JPH08196298A - ナトリウムイオンの定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 正確、簡便かつ安定でナトリウムイオンの測
定濃度領域も広いナトリウムイオンの定量方法を開発す
る。 【構成】 水性媒体中で試料中のナトリウムイオンをβ
−ガラクトシダ−ゼを用いて定量する方法において、二
価金属イオンの存在下にβ−ガラクトシダ−ゼ反応を行
うことを特徴とする方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査等で重要な生
体試料中のナトリウムイオンの定量方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ナトリウムイオン量と比例して活性が増
加するβ−ガラクトシダーゼ反応の特徴を利用して生体
試料中のナトリウムイオンを定量する方法において、該
酵素反応が過剰のナトリウムで飽和するのを防止するた
め、０．２〜５ｍＭのクリプトフィクス２２１（商標
名）を添加して用いる定量法が知られている〔クリニカ
ルケミストリー，３４巻，２２９５頁，１９８８年〕。
また、β−ガラクトシダーゼ反応を用いる該定量法にお
いて、クリプトフィクス２２１の代わりに１００ｍＭ以
上のリチウムイオン、カリウムイオン、セシウムイオン
等のアルカリ金属イオンまたはアンモニウムイオンを用
いる方法が知られている（特開平６−３３９３９８号公
報）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】β−ガラクトシダーゼ
を用いるナトリウムイオンの定量法で、従来用いられる
結合試薬のクリプトフィクス２２１等は高価であるう
え、β−ガラクトシダーゼとプレインキュベーションを
させる必要があるため測定操作が複雑になり時間がかか
ることが指摘されている。さらにリチウムイオン等従来
のアルカリ金属イオンを用いる方法は、大量の金属イオ
ンが反応液中に存在するため、廃液の処理等に手間がか
かる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、水性媒体中
で試料中のナトリウムイオンをβ−ガラクトシダ−ゼを
用いて定量する方法において、二価金属イオンの存在下
にβ−ガラクトシダ−ゼ反応を行うことを特徴とする方
法に関する。

【０００５】二価金属イオンとしては、カルシウムイオ
ン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン、マンガン
イオンおよびコバルトイオンからなる群から選ばれる少
なくとも一種の二価金属イオンがあげられ、これらの二
価金属イオンは水性媒体中に塩化カルシウム、硫酸カル
シウム、硝酸カルシウム、塩化マンガン、硫酸マンガ
ン、硝酸マンガン、塩化ストロンチウム、塩化バリウ
ム、塩化コバルト、硝酸コバルト、硫酸コバルト等の当
該金属の塩を添加することにより調製すればよい。二価
金属イオンの濃度は通常０．０１〜５００ｍＭ、好まし
くは、０．１〜３００ｍＭ、より好ましくは０．１〜２
００ｍＭの濃度で用いることができる。

【０００６】ナトリウムイオンを含む試料とは、水性媒
体に混和する試料であればどのようなものでもよいが、
全血、細胞等、原子吸光法、炎光光度法等では測定しに
くい生体中の試料についても測定できる。

【０００７】本発明におけるβ−ガラクトシダーゼを用
いてナトリウムイオンを定量する方法とは、固相または
液相、好ましくは水性媒体中でβ−ガラクトシダーゼと
β−ガラクトシダーゼの基質とを反応させ、反応液中で
減少するβ−ガラクトシダーゼの基質量、又は増加する
β−ガラクトシダーゼ反応の生成物量を測定することに
よりβ−ガラクトシダーゼ活性を測定し、該活性に対応
するナトリウムイオン量を算出する方法である。

【０００８】水性媒体とは、緩衝液、生理食塩水等水を
含有する液体を示し、緩衝液としては、トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（トリス緩衝
液）、リン酸緩衝液、メス緩衝液、酢酸緩衝液、コハク
酸緩衝液、シュウ酸緩衝液、フタル酸緩衝液、ホウ酸緩
衝液、グリシン緩衝液、バルビタール緩衝液またはグッ
ド（ＧＯＯＤ）の緩衝液等があげられる。本発明におい
て水性媒体はｐＨ４〜１０、好ましくは４〜７であり、
緩衝液の濃度は１０〜１０００ｍＭである。

