JPH05219992A - カルシウムの定量方法 - Google Patents
カルシウムの定量方法Info
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- JPH05219992A JPH05219992A JP5604492A JP5604492A JPH05219992A JP H05219992 A JPH05219992 A JP H05219992A JP 5604492 A JP5604492 A JP 5604492A JP 5604492 A JP5604492 A JP 5604492A JP H05219992 A JPH05219992 A JP H05219992A
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- Japan
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- calcium
- transglutaminase
- gln
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 試料中のカルシウムとカルシウムを活性化因
子とするトランスグルタミナーゼを接触させ、試料中の
カルシウム量に依存して変化するトランスグルタミナー
ゼ活性を測定することにより試料中のカルシウム量を定
量する。 【効果】 本発明の方法によって、体液その他各種試料
中のカルシウム量を除蛋白することなく正確に定量する
ことができる。
子とするトランスグルタミナーゼを接触させ、試料中の
カルシウム量に依存して変化するトランスグルタミナー
ゼ活性を測定することにより試料中のカルシウム量を定
量する。 【効果】 本発明の方法によって、体液その他各種試料
中のカルシウム量を除蛋白することなく正確に定量する
ことができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はカルシウムの定量方法に
関し、詳しくはカルシウムが存在しないと活性を発現し
ないアポ型トランスグルタミナーゼ（ＥＣ ２．３．
２．１３）に試料中のカルシウムを接触せしめ、試料中
のカルシウム量に依存して変化するトランスグルタミナ
ーゼ活性を測定することによってカルシウムを定量する
酵素的定量法に関する。
関し、詳しくはカルシウムが存在しないと活性を発現し
ないアポ型トランスグルタミナーゼ（ＥＣ ２．３．
２．１３）に試料中のカルシウムを接触せしめ、試料中
のカルシウム量に依存して変化するトランスグルタミナ
ーゼ活性を測定することによってカルシウムを定量する
酵素的定量法に関する。
【０００２】本発明によれば試料の除蛋白操作が必要で
なく、迅速且つ正確にカルシウムの測定が実施できるの
で、ヒト血清等の生体試料を含め各種の試料中のカルシ
ウムの定量が可能であり、例えば臨床検査等に大いに貢
献するものである。
なく、迅速且つ正確にカルシウムの測定が実施できるの
で、ヒト血清等の生体試料を含め各種の試料中のカルシ
ウムの定量が可能であり、例えば臨床検査等に大いに貢
献するものである。
【０００３】
【従来の技術及びその課題】生体内カルシウムの９９％
以上は骨・歯に局在しているが、およそ７００ｍｇ／日
は骨への吸収と排泄を繰り返している。そのため骨に較
べると量的には少ないが体液や細胞中にもカルシウムは
存在する。体液や細胞中のカルシウムは血液凝固のほか
“セカンドメッセンジャー”として神経伝達機能、筋収
縮機能、ホルモン作用など生体活性の重要な働きに関与
しているため、体液中特に血液中のカルシウムレベルは
厳密に一定に保たれなければならない。血液中のカルシ
ウムレベルはビタミンＤ、副甲状腺ホルモン、カルシト
ニンなどによって一定に保たれていることは知られてい
る通りであり、健常人の場合は、血液中には９〜１１ｍ
