JP3095887B2

JP3095887B2 - 不飽和鉄結合能の定量法および定量試薬

Info

Publication number: JP3095887B2
Application number: JP04184634A
Authority: JP
Inventors: 崎穂積浜; 々部昌継野; 田剛藤
Original assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Current assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Priority date: 1992-06-19
Filing date: 1992-06-19
Publication date: 2000-10-10
Anticipated expiration: 2015-10-10
Also published as: JPH0697A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は不飽和鉄結合能（以降Ｕ
ＩＢＣと略す）の酵素的定量方法に関し、さらに詳しく
は、体液等の被検試料に既知濃度の過剰な鉄を添加し、
トランスフェリンに鉄を飽和量結合させた後、結合しな
いで残余した鉄を、鉄を加えないと不活性なアポ型アコ
ニターゼ（ＥＣ４．２．１．３）に接触せしめて活性
型とし、アコニターゼが触媒しクエン酸から生じるイソ
クエン酸をイソクエン酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．
１．４１，ＥＣ１．１．１．４２）を検出酵素としア
コニターゼ活性を測定することによりＵＩＢＣを測定す
るＵＩＢＣの高感度な酵素的定量方法、および定量試薬
に関する。

【０００２】

【従来の技術及びその課題】体内鉄の総量は４ｇ前後
で、その２／３は赤血球ヘモグロビン中に、残りの１／
３は貯蔵鉄として肝・脾・骨髄その他の組織に存在す
る。血清鉄の総量は３〜４ｍｇであり、すべて血清のβ
−グロブリンに属するトランスフェリンに結合（その１
分子は鉄２原子を結合）して存在する。血清鉄濃度は、
赤血球の生成と崩壊の程度によって左右され、骨髄にお
ける造血が減退すれば血清鉄の流れは停滞して、血清鉄
濃度は上昇し、逆の場合は低下する。このことより血清
鉄濃度は造血器の機能を反映すると考えられている。ま
た貯蔵鉄の動態も血清鉄に関係があり、肝炎などでは肝
から貯蔵鉄が動員されて他の組織に移動するため、血清
鉄は上昇する。上述のように血清鉄は血液疾患（鉄欠乏
性貧血、再生不良性貧血、悪性貧血、溶血性貧血、白血
病、真性多血症など）のみでなく、各種の疾患（感染
症、急性肝炎、肝硬変症、ヘモクロマトーシス、ネフロ
ーゼなど）と関係があり、その測定は臨床検査上重要視
されている。

【０００３】血清鉄はすべてトランスフェリンに結合し
て血液中に存在するが、健常人では、トランスフェリン
はおよそ１／３が鉄によって飽和されており、残りの２
／３は鉄が結合していない不飽和の状態にある。ＵＩＢ
Ｃとはこの鉄が結合していない不飽和のトランスフェリ
ン量を鉄の結合量で表すものである。血清鉄とＵＩＢＣ
の和を総鉄結合能（以降ＴＩＢＣという）というのは承
知の通りである。血清鉄の測定が臨床検査上重要である
ことは前述した通りであるが、合わせてＵＩＢＣを測定
することによってさらに詳しく病態を掌握できるように
なる。ＵＩＢＣの測定は特に鉄欠乏性貧血の診断に有効
で、この場合、血清鉄量の減少とＵＩＢＣ・ＴＩＢＣの
増大が確認される。血清鉄が減少するその他の疾病、例
えば慢性感染症、悪性腫瘍ではＵＩＢＣ・ＴＩＢＣも減
少するので鉄欠乏性貧血と区別が容易につく様になる。
再生不良性貧血では血清鉄の増大とＵＩＢＣ・ＴＩＢＣ
の減少が観察される。ＵＩＢＣ単独で測定することだけ
でも臨床検査上意義の大きいところであるが、血清鉄と
ＵＩＢＣあるいは血清鉄とＴＩＢＣを合わせて測定する
とさらに詳しい情報が得られるのでさらに意義深いもの
となる。

