず B S S によって 3 ーヒドロキシ胆汁酸に変換させ、この胆汁酸へ /S — ヒドロキシステロイド脱水素酵素（ ^ 一 H S D ) を該脱水素酵素の補酵素であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ N A D ) の存在下に反応させることにより、 3 —ォキソ胆汁酸と共に生じる N A D Hを、 N A D Hの高感度発色試薬として汎用されている還元系発色試薬、ニトロテトラゾリゥムブルー ( N T B ) で比色定量する方法に基づいている。しかし、臨床検査法として、多数の検体を人手をかけずに、迅速に測定するという点では、以下の点で未だ充分ではなかつた ο

即ち、尿を検体とするこの方法では、血清に比べて個体差が大きく、尿検体の内因性の発色物質によるブランク値の継続的な増加があって、その程度が尿検体によつて変動するため、測定値からそのブランク値を消去するために B S Sを省いたブランク試薬による測定も行なわなければならず、 1 検体の測定に、 2種類の測定を並行して行う必要があり、操作が煩雑である。また、還元系発色試薬のニトロテトラゾリゥムブルー（ N T B ) およびそのホルマザンは、水に溶解しにくく、比色定量に用いるセルを 1 度使用すると試薬に汚染され、再利用するには、非常に綿密な洗浄が必要となり、自動分析装置への適用が困難になっている。従って、現状では測定は用手法とならざるを得ず、そのため、処理検体数、時間等で制約を受けている。

本発明は人手をかけず、より簡便に測定できるようにすべく、汎用されている自動分析装置に適した硫酸抱合型胆汁酸の定量法及びキットを提供することを目的とする o

発明の開示

自動分析装置用分析試薬の条件として、（ 1 ) 1 つの測定反応系で検体ブランクの消去を可能とする、（ 2 ) 全反応を短時間で完了する、（ 3 ) 装置の汚染の問題がなく、高感度の測定を可能とする、を挙げて鋭意検討を重ねた。

本発明者らは、研究段階において、 N T B (以下、比較試薬 a とする。）

に代えて試薬として種々の水溶性の還元系発色試薬の使用、例えば、 2 — ( 4 — ョードフエニル）一 3 — ( 2， 4 ージニトロフヱニノレ）一 5 — ( 2， 4 一ジスノレホフェニル）一 2 Η —テトラゾリゥムモノナトリウム塩（以下. 比較試薬 b とする。）

a +

や 2 —べンゾチアゾリノレ一 3 — （ 4 一力ノレボキシ一 2 — メトキシフエ二ル） — 5 — [ 4 — ( 2 —スルホェチルカルバモイル）フヱニル ] 一 2 H —テトラゾリゥム塩（以下、比較試薬 c とする。）

等の試薬を試みた。しかし、これら試薬を使用しても、尿中の発色物質の影響を強く受け、ブランク値が安定せず、自動化には適しておらず、本目的を達成するものではなカヽった。

しかしながら、更なる研究において、 2 — （ 4 ーョードフヱニル）一 3 — ( 4 —ニトロフヱニル） — 5 — （ 2 , 4 一ジスルホフヱニル）一 2 H —テトラゾリゥム塩（以下、本還元系発色試薬という場合がある。 )

(但し、 M +は、アルカリ金属イオン又はアルカリ土類金属イオンを示す。）

を使用することにより、初めて上記目的を達成することを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明者等は還元系発色試薬であるテトラゾリゥム塩の中で、 2 — ( 4 — ョードフエ二ル） — 3 — （ 4 — ニトロフエ二ノレ）一 5 — （ 2 , 4 — ジスノレホフェニル） - 2 H -テトラゾリゥム塩が尿又は血液中の発色物質の影響を受ける程度が極く軽微で、許容範囲内に納まることを見い出した。即ち、本発明では、この試薬を用いることにより、同一セルで第 1 反応として、第 1 試薬に含まれる発色試薬を作用させることによって検体中の内因性発色物質によるブランク発色反応を行なわせ、ブランク値として測定後、第 2 試薬に含まれる B S S を作用させ、検体中の硫酸抱合型胆汁酸の脱硫酸生成物による発色反応を測定、両反応の差から硫酸抱合型胆汁酸を測定することが可能となった。

また、 2 — ( 4 — ョードフヱニル） — 3 — ( 4 —ニト口フエ二ノレ）一 5 — ( 2， 4 — ジスノレホフヱ二ノレ）一 2 H —テトラゾリゥム塩およびそのホルマザンは、水溶性であることから、セルの洗浄が容易で、装置の汚染の問題が無く、且つ、そのホルマサンの分子吸光係数が ε = 3.7 x 10⁴ ( λ = 438nm) と高いことから、高感度測定が可能であつた。

即ち、本発明は、硫酸抱合型胆汁酸を胆汁酸硫酸スルファターゼ（ B S S ) 及び還元系発色試薬を用いて定量する方法において、該還元系発色試薬が 2 — ( 4 — ョ一ドフエ二ノレ）一 3 — ( 4 — ニトロフエニル）一 5 — ( 2， 4 — ジスルホフエニル） — 2 H —テトラゾリゥム塩である硫酸抱合型胆汁酸の定量法及び定量キッ卜を提供する。