ｇ／ｄｌ存在し、日内変動も多くとも±３％と厳密に維
持されている。これが一旦疾病になると、変動するよう
になり、例えば、粘液水腫、悪性腫瘍、サイコイドーシ
ス、高タンパク質血症、甲状腺機能亢進症などの疾病で
は高カルシウム血症に、また、上皮小体機能低下症、骨
軟化症、腎性クル病、尿毒症、低タンパク質血症、悪性
腫瘍骨転移などの疾病では低カルシウム血症へと変動す
る。健常人の血中カルシウムレベルは非常に厳密に維持
されているため、カルシウムレベルが僅かにでも変動を
きたしたならば、それは間違いなく疾病に起因するもの
であると容易に判定が可能であるので血中カルシウムの
定量は臨床検査上非常に重要な検査項目となる。
以上は骨・歯に局在しているが、およそ７００ｍｇ／日
は骨への吸収と排泄を繰り返している。そのため骨に較
べると量的には少ないが体液や細胞中にもカルシウムは
存在する。体液や細胞中のカルシウムは血液凝固のほか
“セカンドメッセンジャー”として神経伝達機能、筋収
縮機能、ホルモン作用など生体活性の重要な働きに関与
しているため、体液中特に血液中のカルシウムレベルは
厳密に一定に保たれなければならない。血液中のカルシ
ウムレベルはビタミンＤ、副甲状腺ホルモン、カルシト
ニンなどによって一定に保たれていることは知られてい
る通りであり、健常人の場合は、血液中には９〜１１ｍ
ｇ／ｄｌ存在し、日内変動も多くとも±３％と厳密に維
持されている。これが一旦疾病になると、変動するよう
になり、例えば、粘液水腫、悪性腫瘍、サイコイドーシ
ス、高タンパク質血症、甲状腺機能亢進症などの疾病で
は高カルシウム血症に、また、上皮小体機能低下症、骨
軟化症、腎性クル病、尿毒症、低タンパク質血症、悪性
腫瘍骨転移などの疾病では低カルシウム血症へと変動す
る。健常人の血中カルシウムレベルは非常に厳密に維持
されているため、カルシウムレベルが僅かにでも変動を
きたしたならば、それは間違いなく疾病に起因するもの
であると容易に判定が可能であるので血中カルシウムの
定量は臨床検査上非常に重要な検査項目となる。
【０００４】血中カルシウムの定量方法としては原子吸
光法、イオン電極法、ＯＣＰＣ（ｏ−クレゾールフタレ
インコンプレクソン）のような試薬を用いるキレート比
色法が挙げられる。しかしながら原子吸光法やイオン電
極法は操作が繁雑なうえ特殊で高価な機器を必要とする
し、キレート比色法ではＯＣＰＣがマグネシウムに反応
する特異性の低さのためマスキング剤として８−オキシ
キノリンを添加しなければならないなど問題点は多い。
８−オキシキノリンはマグネシウムをマスキングし正誤
差を回避させるがカルシウムをもトラップしてしまうの
で発色感度を低下させたり低濃度のカルシウムが測れな
いなどの問題が生じる。また、僅かなｐＨの相違によっ
て発色度合いが大きくかわるため試薬の厳密な調整を必
要とするなどの問題点もかかえている。
光法、イオン電極法、ＯＣＰＣ（ｏ−クレゾールフタレ
インコンプレクソン）のような試薬を用いるキレート比
色法が挙げられる。しかしながら原子吸光法やイオン電
極法は操作が繁雑なうえ特殊で高価な機器を必要とする
し、キレート比色法ではＯＣＰＣがマグネシウムに反応
する特異性の低さのためマスキング剤として８−オキシ
キノリンを添加しなければならないなど問題点は多い。
８−オキシキノリンはマグネシウムをマスキングし正誤
差を回避させるがカルシウムをもトラップしてしまうの
で発色感度を低下させたり低濃度のカルシウムが測れな
いなどの問題が生じる。また、僅かなｐＨの相違によっ
て発色度合いが大きくかわるため試薬の厳密な調整を必
要とするなどの問題点もかかえている。
【０００５】血中カルシウムの定量方法として本方法同
様に酵素を用いた酵素的定量法もいくつか報告されてき
ている。特開昭６２−３６１９９では、試料中のカルシ
ウムをカルモジュリンと反応させカルシウム・カルモジ
ュリン複合体を形成させる。この複合体にてカルモジュ
リン依存性酵素を活性化させその酵素活性を測定するこ