【０００４】これまでの主なＵＩＢＣ・ＴＩＢＣの測定
方法としては、⁵⁹Ｆｅのようなラジオアイソトープを用
いる方法、ニトロソーＰＳＡＰのようなキレート試薬を
用いる方法や原子吸光法があげられる。ＴＩＢＣの基本
的測定原理は、血清に過剰な鉄を加えすべてのトランス
フェリンを飽和させる、次にトランスフェリンに結合し
ないで残余する鉄を分離・除去する、さらにトランスフ
ェリンに結合した鉄を通常の血清鉄を測定する方法・試
薬にて測定するというものである。ＴＩＢＣでのもっと
も大きな問題点は、トランスフェリンに結合しないで残
余する鉄を分離・除去する工程にある。炭酸マグネシウ
ム法では鉄の沈澱能は良好であるがその後の遠心分離で
の液層分離が困難であること、イオン交換樹脂法では分
離は容易であるがイオン交換樹脂のロット間で鉄の吸着
能に差がみられるなど満足できる除去はできてはいな
い。さらにＴＩＢＣでは器具からの鉄の汚染が心配され
ることや、鉄の分離・除去工程が必ず用手法なので全自
動分析への導入が難しく多検体処理には不向きである。
ＵＩＢＣでは、⁵⁹Ｆｅのようなラジオアイソトープを用
いる方法ではＴＩＢＣでの問題に加えて放射能を測定す
るため特殊な施設・機器が必要となる。ニトロソーＰＳ
ＡＰのようなキレート試薬を用いる方法では、ＴＩＢＣ
ほど繁雑な工程は必要でなく操作が容易なので全自動分
析にも適応できるが、健常人のＵＩＢＣは小さい（１４
０〜３００ｕｇ／ｄｌ）ので感度不足・不正確さ故に多
量の検体を必要とし、ヘモグロビン・ビリルビンの干渉
が生じるようになる。原子吸光法は、前処理が必要なう
え処理方法のちがいによって測定値にかなりのばらつき
がみられる他に、高価な特殊機器を必要とする。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した従
来法の欠点を一挙に解決して、生体内の、特に血清のＵ
ＩＢＣを正確に且つ熟練を要することなく簡便、迅速に
測定することができ、自動化ないし多検体処理を可能と
する、ＵＩＢＣの高感度分析システムを新規に開発する
ことを、目的とするものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、本発明者らは、Ｕ
ＩＢＣをすみやかに、かつ、正確に定量するために、鉄
と各種酵素活性との関係を詳細に検討した結果、アコニ
ターゼがその酵素活性を発現するために、鉄を要求し、
ＵＩＢＣの大小に応じてアコニターゼの活性が変化する
ことを知り、そしてその変化を測定することによってＵ
ＩＢＣが測定できることを確認し、本発明を完成するに
至った。

【０００７】アコニターゼがその活性発現に鉄を要求す
ることは良く知られている〔蛋白質核酸酵素Ｖｏ
ｌ．２２，Ｎｏ．１２１２９３−１３０２（１９７
７）；ＴＨＥＪＯＵＲＮＡＬＯＦＢＩＯＬＯＧ
ＩＣＡＬＣＨＥＭＩＳＴＲＹＶｏｌ．２３６，Ｎ
ｏ．１２，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ１９６１；ＴＨＥＪ
ＯＵＲＮＡＬＯＦＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＣＨＥＭ
ＩＳＴＲＹＶｏｌ．２４２．Ｎｏ．８，Ｉｓｓｕ
ｅｏｆＡｐｒｉｌ２５，ｐｐ．１８７０−１
８７９，１９６７；ＴＨＥＪＯＵＲＮＡＬＯＦ
ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＣＨＥＭＩＳＴＲＹＶｏｌ．
２４６，Ｎｏ．３，ＩｓｓｕｅｏｆＦｅｂｒｕａ
ｒｙ１０．ｐｐ．７７２−７７９，１９７１；
Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．６４，８８１−８８３，Ｍａ
ｒｃｈ８，１９９１〕。しかしながらＵＩＢＣ測定に
アコニターゼを応用した例は、従来知られていない。本
発明の方法は、健常人のような低値のＵＩＢＣを再現性
よく高感度に測定することを可能としたものである。

【０００８】本発明は、ＵＩＢＣの定量を行うに際し、
体液等の被検試料に既知濃度の過剰な鉄溶解液を加えト
ランスフェリンを完全に鉄で飽和させ、トランスフェリ
ンに結合しないで残余した鉄をアポ型アコニターゼに結
合させ活性型アコニターゼを形成せしめ、アコニターゼ
が触媒しクエン酸から生ずるイソクエン酸をイソクエン
酸脱水素酵素によって酸化型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド類（以降ＮＡＤ類という）または／およ
び、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸類（以降ＮＡＤＰ類という）から、還元型ＮＡＤ類
（以降ＮＡＤＨ類という）または／および、還元型ＮＡ
ＤＰ類（以降ＮＡＤＰＨ類という）への変化量としてト
ランスフェリンに結合しないで残余した鉄濃度に依存し
て変化するアコニターゼ活性を検出することによってＵ
ＩＢＣを測定することを基本的測定原理とするものであ
る。

