JP3217066B2 - アナライトの嫌気的定量に有用な組成物 - Google Patents
アナライトの嫌気的定量に有用な組成物Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、特定アナライト（被分析物）の定量に有用
な組成物に関するものである。特に、本発明は、一連の
反応の最終結果として鉄（II）イオン含有錯体が形成さ
れる組成物に関するもので、錯体の量がサンプル中のア
ナライトの量に相関している。
な組成物に関するものである。特に、本発明は、一連の
反応の最終結果として鉄（II）イオン含有錯体が形成さ
れる組成物に関するもので、錯体の量がサンプル中のア
ナライトの量に相関している。
背景および従来の技術 臨床化学の主な関心事はサンプル中の特定アナライト
の定性および定量測定にある。血液、血清、尿などの体
液サンプルの分析に特に関心が集中している。各種アナ
ライトの存在および／または量を測定し、その後、確立
されたパラメーターと比較することにより、疾病すなわ
ち異常な状態の診断が下される。
の定性および定量測定にある。血液、血清、尿などの体
液サンプルの分析に特に関心が集中している。各種アナ
ライトの存在および／または量を測定し、その後、確立
されたパラメーターと比較することにより、疾病すなわ
ち異常な状態の診断が下される。
当技術分野では血液、血清、尿などのサンプル中のグ
ルコース、コレステロール、クレアチン、サルコシン、
尿素、その他の物質の測定が研究されてきたので、体液
サンプルの分析測定に関する文献は膨大である。
ルコース、コレステロール、クレアチン、サルコシン、
尿素、その他の物質の測定が研究されてきたので、体液
サンプルの分析測定に関する文献は膨大である。
初期の臨床医学文献はアナライトの非酵素的定量法を
教示している。この例はKaplanおよびPesceがClinical
Chemistry:Theory,Analysis and Correlation（Mosby 1
984）,p.1032−1042において教示したグルコース定量試
験である。この試験は銅イオンの還元、銅とモリブデン
酸の反応などを含むものである。上記文献が指摘するよ
うに、この方法は低い特異性と他のアナライトによる干
渉のために精度が不十分である。Kaplanらによって開示
された１つの方法はアルカリ性フェリシアン化物試験で
ある。この方法は、アルカリ性条件下で、フェリシアン
化物の存在下にグルコース含有溶液を加熱することが必
要である。反応は、次式： に従う黄色から無色への色の変化により達成される。こ
の色の消失を測定するか、あるいは無色のフェロシアン
イオンと鉄（III）イオンとの反応（着色沈殿物の「プ
ルシアンブルー」を形成する）を測定する。
教示している。この例はKaplanおよびPesceがClinical
Chemistry:Theory,Analysis and Correlation（Mosby 1
984）,p.1032−1042において教示したグルコース定量試
験である。この試験は銅イオンの還元、銅とモリブデン
酸の反応などを含むものである。上記文献が指摘するよ
うに、この方法は低い特異性と他のアナライトによる干
渉のために精度が不十分である。Kaplanらによって開示
された１つの方法はアルカリ性フェリシアン化物試験で
ある。この方法は、アルカリ性条件下で、フェリシアン
化物の存在下にグルコース含有溶液を加熱することが必
要である。反応は、次式： に従う黄色から無色への色の変化により達成される。こ
の色の消失を測定するか、あるいは無色のフェロシアン
イオンと鉄（III）イオンとの反応（着色沈殿物の「プ
ルシアンブルー」を形成する）を測定する。
これら初期の「キレート化」型試験は、酵素科学が発
展してきたため、特異性の高いアッセイに置き換えられ
るようになった。酵素はその極端な特異性について知ら
れており、こうして、当業者は適切な酵素を使用するこ
とにより、特定のアナライトが存在するかどうか、そし
てその量はどれほどかを、むしろ簡単に測定できるよう
になった。これらの酵素系は、酵素反応と組み合わせた
とき検出可能なシグナルを発する指示薬系を併用する必
要がある。Kaplanはグルコース−ヘキソキナーゼ系およ