詳しくは、（ 1 ) 検体に B S S を作用させ、（ 2 ) 次いで、得られた 3 /3 — ヒドロキシ胆汁酸にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ N A D ) の存在下、 β - ヒドロキシステロィド脱水素酵素（ S — H S D ) を作用させ、（ 3 ) 3 —ォキソ胆汁酸と共に生じる N A D Hに、電子キャリア一及び 2 — （ 4 — ョードフヱニル） — 3 - ( 4 — ニトロフエ二ノレ）一 5 — ( 2, 4 — ジスノレホフェニル）一 2 H—テトラゾリゥム塩を作用させることによつて生成するホルマザンを定量することを特徴とする定量法を提供するものである。

キットとして、本発明は、；5 — H S D、 A D. 電子キャリア一及び 2 — （ 4 — ョ一ドフエニル） — 3 — ( 4 —ニトロフエ二ノレ）一 5 — ( 2， 4 — ジスノレホフェニル） — 2 H -テトラゾリゥム塩を含む第 1 試薬、及び B S S を含む第 2試薬を含む硫酸抱合型胆汁酸定量キットを提供する。

更に、 /3 — H S Dの反応生成物である 3 —ォキソ胆汁酸に作用する脱水素酵素、 3 —ォキソ— 5 /3 —ステロイドー Δ ⁴ —脱水素酵素（Δ ⁴— D H )を共役させることにより、脱水素反応の結果生じる H +の受容体として 2 - （ 4 一ョードフエニル）一 3 — ( 4 —ニトロフエニル）一 5 — ( 2 , 4 — ジスノレホフェニル）一 2 H—テトラゾリゥム塩が反応し、更に 1 分子のホルマザンが生成することから、吸光度値が約 2倍になり、この酵素を共役させることにより測定感度は、従来の約 2倍にアップすることち見出した。即ち、本発明は、上記定量法の（ 3 ) の工程において、 (i)3 —ォキソ胆汁酸と共に生じる N A D Hに、電子キヤリア一及び 2 - （ 4 — ョードフヱニル）一 3 _ ( 4 —二トロフエニル）一 5 — ( 2， 4 一ジスノレホフェニノレ）一 2 H—テトラゾリゥム塩を作用させることによって生成するホルマサン及び（ii) 3 —ォキソ胆汁酸に Δ ⁴— D H及び 2 — ( 4 — ョードフヱニル）一 3 — ( 4 — ニトロフエ二ル） — 5 — ( 2， 4 — ジスルホフヱ二ル） — 2 H—テトラゾリゥム塩を作用させることによって生成するホルマサンの合計量を定量することを特徴とする定量法、及び、上記キットの第 1 試薬が、 3 — H S D、 A D, 電子キャリアー、 Δ ⁴_ ϋ Η及び 2 — ( 4 — ョードフヱニル） — 3 — （ 4 — ニトロフエ二ノレ）一 5 — ( 2, 4 — ジスルホフェニル） — 2 Η—テトラゾリゥム塩を含むキットも提供する。

この感度の上昇により、検体量が少なくてすむようになり、検体中の夾雑物の影響も減り、より精密な値が得られるようになった。

これら上記定量法及びキットを用いることにより、検体、例えば、尿又は血液中の硫酸抱合型胆汁酸を定量することが可能である。

上記定量法及びキットに使用される電子キャリアーとは、電子供与体から電子受容体へ電子を移動させる反応を触媒する物質である。

本還元系発色試薬である 2 — ( 4 — ョードフユニル） — 3 — ( 4 — ニトロフエニル）一 5 — （ 2， 4 — ジスノレホフ X ニル）一 2 H—テトラゾリゥム塩は、公知物質であり、市販品として容易に入手できる。塩として、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ塩、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。例えば、株式会社同仁化学研究所から、 W S T - 1 の名称で販売されているモノナトリウム塩が使用できる。

本発明に使用する各種酵素、 B S S、 /3 - H S D及び Δ ⁴— D Hは、公知物質であり、いずれの生物由来のものでも用いられ、例えば、いずれも Pseudomonas

testosteroni 由来のものが好適に用いられる。また、遺伝子工学的に製造されたものを使用することもできる。

B S S は、例えば、 Y. Tazuke, K. atsuda, K. Adac hi, & Y. Tsukada； Biosci. Biotech. Biochem.， 08, 8 89-894 ( 1994) の文献の記載に従って精製することができる。

;3 — H S Dは、伊 jえは Richard M， Schultz, Ernest V. Groman and Lewis し. Engel ； J . Biol. Chem 252， 3775-3783 ( 1977 )の文献の記載に従って精製することができる。あるいは、市販されている例えば、 Sigma Chem ical Co. から購入したものを使用することも可能である _c Δ ⁴— D Hは S. J. Davidson & P. Talalay； J. Bio 1. Chem. , 241, 906-915 ( 1966) の文献の記載に従って精製することができる。

