JP3434553B2 - 無機リン測定用試薬 - Google Patents
無機リン測定用試薬Info
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- inorganic phosphorus
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、無機リン測定用試薬に
関する。更に詳細には、長期間安定な無機リン測定用の
液状化された試薬組成物に関する。
関する。更に詳細には、長期間安定な無機リン測定用の
液状化された試薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】人体のリン（無機リン又は有機リン）
は、骨を形成し、高エネルギーリン酸化化合物、核酸又
はリン脂質などを構成する他、血液の緩衝能保持にも貢
献している。無機リンは、各種ホルモンやビタミンＤに
よる代謝調節を受けており、カルシウムと共に電解質代
謝の動態を知る上で血中又は尿中濃度の測定が重要であ
る。臨床的には腎機能や骨代謝をよく反映し、特に尿中
排泄が低下する慢性腎不全では著しい高リン症が見られ
る。
は、骨を形成し、高エネルギーリン酸化化合物、核酸又
はリン脂質などを構成する他、血液の緩衝能保持にも貢
献している。無機リンは、各種ホルモンやビタミンＤに
よる代謝調節を受けており、カルシウムと共に電解質代
謝の動態を知る上で血中又は尿中濃度の測定が重要であ
る。臨床的には腎機能や骨代謝をよく反映し、特に尿中
排泄が低下する慢性腎不全では著しい高リン症が見られ
る。
【０００３】無機リン測定法としては従来から種々の方
法が確立されており、それぞれの特徴をもっている。例
えば、検体中の無機リンを酸性溶液中でモリブデン酸ア
ンモニウムと反応させ、生成するリンモリブデン酸アン
モニウムを比色測定して無機リン量を求める方法や、リ
ンモリブデン酸アンモニウムを更に還元処理してモリブ
デンブルーにし、これを比色測定して無機リン量を求め
る方法などがあった。しかし、これらの方法には、操作
の煩雑さ、低感度、機器の着色や腐食など種々の問題も
ある。
法が確立されており、それぞれの特徴をもっている。例
えば、検体中の無機リンを酸性溶液中でモリブデン酸ア
ンモニウムと反応させ、生成するリンモリブデン酸アン
モニウムを比色測定して無機リン量を求める方法や、リ
ンモリブデン酸アンモニウムを更に還元処理してモリブ
デンブルーにし、これを比色測定して無機リン量を求め
る方法などがあった。しかし、これらの方法には、操作
の煩雑さ、低感度、機器の着色や腐食など種々の問題も
ある。
【０００４】そこで、近年は以下の工程からなる測定方
法がよく用いられている。すなわち、検体中の無機リン
に、イノシンの存在下でプリンヌクレオシドホスフォリ
ラーゼ（以下ＰＮＰと略す）及びキサンチンオキシダー
ゼ（以下ＸＯＤと略す）を作用させてＨ2 Ｏ2 を生成さ
せ、続いてこのＨ2 Ｏ2 をペルオキシダーゼ（以下ＰＯ
Ｄと略す）の存在下で、カプラーとしての４−アミノア
ンチピリン（以下４ＡＡＰと略す）と水素供与体として
のＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン
（以下ＥＳＰＴと略す）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒド
ロキシ−３−スルホプロピル）３，５−ジメトキシアニ
リン（以下ＤＡＯＳと略す）又はＮ−（２−ヒドロキシ
−３−スルホプロピル）３，５−ジメトキシアニリン
（以下ＨＤＡＯＳと略す）などと酸化縮合反応させてキ
ノイド色素を形成させ、得られた色素を比色測定して無
機リン量を求める方法である。この測定法は再現性及び
直線性に優れており、機器の着色や腐食の心配もないの
で繁用されている。
法がよく用いられている。すなわち、検体中の無機リン
に、イノシンの存在下でプリンヌクレオシドホスフォリ
ラーゼ（以下ＰＮＰと略す）及びキサンチンオキシダー
ゼ（以下ＸＯＤと略す）を作用させてＨ2 Ｏ2 を生成さ
せ、続いてこのＨ2 Ｏ2 をペルオキシダーゼ（以下ＰＯ
Ｄと略す）の存在下で、カプラーとしての４−アミノア
ンチピリン（以下４ＡＡＰと略す）と水素供与体として
のＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン
（以下ＥＳＰＴと略す）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒド
ロキシ−３−スルホプロピル）３，５−ジメトキシアニ
リン（以下ＤＡＯＳと略す）又はＮ−（２−ヒドロキシ
−３−スルホプロピル）３，５−ジメトキシアニリン
（以下ＨＤＡＯＳと略す）などと酸化縮合反応させてキ
ノイド色素を形成させ、得られた色素を比色測定して無
機リン量を求める方法である。この測定法は再現性及び
直線性に優れており、機器の着色や腐食の心配もないの
で繁用されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかし、前記のキノイ
ド色素を形成させる方法では不安定なＰＮＰやＸＯＤな
どの酵素が用いられており、液状での長期保存が難しい
ので、試薬形態を凍結乾燥品として供給されていた。ま
た、各成分の安定条件もそれぞれ異なるため、試薬を構
成する場合、それら試薬の安定性は各成分の組み合わせ
により大きく変化し、特に液状試薬の場合、通常の組み
合わせでは長期間安定性を維持するのが困難であった。
ド色素を形成させる方法では不安定なＰＮＰやＸＯＤな
どの酵素が用いられており、液状での長期保存が難しい
ので、試薬形態を凍結乾燥品として供給されていた。ま