【０００９】本発明におけるβ−ガラクトシダーゼとは
酵素番号〔ＥＣ．３．２．１．２３〕に属する酵素であ
ればよく、動物、微生物または植物から採取したβ−ガ
ラクトシダーゼあるいはそれらを遺伝子工学により改変
し製造した酵素が含まれる。

【００１０】β−ガラクトシダーゼの基質とは、合成品
あるいは天然物のいずれでもよく、例えば、β−Ｄ−ガ
ラクトシド、アリール−β−Ｄ−ガラクトシド、アルキ
ル−β−Ｄ−ガラクトシド、３，６−ジヒドロキシフル
オラン−β−Ｄ−ガラクトシド、ニトロフェニル−β−
Ｄ−グリコシド、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラク
トシド、２−ニトロフェニル−β−ガラクトシド、フェ
ニル−β−Ｄ−ガラクトシド、ラクチノール、ラクトー
ス、４−メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド等があげられる。またβ−ガラクトシダーゼの活性化
剤として、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硝酸
マグネシウム等を用いてもよい。

【００１１】反応液中で減少するβ−ガラクトシダーゼ
の基質量の変化は、前述の例えば、ニトロフェニルエス
テル等の基質の減少を吸光光度法等で測定することによ
り求めることができる。

【００１２】反応液中で生成するβ−ガラクトシダーゼ
反応生成物の量は、例えば前述の基質から、β−ガラク
トシダーゼ反応により生成するガラクトース、アグリコ
ン部、３，６−ジヒドロキシフルオラン、ニトロフェノ
ール等を比色法、吸光光度法、蛍光光度法、酸化還元測
定法、高速液体クロマトグラフィー法等で測定すること
により求めることができる。また、該酵素反応をガラク
トースデヒドロゲナーゼ等と共役させて、生成する還元
型補酵素量を定量してもよい。

【００１３】以下に水性媒体として緩衝液を用いる場合
について本発明の測定法を説明する。ｐＨ４〜１０に調
整された緩衝液（１０〜１０００ｍＭ）中に、上述した
二価金属イオンの塩を溶解させ、０．０１ｍＭ〜５００
ｍＭになるよう当該金属のイオン濃度を調製する。な
お、二価金属イオンの濃度を調製した緩衝液を添加し
て、上記イオン濃度に調製してもよい。

【００１４】前記の金属イオンを含有する緩衝液に試料
を加えた後、該緩衝液にβ−ガラクトシダ−ゼの基質お
よびβ−ガラクトシダ−ゼを添加して、β−ガラクトシ
ダ−ゼ反応を行うが、β−ガラクトシダ−ゼおよびβ−
ガラクトシダ−ゼの基質の添加方法は、任意である。例
えば、最初から上述のβ−ガラクトシダ−ゼの基質（２
５０μＭ〜６０ｍＭ）を加えているときは、後からβ−
ガラクトシダ−ゼ（２５Ｕ／ｌ〜１００ＫＵ／ｌ）を添
加し、最初からβ−ガラクトシダ−ゼ（２５０Ｕ／ｌ〜
２００ＫＵ／ｌ）を加えているときは、後からβ−ガラ
クトシダ−ゼの基質（２５０μＭ〜６０ｍＭ）を添加す
る。β−ガラクトシダ−ゼ反応は、８〜５０℃で行う。
反応液中で減少するβ−ガラクトシダーゼの基質量を上
述の方法により測定するかまたは、反応液中で増加する
β−ガラクトシダーゼ反応の生成物量を上述の方法によ
り測定し、β−ガラクトシダーゼ反応で消費された基質
量を測定する。当該酵素反応においては、反応で消費さ
れた基質量と試料中のナトリウム量が対応するので、当
該測定法によりナトリウムの定量を行うことができる。

