JPS62285800A - グアナ−ゼの測定法 - Google Patents

グアナ−ゼの測定法

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JPS62285800A
JPS62285800A JP12878686A JP12878686A JPS62285800A JP S62285800 A JPS62285800 A JP S62285800A JP 12878686 A JP12878686 A JP 12878686A JP 12878686 A JP12878686 A JP 12878686A JP S62285800 A JPS62285800 A JP S62285800A
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JP
Japan
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guanase
guanine
chelating agent
xanthine
electron carrier
Prior art date
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Pending
Application number
JP12878686A
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English (en)
Inventor
Hiroki Takahashi
高橋 宏紀
Toshihito Kanejima
才仁 金島
Tadao Yano
矢野 忠男
Motonobu Ichino
市野 元信
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanko Junyaku Co Ltd
Original Assignee
Sanko Junyaku Co Ltd
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Publication date
Application filed by Sanko Junyaku Co Ltd filed Critical Sanko Junyaku Co Ltd
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  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 3、発明の詳細な説明 (産業上の利用分野) 本発明は、感度が極めて高く、ビリルビン等の影2をう
けにくい新規なグアナーゼの測定法に関する。
(従来の技術) グアナーゼは、プリン代謝径路にありグアニンからキサ
ンチンへの脱アミン化を触媒とする酵素として知られて
いる。グアナーゼは、脳、肝、腎組織に多く存在してお
り、最近非A非Bウィルスによる輸血後肝炎の診断に重
要な指標として注目を浴びている。
血清中のグアナーゼ活性は、通常1〜2U程度であるか
ら、これを再現性よく正確に測ることが極めて難しい。
現在知られている方法に、ホルマザン法、インドフェノ
ール法、H2O,−P OD法がある。
ホルマザン法の反応を具体的に示すと次の通りである。
以下余白 グアナーゼ グアニン       キサンチン士アンモニアキサン
チンオキシダーゼ 還元型1−メトキシPMS      1−メトキシP
?1SNTB        還元型NTB (発色) (上式中、1−メトキシPMSは1−メトキシ−5−メ
チルツェナジニウムメチルスルフェート、NTBはニト
ロブルーテトラゾリウムである。) このように最終的
に生成したホルマザンを可視部で測定するものである。
この方法の一番の問題点は、ホルマザン発色のためセル
やチューブ等を汚し、機械を傷める点にある。
次ぎに、インドフェノール法は、グアニンにグアナーゼ
を組み合わせることによって生じたアンモニアをインド
フェノールを用いて測定するものであるが、血清中の内
因性のアンモニアの影響を受けるため、検体ブランクを
とらなければならないという欠点を有する。
最後に、H20□−POD法の一例を次に示す。
グアナーゼ グアニン       キサンチン士アンモニアキサン
チンオキシダーゼ H20□     H+ このH2ちにMBTH(塩酸3−メチル−2−ベンゾチ
アプリノンヒドラジン)とTOO3(N−エチル−N−
(2−ビトロキシ−3−スルホプロピル)−m−トルイ
ジン又はADPS (N−エチル−N−スルホプロピル
−m−アニシジン)等を作用させてペルオキシダーゼ存
在下で発色させてグアナーゼ活性を測定する。通常、こ
の方法を用いる場合にはレイトアッセイ法で測定する。
この方法は前記2つの方法と比較すると極めて感度は高
いが、ビリルビンやアスコルビン酸の影響を受は易いと
いう欠点がある。
(発明が解決しようとする問題点) 本発明は、上記した問題点を解決すべく鋭意研究を重ね
た結果発明されたもので、感度が極めて高く、ビリルビ
ン等の影響をうけにくい新規なグアナーゼの測定法を提
供することを目的とするものである。
(問題を解決するための手段) 本発明の要旨は、グアニンを基質としキサンチンオキシ
ダーゼを組み合わせてグアナーゼ活性を測定する方法に
おいて、生成したスーパーオキシドアニオンに電子伝達
体を介在させることによってFe3+イオンをFe2+
イオンに還元し、鉄イオンキレート剤で発色させてグア
ナーゼ活性を測定するようにしたグアナーゼの測定法に
存する。
即ち、本発明における反応を示せば次の通りである。
以下余白 グアナーゼ グアニン       キサンチン+アンモニアキサン
チンオキシダーゼ (上式中、1−メトキシPMSは1−メトキシ−5−メ
チルツェナジニウムメチルスルフェートである。)グア
ニンは0.1〜1.Q mM程度用いればよく、キサン
チンオキシダーゼは0.05〜10/mJ程度用いれば
よい。
この反応で最終的に生じたFe2”を鉄キレート剤にト
ロソPSAP ; 2−ニトロソ−5−(N−プロピル
−N−スルホプロピルアミノ)フェノール、PDTS 
:3−(2−ピリジル) −5,6−ビス(4−スルホ
フェニル) −1,2,4−ト、リアジン2ナトリウム