た、各成分の安定条件もそれぞれ異なるため、試薬を構
成する場合、それら試薬の安定性は各成分の組み合わせ
により大きく変化し、特に液状試薬の場合、通常の組み
合わせでは長期間安定性を維持するのが困難であった。
【０００６】一方、自動分析機の普及に伴って、無機リ
ン測定法の試薬構成も１試薬系から２試薬系に代わって
きている。２試薬系での試薬組成の従来の組み合わせ
は、第一試薬がＸＯＤ、ＰＯＤ、ＥＳＰＴ及びイノシン
からなり、第二試薬がＰＮＰと４ＡＡＰとからなる構成
や、あるいは第一試薬がＸＯＤ、ＰＯＤ及びＥＳＰＴか
らなり、第二試薬がイノシン、ＰＮＰ及び４ＡＡＰとか
らなるように構成されていたが、液状での保存安定性は
極めて乏しいものであった。更に、近年、使用時に試薬
を液状に調製するのではなく、供給時の試薬形態から液
状とし、ユーザーの作業性を向上させることが求められ
ている。
ン測定法の試薬構成も１試薬系から２試薬系に代わって
きている。２試薬系での試薬組成の従来の組み合わせ
は、第一試薬がＸＯＤ、ＰＯＤ、ＥＳＰＴ及びイノシン
からなり、第二試薬がＰＮＰと４ＡＡＰとからなる構成
や、あるいは第一試薬がＸＯＤ、ＰＯＤ及びＥＳＰＴか
らなり、第二試薬がイノシン、ＰＮＰ及び４ＡＡＰとか
らなるように構成されていたが、液状での保存安定性は
極めて乏しいものであった。更に、近年、使用時に試薬
を液状に調製するのではなく、供給時の試薬形態から液
状とし、ユーザーの作業性を向上させることが求められ
ている。
【０００７】本発明者らは、こうした従来の問題を解決
すべく鋭意研究を重ねた結果、液状試薬の形態で供給し
ても、長期間にわたって充分な保存安定性を有する試薬
組成を見出した。更に、この試薬組成における酵素の安
定化についても検討した結果、好適な安定化剤を見出す
ことに成功した。本発明はこうした知見に基づくもので
ある。
すべく鋭意研究を重ねた結果、液状試薬の形態で供給し
ても、長期間にわたって充分な保存安定性を有する試薬
組成を見出した。更に、この試薬組成における酵素の安
定化についても検討した結果、好適な安定化剤を見出す
ことに成功した。本発明はこうした知見に基づくもので
ある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、プリンヌクレ
オシドホスフォリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ペ
ルオキシダーゼ、イノシン、４−アミノアンチピリン及
びＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジンを
含む無機リン測定用試薬において、少なくともキサンチ
ンオキシダーゼ及びプリンヌクレオシドホスフォリラー
ゼを含有するが、イノシンを含有しない第一試薬と、少
なくともイノシンを含有するが、キサンチンオキシダー
ゼ及びプリンヌクレオシドホスフォリラーゼを含有しな
い第二試薬とからなり、それぞれが液状試薬であること
を特徴とする、無機リン測定用試薬に関する。
オシドホスフォリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ペ
ルオキシダーゼ、イノシン、４−アミノアンチピリン及
びＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジンを
含む無機リン測定用試薬において、少なくともキサンチ
ンオキシダーゼ及びプリンヌクレオシドホスフォリラー
ゼを含有するが、イノシンを含有しない第一試薬と、少
なくともイノシンを含有するが、キサンチンオキシダー
ゼ及びプリンヌクレオシドホスフォリラーゼを含有しな
い第二試薬とからなり、それぞれが液状試薬であること
を特徴とする、無機リン測定用試薬に関する。
【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
よる無機リン測定用試薬を適用することのできる測定方
法は、検体中の無機リンにプリンヌクレオシドホスフォ
リラーゼ（ＰＮＰ）の存在下でイノシンを反応させてヒ
ポキサンチンを生成させ、得られたヒポキサンチンにキ
サンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）を作用させて過酸化水
素を生成させ、得られた過酸化水素にペルオキシダーゼ
（ＰＯＤ）の存在下で４−アミノアンチピリン（４ＡＡ
Ｐ＝カプラー）及びＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−
ｍ−トルイジン（ＥＳＰＴ＝水素供与体）を反応させて
キノイド色素を形成させ、こうして形成されるキノイド
色素の増加量を測定することからなる。この測定方法を
反応式で示せば、以下のとおりである。
よる無機リン測定用試薬を適用することのできる測定方
法は、検体中の無機リンにプリンヌクレオシドホスフォ
リラーゼ（ＰＮＰ）の存在下でイノシンを反応させてヒ
ポキサンチンを生成させ、得られたヒポキサンチンにキ
サンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）を作用させて過酸化水
素を生成させ、得られた過酸化水素にペルオキシダーゼ
（ＰＯＤ）の存在下で４−アミノアンチピリン（４ＡＡ
Ｐ＝カプラー）及びＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−
ｍ−トルイジン（ＥＳＰＴ＝水素供与体）を反応させて
キノイド色素を形成させ、こうして形成されるキノイド
色素の増加量を測定することからなる。この測定方法を
反応式で示せば、以下のとおりである。
【００１０】
【００１１】前記の反応工程からなる無機リン測定方法