びグルコース−オキシダーゼ系を開示しており、これら
は当技術分野でかなりよく知られている。それらはトリ
ンダー試薬（Trinder reagent）として知られる「共役
指示薬」のような指示薬系、またはｏ−トルイジンおよ
び3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジンのような被酸
化性指示薬とともに用いられる。こうした系では、酵素
とその基質の反応が酵素によって担持される余剰電子を
生成し、この電子が指示薬系によって取り除かれる。続
いて、サンプル中のアナライトの有無または量を示す発
色が生じる。
展してきたため、特異性の高いアッセイに置き換えられ
るようになった。酵素はその極端な特異性について知ら
れており、こうして、当業者は適切な酵素を使用するこ
とにより、特定のアナライトが存在するかどうか、そし
てその量はどれほどかを、むしろ簡単に測定できるよう
になった。これらの酵素系は、酵素反応と組み合わせた
とき検出可能なシグナルを発する指示薬系を併用する必
要がある。Kaplanはグルコース−ヘキソキナーゼ系およ
びグルコース−オキシダーゼ系を開示しており、これら
は当技術分野でかなりよく知られている。それらはトリ
ンダー試薬（Trinder reagent）として知られる「共役
指示薬」のような指示薬系、またはｏ−トルイジンおよ
び3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジンのような被酸
化性指示薬とともに用いられる。こうした系では、酵素
とその基質の反応が酵素によって担持される余剰電子を
生成し、この電子が指示薬系によって取り除かれる。続
いて、サンプル中のアナライトの有無または量を示す発
色が生じる。
特許文献はこのような系の議論に満ちている。かかる
特許の非限定的例として、米国特許第4,680,259,4,212,
938,4,144,129および3,925,164号（コレステロールオキ
シダーゼ）；同第4,672,029,4,636,464,4,490,465およ
び4,418,037号（グルコースオキシダーゼ）；ならびに
同第4,614,714号（Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ）を
挙げることができる。これらの酵素系はすべて、基質
（すなわち、対象のアナライト）から電子を奪い取ると
いう点でその基質を「酸化する」ものである。
特許の非限定的例として、米国特許第4,680,259,4,212,
938,4,144,129および3,925,164号（コレステロールオキ
シダーゼ）；同第4,672,029,4,636,464,4,490,465およ
び4,418,037号（グルコースオキシダーゼ）；ならびに
同第4,614,714号（Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ）を
挙げることができる。これらの酵素系はすべて、基質
（すなわち、対象のアナライト）から電子を奪い取ると
いう点でその基質を「酸化する」ものである。
いったんアナライトが電子を失うと、アナライトは定
量反応においてそれ以上の役割を果たすことはない。先
に示したように、電子は米国特許第4,291,121号に記載
されるトリンダー系のような発色系、または例えば米国
特許第4,576,913号に記載されるようなテトラゾリウム
系に移動する。これらの系は酵素から電子を移す「媒介
物質」、「電子移動剤」または「電子シャトル」として
知られる物質を使用する。最後には、媒介物質が電子を
放出する。媒介物質は１分子あたり１個または２個の電
子を吸着することができる。好適な媒介物質であるフェ
リシアン化物は１分子あたり１個の電子を取り上げる。
上記の米国特許第4,576,913号は、別の媒介物質（すな
わち、フェナジンメトスルフェート）とテトラゾリウム
塩との併用を教示している。指示薬として作用するのは
後者の化合物である。これらの媒介物質を使用すると、
酸素の不在下での進行が可能である。通常、グルコース
定量反応では、還元された酵素から電子を除くのに酸素
が必要とされる。これは過酸化水素を生成し、 過酸化水素はペルオキシダーゼの存在下で発色反応に参