【００１５】本発明方法を実施する際、反応液の濁りの
発生防止等のため、必要に応じてトリトンＸ−１００等
の界面活性剤を加えることができる。また必要に応じ
て、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミ
ン（ＨＳＡ）、ヒト免疫グロブリン、卵白アルブミン等
のタンパク質、ジメチルスルホキシド等の可溶化剤、ジ
チオスレイトール等の抗酸化剤、硫酸マグネシウム等の
活性化剤を添加することも可能である。

【００１６】以下に本発明の実施例を示すが本発明はこ
れに限定されるものではない。

【００１７】

【実施例】

【００１８】実施例１、（コバルトイオンを用いたナト
リウムの定量１） （１）ナトリウム検量線用標準液の作成 塩化ナトリウム（和光純薬工業製）を蒸留水で希釈し、
０，２０，４０，６０，８０，１００，１２０，１４
０，１６０，１８０，２００ｍＭのナトリウム検量線標
準液を調製した。 （２）ナトリウムの定量 サンプルカップにナトリウム検量線標準液を添加（１回
測定につき１０μｌ）した後、第１試薬として硫酸マグ
ネシウム（関東化学製）２０ｍＭ、β−ガラクトシダー
ゼ（東洋紡社製）１４ＫＵ／ｌを含むトリス緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）３００ｍＭ（１回測定につき、３００μｌ）
を加え３７℃で５分間反応させた。次に第２試薬とし
て、２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（東京
化成製）３０ｍＭ、塩化コバルト４０ｍＭを含むメス緩
衝液（ｐＨ５．５）１０ｍＭ（１回測定につき、１００
μｌ）を加え３７℃で反応させた。１分間に生成するｏ
−ニトロフェニル量を、４０５ｎｍの可視部の吸光度を
測定（日立７２５０自動分析装置）することにより測定
した。上記の広いナトリウムイオン濃度範囲において検
量線は直線性を示し、相関係数は０．９９８３であっ
た。

【００１９】実施例２、（コバルトを用いたナトリウム
の定量２） 第１試薬のｐＨを５．５に変える以外は、実施例１と同
様の方法によりナトリウム検量線用標準液の濃度を測定
した。得られた検量線の１次関数の回帰式による相関係
数を求めたところ、０．９９８９であった。

【００２０】実施例３、（コバルトを用いたナトリウム
の定量３） 塩化コバルトの濃度を４０ｍＭから０．０１、０．１、
１、５、１０、５０、１００、２００、３００または５
００ｍＭの各種濃度に変える以外は、実施例１と同様の
方法により、ナトリウムイオンの検量線を得た。得られ
た検量線の１次関数の回帰式による相関係数を求め第１
表に示した。

【００２１】

【表１】

【００２２】第１表によれば、０．１〜２００ｍＭのコ
バルトを用いたときに相関係数が０．９５を越え信頼で
きる定量値が得られることが示された

【００２３】実施例４、（マンガンを用いたナトリウム
イオンの定量） 塩化コバルトの代わりに０．０１、０．１、１、５、１
０、５０、１００、２００、３００、５００ｍＭの各種
濃度の塩化マンガンを用いる以外は実施例２と同様の方
法により、ナトリウムイオンの検量線の１次関数の回帰
式による相関係数を求め第２表に示した。

【００２４】

【表２】

【００２５】第２表によれば、１〜２００ｍＭのマンガ
ンを用いたときに相関係数が０．９５を越え、信頼でき
る定量値が得られることが示された。

【００２６】実施例５、（カルシウムを用いたナトリウ
ムイオンの定量） 塩化コバルトの代わりに０．０１、０．１、１、５、１
０、５０、１００、２００、３００、５００ｍＭの各種
濃度の塩化カルシウムを用いる以外は、実施例２と同様
の方法により、ナトリウムイオンの検量線の１次関数の
回帰式による相関係数を求め第３表に示した。

【００２７】

【表３】

【００２８】第３表によれば、５〜３００ｍＭのカルシ
ウムを用いたときに相関係数が０．０９５を越え、信頼
できる定量値が得られることが示された。なお、第１、
第２試薬を混ぜ合わせた最終ｐＨは、第１試薬と同じｐ
Ｈである。