に用いる本発明の無機リン測定用試薬は、（１）少なく
ともＸＯＤとＰＮＰとを含む液状第一試薬と、（２）少
なくともイノシンを含む液状第二試薬とから構成され
る。イノシンとＰＮＰとを共存させると、これらが保存
中に反応してしまい、無機リンの測定に大きな影響を与
える（キサンチン様物質が生成するためと考えられ
る）。この影響を回避するために両者を分ける必要があ
る。
に用いる本発明の無機リン測定用試薬は、（１）少なく
ともＸＯＤとＰＮＰとを含む液状第一試薬と、（２）少
なくともイノシンを含む液状第二試薬とから構成され
る。イノシンとＰＮＰとを共存させると、これらが保存
中に反応してしまい、無機リンの測定に大きな影響を与
える（キサンチン様物質が生成するためと考えられ
る）。この影響を回避するために両者を分ける必要があ
る。
【００１２】更に、これらの第一試薬と第二試薬とを用
いて無機リンを測定する場合には、検体中の内因性キサ
ンチンを予め消去しておくことが好ましい。このため、
最初に検体と接触させる第一試薬にＸＯＤを含ませてお
くと共に、第一試薬には更にＥＳＰＴを添加するか、あ
るいは、第一試薬に更にカタラーゼを添加するのが好ま
しい。後者の場合には、ＥＳＰＴを第二試薬に添加す
る。また、第一試薬にＥＳＰＴとカタラーゼとを添加
し、第二試薬にＰＯＤを添加してもよい。すなわち、Ｘ
ＯＤを含有する第一試薬を検体と接触させると、このＸ
ＯＤが内因性キサンチンに作用してＨ2 Ｏ2 が生成され
る。第一試薬内に、更にＥＳＰＴが存在すると、ＥＳＰ
Ｔによる自己縮合反応によりＨ2 Ｏ2 が消去される。ま
た、第一試薬内にカタラーゼが存在すると、カタラーゼ
による消去反応によりＨ2Ｏ2 が消去される。こうして
内因性キサンチンによる影響をなくした後で、イノシン
を含有する第二試薬を検体に接触させると、測定対象物
である無機リンがイノシンの存在下でＰＮＰ及びＸＯＤ
の作用によりＨ2 Ｏ2 を生成し、このＨ2 Ｏ2 がＰＯＤ
の存在下でカプラーと水素供与体を酸化縮合反応してキ
ノイド色素を形成させる。この際に、イノシンとＰＮＰ
との共存を避けるために、ＰＮＰを第一試薬に添加する
のが好ましい。
いて無機リンを測定する場合には、検体中の内因性キサ
ンチンを予め消去しておくことが好ましい。このため、
最初に検体と接触させる第一試薬にＸＯＤを含ませてお
くと共に、第一試薬には更にＥＳＰＴを添加するか、あ
るいは、第一試薬に更にカタラーゼを添加するのが好ま
しい。後者の場合には、ＥＳＰＴを第二試薬に添加す
る。また、第一試薬にＥＳＰＴとカタラーゼとを添加
し、第二試薬にＰＯＤを添加してもよい。すなわち、Ｘ
ＯＤを含有する第一試薬を検体と接触させると、このＸ
ＯＤが内因性キサンチンに作用してＨ2 Ｏ2 が生成され
る。第一試薬内に、更にＥＳＰＴが存在すると、ＥＳＰ
Ｔによる自己縮合反応によりＨ2 Ｏ2 が消去される。ま
た、第一試薬内にカタラーゼが存在すると、カタラーゼ
による消去反応によりＨ2Ｏ2 が消去される。こうして
内因性キサンチンによる影響をなくした後で、イノシン
を含有する第二試薬を検体に接触させると、測定対象物
である無機リンがイノシンの存在下でＰＮＰ及びＸＯＤ
の作用によりＨ2 Ｏ2 を生成し、このＨ2 Ｏ2 がＰＯＤ
の存在下でカプラーと水素供与体を酸化縮合反応してキ
ノイド色素を形成させる。この際に、イノシンとＰＮＰ
との共存を避けるために、ＰＮＰを第一試薬に添加する
のが好ましい。
【００１３】従って、第一試薬がＸＯＤ、ＰＮＰ及びＰ
ＯＤを含有し、第二試薬がイノシン及び４ＡＡＰを含有
し、更に、内因性キサンチンを予め消去するために、上
記第一試薬にＥＳＰＴを添加（自己縮合反応による消
去）するか、あるいは上記第一試薬にカタラーゼを添加
し、第二試薬にＥＳＰＴを添加（カタラーゼによる消去
反応）した試薬構成とすることが好適である。なお、上
記の反応工程に参加するＨ2 ＯとＯ2 は、検体から供給
される。
ＯＤを含有し、第二試薬がイノシン及び４ＡＡＰを含有
し、更に、内因性キサンチンを予め消去するために、上
記第一試薬にＥＳＰＴを添加（自己縮合反応による消
去）するか、あるいは上記第一試薬にカタラーゼを添加
し、第二試薬にＥＳＰＴを添加（カタラーゼによる消去
反応）した試薬構成とすることが好適である。なお、上
記の反応工程に参加するＨ2 ＯとＯ2 は、検体から供給
される。
【００１４】第一試薬に含まれるＸＯＤの由来について
は特に限定されないが、微生物由来のＸＯＤが好適に用
いられる。その添加量は個々の具体的測定系を考慮して
適宜選択することができるが、一般的に１〜１００Ｕ／
ｍｌ、好ましくは５〜５０Ｕ／ｍｌであれば良い。１Ｕ
／ｍｌ未満になると充分な酵素活性が得られない。１０
０Ｕ／ｍｌを超えても測定上の支障はないが、不純物混
入の問題やコストの面からは必ずしも有利ではなく、必
要以上の過剰量を添加する必要はない。
は特に限定されないが、微生物由来のＸＯＤが好適に用
いられる。その添加量は個々の具体的測定系を考慮して
適宜選択することができるが、一般的に１〜１００Ｕ／
ｍｌ、好ましくは５〜５０Ｕ／ｍｌであれば良い。１Ｕ
／ｍｌ未満になると充分な酵素活性が得られない。１０
０Ｕ／ｍｌを超えても測定上の支障はないが、不純物混
入の問題やコストの面からは必ずしも有利ではなく、必
要以上の過剰量を添加する必要はない。
【００１５】ＰＮＰについてもその由来は特に限定され
ず、動物組織、赤血球又は酵母由来のＰＮＰを用いるこ
とができる。その添加量は個々の具体的測定系を考慮し
て適宜選択することができるが、一般的に０．１〜１０
Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．５〜５Ｕ／ｍｌであれば良
い。０．１Ｕ／ｍｌ未満になると充分な酵素活性が得ら