加する。
量反応においてそれ以上の役割を果たすことはない。先
に示したように、電子は米国特許第4,291,121号に記載
されるトリンダー系のような発色系、または例えば米国
特許第4,576,913号に記載されるようなテトラゾリウム
系に移動する。これらの系は酵素から電子を移す「媒介
物質」、「電子移動剤」または「電子シャトル」として
知られる物質を使用する。最後には、媒介物質が電子を
放出する。媒介物質は１分子あたり１個または２個の電
子を吸着することができる。好適な媒介物質であるフェ
リシアン化物は１分子あたり１個の電子を取り上げる。
上記の米国特許第4,576,913号は、別の媒介物質（すな
わち、フェナジンメトスルフェート）とテトラゾリウム
塩との併用を教示している。指示薬として作用するのは
後者の化合物である。これらの媒介物質を使用すると、
酸素の不在下での進行が可能である。通常、グルコース
定量反応では、還元された酵素から電子を除くのに酸素
が必要とされる。これは過酸化水素を生成し、 過酸化水素はペルオキシダーゼの存在下で発色反応に参
加する。
往々にして、酸素を用いること、つまり好気系は好ま
しくない。なぜならば、こうした系に固有の問題が多々
あるからである。例えば、これらの反応では、大気中の
O2の分圧に反応が左右される。さらに、O2が試験媒体全
体に透過する必要があるから、かかる透過を可能とする
ように媒体の設計を適合させねばならない。それゆえ、
嫌気的である指示薬系（例えば、指示薬とともに媒介物
質を用いる系）または媒介物質のみを用いる電気化学系
には興味がもてる。発色のような検出可能なシグナルを
生じる指示薬反応を利用する嫌気系の必要性が存在して
いる。
しくない。なぜならば、こうした系に固有の問題が多々
あるからである。例えば、これらの反応では、大気中の
O2の分圧に反応が左右される。さらに、O2が試験媒体全
体に透過する必要があるから、かかる透過を可能とする
ように媒体の設計を適合させねばならない。それゆえ、
嫌気的である指示薬系（例えば、指示薬とともに媒介物
質を用いる系）または媒介物質のみを用いる電気化学系
には興味がもてる。発色のような検出可能なシグナルを
生じる指示薬反応を利用する嫌気系の必要性が存在して
いる。
上記のタイプの指示薬系を利用しうるが、これらに
は、指示薬分子自体がしばしば不安定で、長い保存寿命
を持ち合わせていないという難点がある。かくして、検
出可能なシグナルを発することができる安定した分子を
利用する系に関心が集まることとなる。
は、指示薬分子自体がしばしば不安定で、長い保存寿命
を持ち合わせていないという難点がある。かくして、検
出可能なシグナルを発することができる安定した分子を
利用する系に関心が集まることとなる。
Kaplanは、グルコース定量におけるプルシアンブルー
の形成を教示したが、特異性の欠如のために実行可能な
代替法としてはそれを退けたことが思い出されよう。こ
のほかにも、反応が起こると教示された厳しい条件は酵
素アッセイには全く適していない。Kaplanが教示する反
応は溶液を沸騰させることを必要とする。酵素はタンパ
ク質分子であり、タンパク質を煮沸するときに起こる特
徴として変性による不活性化がある。従って、当業者で
あれば、Kaplanの加熱パラメーターをスクリーンして、
酵素アッセイのためにこの教示を採用することを避ける
であろう。
の形成を教示したが、特異性の欠如のために実行可能な
代替法としてはそれを退けたことが思い出されよう。こ
のほかにも、反応が起こると教示された厳しい条件は酵
素アッセイには全く適していない。Kaplanが教示する反
応は溶液を沸騰させることを必要とする。酵素はタンパ
ク質分子であり、タンパク質を煮沸するときに起こる特
徴として変性による不活性化がある。従って、当業者で
あれば、Kaplanの加熱パラメーターをスクリーンして、
酵素アッセイのためにこの教示を採用することを避ける
であろう。
プルシアンブルー系の記述は上記の米国特許第4,576,
913号に見いだせる。この特許は、基質分子から２個の
電子を取り除くという点でオキシダーゼに類似した様式
で作用するグリセロールデヒドロゲナーゼを教示してい
る。この特許の第５欄には、指示薬としてのプルシアン
