JPS62285800A - グアナ−ゼの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 （産業上の利用分野） 本発明は、感度が極めて高く、ビリルビン等の影２をう
けにくい新規なグアナーゼの測定法に関する。

（従来の技術） グアナーゼは、プリン代謝径路にありグアニンからキサ
ンチンへの脱アミン化を触媒とする酵素として知られて
いる。グアナーゼは、脳、肝、腎組織に多く存在してお
り、最近非Ａ非Ｂウィルスによる輸血後肝炎の診断に重
要な指標として注目を浴びている。

血清中のグアナーゼ活性は、通常１〜２Ｕ程度であるか
ら、これを再現性よく正確に測ることが極めて難しい。

現在知られている方法に、ホルマザン法、インドフェノ
ール法、Ｈ２Ｏ，−Ｐ　ＯＤ法がある。

ホルマザン法の反応を具体的に示すと次の通りである。

以下余白 グアナーゼ グアニン　　　　　　　キサンチン士アンモニアキサン
チンオキシダーゼ 還元型１−メトキシＰＭＳ　　　　　　１−メトキシＰ
？１ＳＮＴＢ　　　　　　　　還元型ＮＴＢ （発色） （上式中、１−メトキシＰＭＳは１−メトキシ−５−メ
チルツェナジニウムメチルスルフェート、ＮＴＢはニト
ロブルーテトラゾリウムである。）　このように最終的
に生成したホルマザンを可視部で測定するものである。

この方法の一番の問題点は、ホルマザン発色のためセル
やチューブ等を汚し、機械を傷める点にある。

次ぎに、インドフェノール法は、グアニンにグアナーゼ
を組み合わせることによって生じたアンモニアをインド
フェノールを用いて測定するものであるが、血清中の内
因性のアンモニアの影響を受けるため、検体ブランクを
とらなければならないという欠点を有する。

最後に、Ｈ２０□−ＰＯＤ法の一例を次に示す。

グアナーゼ グアニン　　　　　　　キサンチン士アンモニアキサン
チンオキシダーゼ Ｈ２０□　　　　　Ｈ＋ このＨ２ちにＭＢＴＨ（塩酸３−メチル−２−ベンゾチ
アプリノンヒドラジン）とＴＯＯ３（Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ビトロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイ
ジン又はＡＤＰＳ　（Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル
−ｍ−アニシジン）等を作用させてペルオキシダーゼ存
在下で発色させてグアナーゼ活性を測定する。通常、こ
の方法を用いる場合にはレイトアッセイ法で測定する。

この方法は前記２つの方法と比較すると極めて感度は高
いが、ビリルビンやアスコルビン酸の影響を受は易いと
いう欠点がある。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は、上記した問題点を解決すべく鋭意研究を重ね
た結果発明されたもので、感度が極めて高く、ビリルビ
ン等の影響をうけにくい新規なグアナーゼの測定法を提
供することを目的とするものである。

（問題を解決するための手段） 本発明の要旨は、グアニンを基質としキサンチンオキシ
ダーゼを組み合わせてグアナーゼ活性を測定する方法に
おいて、生成したスーパーオキシドアニオンに電子伝達
体を介在させることによってＦｅ３＋イオンをＦｅ２＋
イオンに還元し、鉄イオンキレート剤で発色させてグア
ナーゼ活性を測定するようにしたグアナーゼの測定法に
存する。

即ち、本発明における反応を示せば次の通りである。

以下余白 グアナーゼ グアニン　　　　　　　キサンチン＋アンモニアキサン
チンオキシダーゼ （上式中、１−メトキシＰＭＳは１−メトキシ−５−メ
チルツェナジニウムメチルスルフェートである。）グア
ニンは０．１〜１．Ｑ　ｍＭ程度用いればよく、キサン
チンオキシダーゼは０．０５〜１０／ｍＪ程度用いれば
よい。

この反応で最終的に生じたＦｅ２”を鉄キレート剤にト
ロソＰＳＡＰ　；　２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル
−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フェノール、ＰＤＴＳ　
：３−（２−ピリジル）　−５，６−ビス（４−スルホ
フェニル）　−１，２，４−ト、リアジン２ナトリウム
、５−Ｂｒ−ＰＳＡＡ：２−（５−ブロモピリジルアゾ
）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）
アニリンナトリウム塩、バソフエナンスロリン等を用い
て発色させる。測定に際しては、初速度測定でもよいし
、反応停止液を加えて終末法で測定してもよい。ニトロ
ソＰＳＡＰを用いる際は０．５〜２　ｍＭ程度使用すれ
ばよい。

１〜メトキシＰＭＳは、電子伝達体としての働きを持つ
ものであるが、これに限らずＰＭＳ　、ジアホラーゼ、
メルトラブル−等の電子伝達体を用いてもよい。１−メ
トキシＰＭＳは０．０２〜０．５ｍＭ用いればよい。