本発明に使用する N A D も例えば、市販されているものを使用することができる。

本発明に使用される電子キャリア一としては、例えば、ジァホラーゼゃ N A D Hォキシダーゼなどの酵素、及びフエナジンメトサルフェート（ P M S ) 、 1 —メトキシフエナジニゥムメチルサルフェート（ 1 —メトキシ P M S ) 、 9 — ジメチルアミノベンゾ— α — フエナゾキソニゥムクロライド（メノレドラブル一）等の物質が例示され、 1 種又は 2種以上使用することができる。好ましくは、ジァホラーゼ、 1 ーメトキシフエナジニゥムメチルサルフエ一ト及び 9 — ジメチルアミノベンゾ— α — フエナゾキソニゥムクロライドからなる群から選ばれる少なくとも 1 種である。これら、電子キャリア一は、市販されているものを使用することができ、例えば、ジァホラ一ゼはオリエンタル酵母工業株式会社、 1 ーメトキシ P M S、メルドラブル一は株式会社同仁化学研究所により提供される製品が各々使用できる。

本発明の方法を以下に図 1 及び図 2 を用いて説明する。図 1 において、自動分析装置のセル内で、まず、検体、例えば尿又は血液に、 N A D、 yS — H S D、電子キヤリァー及び 2 - （ 4 — ョードフヱニル）一 3 - （ 4 一二ト口フエニル）一 5 — ( 2, 4 — ジスノレホフェニル）一 2 H -テトラゾリゥム塩を含む第 1 試薬を作用させる反応を第 1 反応として、検体中の内因性発色物質を所定時間内で反応、発色させ、ブランク値（図 1 における測定値 A ) として測定する。所要時間としては、約 5分程度である。

続いて、第 2反応として同一セル内へ B S Sを含む第 2試薬を添加し、検体中に含まれる硫酸抱合型胆汁酸を 3 /3 — ヒドロキシ胆汁酸に変換し、該 3 5 — ヒドロキシ胆汁酸を、所定時間内にセル内に存在しているー H S Dで酸化し、同時に生成する N A D Hを発色させて吸光度を測定する（測定値 B ) 。その所要時間は、約 2分から 5分程度である。得られた測定値 Bからブランク値 (測定値 A ) を差引いた値から、目的の検体中の硫酸抱合型胆汁酸値を算出する。

また、図 2 に示すように、 3 _ H S Dの反応生成物である 3 —ォキソ胆汁酸に作用する脱水素酵素、 Δ ⁴— D H を共役させることにより、脱水素反応の結果生じる H ⁺の受容体として 2 — ( 4 — ョードフヱニル）一 3 — ( 4 - ニトロフエニル）一 5 — ( 2 , 4 — ジスノレホフェニル）一 2 H —テトラゾリゥム塩が反応し、更に 1 分子のホルマサンが生成することから、吸光度値が約 2倍になり、この酵素を共役させることにより測定感度は従来法の約 2倍にアップすることも可能となった。

即ち、自動分析装置のセル内で、まず、検体、例えば尿又は血液に、 N A D、 /3 — H S D、 Δ ⁴— D H、電子キャリア一及び 2 — （ 4 — ョードフエ二ノレ）一 3 — ( 4 — ニトロフエニル）一 5 — ( 2， 4 一ジスルホフエ二ノレ）一 2 H —テトラゾリゥム塩を含む第 1 試薬を作用させる反応を第 1 反応として、検体中の内因性発色物質を所定時間內で、反応、発色させ、ブランク値（図 1 における測定値 A ) として測定する。所要時間としては、約 5分程度である。

続いて、第 2反応として同一セル内へ B S Sを含む第 2試薬を添加し、検体中に含まれる硫酸抱合型胆汁酸を 3 J3 — ヒドロキシ胆汁酸に変換し、該 3 β — ヒドロキシ胆汁酸を、所定時間内にセル内に存在している；5 — H S Dで酸化し、同時に生成する N A D H及び 3 —才キソ胆汁酸を、電子キャリアー及び本還元系発色試薬、及び、厶 ⁴一 D H及び本還元系発色試薬で発色させて吸光度を測定する（測定値 B ) 。その所要時間は、約 2分から 5分程度である。得られた測定値 Bからブランク値（測定値 A ) を差引いた値から、目的の検体中の硫酸抱合型胆汁酸値を算出する。

本発明の検体中の硫酸抱合型胆汁酸の測定原理は上記の通りである力、'、本発明は、生成する N A D H (及び 3 -ォキソ胆汁酸）の比色測定法の発色試薬として、 2 - ( 4 一ョードフヱニノレ）一 3 — （ 4 —ニトロフヱニル）一 5 — （ 2， 4 一ジスルホフエ二ル）一 2 H—テトラゾリウム塩を特定し、この試薬を使用した時、始めて目的とする 1 つの測定反応系で検体ブランクの消去が可能となることを見出した。

検体量としては、適宜選択できる。

特に、検体が尿の場合に、その効果が顕著であった。キットとしては、以下の通りである。第 1 試薬としては、基本的には — H S D、 N A D、電子キャリアー及び 2 — ( 4 — ョードフヱニル）一 3 — ( 4 —ニトロフエ二ル） — 5 — ( 2， 4 一ジスルホフヱ二ル） — 2 H—テトラゾリゥム塩（本還元系発色試薬）を含んでいる。更に、感度を倍増させるために、第 1 試薬に Δ ⁴— D Hを含有させることもできる。第 2試薬としては、 B S Sを含んでいる。

また、上記成分に加えて、反応促進のため及び干渉物質の影響を除くため、第 1 試薬及び第 2 試薬に、界面活性剤ゃァスコルビン酸酸化酵素（ A S 0 D )、及び緩衝剤を含有させることができる。