ブルー系（「ベルリン青」とも言う）が記載されてい
る。
913号に見いだせる。この特許は、基質分子から２個の
電子を取り除くという点でオキシダーゼに類似した様式
で作用するグリセロールデヒドロゲナーゼを教示してい
る。この特許の第５欄には、指示薬としてのプルシアン
ブルー系（「ベルリン青」とも言う）が記載されてい
る。
しかし、この特許は総括的に読む必要があり、特に酵
素の作用についての教示はそうである。酵素は非常にpH
感受性であり、上記特許の酵素はpH6.0〜10.0、最適に
はpH7.0〜8.5の範囲で作用すると書かれている。従っ
て、この教示は、グリセロールデヒドロゲナーゼがアル
カリ性pHで作用するから、プルシアンブルー系の酵素検
出への適合はアルカリ性pHであろうことを、当業者に示
唆するだろう。ところが、アルカリ性pHでは鉄（III）
塩が沈殿し、Adachiが必要であると記述する条件下でプ
ルシアンブルーを形成する反応に鉄（III）塩を参加さ
せることを妨げるだろう。
素の作用についての教示はそうである。酵素は非常にpH
感受性であり、上記特許の酵素はpH6.0〜10.0、最適に
はpH7.0〜8.5の範囲で作用すると書かれている。従っ
て、この教示は、グリセロールデヒドロゲナーゼがアル
カリ性pHで作用するから、プルシアンブルー系の酵素検
出への適合はアルカリ性pHであろうことを、当業者に示
唆するだろう。ところが、アルカリ性pHでは鉄（III）
塩が沈殿し、Adachiが必要であると記述する条件下でプ
ルシアンブルーを形成する反応に鉄（III）塩を参加さ
せることを妨げるだろう。
プルシアンブルーに基づくアッセイ系の詳細は米国特
許第4,929,545号に開示されており、その開示内容を参
考としてここに組み入れる。この特許は、フェロシアン
イオンが鉄（III）イオン含有塩Fe3（SO4）２からの鉄
（III）イオンと反応することを教示している。この系
はグルコースやコレステロールを含む種々のアナライト
の定量に用いることができる。
許第4,929,545号に開示されており、その開示内容を参
考としてここに組み入れる。この特許は、フェロシアン
イオンが鉄（III）イオン含有塩Fe3（SO4）２からの鉄
（III）イオンと反応することを教示している。この系
はグルコースやコレステロールを含む種々のアナライト
の定量に用いることができる。
プルシアンブルー系に似た系はキレート剤フェロジン
（ferrozine）に基づくものである。米国特許第4,701,4
20号（その開示内容を参考としてここに組み入れる）は
この反応を記述している。本質的に、この系はNAD
（Ｐ）H/NAD（Ｐ）系とともに電子移動剤を使用するも
のである。基本的に、この反応はアナライトからNAD
（Ｐ）Ｈへの１個の電子の移動と、これに続く電子移動
剤への電子の移動を含む。その後、電子移動剤はその電
子を鉄（III）イオン含有錯体へ移し、これにより鉄（I
I）イオンが生成する。次に、鉄（II）イオンは第２の
物質と結合し、着色物質の形成をもたらす。一連の可能
な物質が鉄（III）イオンのための錯化剤として有用で
あると記載されている、上記の'420特許に記載される物
質は非常に強いキレート剤である。
（ferrozine）に基づくものである。米国特許第4,701,4
20号（その開示内容を参考としてここに組み入れる）は
この反応を記述している。本質的に、この系はNAD
（Ｐ）H/NAD（Ｐ）系とともに電子移動剤を使用するも
のである。基本的に、この反応はアナライトからNAD
（Ｐ）Ｈへの１個の電子の移動と、これに続く電子移動
剤への電子の移動を含む。その後、電子移動剤はその電
子を鉄（III）イオン含有錯体へ移し、これにより鉄（I
I）イオンが生成する。次に、鉄（II）イオンは第２の
物質と結合し、着色物質の形成をもたらす。一連の可能
な物質が鉄（III）イオンのための錯化剤として有用で
あると記載されている、上記の'420特許に記載される物
質は非常に強いキレート剤である。
今回、驚いたことに、指示薬系において有用であると
記述されたことがなく、しかも当技術分野で記述された
キレート剤よりも弱いキレート剤が指示薬系においてよ
り一層有効であることが見いだされた。かくして、これ
らのキレート剤はここに記載される発明、つまりアナラ