【０００９】⁵⁹Ｆｅのようなラジオアイソトープを用い
る方法やニトロソーＰＳＡＰのようなキレート試薬を用
いる方法および原子吸光法では１個の鉄に対して１個の
応答しか得られないのに対して、本発明の酵素的定量法
は、酵素が増幅作用を示すことにより１個の鉄に対して
多数の応答が得られるという点で高感度化、精密性につ
ながる。また鉄への特異性が高いという点で現行の測定
法より優れている。

【００１０】本発明の方法を良好に実施するには、
（１）トランスフェリンを完全に鉄で飽和させるための
安定なアルカリ性既知濃度の過剰な鉄溶液を調製するこ
と、（２）自動分析に対応するため、検体と鉄溶液を混
和後速やかにトランスフェリンが完全に鉄で飽和する鉄
溶液であること、（３）鉄溶液の鉄がトランスフェリン
以外に非特異吸着しない鉄溶液であることが先ず第一に
要望される。

【００１１】これらの内、要望（１）は、鉄イオン元来
の性質が、硝酸・塩酸水溶液などの酸性ｐＨ下では安定
にイオンとして存在するが、微酸性からアルカリ性にす
ると水酸化鉄を形成し沈澱や器具への吸着を起こすた
め、トランスフェリンが鉄を結合するのに好都合なｐ
Ｈ、例えば、ｐＨ７〜１０、好ましくはｐＨ８〜９なる
ｐＨのもとでは鉄は安定に存在しにくいため難しいが、
通常は３価鉄より幾分安定な２価鉄（硫酸第一鉄アンモ
ニウムあるいは塩化第一鉄）を用い、アスコルビン酸な
どの還元剤共存下トリスヒドロキシルメチルアミノメタ
ン（以降トリスと略す）緩衝液中で安定化をはかってい
る。これでも不充分な場合には、ニトリロ３酢酸を添加
しさらに安定性を向上させる方法（特公昭５２−９１６
０）を本発明の方法に適応しても良い。また特開平２−
１６７４７６とは目的は異なるがキレート剤、例えば、
エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ′−２酢酸、ヒドロキシエチ
ルイミノ２酢酸、ニトリロ３酢酸などを添加するのも効
果的である。特開平２−１６７４７６ではこれらキレー
ト剤の添加により検体と鉄溶液を混和後速やかにトラン
スフェリンが完全に鉄で飽和するようになるので、この
事は要望（２）をも満足するようになる。

【００１２】また要望（２）を満足するその他の方法と
しては、グリコール酸、乳酸、α−オキシ酪酸、グリセ
リン酸、タルトロン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸ま
たはマンデル酸の様なオキシ酸をトリスに代えて緩衝液
とするとトリスに較べて速くトランスフェリンが飽和す
る方法（特開昭６０−６９５５７）も本発明の方法に有
効となろう。そして要望（３）は、特にアルブミンへの
非特異吸着を防止する方法を組み込むかたちになるが、
例えば界面活性剤を加えることで回避できることは知ら
れている（特開平０２−１５６１６０）。

【００１３】本発明の方法に特開平０２−１５６１６０
にあるような界面活性剤を加えると効果的であることは
確認されている。トリスおよびオキシ酸緩衝液のｐＨは
７〜１０、好ましくは８〜９、使用する濃度としては１
〜１，０００ｍＭ、好ましくは１０〜５００ｍＭ。キレ
ート剤の濃度としてはトランスフェリンへの鉄の結合を
阻害しない、かつ、アコニターゼへの残余鉄の結合を皆
無にしないような程度がよく、キレート剤により最適濃
度は異なるが、０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．
１〜１０ｍＭにて使用する。界面活性剤も種類によって
最適濃度は異なるが、０．００１〜１０％、好ましく
は、０．０１〜５％加えることにより非特異吸着はかな
り抑えることができる。