れない。１０Ｕ／ｍｌを超えても測定上の支障はない
が、不純物混入の問題やコストの面からは必ずしも有利
ではなく、必要以上の過剰量を添加する必要はない。
ず、動物組織、赤血球又は酵母由来のＰＮＰを用いるこ
とができる。その添加量は個々の具体的測定系を考慮し
て適宜選択することができるが、一般的に０．１〜１０
Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．５〜５Ｕ／ｍｌであれば良
い。０．１Ｕ／ｍｌ未満になると充分な酵素活性が得ら
れない。１０Ｕ／ｍｌを超えても測定上の支障はない
が、不純物混入の問題やコストの面からは必ずしも有利
ではなく、必要以上の過剰量を添加する必要はない。
【００１６】ＰＯＤについてもその由来は特に限定され
ず、動物組織や西洋わさび由来のＰＯＤを用いることが
できる。その添加量は個々の具体的測定系を考慮して適
宜選択することができるが、一般的に１〜１００Ｕ／ｍ
ｌ、好ましくは５〜５０Ｕ／ｍｌであれば良い。１Ｕ／
ｍｌ未満になると充分な酵素活性が得られない。１００
Ｕ／ｍｌを超えても測定上の支障はないが、不純物混入
の問題やコストの面からは必ずしも有利ではなく、必要
以上の過剰量を添加する必要はない。
ず、動物組織や西洋わさび由来のＰＯＤを用いることが
できる。その添加量は個々の具体的測定系を考慮して適
宜選択することができるが、一般的に１〜１００Ｕ／ｍ
ｌ、好ましくは５〜５０Ｕ／ｍｌであれば良い。１Ｕ／
ｍｌ未満になると充分な酵素活性が得られない。１００
Ｕ／ｍｌを超えても測定上の支障はないが、不純物混入
の問題やコストの面からは必ずしも有利ではなく、必要
以上の過剰量を添加する必要はない。
【００１７】第二試薬に含まれるイノシンの添加量も、
個々の具体的測定系を考慮して適宜選択することができ
るが、一般的に０．５〜５０ｍＭ、好ましくは１〜１０
ｍＭであれば良い。０．５ｍＭ未満になると充分な酵素
反応が起こらない。５０ｍＭを超えても測定上の支障は
ないが、不純物混入の問題やコストの面、更には基質障
害の発生から必ずしも有利ではなく、必要以上の過剰量
を添加する必要はない。
個々の具体的測定系を考慮して適宜選択することができ
るが、一般的に０．５〜５０ｍＭ、好ましくは１〜１０
ｍＭであれば良い。０．５ｍＭ未満になると充分な酵素
反応が起こらない。５０ｍＭを超えても測定上の支障は
ないが、不純物混入の問題やコストの面、更には基質障
害の発生から必ずしも有利ではなく、必要以上の過剰量
を添加する必要はない。
【００１８】４ＡＡＰについても、その添加量は個々の
具体的測定系を考慮して適宜選択することができるが、
一般的に０．１〜２０ｍＭ、好ましくは０．５〜１０ｍ
Ｍであれば良い。０．１ｍＭ未満になると充分な酵素反
応が起こらない。２０ｍＭを超えても測定上の支障はな
いが、不純物混入の問題やコストの面から必ずしも有利
ではなく、必要以上の過剰量を添加する必要はない。
具体的測定系を考慮して適宜選択することができるが、
一般的に０．１〜２０ｍＭ、好ましくは０．５〜１０ｍ
Ｍであれば良い。０．１ｍＭ未満になると充分な酵素反
応が起こらない。２０ｍＭを超えても測定上の支障はな
いが、不純物混入の問題やコストの面から必ずしも有利
ではなく、必要以上の過剰量を添加する必要はない。
【００１９】また、緩衝液及びそのｐＨは、第一試薬及
び第二試薬共に、ＸＯＤ、ＰＮＰ及びＰＯＤの反応至適
ｐＨで、保存安定性のよいｐＨ５．０〜ｐＨ９．０、特
にｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が好ましく、このｐＨで緩衝
能のある緩衝液を用いるのが好ましい。具体的にはＰＩ
ＰＥＳ〔ピペラジン−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−エタンス
ルホン酸）〕、ＢＥＳ〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ
エチル）−２−アミノエタンスルホン酸〕、ＨＥＰＥＳ
〔Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エ
タンスルホン酸〕などのグッド緩衝液を使用することが
できる。この他、前記ｐＨ範囲で緩衝能のある緩衝液
で、反応性や安定性などに問題がないものであれば、何
を用いてもよい。
び第二試薬共に、ＸＯＤ、ＰＮＰ及びＰＯＤの反応至適
ｐＨで、保存安定性のよいｐＨ５．０〜ｐＨ９．０、特
にｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が好ましく、このｐＨで緩衝
能のある緩衝液を用いるのが好ましい。具体的にはＰＩ
ＰＥＳ〔ピペラジン−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−エタンス
ルホン酸）〕、ＢＥＳ〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ
エチル）−２−アミノエタンスルホン酸〕、ＨＥＰＥＳ
〔Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エ
タンスルホン酸〕などのグッド緩衝液を使用することが
できる。この他、前記ｐＨ範囲で緩衝能のある緩衝液
で、反応性や安定性などに問題がないものであれば、何
を用いてもよい。
【００２０】検体中の内因性キサンチンを予め消去する
ために、第一試薬にＥＳＰＴを添加する場合、その添加
量は個々の具体的測定系を考慮して適宜選択することが
できるが、一般的に０．５〜５０ｍＭ、好ましくは１〜
１０ｍＭであれば良い。０．１ｍＭ未満になると充分な