また、上記各酵素の安定化のために、第 1 試薬及び第 2 試薬中に、ソノレビトール、マンニトール、グリセ口一ル、サッカロース、トレハロースなどの糖類、血清アルブミン等を配合しても良い。また、エチレンジァミン四酢酸（ E D T A ) 、アジ化ナトリウム、ォキサミド酸を配合していても良い。

第 1 試薬及び第 2 試薬は、粉末（凍結乾燥品）の状態で、使用時に緩衝液や水を加えることによって調製しても良いし、溶液の状態であっても良い。添加する水又は緩衝液を、キット中に、試薬として含んでいても良い。

また、標準物質となる硫酸抱合型胆汁酸（好ましくはグリコリトコール酸一 3 —硫酸等）を含む試薬を、キット中の試薬としても良い。濃度としては、特に限定されない力、例えば、標準液中の濃度として 1 0 M〜 1 0 0 ^ M程度になるような濃度がよい。この試薬は粉末

(凍結乾燥品）の状態で、使用時に上記に記載の緩衝液や水を加えることによって調製しても良いし、溶液の状態であっても良い。添加する水又は緩衝液を、キット中に、試薬として含んでいても良い。

その他、キット中に一般的に使用されている試薬を、本発明のキッ卜に含んでいても良い。

これら試薬中の各成分は、キット中有効量含まれ、当業者であればその各成分の有効量を設定することができる。具体例として、以下のように例示する。

検体に、第 1 試薬及び第 2試薬が加えられた最終的な反応液中での各成分の濃度としては、以下の範囲で使用できる：

^ - H S D 100- 1， 000 Uノ 1

N A D 0.3〜5gZl

本還元系発色試薬 0.1〜 2gZ 1

Δ ⁴ - D H 100 〜 3, 000 U/ 1

第 1 試薬に含まれる電子キャリアーの濃度としては、反応液中の N A D Hから電子を移動するのに十分な濃度であれば、特に限定されない。例えば、ジァホラーゼの場合、 1， 000〜20， 000 Uノ 1、 1 —メトキシ P M S及びメルドラブルーの場合、 0.01~0.5mMの範囲で使用できる。他の電子キャリアーについては、これらの値を参考して濃度を設定することができる。

第 2試薬に含まれる B S Sの濃度としては、上記反応液中 100〜 3, 000U/ 1程度である。

上記各成分の好ましい範囲としては、以下の通りである。

β - U S Ό 200〜500 U/ 1

N A D 0.4〜 lg 1

本還元系発色試薬 0.2〜 0.5gZ l

電子キャリアー

ジァホラーゼ 2， 000〜 10， 000 U/ 1 1 ーメトキシ P M S

又はメルドラブル一 0.03- 0.05mM

Δ ⁴ - D H 300 〜 1, 000 U/ 1 B S S 200〜 500UZ 1

また、緩衝剤としては、グッドの緩衝剤、具体的には- H E P E S、 M O P S、 T A P S. H E P P S O、 T E S、 T A P S O、 P O P S O、 E P P S、 P I P E S等が使用できる。反応液中での濃度としては、 pH 7 〜 8 の 50〜200 mM グッド緩衝液になるような量配合されているのがよく、これらは、緩衝剤として第 1 試薬及び又は第 2 試薬に配合し、調製時に水を添加して、上記濃度になるように調製しても良いし、調製時に上記濃度の反応液になるように緩衝液を添加しても良い。この添加する水又は緩衝液も、キット中の試薬として、含まれていても良い。

A S 0 Dは、反応液中で 50〜 500ϋΖ ΐの濃度で含有されていてもよく、好ましい濃度としては 50 〜 200UZ 1である ο

含有してもよい界面活性剤としては、 Tween系界面活性剤が挙げられ、具体的には Tween 20が反応液中に 0.2〜 1. 5重量％含まれていてもよい。

その他、配合しても良い上記各成分も、適当な濃度で配合することができる。

本発明の方法は、具体的には以下の通りである。例えば、尿検体の場合、検体 10〜 20 z 1に対し、第 1 試薬を添加、混合して 37°C下所定時間（例えば約 5分間）反応した時点の吸光度を読み取り、この値をブランク値とし、続いて第 2試薬を添加、混合して更に所定時間（例えば 2 〜 5分間）反応を継続した時点の吸光度を読み取って、この値からブランク値を差し引き、得られる吸光度の増加値を求めることにより行われる。尿検体中の硫酸抱合型胆汁酸値は、同様の操作から得た標準物質を含む標準液での吸光度増加値を標準値として比例計算により求めることができる。

血液の場合も、上記の方法と同様に行うことができる。

図面の簡単な説明図 1 は、本発明の方法及び従来の方法を示す図である。図 2 は、本発明の方法を示す図である。

図 3 は、自動分析装置を使用して、 N T Bを還元系発色試薬として各種尿検体（No.1〜 10)を測定した時の吸光度の経時的変化（ 1 ポイント： 25秒）を示す図である。

図 4 は、自動分析装置を使用する尿検体の測定において還元系発色試薬の種類による吸光度の経時的変化（ 1 ポイント： 25秒）を示す図である。

図 5 は、自動分析装置を使用して、本還元系発色試薬を用いて、各種尿検体（No.1〜 10)を測定した時の吸光度の経時的変化（ 1 ボイント： 25秒）を示す図である。