イトの定量に有用な新規組成物の重要な一成分である。
以下の記載の中で本発明をより詳しく説明することにす
る。
記述されたことがなく、しかも当技術分野で記述された
キレート剤よりも弱いキレート剤が指示薬系においてよ
り一層有効であることが見いだされた。かくして、これ
らのキレート剤はここに記載される発明、つまりアナラ
イトの定量に有用な新規組成物の重要な一成分である。
以下の記載の中で本発明をより詳しく説明することにす
る。
発明の概要 本発明は、サンプル中のアナライトを定量するのに有
用な組成物に関する。この組成物は、必須成分として、
対象となるアナライトのための特異的酸化剤、電子移動
剤、鉄（III）イオン源および２種類のキレート剤を含
有する。第１のキレート剤は鉄（II）イオンに対する親
和性よりも高い親和性を鉄（III）イオンに対して有す
る点に特徴がある。第２のキレート剤は鉄（II）イオン
と結合して対象アナライトの指標となる着色組成物を形
成するものである。
用な組成物に関する。この組成物は、必須成分として、
対象となるアナライトのための特異的酸化剤、電子移動
剤、鉄（III）イオン源および２種類のキレート剤を含
有する。第１のキレート剤は鉄（II）イオンに対する親
和性よりも高い親和性を鉄（III）イオンに対して有す
る点に特徴がある。第２のキレート剤は鉄（II）イオン
と結合して対象アナライトの指標となる着色組成物を形
成するものである。
本発明およびその特徴を以下の「好適な実施態様の詳
細な説明」で詳しく述べることにする。
細な説明」で詳しく述べることにする。
好適な実施態様の詳細な説明 実施例１ サンプル中に含まれるグルコースの公知の検出系は次
の一連の反応を含む。
の一連の反応を含む。
反応“I"と“II"は共役しており、すなわち、グルコ
ースの酸化において除かれた電子はoPESに移動してrPES
を生成する。しかし、この物質種rPESは直ちに反応“II
I"において電子を移し、 これによりrPESがoPESに戻る。その後、鉄（II）イオン
（Fe2+）は反応“IV"においてフェロジンと結合する。
ースの酸化において除かれた電子はoPESに移動してrPES
を生成する。しかし、この物質種rPESは直ちに反応“II
I"において電子を移し、 これによりrPESがoPESに戻る。その後、鉄（II）イオン
（Fe2+）は反応“IV"においてフェロジンと結合する。
IV. Fe2+＋フェロジン→紫色の錯体 紫色の強度がグルコースの測定値となる。
この実験では、本発明のキレート剤としてクエン酸ナ
トリウムを使用した。クエン酸（230mM）の溶液を調製
し、さらにFe2（SO4）３（22mM）の溶液もつくってその
pHを5.00に調整した。これらの物質種はそれぞれ本発明
のキレート剤と鉄（III）イオンに相当する。PES（18m
M）、すなわち電子移動剤、の溶液を調製し、グルコー
スオキシダーゼ（5ku/g）の溶液も調製した。最後に、
フェロジンの60mM溶液を調製した。これらの物質を試験
管の中で合わせて、200mM クエン酸、19.1mM Fe2（SO
4）３、7.8mM PES、26.5mM フェロジン、および2.5単
位のグルコースオキシダーゼの最終濃度を得た。グルコ
ース溶液（50mg/dl）を加えて9.1mg/dlの最終グルコー
ス濃度とした。発色を分光光度計（シマズモデルUV160
U）を使って563nmの波長で肉眼で観察し、反応速度も調
べた。吸光度を１分間にわたって２秒ごとに測定した。
トリウムを使用した。クエン酸（230mM）の溶液を調製
し、さらにFe2（SO4）３（22mM）の溶液もつくってその
pHを5.00に調整した。これらの物質種はそれぞれ本発明
のキレート剤と鉄（III）イオンに相当する。PES（18m
M）、すなわち電子移動剤、の溶液を調製し、グルコー
スオキシダーゼ（5ku/g）の溶液も調製した。最後に、
フェロジンの60mM溶液を調製した。これらの物質を試験
管の中で合わせて、200mM クエン酸、19.1mM Fe2（SO
4）３、7.8mM PES、26.5mM フェロジン、および2.5単
位のグルコースオキシダーゼの最終濃度を得た。グルコ
ース溶液（50mg/dl）を加えて9.1mg/dlの最終グルコー