酵素反応が起こらない。２０ｍＭを超えても測定上の支
障はないが、不純物混入の問題やコストの面から必ずし
も有利ではなく、必要以上の過剰量を添加する必要はな
い。
ために、第一試薬にＥＳＰＴを添加する場合、その添加
量は個々の具体的測定系を考慮して適宜選択することが
できるが、一般的に０．５〜５０ｍＭ、好ましくは１〜
１０ｍＭであれば良い。０．１ｍＭ未満になると充分な
酵素反応が起こらない。２０ｍＭを超えても測定上の支
障はないが、不純物混入の問題やコストの面から必ずし
も有利ではなく、必要以上の過剰量を添加する必要はな
い。
【００２１】また、第一試薬にカタラーゼを添加し、第
二試薬にＥＳＰＴを添加する場合、ＥＳＰＴは第一試薬
に添加する場合と同様の条件で第二試薬に添加すれば良
い。一方、カタラーゼについてはその由来は特に限定さ
れず、動物や細菌由来のカタラーゼを用いることができ
る。その添加量は個々の具体的測定系を考慮して適宜選
択することができるが、一般的に１〜１００Ｕ／ｍｌ、
好ましくは５〜５０Ｕ／ｍｌであれば良い。１Ｕ／ｍｌ
未満になると充分な酵素活性が得られない。１００Ｕ／
ｍｌを超えても測定上の支障はないが、不純物混入の問
題やコストの面からは必ずしも有利ではなく、必要以上
の過剰量を添加する必要はない。
二試薬にＥＳＰＴを添加する場合、ＥＳＰＴは第一試薬
に添加する場合と同様の条件で第二試薬に添加すれば良
い。一方、カタラーゼについてはその由来は特に限定さ
れず、動物や細菌由来のカタラーゼを用いることができ
る。その添加量は個々の具体的測定系を考慮して適宜選
択することができるが、一般的に１〜１００Ｕ／ｍｌ、
好ましくは５〜５０Ｕ／ｍｌであれば良い。１Ｕ／ｍｌ
未満になると充分な酵素活性が得られない。１００Ｕ／
ｍｌを超えても測定上の支障はないが、不純物混入の問
題やコストの面からは必ずしも有利ではなく、必要以上
の過剰量を添加する必要はない。
【００２２】上述のように構成された本発明による無機
リン測定用液状試薬は、上記の態様で充分に長期間安定
性を維持することができるが、本発明者は更に、微生物
由来のＸＯＤについてその安定化方法を検討したとこ
ろ、オキソン酸又はその塩、あるいはエチレンジアミン
四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ２Ｎａ）などのキレ−ト
剤、あるいはエチレンジアミン四酢酸亜鉛錯体（ＥＤＴ
Ａ−Ｚｎ）などの金属−キレート化合物を含有させるこ
とにより、ＸＯＤを安定化することができることを見出
した。
リン測定用液状試薬は、上記の態様で充分に長期間安定
性を維持することができるが、本発明者は更に、微生物
由来のＸＯＤについてその安定化方法を検討したとこ
ろ、オキソン酸又はその塩、あるいはエチレンジアミン
四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ２Ｎａ）などのキレ−ト
剤、あるいはエチレンジアミン四酢酸亜鉛錯体（ＥＤＴ
Ａ−Ｚｎ）などの金属−キレート化合物を含有させるこ
とにより、ＸＯＤを安定化することができることを見出
した。
【００２３】従来技術においても、例えば、特開平４−
３３５８８７号公報にはＸＯＤを安定化させる方法が開
示されている。すなわち、鉄、銅、コバルト及びマンガ
ンからなる群より選ばれた金属の塩（錯塩を含む）及び
／又はこれらの金属キレート化合物によりＸＯＤが安定
化されることが記載されている。しかし、この方法は、
バターミルク由来のＸＯＤを使用した場合の安定化方法
であり、微生物由来ＸＯＤの安定化条件とは異なる。こ
れに対して、微生物由来のＸＯＤでは、鉄、銅、コバル
ト及びマンガンからなる群より選ばれた金属の金属キレ
ート化合物以外にも、亜鉛、マグネシウム及びカルシウ
ムからなる群より選ばれた金属の金属キレート化合物に
より、好適な安定化効果を得ることができる。
３３５８８７号公報にはＸＯＤを安定化させる方法が開
示されている。すなわち、鉄、銅、コバルト及びマンガ
ンからなる群より選ばれた金属の塩（錯塩を含む）及び
／又はこれらの金属キレート化合物によりＸＯＤが安定
化されることが記載されている。しかし、この方法は、
バターミルク由来のＸＯＤを使用した場合の安定化方法
であり、微生物由来ＸＯＤの安定化条件とは異なる。こ
れに対して、微生物由来のＸＯＤでは、鉄、銅、コバル
ト及びマンガンからなる群より選ばれた金属の金属キレ
ート化合物以外にも、亜鉛、マグネシウム及びカルシウ
ムからなる群より選ばれた金属の金属キレート化合物に
より、好適な安定化効果を得ることができる。
【００２４】本発明で微生物由来ＸＯＤを使用する場合
には、その安定化剤として、具体的には、オキソン酸；
オキソン酸塩、例えば、オキソン酸カリウム又はオキソ
ン酸アンモニウム；キレート剤、例えば、エチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，２−シクロヘキサンジア
ミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、サルコシン二アンモニウム
塩（ＤＴＣＳ）、ニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、
イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、若しくはニトリロ三酢酸（Ｎ
ＴＡ）又はこれらの塩、例えば、エチレンジアミン四酢
酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ２Ｎａ）やニトリロ三酢酸二
ナトリウム塩（ＮＴＡ２Ｎａ）；又は金属−キレート化
合物（すなわち、前述のキレート剤と鉄、銅、コバル