図 6 は、自動分析装置を使用して、 N T Bを還元系発色試薬として測定した値と従来法（用手法）の測定値との相関性を示す図である。

図 7 は、本発明の方法（本還元系発色試薬を用いた自動分析）と従来法（用手法）の測定値間の相関性を示す図であ。

図 8 は、実施例 4 における、 GLCA- S濃度に対する

450ηιπにおける吸光度変化量の結果を示す図である。

図 9 は、実施例 4 における、尿濃度に対する 450ηπιにおける吸光度変化量の結果を示す図である。

図 1 0 は、実施例 5 における、 GLCA- S濃度に対する 450nmにおける吸光度変化量の結果を示す図である。

図 1 1 は、実施例 5 における、尿濃度に対する 450ηιηにおける吸光度変化量の結果を示す図である。

図 1 2 は、実施例 6 における、 GLCA- S濃度に対する 45 Onmにおける吸光度変化量の結果を示す図である。

本発明によれば、汎用されている臨床検査用自動分析装置を用いて硫酸抱合型胆汁酸の定量が 1反応系でできるようになり、測定の操作性が大幅に改善され、人手を要さない自動分析装置での測定が可能となり、検体の測定処理性能の改善も可能となった。

発明を実施するための最良の形態

以下、実施例を用いて、より詳細に説明する力、'、本発明はこれらに制限されるものではない。本明細書において、特に記載がない限り、％は、重量％を示す。

比較例 1 還元系発色試薬としてニトロテトラゾリゥムブルー（ N T B ) (比較試薬 a ) を使用した時の吸光度の経時的変化

還元系発色試薬として N T Bを使用して、下記組成の第 1 試薬及び第 2試薬を用いて、自動分析装置 C O B A S M I R Aにより 1 0種類の尿を検体として測定を行い、吸光度の経時的変化を観測した。反応温度は 37°Cで、検体 20 1、精製水 30 u 1及び第 1 試薬 160 1添加し 5分間反応後、同一セルに第 2 試薬 40 1及び精製水 10^ 1添加し、 2 5秒ごとに 5 5 0 n mの吸光度を測定した。第 1 試薬及び第 2試薬中の各成分濃度は以下の通りである。第 1 試薬（ p H 7. 5 )

ジァホラ一ゼ（オリエンタル酵母工業株式会社）

： 5, 000 U/1 S - H S D (J. Biol. Chem 252, 3775-3783 ( 1977)の記載に従つて精製）： 500 U/1

;3 — N A D (オリエンタル酵母工業株式会社）

： 1 /1

N T B (ナカライテスク株式会社）： 0.5g/l

A S O D (オリエンタル酵母工業株式会社）

： 200 U/1

Tween20 (ナカライテスク株式会社）

： 0.5 重量％ソルビトール（ナカライテスク株式会社）

: 20 重量％

HEPES (ナカライテスク株式会社）： 100 mM 第 2試薬（ p H 7. 5 )

B S S ( Biosci. Biotech. Biochem. , 58, 889-894

( 1994) の記載に従つて精製）

： 2, 000 U/1 Tween20 ： 0. 5 重量 ¾ ソルビトーノレ： 20 重量％

HEPES ： 100 mM 結果を図 3 に示した。第 1 反応のブランク値が直線的に増加し、所定時間の 5 分間で完結せず、第 2 反応に移行しても同様の傾向が継続した。また、尿検体によってブランク値の増加傾向に差があった。

従って、還元系発色試薬として N T B を用いた場合、前述のブランク反応を別のセルで並行して行なう方法を取らざるを得ない状況にあった。

突施例 1 各種テトラゾリゥム塩を還元系発色試薬として使用したときの吸光度の経時的変化

以下の各種テトラゾリゥム塩を還元系発色試薬として使用したときの吸光度の経時的変化を観測した。

還元系発色試薬：

(比較試薬 a ) N T B (ナカライテスク株式会社） (比較試薬 d ) 3 - ( 4 , 5 — ジメチル— 2 — チアゾリル）一 2， 5 — ジフヱニル一 2 H テトラゾリゥムブ口ミド、 S igma chem i ca l Co. )

(比較試薬 b ) 2 — ( 4 — ョ一ドフヱニル）一 3 - （ 2, 4 — ジニトロフヱニノレ）一 5 - ( 2 , 4 一ジスノレホフェニル） — 2 H— テトラゾリゥムモノナトリゥム塩（株式会社同仁化学研究所、 W S T - 3 )

(比較試薬 c ) 2 —べンゾチァゾリノレー 3 — ( 4 一カルボキシ — 2 — メトキシフエ二ル）一 5 — [ 4 一（ 2 — スノレホェチルカノレバモイノレ）フェニル ] — 2 H—テトラゾリウム塩（株式会社同仁化学研究所、 W S T 一 4 )

(本還元系発色試薬） 2 - ( 4 ーョードフヱニル）一 3 ― ( 4 一二トロフエ二ノレ）一 5 - （ 2， 4 - ジスルホフェニル） — 2 H— テトラゾリゥムモノナトリウム塩 (株式会社同仁化学研究所、 W S T - 1 )