また、試薬として加えるＦｅ５ｆに硫酸鉄（ＩＩＩ）ア
ンモニウム、塩化第二鉄、鉄ミョウバン、Ｆｌｌ！”・
ＡｎＰ等の化合物を用いることができる。Ｆ　ｅ２すを
安定に発色させるために、酒石酸、蓚酸等の有機酸を加
えることもできる。硫酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウムは０
．０５〜２ｍＭ程度用いればよい。

緩衝液として、トリス、トリエタノールアミン、ＧＯＯ
Ｄ　ＢＵＦＦＥＲなどが使える。トリス、トリエタノー
ルアミンを使う際は、５０ｍＭ〜２００ｍＭが適当であ
り、ＧＯＯＤ　ＢＵＦＦＥＲを用いる時は２０ｍＭ〜１
００ｍＭがよい。ｐｉ（は７〜８．５で用いることがで
きる。

（発明の効果） 本発明方法は、極めて感度が高く、かつビリルビン等の
影響をうけにくいという利点を有する。

また、グアナーゼ及びキサンチンオキシダーゼの至適ｐ
Ｈが８付近にあるため、や＼アルカリ側で測定すること
が好ましく、丁度Ｆｅ”＋の発色にも都合がよいという
有利さがある。

以下に実施例を挙げて本発明方法をさらに説明する。

実施例 １ニエ直 トリス緩衝液−−−−一−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−一−−・１００ｍＭ、　ｐＨ
８，０キサンチンオキシダーゼー−−−−−・−−−０
，２０／ｍ　１硫酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム−・−−
−−０，２ｍＭ１−メトキシＰＭＳ　−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−０，１ｍ
ＭＲ−２’夜 グアニン−・−・−ｍ−−−−・・−−一−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−・０．２ｍＭニトロソ
ＰＳＡＰ　−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−１ｍＭＨＣ１−一−−−−−−・・
−一−−−−−−−−−−−−−−−−−−〜−−−−
−−−−−−０、０２Ｎ検体２０μｌにＲ・１液５００
μｌを加え、３７℃で３〜５分加温後、Ｒ・２液５００
μｌを加える。３分後に７５０　ｎｍで標準液（グアナ
ーゼ５Ｕ）を対照に１分間あたりの吸光度変化を測定し
た。

本実施例によって得られた直線性を第１図に、及びタイ
ムコースを第２図に示した。

直線性：グアナーゼ（ウサギ肝臓）を適当に５段階希釈
し、直線性を調べた。グアナーゼ活性６０Ｕ以下で、は
ぼ原点を通る直線を示した。

タイムコース：Ｒ・２液添加の２分後にほぼ直線的に反
応が進んだ。

比較例 且二土液 リン酸緩衝液・−・−・−・−・−・−・−−−−−−
−−−−−２０Ｏｎ＋Ｍ、ｐＨ７，５キサンチンオキシ
ダーゼ−・−−−−−−−−・０．ＩＵ／ｍ　ｌペルオ
キシダーゼ−・−・・−・−・〜・−−−−−−２０、
／　ｍ　ｌスーパーオキシドジムターゼー−−−−−一
〜８０／ｍ　ｌｌ二１液 Ｈ（ｊ’−−−−・・−・−・・・−・−−−一−−・
＝−−−−一−−−・−・−−ｍ−−−−・０．０２Ｎ
グアニン−・−・−・−一−−−−−−・・−一−−−
−−−・・−−−−−−−−−−−０、２ｍ　ＭＭＢＴ
Ｈ−−・−−−−−一−・−一−〜−−−−一−−一一
一・−−−−一−・−−−ｍ−・−−−−−−−−−−
０，１ｒｍ　ＭＴＯＯＳ−・〜−−−−−−−−−−−
・−一−−−−−−−−−・・〜・−−−−一・−−−
−一・−−−−６ｍＭ検体２０μｌにＲ・１液５００μ
ｌを加え、３７℃で３〜５分加温後、Ｒ・２液５００μ
ｌを加える。３分後に６００　ｎｍで標準液（グアナー
ゼ５Ｕ）を対照に１分間あたりの吸光度変化を測定した
。

本発明方法（実施例）と従来法（比較例）との相関は良
好な関係を示し、ｒ＝０．９８．ｙ＝０．９６ｘ＋０．
５　（ｎ＝３０＞であった（ｘ：従来法、ｙ：本発明）
。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例の直線性を示すグラフ及び第２図は実施
例のタイムコースを示すグラフである。 特許出願人　　　　三光純薬株式会社 代理人弁理士　　　石　摩　詔　二 第１図 ダアたゼ（廊慎（充８′）う 第２図 ＋り　　　　　　　　険

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）グアニンを基質としキサンチンオキシダーゼを組
   み合わせてグアナーゼ活性を測定する方法において、生
   成したスーパーオキシドアニオンに電子伝達体を介在さ
   せることによってＦｅ＾３＾＋イオンをＦｅ＾２＾＋イ
   オンに還元し、鉄イオンキレート剤で発色させてグアナ
   ーゼ活性を測定するようにしたグアナーゼの測定法。