JP3260020B2 - Uibc測定用試薬 - Google Patents

Uibc測定用試薬

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洋子 古賀
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株式会社ヤトロン
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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、血清の不飽和鉄結合能
(UIBC)測定用試薬に関する。より詳細には、長期
間安定なUIBC測定用の改良された液状試薬に関す
る。
【0002】
【従来の技術】血清中で鉄は、β1 −グロブリンに属す
るトランスフェリンと結合して存在している。通常、血
清中トランスフェリンの約1/3が鉄と結合しており、
残りの約2/3は鉄を結合していないトランスフェリン
として存在する。この鉄と結合していないトランスフェ
リンがさらに結合することのできる鉄量を不飽和鉄結合
能(以下、UIBCと略称する)、全てのトランスフェ
リンが鉄で飽和されたときの鉄量を総鉄結合能(以下、
TIBCと略称する)とそれぞれ称し、TIBC=UI
BC+血清鉄の関係がある。TIBC、UIBC及び血
清鉄は各種貧血、肝疾患、感染症、栄養障害などの診断
や治療の経過観察の指標として重要な項目の一つであ
る。
【0003】UIBCの測定法としては、血清に過剰鉄
を添加した後、結合していない鉄を炭酸マグネシウムな
どで吸着除去して、トランスフェリンと結合した鉄によ
りTIBCを求め、別に測定した血清鉄量を差し引いて
求める方法や、既知量の鉄でトランスフェリンを飽和さ
せ、トランスフェリンと結合しなかった残余の鉄を測定
し、添加した鉄量から差し引いてUIBCを測定する方
法がある。後者の方法は吸着除去等の操作を必要としな
いため、自動分析用として汎用されている。
【0004】鉄の濃度を比色測定するために用いる発色
剤はほとんどが三価の鉄とは反応しないので、予め三価
の鉄を二価に還元しなければならない。その還元剤とし
ては、チオグリコ−ル酸、アスコルビン酸又は塩酸ヒド
ロキシルアミン等が用いられている。一般的に還元剤を
含む試薬は、その保存安定性の面を考慮して、反応に必
要な配合成分を含む凍結乾燥品として提供され、使用時
に緩衝液などで溶解し用いられていた。しかし、作業性
やコストの面から、溶解後の試薬の安定性も要求される
ようになり、例えば特開昭62−32364号公報のよ
うにUIBC試薬の安定性に関する技術が開示されてい
る。
【0005】前記の特開昭62−32364号公報記載
の技術は、特にアスコルビン酸の安定化のために、アス
コルビン酸誘導体(アスコルビン酸リン酸エステル、ア
スコルビン酸スルホン酸エステル等)と酵素(ホスファ
タ−ゼ、サルファタ−ゼ等)を併用・添加してアスコル
ビン酸の還元性の安定化を図ったものである。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】近年、特に試薬形態を
供給時から液状とし、ユ−ザ−の作業性を向上させるこ
とが求められている。また、これらの試薬は多くの場
合、自動分析機にて使用されるので、試薬構成を2試薬
系とし、しかも試薬組成物の安定性を長期間(例えば半
年から1年)維持する必要がある。これに対して、前記
の特開昭62−32364号公報記載の技術は、アスコ
ルビン酸誘導体と酵素を使用して安定化を図っている。
しかしながら、自動分析の場合には、この系で使用する
酵素による相互汚染を考慮しなければならず、いまだ不
十分であった。本発明者等はこうした従来の問題点を解
消すべく種々鋭意検討した結果、液状試薬としての充分
な保存安定性を有するUIBC測定試薬組成を見出し
た。本発明は、こうした知見に基づくものである。
【0007】
【課題を解決するための手段】本発明は、血清の不飽和
鉄結合能(UIBC)の測定試薬において、少なくと
も三価鉄及びキレ−ト剤を含有する第一試薬と、少なく
とも発色性キレート剤及びヒドラジン誘導体を含有する
第二試薬とからなり、第一試薬のpHが7.5〜9であ
り、第二試薬のpHがpH7.5〜9であり、そしてそ
れぞれ液状試薬であることを特徴とする、血清の不飽和
鉄結合能(UIBC)測定用試薬に関する。