下記組成の第 1 試薬及び第 2 試薬を用いて、自動分析装置 C O B A S M I R Aにより尿を検体として測定を行い、吸光度の経時的変化を観測した。反応温度は 37°C で、検体 20 1、精製水 30 1及び第 1 試薬 160 1添加し 5分間反応後、同一セルに第 2試薬 40^ 1及び精製水 10 // 1添加し、 2 5秒ごとに吸光度を測定した。比較試薬 a、比較試薬 c 及び比較試薬 dを用いた場合は 5 5 0 n mの吸光度、比較試薬 b及び本還元系発色試薬を用いた場合は 4 5 0 n mの吸光度を測定した。第 1 試薬及び第 2試薬中の各成分濃度は以下の通りである。

第 1 試薬（pH7.5)

ジァホラ一ゼ 5, 000 U/1

/3 - H S D 500 U/1

β - N Α Ό 1 g/1

各種還元系発色試薬 0.5 g/1

A S 0 D 200 U/1

Tween20 0.5 重量％

ソゾレビトーノレ 20 重量％

HEPES 100 mH

第 2試薬（pH7.5)

B S S 2， 000 ϋ/1

Tween20 0.5 重量％

ソノレビトーノレ 20 重量％

HEPES 100 mM 結果を図 4 に示した。比較試薬 a、比較試薬 b、比較試薬 c 及び比較試薬 d ではブランク値の継続的増加があるのに反して、本還元系発色試薬では反応が速やかに進行し、且つ、尿中の内因性発色物質の影響を受けにくいため、ブランク値が許容範囲内で安定していた。

実施例 2 還元系発色試薬として 2 — （ 4 — ョードフエ二ル） — 3 — ( 4 —ニトロフヱニル） — 5 — （ 2 , 4 — ジスルホフエニル） — 2 H —テトラゾリゥム塩（本還元系発色試薬）を使用したときの吸光度の経時的変化

還元系発色試薬として 2 — （ 4 — ョードフヱニル）一 3 — （ 4 —ニトロフエニル） — 5 — ( 2， 4 — ジスルホフエニル）一 2 H —テトラゾリゥムモノナトリウム塩 (株式会社同仁化学研究所、 W S T - 1 ) を使用して、 1 0種類の尿検体での吸光度の経時的変化を実施例 1 と同様の方法によって観測した。結果を図 5 に示した。

何れの尿検体でもブランク値は 5分以内にほぼ安定化し、反応は速やかに進行して、第 2試薬添加後、 2 ~ 3 分の測定で、ブランク値の変動の影響を殆ど受けることなく、硫酸抱合型胆汁酸の測定が可能であった。

実施例 3 従来の方法と本発明の方法との相関

還元系発色試薬として N T B (比較試薬 a ) 及び 2 — ( 4 ーョードフヱニル）一 3 — ( 4 —ニトロフヱニノレ） - 5 - ( 2, 4 一ジスルホフエ二ル） — 2 H—テトラゾリウムモノナトリウム塩（本還元系発色試薬）を使用した本発明の方法での測定値と従来の方法の測定値との相関関係を、尿を検体として調べた。

従来の方法として、「ユーバステック」（マルキン醤油株式会社製）を用いて測定した。具体的には以下の通りである。

測定用及び検体盲検用の試験管を用意し、各試験管に尿を 200 1 を加えた。測定用試験管に以下に記載の第 1 ' 試薬酵素液を 400 1、検体盲検用試験管に第 1 ' 試薬ブランク液を 400 I 加え混和し、 3 7 °Cで 1 0分間加温した。各試験管に第 2 ' 試薬発色液を 1 加え混和し、更に 3 7 °Cで 1 0分間加温した。その後各試験管に 2 IV [クェン酸水溶液を 100 1 加え反応を停止し、それぞれを水を対照として波長 5 4 0 n mで、第 1 ' 試薬酵素液を加えた反応液の吸光度（ A ' ) , 第 1 ' 試薬ブランク液を加えた反応液の吸光度（ Β ' ) を測定し、

( A ' — B ' ) を求め、標準液（グリコリトコール酸一 3 —硫酸、 5 0 ^ m o l Zl) での測定値から各尿中の硫酸抱合型胆汁酸の濃度を定量した。

第 1 ' 試薬酵素液

B S S ： 2.5U / m 1 A S O D : 2.5U Zm 】

Tris_HCl緩衝液： 0.1M ( p H 7 5 )

第 1 ' 試薬ブランク液

A S O D 2.5U / m 】

Tris- HC1緩衝液 0.1M ( p H 7 5 )

第 2 ' 試薬発色液

ジァホラーゼ： 4.0 U /m 1

^ - H S D : 0.7 U /m 1

^ - N A D ： 1.3 m g / m 1

NN TT BB : 0.4 m g / m 1

リン酸緩衝液 : 0. 2 M ( p H 7. 0 )

本発明の方法については、以下の通りである。

下記組成の第 1 試薬及び第 2試薬を用いて、日立 7070 型自動分析装置により各種尿を検体として測定を行った。反応温度は 37°Cで、検体 20 1及び第 1 試薬 240 ^ 1添加し 5分間反応後第 2試薬 50 1添加、第 2試薬添加 2分後の 450nmの吸光度から第 2試薬添加前の 450nmの吸光度をブランクとして差し引き、その吸光度差を測定値とした。標準液（グリコリトコール酸— 3 —硫酸、 5 0 m o 1 /1、 ( Sigma chemical Co. ) ) での測定 ί直力、ら各尿中の硫酸抱合型胆汁酸の濃度を定量した。