ト、マンガン、亜鉛、マグネシウム及びカルシウムから
なる群より選ばれた金属との化合物）、例えば、エチレ
ンジアミン四酢酸亜鉛錯体（ＥＤＴＡ−Ｚｎ）、１，２
−シクロヘキサンジアミン四酢酸カルシウム錯体（Ｃｙ
ＤＴＡ−Ｃａ）などを、単独で又は組み合わせて用いる
ことができる。
には、その安定化剤として、具体的には、オキソン酸；
オキソン酸塩、例えば、オキソン酸カリウム又はオキソ
ン酸アンモニウム；キレート剤、例えば、エチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，２−シクロヘキサンジア
ミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、サルコシン二アンモニウム
塩（ＤＴＣＳ）、ニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、
イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、若しくはニトリロ三酢酸（Ｎ
ＴＡ）又はこれらの塩、例えば、エチレンジアミン四酢
酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ２Ｎａ）やニトリロ三酢酸二
ナトリウム塩（ＮＴＡ２Ｎａ）；又は金属−キレート化
合物（すなわち、前述のキレート剤と鉄、銅、コバル
ト、マンガン、亜鉛、マグネシウム及びカルシウムから
なる群より選ばれた金属との化合物）、例えば、エチレ
ンジアミン四酢酸亜鉛錯体（ＥＤＴＡ−Ｚｎ）、１，２
−シクロヘキサンジアミン四酢酸カルシウム錯体（Ｃｙ
ＤＴＡ−Ｃａ）などを、単独で又は組み合わせて用いる
ことができる。
【００２５】これらＸＯＤ安定化剤の添加量は、個々の
具体的測定系を考慮して適宜選択することができるが、
一般的に０．１〜１００ｍＭ、好ましくは０．２〜２０
ｍＭであれば良い。０．１ｍＭ未満になると充分な安定
化効果を得ることができない。１００ｍＭを超えても安
定化効果の上では支障はないが、不純物混入の問題やコ
ストの面から必ずしも有利ではなく、必要以上の過剰量
を添加する必要はない。なお、バターミルク由来のＸＯ
Ｄは不安定な酵素であり、前記特開平４−３３５８８７
号公報記載のＸＯＤ安定化方法を用いても、長期保存可
能な液状試薬を完成するために必要な安定性を得ること
はできない。
具体的測定系を考慮して適宜選択することができるが、
一般的に０．１〜１００ｍＭ、好ましくは０．２〜２０
ｍＭであれば良い。０．１ｍＭ未満になると充分な安定
化効果を得ることができない。１００ｍＭを超えても安
定化効果の上では支障はないが、不純物混入の問題やコ
ストの面から必ずしも有利ではなく、必要以上の過剰量
を添加する必要はない。なお、バターミルク由来のＸＯ
Ｄは不安定な酵素であり、前記特開平４−３３５８８７
号公報記載のＸＯＤ安定化方法を用いても、長期保存可
能な液状試薬を完成するために必要な安定性を得ること
はできない。
【００２６】ＰＮＰについても同様に安定化方法を検討
したところ、微生物由来ＰＮＰに対しては、ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）を安定化剤として用いることができ
る。このＰＮＰ安定化剤の添加量も、個々の具体的測定
系を考慮して適宜選択することができるが、一般的に
０．１〜１００ｇ／リットル、好ましくは１〜１０ｇ／
リットルであれば良い。０．１ｇ／リットル未満になる
と充分な安定化効果を得ることができない。１００ｇ／
リットルを超えても安定化効果の上では支障はないが、
不純物混入の問題やコストの面から必ずしも有利ではな
く、必要以上の過剰量を添加する必要はない。
したところ、微生物由来ＰＮＰに対しては、ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）を安定化剤として用いることができ
る。このＰＮＰ安定化剤の添加量も、個々の具体的測定
系を考慮して適宜選択することができるが、一般的に
０．１〜１００ｇ／リットル、好ましくは１〜１０ｇ／
リットルであれば良い。０．１ｇ／リットル未満になる
と充分な安定化効果を得ることができない。１００ｇ／
リットルを超えても安定化効果の上では支障はないが、
不純物混入の問題やコストの面から必ずしも有利ではな
く、必要以上の過剰量を添加する必要はない。
【００２７】第一試薬及び／又は第二試薬には、前記の
各成分の他に、ＮａＮ3 などの防腐剤やＰＯＤの安定化
剤（例えば、アスコルビン酸オキシダーゼなど）を適宜
添加することができる。
各成分の他に、ＮａＮ3 などの防腐剤やＰＯＤの安定化
剤（例えば、アスコルビン酸オキシダーゼなど）を適宜
添加することができる。
【００２８】
【作用】このように構成された本発明による無機リン測
定用試薬により、検体中の無機リンから、イノシンの存
在下でＰＮＰ及びＸＯＤの作用によりＨ2 Ｏ2 を生成さ
せ、このＨ2 Ｏ2 をＰＯＤの存在下で４ＡＡＰとＥＳＰ
Ｔとにより酸化縮合反応させて、キノイド色素を形成さ
せる。この色素を比色測定して無機リン量を求めること
ができる。更に、本発明の液状試薬は、長期間保存可能
で、臨床検査分野での取扱いが極めて容易になる。
定用試薬により、検体中の無機リンから、イノシンの存
在下でＰＮＰ及びＸＯＤの作用によりＨ2 Ｏ2 を生成さ
せ、このＨ2 Ｏ2 をＰＯＤの存在下で４ＡＡＰとＥＳＰ
Ｔとにより酸化縮合反応させて、キノイド色素を形成さ
せる。この色素を比色測定して無機リン量を求めること
ができる。更に、本発明の液状試薬は、長期間保存可能
で、臨床検査分野での取扱いが極めて容易になる。