ス濃度とした。発色を分光光度計（シマズモデルUV160
U）を使って563nmの波長で肉眼で観察し、反応速度も調
べた。吸光度を１分間にわたって２秒ごとに測定した。
実施例２ 実施例１のプロトコールに従ったが、クエン酸ナトリ
ウムの代わりにdlリンゴ酸ナトリウムを使用した。
ウムの代わりにdlリンゴ酸ナトリウムを使用した。
実施例３ 実施例１のプロトコールに従ったが、クエン酸ナトリ
ウムの代わりにイミノジ酢酸ナトリウムを使用した。
ウムの代わりにイミノジ酢酸ナトリウムを使用した。
３つすべての事例において、生成すると予想された比
色沈殿物（すなわち、鉄（II）イオンとフェロジンとの
錯体）が形成されたが、シトレート混合物が最も速やか
に沈殿物を形成し、マレートがこれに続き、イミノジア
セテートは最も遅い形成剤であった。詳しくは、1.29単
位の吸光度の変化に対しシトレートの場合は17秒かか
り、マレートの場合は23秒、そしてイミノジアセテート
では60秒を要した。これらの数値を以下の表１〜３にま
とめてある。最初の２つのキレート剤の方がイミノジア
セテートよりも強く発色した。
色沈殿物（すなわち、鉄（II）イオンとフェロジンとの
錯体）が形成されたが、シトレート混合物が最も速やか
に沈殿物を形成し、マレートがこれに続き、イミノジア
セテートは最も遅い形成剤であった。詳しくは、1.29単
位の吸光度の変化に対しシトレートの場合は17秒かか
り、マレートの場合は23秒、そしてイミノジアセテート
では60秒を要した。これらの数値を以下の表１〜３にま
とめてある。最初の２つのキレート剤の方がイミノジア
セテートよりも強く発色した。
上記の実施例は溶液中に含まれるアナライトの定量に
有用な試薬組成物の使用を例示するものである。この組
成物の必須成分はアナライト酸化剤、電子移動剤、鉄
（III）イオン源、鉄（II）イオンと比べて優先的に鉄
（III）イオンと結合するキレート剤、および鉄（II）
イオン錯化剤を含むが、ただしキレート剤はイミノジア
セテート含有化合物ではない。
有用な試薬組成物の使用を例示するものである。この組
成物の必須成分はアナライト酸化剤、電子移動剤、鉄
（III）イオン源、鉄（II）イオンと比べて優先的に鉄
（III）イオンと結合するキレート剤、および鉄（II）
イオン錯化剤を含むが、ただしキレート剤はイミノジア
セテート含有化合物ではない。
本明細書中で用いる用語「アナライト酸化剤」とは、
対象のアナライトから特異的に電子を取り去る物質を意
味する。理想的には、これは酵素酸化剤であり、こうし
た物質の活性の特異性についてはよく知られている。例
えば、グルコースが対象のアナライトであるならば、グ
ルコースオキシダーゼを用いることができる。同様に、
コレステロールを測定しようとする場合は、コレステロ
ールオキシダーゼを用いることができる。当業者はこの
ような酸化酵素について熟知しているだろう。
対象のアナライトから特異的に電子を取り去る物質を意
味する。理想的には、これは酵素酸化剤であり、こうし
た物質の活性の特異性についてはよく知られている。例
えば、グルコースが対象のアナライトであるならば、グ
ルコースオキシダーゼを用いることができる。同様に、
コレステロールを測定しようとする場合は、コレステロ
ールオキシダーゼを用いることができる。当業者はこの
ような酸化酵素について熟知しているだろう。
本明細書中で用いる用語「電子移動剤」とは、酸化さ
れたアナライトからの電子を受け入れるが、直ちに他の
物質へその電子を移動させる物質を言う。電子移動剤は
再使用可能な物質で、移動の挙動はきわめて迅速に起こ
り、こうすることによって移動剤は更なる電子を受け入
れるようになる。電子移動剤の非限定的例として、フェ
リシアン化物（例えば、フェリシアン化カリウム）、フ
ェナジンメトスルフェート（PMS）、フェナジンエトス
ルフェート（PES）などを挙げることができる。用いる
電子移動剤は組成物のpHを含めて多くの基準により変わ
るだろう。例えば、フェリシアン化カリウムは約3.0〜
5.5のpH範囲で使用される。PESはもっと広い範囲、すな
わち約3.0〜9.0のpHで用いられる。しかし、この試薬が
約5.5以上のpHで使用されると、鉄（III）イオンと遊離
ヒドロキシル基とが結合して不溶性の水酸化鉄（III）