第 1 試薬（ρΗ7.5) ジァホラーゼ： 5, 000 U/1 一 H S D ： 500 U/1

β ~ N Α Ό ： 1 g/1

比較試薬 a又は本還元系発色試薬： 0.5 g/1

A S 0 D ： 200 U/1

Tween20 ： 0.5 重量％ソノレビトール： 20 重量％

HEPES ： 100 mM

第 2試薬（pH7.5)

B S S ： 2, 000 U/1 Tween20 ： 0.5 重量％ソノレビトーノレ： 20 重量％

HEPES ： 100 mH

結果を図 6 および図 7 に示した。 N T Bでは、ブランク値の増加が加筹されるため、その分従来法に比べ高値 (1.3 倍程度）になり、相関係数も悪くなる傾向にあった。

他方、本還元系発色試薬では、従来法との相関係数は r= 0.995 と極めて良好で、測定値もほぼ 1 対 1 の関係にあって、従来法と同等の正確度の測定法であることが示された。

実施例 4 ジァホラーゼ含む第 1 試薬を用いての本発明の効果下記組成の第 1 試薬及び第 2 試薬を用いて、日立 7070 型自動分析装置により各濃度（ 20〜 200 /z mol/1) に調製したグリコリトコール酸— 3 —硫酸（ GLCA- S) 溶液及び、 5 段階に希釈した 3 種類の尿を検体として測定を行った。還元系発色試薬として、実施例 1 に記載の 2 — （ 4 ーョ一ドフヱニル） — 3 — ( 4 — ニトロフヱニル）一 5 — ( 2 , 4 _ ジスルホフエニル）一 2 H —テトラゾリゥムモノナトリウム塩（本還元系発色試薬）を使用した。反応温度は 37°Cで、検体 20 1及び第 1 試薬 240 1添加し 5 分間反応後第 2 試薬 50 1添加、第 2 試薬添加 2 分後の 450nmの吸光度から第 2 試薬添加前の 450ηπιの吸光度をブランクとして差し引き、その吸光度差を測定値とした。第 1 試薬（_ΡΗ7.5)

ジァホラーゼ： 5, 000 U/1

^ - H S D ： 500 U/1

/3 - N A D ： 1 g/1

本還元系発色試薬： 0.5 g/1

A S 0 D 200 U/1

Tween20 0.5 重量％

ソノレビトーノレ 20 重量

HEPES 100 mM

第 2 試薬（pH7.5) B S S ： 2， 000 U/1

Tween20 ： 0.5 重量％

ソノレビトーノレ： 20 重量％

HEPES ： 100 mM

結果を図 8及び図 9 に示す。図 8 に示す様に、 GLCA - S 濃度と測定値の間には、原点を通る良好な直線性が得られた。図 9 に示す様に、 5段階に希釈した 3種類の尿についても直線性が得られた。

実施例 5 ジァホラーゼ及び Δ ⁴— D Hを含む第 1 試薬を用いての本発明の効果

下記組成の第 1 試薬及び第 2試薬を用いて、日立 7070 型自動分析装置により各濃度（20〜 200 /z mol/1) に調製したグリコリトコール酸— 3—硫酸（GLCA- S) 溶液及び、 5段階に希釈した 3種類の尿を検体として測定を行った。還元系発色試薬として、実施例 1 に記載の 2 — （ 4 ーョ — ドフエ二ノレ）一 3 — （ 4 一二トロフヱニノレ）一 5 — ( 2 , 4 — ジスノレホフェニル）一 2 H — テトラゾリゥムモノナトリウム塩（本還元系発色試薬）を使用した。反応温度は 37°Cで、検体 20 1及び第 1 試薬 240 i添加し 5分間反応後第 2試薬 50 ^ 1添加、第 2試薬添加 2分後の 450nmの吸光度から第 2試薬添加前の 450nmの吸光度をブランクとして差し引き、その吸光度差を測定値とした。第 1 試薬（pH7.5)

ジァホラーゼ： 5, 000 U/1

ー H S D ： 500 U/1

厶 ⁴ — D H ( J. Biol. Chera.， 241 906-915 (1966) の記載に従つて精製）： 1, 000 U/1

^ - N A D ： 1 g/1

本還元系発色試薬 0.5 g/1

A S 0 D 200 U/1

Tween20 0.5 重量! ¾

ソルビトール 20 重量％

HEPES 100 mM

第 2試薬（pH7.5)

B S S 2, 000 U/1

Tween20 0.5 重量％

ソルビトーノレ： 20 重量

HEPES ： 100 mM

結果を図 1 0及び図 1 1 に示す。図 1 0 に示す様に、 GLCA- S濃度と測定値の間には、原点を通る良好な直線性が得られた。図 1 1 に示す様に、 5段階に希釈した 3種類の尿についても直線性が得られた。