【００２９】実施例６、（血清中のナトリウムイオンの
定量） ナトリウム検量線標準液の代わりにウマ血清（化学品検
査協会製）３検体および健常人血清３検体を用いる以外
は、実施例１と同様の方法によりウマおよびヒト血清中
のナトリウムイオン濃度を測定した。結果を第４表に示
した。なお、第４表には化学品検査協会表示の各ウマ血
清中のナトリウムイオン濃度も示した。

【００３０】

【表４】

【００３１】実施例７、（ストロンチウムを用いたナト
リウムイオンの定量） 塩化コバルトの代わりに５、５０、１５０ｍＭの各種濃
度の塩化ストロンチウムを用いる以外は、実施例２と同
様の方法により、ナトリウムイオンの検量線の１次関数
の回帰式による相関係数を求め第５表に示した。なお、
第５表にはコバルト、マンガン、カルシウム（各５、５
０、１５０ｍＭ）を添加した場合の相関係数も示した。

【００３２】実施例８、（バリウムを用いたナトリウム
イオンの定量） 塩化コバルトの代わりに５、５０、１５０ｍＭの各種濃
度の塩化バリウムを用いる以外は、実施例２と同様の方
法により、ナトリウムイオンの検量線の１次関数の回帰
式による相関係数を求め第５表に示した。

【００３３】参考例１、（アンモニウムを用いたナトリ
ウムイオンの定量） 塩化コバルトの代わりに５、５０、１５０ｍＭの各種濃
度の塩化アンモニウムを用いる以外は、参考例１と同様
の方法により、ナトリウムイオンの検量線の１次関数の
回帰式による相関係数を求め第５表に示した。

【００３４】参考例２、（カリウムを用いたナトリウム
イオンの定量） 塩化コバルトの代わりに５、５０、１５０ｍＭの各種濃
度の塩化カリウムを用いる以外は、参考例１と同様の方
法により、ナトリウムイオンの検量線の１次関数の回帰
式による相関係数を求め第５表に示した。

【００３５】参考例３、（リチウムを用いたナトリウム
イオンの定量） 塩化コバルトの代わりに５、５０、１５０ｍＭの各種濃
度の塩化リチウムを用いる以外は、参考例１と同様の方
法により、ナトリウムイオンの検量線の１次関数の回帰
式による相関係数を求め第５表に示した。

【００３６】参考例４、（セシウムを用いたナトリウム
イオンの定量） 塩化コバルトの代わりに５、５０、１５０ｍＭの各種濃
度の塩化セシウムを用いる以外は、参考例１と同様の方
法により、ナトリウムイオンの検量線の１次関数の回帰
式による相関係数を求め第５表に示した。

【００３７】

【表５】

【００３８】第５表によれば、１５０ｍＭの濃度におい
て、コバルトイオン、マンガンイオン、カルシウムイオ
ン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンを用いた場
合、アンモニウムイオン、カリウムイオン、リチウムイ
オン、セシウムイオンを用いた場合よりも格段に良い相
関係数が得られた。さらに、５０ｍＭ以下の濃度の場
合、アンモニウムイオン、カリウムイオン、リチウムイ
オン、セシウムイオンでは定量に使用可能な相関係数が
得られないのに対して、コバルトイオン、マンガンイオ
ン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウ
ムイオンを用いた場合は５ｍＭの濃度においても０．９
５以上の相関係数を示し精度の高い定量が可能であるこ
とを示した。

【００３９】

【発明の効果】本発明により正確、簡便かつ安定でナト
リウムイオンの測定濃度領域も広いナトリウムイオンの
定量方法が提供される。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水性媒体中で試料中のナトリウムイオン
   をβ−ガラクトシダ−ゼを用いて定量する方法におい
   て、二価金属イオンの存在下にβ−ガラクトシダ−ゼ反
   応を行うことを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 二価金属イオンが、カルシウムイオン、
   ストロンチウムイオン、バリウムイオン、マンガンイオ
   ンおよびコバルトイオンからなる群から選ばれる少なく
   とも一種である請求項１記載の方法。