【００１４】アコニターゼが鉄を結合する時、還元剤の
存在が必要である。上記鉄の安定化を目的に鉄溶液に加
えてある還元剤の還元力でアコニターゼへ鉄を結合させ
ることは可能であるが、アコニターゼ溶液に更に還元剤
を添加しても差しつかえない。有効な還元剤としては、
アスコルビン酸、チオ−グリコール酸、チオ−マレー
ト、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、ヒドロキシ
ルアミン、２ーメルカプトエタノール、還元型グルタチ
オン、ジチオトレイトール、ジチオエリトリオール、臭
化２−アミノエチルイソチオウロニウム及びチオ−グリ
セロールなどのほかに、アコニターゼへの鉄の結合を促
進するものであれば何を使っても構わない。試薬濃度
は、０〜１．０００ｍＭ、好ましくは０．１〜５００ｍ
Ｍを用いる。

【００１５】本発明に使用できるアコニターゼとして
は、鉄の添加無添加によって活性が変化するものであれ
ば良く、特に規定されることはない。また、アポ型アコ
ニターゼの調整法としては、キレート剤処理があげられ
る。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸類、
ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、シクロヘキ
サンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、グ
リコールエーテルジアミン四酢酸、トリエチレンテトラ
ミン六酢酸、ジアミノプロパノール四酢酸、ｏ−フェナ
ントロリンなどが有効であり、鉄を加えていない状況で
のバックグランドができるだけ小さなものが好ましい。
また、エチレンジアミン四酢酸類は、遊離酸型、アルカ
リ金属やアンモニウムなどの塩型のアルコール沈澱物で
も結晶物でもよく、特に規定されることはない。キレー
ト剤処理をしてもバックグランドが小さくならない場合
にはＣＭ−セファロースなどで再精製をする。添加する
酵素濃度は、０．０１〜１００ｕ／ｍｌ、好ましくは
０．１〜３０ｕ／ｍｌを用いる。

【００１６】アコニターゼ活性を検出するイソクエン酸
脱水素酵素としては、イソクエン酸へのＫｍ値が小さい
ものが好適であるが、本反応によって生成されるイソク
エン酸と反応でき得るものであれば、特に規定されるこ
とはない。ＮＡＤ類に特異的なものでも、ＮＡＤＰ類に
特異的なものでも差し支えない。添加する酵素濃度は、
０．０１〜２００ｕ／ｍｌ、好ましくは０．１〜２０ｕ
／ｍｌを用いる。また、イソクエン酸脱水素酵素および
アコニターゼが、その酵素活性を発現するために、マグ
ネシウムイオンあるいはマンガンイオンを要求するが、
その試薬濃度は、０．５μＭ〜１００ｍＭ、好ましくは
５μＭ〜１０ｍＭを用いる。

【００１７】ＮＡＤ類または／およびＮＡＤＰ類として
は、遊離酸型またはアルカリ金属やアンモニウムなどの
塩型のアルコール沈澱物でも結晶物でもよく、純度の高
いものほど好適であるが、一般に市販されているＮＡＤ
類、ＮＡＤＰ類は十分に本発明に使用できる。ＮＡＤ
類、ＮＡＤＰ類としてＮＡＤ、ＮＡＤＰは言うまでもな
く、チオ−ＮＡＤ、チオ−ＮＡＤＰも本発明の方法に使
用できる。他のＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類もイソクエン酸脱
水素酵素と反応できうるものは本発明の方法を応用でき
る。試薬濃度は、０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは
０．１〜１０ｍＭを用いる。

【００１８】本発明のＵＩＢＣ測定用組成物は、ｐＨ７
〜１０、好ましくはｐＨ８〜９で、少なくとも鉄を含む
第一試薬と、少なくとも０．０１〜３００ｕ／ｍｌ、好
ましくは０．１〜３０ｕ／ｍｌのアコニターゼを含む第
二試薬と、少なくとも０．０１〜１，０００ｍＭ、好ま
しくは０．１〜１００ｍＭのクエン酸を含む第三試薬か
らなり、還元剤、イソクエン酸脱水素酵素、ＮＡＤ類ま
たは／およびＮＡＤＰ類、マグネシウムイオンまたはマ
ンガンイオンは、第一〜第三試薬のいずれか、または、
第１〜第三試薬の複数にまたがって添加使用される。還
元剤を第一・第二試薬に、イソクエン酸脱水素酵素、Ｎ
ＡＤ類または／およびＮＡＤＰ類、マグネシウムイオン
またはマンガンイオンを第三試薬に添加することが、推
奨される。以上のように、本発明は、反応系に酵素を用
いることを特徴とするＵＩＢＣの定量方法である。また
本発明は、それに用いるための試薬ないし測定キットに
も関するものである。