【００２９】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１ （１）試薬の調製 以下の組成からなる、本発明の第一試薬Ａ〜Ｄ及び第二
試薬Ａを調製した。 第一試薬Ａ：５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．
８） ＸＯＤ １６Ｕ／ｍｌ ＰＮＰ ２Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ １０Ｕ／ｍｌ ＥＳＰＴ ５ｍＭ 第一試薬Ｂ：第一試薬ＡにＢＳＡを２ｍｇ／ｍｌとなる
ように添加したもの。 第一試薬Ｃ：第一試薬Ａにオキソン酸カリウム５ｍＭ、
ＥＤＴＡ−Ｚｎを０．５ｍＭとなるように添加したも
の。 第一試薬Ｄ：第一試薬ＡにＢＳＡを２ｍｇ／ｍｌ、オキ
ソン酸カリウム５ｍＭ、ＥＤＴＡ−Ｚｎを０．５ｍＭと
なるように添加したもの。 第二試薬Ａ：５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．
８） イノシン ３．７ｍＭ ４ＡＡＰ １ｍＭ
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１ （１）試薬の調製 以下の組成からなる、本発明の第一試薬Ａ〜Ｄ及び第二
試薬Ａを調製した。 第一試薬Ａ：５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．
８） ＸＯＤ １６Ｕ／ｍｌ ＰＮＰ ２Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ １０Ｕ／ｍｌ ＥＳＰＴ ５ｍＭ 第一試薬Ｂ：第一試薬ＡにＢＳＡを２ｍｇ／ｍｌとなる
ように添加したもの。 第一試薬Ｃ：第一試薬Ａにオキソン酸カリウム５ｍＭ、
ＥＤＴＡ−Ｚｎを０．５ｍＭとなるように添加したも
の。 第一試薬Ｄ：第一試薬ＡにＢＳＡを２ｍｇ／ｍｌ、オキ
ソン酸カリウム５ｍＭ、ＥＤＴＡ−Ｚｎを０．５ｍＭと
なるように添加したもの。 第二試薬Ａ：５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．
８） イノシン ３．７ｍＭ ４ＡＡＰ １ｍＭ
【００３０】（２）安定性試験操作
上記の組み合わせにおいて、無機リン含量既知の管理血
清５μｌに各第一試薬Ａ〜Ｄ０．２ｍｌを添加し、３７
℃にて５分間加温した。次いで、第二試薬Ａ０．２ｍｌ
を添加して、３７℃で５分間反応させ、該反応液につい
て波長６００ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に、
血清に代えて生理食塩水を用いて同様の操作を行い、そ
の時の値をブランク値とした。更に別に、標準としてリ
ン酸一カリウムの水溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を調製して同
様の操作を行い管理血清中の無機リン量を求めた。ま
た、各試薬を１０℃にて保存し、２ヶ月後、４ヶ月後、
６ヶ月後、９ヶ月後及び１２ヶ月後に前記と同様の管理
血清を用いて同様の操作を行い無機リン量を求めた。こ
の時の標準は調製直後に測定した際の吸光度を用いて計
算した。得られた結果を図１に示す。本発明の試薬（第
一試薬Ａ〜Ｄと第二試薬Ａとの組み合わせ）によれば、
長期間保存後の無機リン測定値の変動は極めて少なく、
長期間安定な性能を維持していることを確認することが
できる。
清５μｌに各第一試薬Ａ〜Ｄ０．２ｍｌを添加し、３７
℃にて５分間加温した。次いで、第二試薬Ａ０．２ｍｌ
を添加して、３７℃で５分間反応させ、該反応液につい
て波長６００ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に、
血清に代えて生理食塩水を用いて同様の操作を行い、そ
の時の値をブランク値とした。更に別に、標準としてリ
ン酸一カリウムの水溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を調製して同
様の操作を行い管理血清中の無機リン量を求めた。ま
た、各試薬を１０℃にて保存し、２ヶ月後、４ヶ月後、
６ヶ月後、９ヶ月後及び１２ヶ月後に前記と同様の管理
血清を用いて同様の操作を行い無機リン量を求めた。こ
の時の標準は調製直後に測定した際の吸光度を用いて計
算した。得られた結果を図１に示す。本発明の試薬（第
一試薬Ａ〜Ｄと第二試薬Ａとの組み合わせ）によれば、
長期間保存後の無機リン測定値の変動は極めて少なく、
長期間安定な性能を維持していることを確認することが
できる。
【００３１】比較例
比較対照用として、以下の組成からなる第一試薬ａと第
二試薬ａとの組み合わせａ（比較例１）、及び第一試薬
ｂと第二試薬ｂとの組み合わせｂ（比較例２）を調製し
た。 （ａ）第一試薬ａ：５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ６．８） ＸＯＤ １６Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ １０Ｕ／ｍｌ ＥＳＰＴ ５ｍＭ 第二試薬ａ：５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．
８） イノシン ３．７ｍＭ ＰＮＰ ２Ｕ／ｍｌ ４ＡＡＰ １ｍＭ （ｂ）第一試薬ｂ：５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ６．８） ＸＯＤ １６Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ １０Ｕ／ｍｌ ＥＳＰＴ ５ｍＭ イノシン ３．７ｍＭ 第二試薬ｂ：ＰＮＰ ２Ｕ／ｍｌ ４ＡＡＰ １ｍＭ 前記実施例１と同様の方法で安定性試験を実施した。結