とによって試料中のカルシウムを定量するというもので
あるが、測定レンジが狭く感度が高すぎるためあらかじ
め検体希釈が必要なことやカルモジュリンやカルモジュ
リン依存性酵素の基質が高価なうえに不安定であるので
なかなか広範に応用しがたい。特開昭６４−２５９８で
は、過剰のシュウ酸塩中にカルシウムを加え沈殿、残存
するシュウ酸をシュウ酸オキシダーゼにて測定すること
によりカルシウムを定量しようとするものであるが、カ
ルシウムをシュウ酸カルシウムとして沈殿させる操作が
用手法であること、検出にシュウ酸オキシダーゼを用い
ているので試料中のアスコルビン酸やビリルビンの影響
をうけやすいこと、スタンダードカーブが右さがりにな
ること、レートアッセイができないなど、満足できるも
のではない。特開平１−２３１８９６では、ホスホリル
コリンチオエステルを基質としカルシウム濃度によって
活性の変化するホスホリパーゼＡ２の酵素活性を測定す
ることによって、カルシウムを定量しようとするもので
あるが、酵素活性の検出にＤＴＮＢ（５，５’−ジチオ
ビス−２−ニトロ安息香酸）のようなＳＨ定量試薬を用
いているので、血液中のシステインのような含イオウ化
合物や蛋白質の影響をまともに受けることになる。アミ
ラーゼを用いた定量法も報告されてきている（日本臨床
検査自動化学会、第２３回大会予講集、演題２２２〜２
２３）。しかし、アミラーゼは周知の通り血液中にも存
在し、病態、個々および日・時などによって大きく変動
する。そうなるとカルシウム濃度をアミラーゼ活性で定
量しようとする場合にはこの血中アミラーゼ活性の変動
がカルシウム測定に正負誤差をあたえることになる。
様に酵素を用いた酵素的定量法もいくつか報告されてき
ている。特開昭６２−３６１９９では、試料中のカルシ
ウムをカルモジュリンと反応させカルシウム・カルモジ
ュリン複合体を形成させる。この複合体にてカルモジュ
リン依存性酵素を活性化させその酵素活性を測定するこ
とによって試料中のカルシウムを定量するというもので
あるが、測定レンジが狭く感度が高すぎるためあらかじ
め検体希釈が必要なことやカルモジュリンやカルモジュ
リン依存性酵素の基質が高価なうえに不安定であるので
なかなか広範に応用しがたい。特開昭６４−２５９８で
は、過剰のシュウ酸塩中にカルシウムを加え沈殿、残存
するシュウ酸をシュウ酸オキシダーゼにて測定すること
によりカルシウムを定量しようとするものであるが、カ
ルシウムをシュウ酸カルシウムとして沈殿させる操作が
用手法であること、検出にシュウ酸オキシダーゼを用い
ているので試料中のアスコルビン酸やビリルビンの影響
をうけやすいこと、スタンダードカーブが右さがりにな
ること、レートアッセイができないなど、満足できるも
のではない。特開平１−２３１８９６では、ホスホリル
コリンチオエステルを基質としカルシウム濃度によって
活性の変化するホスホリパーゼＡ２の酵素活性を測定す
ることによって、カルシウムを定量しようとするもので
あるが、酵素活性の検出にＤＴＮＢ（５，５’−ジチオ
ビス−２−ニトロ安息香酸）のようなＳＨ定量試薬を用
いているので、血液中のシステインのような含イオウ化
合物や蛋白質の影響をまともに受けることになる。アミ
ラーゼを用いた定量法も報告されてきている（日本臨床
検査自動化学会、第２３回大会予講集、演題２２２〜２
２３）。しかし、アミラーゼは周知の通り血液中にも存
在し、病態、個々および日・時などによって大きく変動
する。そうなるとカルシウム濃度をアミラーゼ活性で定
量しようとする場合にはこの血中アミラーゼ活性の変動
がカルシウム測定に正負誤差をあたえることになる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前述の問
題点に鑑み、鋭意研究の結果、トランスグルタミナーゼ
（ＥＣ ２．３．２．１３）が血清中に存在せずしかも
カルシウムに対し極めて特異性が高い点、さらに、アポ