を形成するという問題が生じる。こうした問題が起こる
のを回避するために、キレート剤は強いものである必要
がある。pH5.0以上においてはクエン酸やクエン酸ナト
リウムようなシトレートイオンが好適である。また、リ
ンゴ酸やリンゴ酸ナトリウムのようなマレート含有化合
物も好ましいものである。
れたアナライトからの電子を受け入れるが、直ちに他の
物質へその電子を移動させる物質を言う。電子移動剤は
再使用可能な物質で、移動の挙動はきわめて迅速に起こ
り、こうすることによって移動剤は更なる電子を受け入
れるようになる。電子移動剤の非限定的例として、フェ
リシアン化物（例えば、フェリシアン化カリウム）、フ
ェナジンメトスルフェート（PMS）、フェナジンエトス
ルフェート（PES）などを挙げることができる。用いる
電子移動剤は組成物のpHを含めて多くの基準により変わ
るだろう。例えば、フェリシアン化カリウムは約3.0〜
5.5のpH範囲で使用される。PESはもっと広い範囲、すな
わち約3.0〜9.0のpHで用いられる。しかし、この試薬が
約5.5以上のpHで使用されると、鉄（III）イオンと遊離
ヒドロキシル基とが結合して不溶性の水酸化鉄（III）
を形成するという問題が生じる。こうした問題が起こる
のを回避するために、キレート剤は強いものである必要
がある。pH5.0以上においてはクエン酸やクエン酸ナト
リウムようなシトレートイオンが好適である。また、リ
ンゴ酸やリンゴ酸ナトリウムのようなマレート含有化合
物も好ましいものである。
本組成物はさまざまな剤型に調製することができる。
実施例では溶液の形態を示してあるが、組成物はマルチ
パートキット（multi part kit）として製剤化すること
もでき、組成物の成分を互いに分離しても、異なる組合
せを調製してもよい。例えば、鉄（III）イオン源をキ
レート剤から離して容器に保管することができ、また、
２つの成分を一緒にして１つの容器に入れることもでき
る。試薬成分の一部または全部が液体または固体の形態
であってよく、例えば水溶液、粉末、錠剤、凍結乾燥品
などであり得る。また、試験片や多層分析器具のような
分析装置に組成物を含浸させることもできる。多層分析
器具において使用する場合は、個々の成分を異なる層に
含浸させて、上で述べた一連の反応がそれぞれ異なる層
で起こるようにすることができる。試験片のような単一
の層を使用する場合は、逐次反応が試験片の異なる地点
で起こるように、試薬類を試験片に沿って配置すること
ができる。
実施例では溶液の形態を示してあるが、組成物はマルチ
パートキット（multi part kit）として製剤化すること
もでき、組成物の成分を互いに分離しても、異なる組合
せを調製してもよい。例えば、鉄（III）イオン源をキ
レート剤から離して容器に保管することができ、また、
２つの成分を一緒にして１つの容器に入れることもでき
る。試薬成分の一部または全部が液体または固体の形態
であってよく、例えば水溶液、粉末、錠剤、凍結乾燥品
などであり得る。また、試験片や多層分析器具のような
分析装置に組成物を含浸させることもできる。多層分析
器具において使用する場合は、個々の成分を異なる層に
含浸させて、上で述べた一連の反応がそれぞれ異なる層
で起こるようにすることができる。試験片のような単一
の層を使用する場合は、逐次反応が試験片の異なる地点
で起こるように、試薬類を試験片に沿って配置すること
ができる。
上で述べたことは試薬組成物の剤型の例であり、その
限定として解釈されるべきでない。
限定として解釈されるべきでない。
上記説明および実施例は本発明を例示するものであっ
て、制限するものではないことが理解されよう。本発明
の精神および範囲に含まれる他の態様が当業者には思い
浮かぶであろう。
て、制限するものではないことが理解されよう。本発明
の精神および範囲に含まれる他の態様が当業者には思い
浮かぶであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平３−43096（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−247656（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−698557（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/66 G01N 31/22