果を図１に示す。
二試薬ａとの組み合わせａ（比較例１）、及び第一試薬
ｂと第二試薬ｂとの組み合わせｂ（比較例２）を調製し
た。 （ａ）第一試薬ａ：５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ６．８） ＸＯＤ １６Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ １０Ｕ／ｍｌ ＥＳＰＴ ５ｍＭ 第二試薬ａ：５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．
８） イノシン ３．７ｍＭ ＰＮＰ ２Ｕ／ｍｌ ４ＡＡＰ １ｍＭ （ｂ）第一試薬ｂ：５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ６．８） ＸＯＤ １６Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ １０Ｕ／ｍｌ ＥＳＰＴ ５ｍＭ イノシン ３．７ｍＭ 第二試薬ｂ：ＰＮＰ ２Ｕ／ｍｌ ４ＡＡＰ １ｍＭ 前記実施例１と同様の方法で安定性試験を実施した。結
果を図１に示す。
【００３２】
【発明の効果】本発明の無機リン測定用試薬は、液状の
ままで、暗所又は明所にて、常温ないし低温下で長期間
（少なくとも１年程度）にわたって安定に貯蔵すること
ができる。従って、臨床検査を実施する現場で長期に保
存しておき、使用に際しては、溶解操作の必要もなく、
そのまま自動分析機などに適用することができる。
ままで、暗所又は明所にて、常温ないし低温下で長期間
（少なくとも１年程度）にわたって安定に貯蔵すること
ができる。従って、臨床検査を実施する現場で長期に保
存しておき、使用に際しては、溶解操作の必要もなく、
そのまま自動分析機などに適用することができる。
【図１】本発明試薬及び比較用試薬を１０℃で保存した
場合の安定性を示すグラフである。
場合の安定性を示すグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12Q 1/00 - 3/00
Claims (4)
- 【請求項１】 プリンヌクレオシドホスフォリラーゼ、
キサンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、イノシ
ン、４−アミノアンチピリン及びＮ−エチル−Ｎ−スル
ホプロピル−ｍ−トルイジンを含む無機リン測定用試薬
において、少なくともキサンチンオキシダーゼ及びプリ
ンヌクレオシドホスフォリラーゼを含有するが、イノシ
ンを含有しない第一試薬と、少なくともイノシンを含有
するが、キサンチンオキシダーゼ及びプリンヌクレオシ
ドホスフォリラーゼを含有しない第二試薬とからなり、
それぞれが液状試薬であることを特徴とする、無機リン
測定用試薬。 - 【請求項２】 第一試薬が更にＮ−エチル−Ｎ−スルホ
プロピル−ｍ−トルイジンを含有する請求項１記載の無
機リン測定用試薬。 - 【請求項３】 第一試薬が更にカタラーゼを含有し、第
二試薬が更にＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−ト
ルイジンを含有する請求項１記載の無機リン測定用試
薬。 - 【請求項４】 第一試薬が、更に、オキソン酸、オキソ
ン酸塩、キレート剤、金属−キレート化合物及び／又は
牛血清アルブミンを含有する請求項１〜３のいずれか一
項に記載の無機リン測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35033293A JP3434553B2 (ja) | 1993-12-29 | 1993-12-29 | 無機リン測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35033293A JP3434553B2 (ja) | 1993-12-29 | 1993-12-29 | 無機リン測定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07194395A JPH07194395A (ja) | 1995-08-01 |
| JP3434553B2 true JP3434553B2 (ja) | 2003-08-11 |
Family
ID=18409769
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35033293A Expired - Lifetime JP3434553B2 (ja) | 1993-12-29 | 1993-12-29 | 無機リン測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3434553B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4640400B2 (ja) * | 2007-09-28 | 2011-03-02 | 和光純薬工業株式会社 | カタラーゼ安定化剤を用いた成分測定用試薬 |
| CN113514452A (zh) * | 2021-04-19 | 2021-10-19 | 深圳市锦瑞生物科技有限公司 | 一种无机磷检测试剂及检测芯片 |
-
1993
- 1993-12-29 JP JP35033293A patent/JP3434553B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07194395A (ja) | 1995-08-01 |
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