実施例 6 1 —メトキシ P M Sを含有する第 1 試薬用 t ての ¾^ HJの下記組成の第 1 試薬及び第 2試薬を用いて、日立 7070 型自動分析装置により各濃度（20〜 200 ^ mol ）に調製したグリコリトコ一ル酸— 3—硫酸（GLCA- S) 溶液を検体として測定を行った。還元系発色試薬として、実施例 1 に記載の 2 — （ 4 一ョードフエニル）一 3 — （ 4 —ニト口フエ二ノレ）一 5 — ( 2， 4 — ジスルホフエニル）一 2 H —テトラゾリゥムモノナトリウム塩（本還元系発色試薬）を使用した。反応温度は 37°Cで、検体 20 ^ 1及び第 1 試薬 240 1添加し 5分間反応後第 2試薬 50 ^ 1添加、第 2試薬添加 2分後の 450ηιπの吸光度から第 2試薬添加前の 450nmの吸光度をブランクとして差し引き、その吸光度差を測定値とした。

第 1 試薬（pH7.5)

1—メトキシ P M S 0.05 mM (株式会社同仁化学研究所） /3 - H S D 500 U/1

β - N Α Ό 1 g/1

本還元系発色試薬 0.5 g/1

A S 0 D 200 U/1

Tween20 0.5 重量 ¾

ソノレビトーノレ 20 重量! ¾

HEPES 100 mM

第 2試薬（pH7.5) B S S ： 2, 000 U/l

Tween20 ： 0.5 重量

ソノレビトーノレ： 20 重量! ¾

HEPES ： 100 mH

結果を図 1 2 に示す。図 1 2 に示す様に、 GLCA- S濃度と測定値の間には、原点を通る良好な直線性が得られた,

Claims

請求の範囲

1. 硫酸抱合型胆汁酸を胆汁酸硫酸スルファターゼ及び還元系発色試薬を用いて定量する方法において、還元系発色試薬が 2 — ( 4 — ョードフニニル） — 3 — （ 4 —ニトロフエ二ル）一 5 — （ 2， 4 一ジスノレホフェニル）一 2 H—テトラゾリゥム塩である硫酸抱合型胆汁酸の定量法。

2. 請求項 1 に記載の方法であって、

( 1 ) 検体に胆汁酸硫酸スルファタ一ゼを作用させ、 ( 2 ) 次いで、得られた 3 S — ヒドロキシ胆汁酸にニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下、 /3 — ヒドロキシステロィド脱水素酵素を作用させ、

( 3 ) 3 —ォキソ胆汁酸と共に生じる N A D Hに、電子キャリア一及び 2 — ( 4 — ョ一ドフヱ二ノレ）ー 3 — ( 4 一二トロフエニル）一 5 — （ 2， 4 — ジスノレホフェニル）一 2 H —テトラゾリゥム塩を作用させることによって生成するホルマザンを定量する

ことを包含する定量法。

3. 請求項 1 に記載の方法であって、

( 1 ) 検体に胆汁酸硫酸スルファターゼを作用させ、

( 2 ) 次いで、得られた 3 — ヒドロキシ胆汁酸にニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下、 yS — ヒドロキシステロィド脱水素酵素を作用させ、

( 3 ) (i) 3 -ォキソ胆汁酸と共に生じる N A D Hに、電子キャリアー及び 2 — ( 4 — ョードフヱニル） — 3 — ( 4 一二トロフエニル） — 5 — ( 2， 4 — ジスルホフヱニル）一 2 H—テトラゾリゥム塩を作用させることによって生成するホルマザン及び

(ii) 3 —ォキソ胆汁酸に、 3 —ォキソ — 5 ーステロイド一 Δ ⁴ —脱水素酵素及び 2 - （ 4 一ョ一ドフエ二ル） — 3 — ( 4 —二トロフエ二ル） — 5 — ( 2， 4 一ジスルホフエニル） — 2 H—テトラゾリゥム塩を作用させることによって生成するホルマサン

の合計量を定量する

ことを包含する定量法。

4. 電子キャリアー力、'、ジァホラ一ゼ、 1 — メトキシフェナジニゥムメチルサルフェート及び 9 — ジメチルァミノベンゾ一ひ一フニナゾキソニゥムクロライドカ、らなる群から選ばれる少なくとも 1種である請求項 1 〜 3のいずれかに記載の定量法。

5. 第 1試薬及び第 2試薬を含む硫酸抱合型胆汁酸定量キットであって、

( I ) 第 1試薬が、 — ヒドロキシステロイド脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、電子キャリア一及び 2 — ( 4 — ョードフヱニル） — 3 — ( 4

—ニトロフエニル）一 5 — ( 2, 4 — ジスルホフエ二ル）一 2 H—テトラゾリゥム塩を含み、

(II) 第 2試薬が胆汁酸硫酸スルファタ一ゼを含む硫酸抱合型胆汁酸定量キッ卜。

6. 請求項 5 に記載のキットであって、第 1 試薬が、更に 3 _ォキソ — 5 /3 — ステロイドー Δ ⁴—脱水素酵素を含むキット。

7. 電子キャリアーが、ジァホラーゼ、 1 ーメトキシフェナジニゥムメチルサルフエ一ト及び 9 ージメチルァミノベンゾ一 α — フエナゾキソニゥムクロライドカ、らなる群から選ばれる少なくとも 1種である請求項 5又は 6 に記載のキット。