型トランスグルタミナーゼの酵素活性が加えられるカル
シウム量に依存し変化するという点に新たに着目し、こ
れらの新知見に基づいて本発明を完成させた。すなわ
ち、本発明はカルシウムのエンザイムアッセイに関する
ものであって、試料中のカルシウムとカルシウムを活性
化因子とするトランスグルタミナーゼを接触させ、試料
中のカルシウム量に依存して変化するトランスグルタミ
ナーゼ活性を測定することによって、試料中のカルシウ
ム量を測定することを基本的技術思想とするものであ
る。
題点に鑑み、鋭意研究の結果、トランスグルタミナーゼ
（ＥＣ ２．３．２．１３）が血清中に存在せずしかも
カルシウムに対し極めて特異性が高い点、さらに、アポ
型トランスグルタミナーゼの酵素活性が加えられるカル
シウム量に依存し変化するという点に新たに着目し、こ
れらの新知見に基づいて本発明を完成させた。すなわ
ち、本発明はカルシウムのエンザイムアッセイに関する
ものであって、試料中のカルシウムとカルシウムを活性
化因子とするトランスグルタミナーゼを接触させ、試料
中のカルシウム量に依存して変化するトランスグルタミ
ナーゼ活性を測定することによって、試料中のカルシウ
ム量を測定することを基本的技術思想とするものであ
る。
【０００７】具体的には、本発明は、カルシウムを添加
しないと活性を発現しないアポ型トランスグルタミナー
ゼ、基質、適当な緩衝液および検出系試薬を少なくとも
含む反応液に検体を加え、アポ型トランスグルタミナー
ゼを検体中のカルシウム量に比例するようにホロ型へと
変換し、その酵素活性量を測定することによって検体中
のカルシウムを定量するものである。
しないと活性を発現しないアポ型トランスグルタミナー
ゼ、基質、適当な緩衝液および検出系試薬を少なくとも
含む反応液に検体を加え、アポ型トランスグルタミナー
ゼを検体中のカルシウム量に比例するようにホロ型へと
変換し、その酵素活性量を測定することによって検体中
のカルシウムを定量するものである。
【０００８】トランスグルタミナーゼはカルシウムに対
し高い特異性を有する（Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３
８，１０９〜１９１，１９７３）、カルシウム以外の金
属としてストロンチウムでもトランスグルタミナーゼは
活性化を受けるが、ストロンチウムに対するｋｍ値がカ
ルシウムのｋｍ値の２０倍大きい事、およびストロンチ
ウムが血液や尿のような生体試料中にはほとんど含まれ
ていない事などにより臨床検査上はカルシウムに高く特
異的であると言える。したがってＯＣＰＣ法で問題とな
ったようなマグネシウムへの配慮は本発明ではまったく
不要である。また、トランスグルタミナーゼは血清中に
は存在しない。赤血球や血小板には分類上トランスグル
タミナーゼの中に含まれ同様の触媒作用を現す血液凝固
因子XIIIが存在するが、これは血餅分離の際に血清から
除去される。したがって、本方法ではアミラーゼの場合
のような正負誤差の心配はいらない。トランスグルタミ
ナーゼ活性は、基質にグルタミンペプチドまたは、グル
タミンペプチドとアミンを用い、生成されるアンモニア
あるいはヒドロキサム酸を測定することによって算出さ
れる。アンモニアで検出する場合の留意点は、アンモニ
アが尿中には多量に存在する点であるが、この場合は既
存のイソクエン酸脱水素酵素（ＩＣＤＨ）法（特開昭６
１−２４７９６３、特開昭６２−６７００、特開昭６２
−６６９９）を適用すれば問題なくカルシウムを定量す
ることが可能である。血清中のアンモニアは微量なので
無視でき、グルタミン酸脱水素酵素（ＧＩＤＨ）法など
で容易に定量できる。ヒドロキサム酸で検出する場合に
はなんら留意もいらない。このように本発明の方法は検
出系においても、血清成分の影響を受けにくいこと、用
いる試薬が安価なことなどから上記酵素的定量法よりも
優れ、日々の臨床検査に実用的である。