【００１９】

【発明の効果】本発明は、酵素を用いることによって
ＵＩＢＣの高感度測定が可能である、測定精度が上が
る、酵素を用いることによって温和な条件での測定が
可能である、レートアッセイもできる、操作が簡便
であるという大きな効果がある。

【００２０】

【実施例】以下に本発明の実施例を挙げてさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定さ
れるものではない。

【００２１】

【実施例１】トリス−塩酸緩衝液（１６０ｍＭ）、ｐＨ
９（コントロール）、または、１ｍＭの種々のキレート
剤を含む１６０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９に同一
の濃度になるように硫酸第一鉄アンモニウム水溶液を加
えた。１１℃にて１週間放置後、それぞれの溶液の鉄濃
度を測定した。その結果を下記の表１に示す。

【００２２】

【表１】

【００２３】表１をみて分かるように、鉄に対するキレ
ート安定化定数が比較的大きなキレート剤、ヒドロキシ
エチルイミノ２酢酸、ニトリロ３酢酸、エチレンジアミ
ン２酢酸などを加えることで鉄溶液の安定化が図られ
た。ＵＩＢＣの測定原理上、この鉄溶液が設定濃度より
低い濃度になるとＵＩＢＣの測定値に正誤差をあたえる
ので（無添加ではヒドロキシエチルイミノ２酢酸、ニト
リロ３酢酸、エチレンジアミン２酢酸などの添加区に比
べて２．４倍高値に算出される）、キレート剤による鉄
安定化効果が、本発明の方法を正確かつ再現性のよいも
のにすることがわかる。

【００２４】

【実施例２】下記表２に示す組成にしたがって、各試薬
を調製した。

【００２５】

【表２】

【００２６】検体として、０、５、１０、２０％牛血清
アルブミンを用意し、これら４検体について、上記した
試薬を用い、下記する操作、算出により測定を行った。

【００２７】操作１倍量の検体に１０倍量の試薬１’ｂ〜１ｓを加え自動
分析機（日立７１５０）のサンプルとした。試薬−２
（１００μｌ）に２０μｌのサンプルを加え３７℃で５
分間インキュベーションした。試薬−３（９０μｌ）を
添加し同温度にて２分間インキュベーションしたのちの
１分間の３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度を測定し
た。

【００２８】算出試薬１’ｂまたは試薬１’ｓと０％牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）の組み合わせによって得られる吸光度を差し
引き１９０μＭの鉄（つまりＵＩＢＣが０μＭ）の吸光
度変化量（Ｖ０）とした。５〜２０％のＢＳＡと試薬
１’ｂまたは試薬１’ｓとの組み合わせによって得られ
る吸光度を差し引き吸光度変化量（ｖ）とした。

【００２９】ＵＩＢＣ（μＭ）＝（Ｖ０−ｖ）／Ｖ０
×１９０なる式に導入しＵＩＢＣをもとめた。試薬１ｂ
または試薬１ｓを用いた時も同様に算出した。その結果
を下記の表３に示す。

【００３０】

【表３】

【００３１】表３にあるように、Ｎ−ラウロイルサルコ
シネートを鉄溶液に添加していないと、ＢＳＡ濃度が大
きくなるにつれてＢＳＡへの鉄の非特異的吸着が増え、
あたかもＵＩＢＣ値が増加しているように観察される。
一方、Ｎ−ラウロイルサルコシネートを鉄溶液に添加し
ておくと、ＢＳＡへの鉄の非特異的吸着が抑えられＢＳ
Ａ濃度が大きくなってもＵＩＢＣ値の増加は認められな
い。本発明の方法にもアルブミンなど血清蛋白質への鉄
の非特異的吸着を抑えるために界面活性剤、特に陰イオ
ン性の界面活性剤を鉄溶液に添加することが有効である
ことが分かる。

【００３２】

【実施例３】下記表４に示す組成にしたがって各試薬を
調製し、下記する操作により自動分析機での測定を行っ
た。

【００３３】

【表４】

【００３４】操作試薬−１’ｂ：試薬−１’ｓを５：０．４：１．３：
２．２：３．１：４．０：５に混合したものを自動分析
機（日立７１５０）のサンプルとした。試薬−２（１０
０μｌ）に７μｌのサンプルを加え、３７℃で５分間イ
ンキュベーションした。試薬−３（ＮＡＤ系またはＮＡ
ＤＰ系、９０μｌ）を添加し同温度にて２分間インキュ
ベーションしたのちの１分間の３４０ｎｍにおける吸光
度の増加速度を測定した。試薬−１’ｂ：試薬−１’ｓ
が５：０である吸光度の変化量をブランク値とし差し引
きプロットした。その結果を図１に示す。