Claims (11)
- 【請求項１】サンプル中のアナライトを定量する方法で
あって、該サンプルと、 （ｉ）アナライト酸化剤、 （ii）電子移動剤、 （iii）鉄（III）イオンとキレート剤との錯体であっ
て、該キレート剤が、イミノジアセテート含有化合物で
はなく、鉄（II）イオンに対してよりも鉄（III）イオ
ンに対して高い親和性を有するシトレートイオン含有化
合物およびマレートイオン含有化合物からなる群から選
ばれるものである前記錯体、および （iv）鉄（II）イオンと結合するとき発色する鉄（II）
イオン錯化剤、 を含有する組成物とを接触させ、そして該サンプルに含
まれるアナライトの指標として該サンプルにおける発色
を測定することを含む方法。 - 【請求項２】アナライト酸化剤が少なくとも１つの酵素
を含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】少なくとも１つの酵素がグルコースオキシ
ダーゼである、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】少なくとも１つの酵素がコレステロールオ
キシダーゼである、請求項２に記載の方法。 - 【請求項５】電子移動剤がフェリシアン化物である、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項６】電子移動剤がフェナジンエトスルフェート
である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】電子移動剤がフェナジンメトスルフェート
である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】キレート剤がシトレートイオン含有化合物
である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】キレート剤がマレートイオン含有化合物で
ある、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】キレート剤がフェロジンである、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項１１】前記の組成物がバッファーをさらに含有
する、請求項１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US1023293A | 1993-01-28 | 1993-01-28 | |
| US08/010,232 | 1993-01-28 | ||
| PCT/US1994/000969 WO1994017199A1 (en) | 1993-01-28 | 1994-01-26 | Compositions useful in anaerobic determination of analytes |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08507206A JPH08507206A (ja) | 1996-08-06 |
| JP3217066B2 true JP3217066B2 (ja) | 2001-10-09 |
Family
ID=21744683
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51732094A Expired - Fee Related JP3217066B2 (ja) | 1993-01-28 | 1994-01-26 | アナライトの嫌気的定量に有用な組成物 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5434055A (ja) |
| EP (1) | EP0681611B1 (ja) |
| JP (1) | JP3217066B2 (ja) |
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