【0008】以下、本発明を詳細に説明する。UIBC
測定で使用する還元剤を安定な条件で維持すると共に、
反応時のpHを、トランスフェリンと結合した三価鉄が
解離しないpHであるpH8.2付近に設定すると、従
来の還元剤は、それ自体の安定性が得られない。本発明
者が見出したところによれば、特に2試薬系で構成する
場合に、還元剤としてヒドラジン誘導体を使用すること
により、液性がアルカリ性であっても、還元剤としての
安定性を維持することができる。
【0009】第一試薬に添加する三価鉄は、従来のUI
BC測定用試薬と同様に、三価鉄の各種の塩、例えば、
クエン酸鉄(III)アンモニウム、シュウ酸鉄(III)アン
モニウム又は硫酸鉄(III)アンモニウム等を用いること
ができる。
【0010】しかし、三価鉄は水溶液中では不安定なた
め、キレート剤を共存させる必要がある。キレート剤と
しては、鉄とトランスフェリンの結合や鉄と発色剤の反
応を妨害せず、還元剤によって速やかに二価鉄を遊離す
るキレート剤、例えば、クエン酸ナトリウム又はニトリ
ロ三酢酸等を好適に用いることができる。
【0011】第一試薬における三価鉄の配合量は、10
〜100μM、好ましくは10〜50μMであり、キレ
ート剤の配合量は、50〜2000μM、好ましくは8
0〜1500μMである。
【0012】第二試薬に添加する発色性キレート剤とし
ては、例えば2−(5−ニトロ−2−ピリジルアゾ)−
5−(N−プロピル−N−スルホプロピルアミノ)フェ
ノ−ル(Nitro−PAPS)等のピリジルアゾ化合
物や、2−ニトロソ−5−(N−プロピル−N−スルホ
プロピルアミノ)フェノール(ニトロソ−PSAP)、
2−ニトロソ−5−(N−エチル−N−スルホプロピル
アミノ)フェノール(ニトロソ−ESAP)等のニトロ
ソアミノフェノール誘導体、あるいはバソフェナンスロ
リン等を用いることができる。還元剤としては、チオセ
ミカルバシド又はカルボヒドラジド等のヒドラジン誘導
体を用いることができる。
【0013】発色性キレート剤の配合量は、1〜10m
M、好ましくは2〜5mMであり、還元剤であるチオセ
ミカルバジドの配合量は、0.1〜10mM、好ましく
は0.5〜5mMである。また、カルボヒドラジドの配
合量は10〜100mM、好ましくは20〜50mMで
ある。
【0014】第一試薬のpHを7.5〜9(特に8.5
付近)とし、第二試薬のpHを7.5〜9(特に8.5
付近)に維持することにより、各構成成分を長期間安定
に保存することができる。また、第一試薬と第二試薬と
を被検検体と混合した場合に、トランスフェリンと三価
鉄の反応時のpHをpH7.8〜8.5(特にpH8.
2付近)に設定することができる。
【0015】第一試薬及び第二試薬の緩衝液は、トラン
スフェリンと三価鉄の反応時のpHを前記の範囲内にす
ることができれば特に限定されず、従来公知のものを使
用することができる。具体的には、グリシン緩衝液、そ
の他トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン等を使用
することができる。また、そのpHは好ましくは7.5
〜9.0、特に好ましくは8.0〜8.8である。
【0016】前記の第一試薬及び/又は第二試薬には、
前記の必須の配合成分の他に、必要により、一般的に添
加される成分、例えばアジ化物等の防腐剤、及び各種界
面活性剤等を適宜添加使用することができる。
【0017】このように構成されたUIBC測定用試薬
によって、被検検体にトランスフェリン量よりも過剰の
既知量の三価鉄を作用させると、トランスフェリンは三
価の鉄で飽和される。トランスフェリンと結合しなかっ
た三価鉄はチオセミカルバジドによって二価に還元さ
れ、発色剤とキレ−ト結合して発色する。添加した既知
過剰量の鉄量から、結合しなかった残余鉄量を差し引く
ことによってUIBCを求めることができる。
【0018】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例1 ニトリロ三酢酸(1mM)及び硫酸鉄(III)アンモニウ
ム・12水塩(18μM)を1Mグリシン緩衝液(pH
8.5)に溶解し、1N−NaOHでpHを8.50に
調整し、全体を1リットルとして第一試薬とした。Ni
tro−PAPS(2.7mM)と還元剤としてのチオ
セミカルバジド(2mM)を0.1Mグリシン緩衝液
(pH8.5)に溶解し、pHを8.50に調整し、全