【００３５】図１にあるように本発明の方法は０〜１９
０μＭのＵＩＢＣ値に対し良好な直線性を示した。

【００３６】

【実施例４】下記表５に示す組成にしたがって各試薬を
調製し、下記する操作により自動分析機での測定を行っ
た。

【００３７】

【表５】

【００３８】操作３種の血清に等量の試薬−１ｂ及び試薬−１ｓを混合し
たものを自動分析機（日立７１５０）の検体サンプルと
した。０．９％のＮａＣｌに等量の試薬−１ｂ及び試薬
−１ｓを混合したものを自動分析機（日立７１５０）の
盲検及び標準サンプルとした。試薬−２（１００μｌ）
に５μｌのサンプルを加え３７℃で５分間インキュベー
ションした。試薬−３（９０μｌ）を添加し同温度にて
２分間インキュベーションした後の１分間の３４０ｎｍ
における吸光度の増加速度を測定した。０．９％のＮａ
Ｃｌに等量の試薬−１ｂを混合したものから得られる吸
光度の増加速度をブランク値として０．９％のＮａＣｌ
に等量の試薬−１ｓを混合したものから得られる吸光度
の増加速度から差し引きＵＩＢＣのスタンダードカーブ
を作図した。検体サンプルは、血清に試薬−１ｓを加え
て得られる吸光度の増加速度から血清に試薬−１ｂを加
えて得られる吸光度の増加速度をブランク値とし差し引
きスタンダードカーブにあてはめた。その結果を図２に
示す。図中、血清の位置を矢印で示した。

【００３９】図２にあるように、本発明の方法によって
３種の血清ＵＩＢＣが求められ、それぞれ、４．５μ
Ｍ、１３．４μＭ、１８．３μＭであることがわかっ
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３に記載した方法によるＵＩＢＣの測定
カーブである。

【図２】実施例４に記載した方法によるＵＩＢＣの測定
カーブ及びこれより得られる血清のＵＩＢＣ値を示す。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】被検試料に過剰な鉄を添加し、被検試料
中のトランスフェリンに鉄を結合させる工程と、結合し
ないで余った鉄をアコニターゼに結合させる工程と、ア
コニターゼ活性を測定する工程からなり、鉄を活性化因
子とするアコニターゼを用いて不飽和鉄結合能を測定す
ること、を特徴とする不飽和鉄結合能の酵素的定量方
法。
【請求項２】トランスフェリンに鉄を結合させる工程
にキレート剤を添加することを特徴とする請求項１に記
載の不飽和鉄結合能の酵素的定量方法。
【請求項３】トランスフェリンに鉄を結合させる工程
に界面活性剤を添加することを特徴とする請求項１また
は請求項２に記載の不飽和鉄結合能の酵素的定量方法。
【請求項４】アコニターゼ活性をイソクエン酸脱水素
酵素によって検出することにより不飽和鉄結合能を測定
することを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１
項に記載の不飽和鉄結合能の酵素的定量方法。
【請求項５】イソクエン酸脱水素酵素の補酵素とし
て、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類または／
およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
類、を用いることを特徴とする請求項４に記載の不飽和
鉄結合能の酵素的定量方法。
【請求項６】被検試料に過剰な鉄を添加し、トランス
フェリンに鉄を結合させる工程と、結合しないで余った
鉄をアコニターゼに結合させる工程と、アコニターゼ活
性を測定する工程からなる不飽和鉄結合能の酵素的定量
を実施するための試薬であって、鉄を含む第一試薬と、
アコニターゼを含む第二試薬と、クエン酸を含む第三試
薬からなり、更に、還元剤、イソクエン酸脱水素酵素、
イソクエン酸脱水素酵素の補酵素からなること、を特徴
とする不飽和鉄結合能の酵素的定量試薬。
【請求項７】トランスフェリンに鉄を結合させる試薬
にキレート剤を添加することを特徴とする請求項６に記
載の不飽和鉄結合能の酵素的定量試薬。
【請求項８】トランスフェリンに鉄を結合させる試薬
に界面活性剤を添加することを特徴とする請求項６また
は請求項７に記載の不飽和鉄結合能の酵素的定量試薬。
【請求項９】イソクエン酸脱水素酵素の補酵素とし
て、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類または／
およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
類、を用いることを特徴とする請求項６〜請求項８のい
ずれか１項に記載の不飽和鉄結合能の酵素的定量試薬。