、5−Br−PSAA:2−(5−ブロモピリジルアゾ
)−5−(N−プロピル−N−スルホプロピルアミノ)
アニリンナトリウム塩、バソフエナンスロリン等を用い
て発色させる。測定に際しては、初速度測定でもよいし
、反応停止液を加えて終末法で測定してもよい。ニトロ
ソPSAPを用いる際は0.5〜2 mM程度使用すれ
ばよい。
1〜メトキシPMSは、電子伝達体としての働きを持つ
ものであるが、これに限らずPMS 、ジアホラーゼ、
メルトラブル−等の電子伝達体を用いてもよい。1−メ
トキシPMSは0.02〜0.5mM用いればよい。
また、試薬として加えるFe5fに硫酸鉄(III)ア
ンモニウム、塩化第二鉄、鉄ミョウバン、Fll!”・
AnP等の化合物を用いることができる。F e2すを
安定に発色させるために、酒石酸、蓚酸等の有機酸を加
えることもできる。硫酸鉄(III)アンモニウムは0
.05〜2mM程度用いればよい。
緩衝液として、トリス、トリエタノールアミン、GOO
D BUFFERなどが使える。トリス、トリエタノー
ルアミンを使う際は、50mM〜200mMが適当であ
り、GOOD BUFFERを用いる時は20mM〜1
00mMがよい。pi(は7〜8.5で用いることがで
きる。
(発明の効果) 本発明方法は、極めて感度が高く、かつビリルビン等の
影響をうけにくいという利点を有する。
また、グアナーゼ及びキサンチンオキシダーゼの至適p
Hが8付近にあるため、や\アルカリ側で測定すること
が好ましく、丁度Fe”+の発色にも都合がよいという
有利さがある。
以下に実施例を挙げて本発明方法をさらに説明する。
実施例 1ニエ直 トリス緩衝液−−−−一−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−一−−・100mM、 pH
8,0キサンチンオキシダーゼー−−−−−・−−−0
,20/m 1硫酸鉄(III)アンモニウム−・−−
−−0,2mM1−メトキシPMS −−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−0,1m
MR−2’夜 グアニン−・−・−m−−−−・・−−一−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−・0.2mMニトロソ
PSAP −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−1mMHC1−一−−−−−−・・
−一−−−−−−−−−−−−−−−−−−〜−−−−
−−−−−−0、02N検体20μlにR・1液500
μlを加え、37℃で3〜5分加温後、R・2液500
μlを加える。3分後に750 nmで標準液(グアナ
ーゼ5U)を対照に1分間あたりの吸光度変化を測定し
た。
本実施例によって得られた直線性を第1図に、及びタイ
ムコースを第2図に示した。
直線性:グアナーゼ(ウサギ肝臓)を適当に5段階希釈
し、直線性を調べた。グアナーゼ活性60U以下で、は
ぼ原点を通る直線を示した。
タイムコース:R・2液添加の2分後にほぼ直線的に反
応が進んだ。
比較例 且二土液 リン酸緩衝液・−・−・−・−・−・−・−−−−−−
−−−−−20On+M、pH7,5キサンチンオキシ
ダーゼ−・−−−−−−−−・0.IU/m lペルオ
キシダーゼ−・−・・−・−・〜・−−−−−−20、
/ m lスーパーオキシドジムターゼー−−−−−一
〜80/m ll二1液 H(j’−−−−・・−・−・・・−・−−−一−−・
=−−−−一−−−・−・−−m−−−−・0.02N
グアニン−・−・−・−一−−−−−−・・−一−−−
−−−・・−−−−−−−−−−−0、2m MMBT
H−−・−−−−−一−・−一−〜−−−−一−−一一
一・−−−−一−・−−−m−・−−−−−−−−−−
0,1rm MTOOS−・〜−−−−−−−−−−−
・−一−−−−−−−−−・・〜・−−−−一・−−−
−一・−−−−6mM検体20μlにR・1液500μ
lを加え、37℃で3〜5分加温後、R・2液500μ
lを加える。3分後に600 nmで標準液(グアナー
ゼ5U)を対照に1分間あたりの吸光度変化を測定した
本発明方法(実施例)と従来法(比較例)との相関は良
好な関係を示し、r=0.98.y=0.96x+0.
5 (n=30>であった(x:従来法、y:本発明)
【図面の簡単な説明】
第1図は実施例の直線性を示すグラフ及び第2図は実施
例のタイムコースを示すグラフである。 特許出願人    三光純薬株式会社 代理人弁理士   石 摩 詔 二 第1図 ダアたゼ(廊慎(充8′)う 第2図 +り        険

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)グアニンを基質としキサンチンオキシダーゼを組
    み合わせてグアナーゼ活性を測定する方法において、生
    成したスーパーオキシドアニオンに電子伝達体を介在さ
    せることによってFe^3^+イオンをFe^2^+イ
    オンに還元し、鉄イオンキレート剤で発色させてグアナ
    ーゼ活性を測定するようにしたグアナーゼの測定法。
JP12878686A 1986-06-03 1986-06-03 グアナ−ゼの測定法 Pending JPS62285800A (ja)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0681611A4 (en) * 1993-01-28 1998-07-29 Boehringer Mannheim Corp COMPOSITIONS USED IN ANAEROBIC DETERMINATION OF ANALYZES.

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0681611A4 (en) * 1993-01-28 1998-07-29 Boehringer Mannheim Corp COMPOSITIONS USED IN ANAEROBIC DETERMINATION OF ANALYZES.

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