体を1リットルとして第二試薬とした。比較用として、
還元剤としてアルコルビン酸(10mM)を用いたもの
を別途調製した。
【0019】前記の第一試薬と第二試薬を25℃にて保
存し、保存当日、1ヶ月後、及び3ヶ月後の反応曲線を
生理食塩水及び鉄標準液をサンプルとし、そのサンプル
20μlに第一試薬240μlを入れ、37℃で5分間
加温した後、第二試薬60μlを入れ、37℃で5分間
加温し、波長800nmにおける吸光度を測定した。こ
の結果を図1(アスコルビン酸=対照用還元剤)及び図
2(チオセミカルバジド=本発明還元剤)に示した。
1及び図2において、「R1」は第一試薬を意味し、そ
して「R2」は第二試薬を意味する。
【0020】実施例2 第一試薬としては、実施例1で調製した第一試薬を使用
した。また、Nitro−PAPS(2.7mM)とチ
オセミカルバジド(2mM)とを0.1Mグリシン緩衝
液(pH8.5)に溶解し、1N−NaOHでpHを
8.50に調整し、全体を1リットルとして第二試薬と
した。検体20μlに第一試薬240μlを入れ、37
℃で5分間加温した後、第二試薬60μlを入れ、37
℃で5分間加温した後、800nmの吸光度を測定して
UIBCを測定した。
【0021】前記の本発明試薬を評価するために、下記
の従来法を実施した。即ち、TIBCと血清鉄とを求
め、両者の差からUIBCを測定する方法である。血清鉄測定方法: アルコルビン酸(0.08重量%)を
1.3M酢酸緩衝液(pH4.6)に溶解し、全体を1
リットルとして第一試薬とした。Nitro−PAPS
(0.14mM)を酢酸ナトリウム(0.2M)溶液に
溶解し、全体を1リットルとして第二試薬とした。検体
15μlに第一試薬320μlを入れ、37℃で5分間
加温した後、第二試薬80μlを入れ、37℃で5分間
加温した後、600nmの吸光度を測定して血清鉄を測
定した。
【0022】TIBC測定方法:塩化第二鉄72μMを
1N−HClに溶解し、全体を1リットルとして鉄溶液
とした。検体200μlに鉄溶液400μlを加えて混
和し、吸着剤である炭酸マグネシウム約0.5gを加え
てよく混和した。室温に5分間以上静置した後、300
0rpmで10分間遠心し、上清をTIBC測定用検体
とした。TIBC検体15μlに血清鉄測定用第一試薬
320μlを入れ、37℃で5分間加温した後、血清鉄
測定用第二試薬80μlを入れ、37℃で5分間加温し
た後、600nmの吸光度を測定してTIBC値を測定
した。両者の差を求めUIBC値とした。前記の従来法
と本発明試薬との相関関係を図3に示した。
【0023】
【発明の効果】本発明のUIBC測定用試薬は、液状の
ままで、暗所又は明所にて、常温ないし低温下で長期間
(少なくとも半年以上)にわたって安定に貯蔵すること
ができる。従って、臨床検査を実施する現場で長期に保
存しておき、使用に際しては、溶解操作の必要もなく、
そのまま自動分析機などに適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】対照用試薬における保存安定性を示すグラフで
ある。
【図2】本発明試薬における保存安定性を示すグラフで
ある。
【図3】本発明試薬と、従来のTIBC量から血清鉄量
を差し引く方法の試薬による測定結果の相関関係を示す
グラフである。

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 血清の不飽和鉄結合能(UIBC)の測
    試薬において、少なくとも三価鉄及びキレ−ト剤を
    含有する第一試薬と、少なくとも発色性キレート剤及び
    ヒドラジン誘導体を含有する第二試薬とからなり、第一
    試薬のpHが7.5〜9であり、第二試薬のpHがpH
    7.5〜9であり、そしてそれぞれ液状試薬であること
    を特徴とする、血清の不飽和鉄結合能(UIBC)測定
    用試薬。
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JP2020054249A (ja) * 2018-09-28 2020-04-09 ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社 エタノールアミンリン酸の測定方法
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