し高い特異性を有する（Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３
８，１０９〜１９１，１９７３）、カルシウム以外の金
属としてストロンチウムでもトランスグルタミナーゼは
活性化を受けるが、ストロンチウムに対するｋｍ値がカ
ルシウムのｋｍ値の２０倍大きい事、およびストロンチ
ウムが血液や尿のような生体試料中にはほとんど含まれ
ていない事などにより臨床検査上はカルシウムに高く特
異的であると言える。したがってＯＣＰＣ法で問題とな
ったようなマグネシウムへの配慮は本発明ではまったく
不要である。また、トランスグルタミナーゼは血清中に
は存在しない。赤血球や血小板には分類上トランスグル
タミナーゼの中に含まれ同様の触媒作用を現す血液凝固
因子XIIIが存在するが、これは血餅分離の際に血清から
除去される。したがって、本方法ではアミラーゼの場合
のような正負誤差の心配はいらない。トランスグルタミ
ナーゼ活性は、基質にグルタミンペプチドまたは、グル
タミンペプチドとアミンを用い、生成されるアンモニア
あるいはヒドロキサム酸を測定することによって算出さ
れる。アンモニアで検出する場合の留意点は、アンモニ
アが尿中には多量に存在する点であるが、この場合は既
存のイソクエン酸脱水素酵素（ＩＣＤＨ）法（特開昭６
１−２４７９６３、特開昭６２−６７００、特開昭６２
−６６９９）を適用すれば問題なくカルシウムを定量す
ることが可能である。血清中のアンモニアは微量なので
無視でき、グルタミン酸脱水素酵素（ＧＩＤＨ）法など
で容易に定量できる。ヒドロキサム酸で検出する場合に
はなんら留意もいらない。このように本発明の方法は検
出系においても、血清成分の影響を受けにくいこと、用
いる試薬が安価なことなどから上記酵素的定量法よりも
優れ、日々の臨床検査に実用的である。
【０００９】本発明の方法に使用できるトランスグルタ
ミナーゼとしては、哺乳動物各組織、植物、微生物など
から抽出し精製したものが使用されるが、好適な例とし
てモルモットの肝臓由来のものが挙げられる。モルモッ
ト肝臓を破砕後、遠心分離、上清をＤＥＡＥカラムクロ
マトグラフィー、硫安分画、ゲル濾過、疎水クロマトグ
ラフィーなどで精製する。性能としてはバックグランド
が小さくカルシウムへの特異性が高いものが望まれる。
アポ型トランスグルタミナーゼの調製には特別な工程は
必要なく精製工程中に使用するバッファーのなかにキレ
ート剤を加えておけば良い。精製した酵素のバックグラ
ンドが高いような場合には再精製するかカルシウムの除
去工程を追加する。キレート剤としては、形態について
特に問わないが、カルシウムに対するキレート安定度定
数が大きなもの（ＬｏｇＫ ML≧１０）が良く、ＥＤＴ
Ａ（エチレンジアミン四酢酸）、ＣｙＤＴＡ（トランス
−１，２−シクロヘキサンヂアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，
Ｎ’−四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢
酸）、ＧＥＤＴＡ（グリコールエーテルジアミン四酢
酸）、ＴＴＨＡ（トリエチレンテトラミン六酢酸）、メ
チルＥＤＴＡ（ジアミノプロパン四酢酸）などが有効で
ある。０．０１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは、０．１ｍＭ〜
１００ｍＭのキレート剤をトランスグルタミナーゼが失
活しないような条件にて使用する。本発明の方法に使用
するために最終的に透析あるいはセファデックスＧ−２
５のようなゲル濾過にてキレート剤を完全に除去する。
ミナーゼとしては、哺乳動物各組織、植物、微生物など
から抽出し精製したものが使用されるが、好適な例とし
てモルモットの肝臓由来のものが挙げられる。モルモッ
ト肝臓を破砕後、遠心分離、上清をＤＥＡＥカラムクロ
マトグラフィー、硫安分画、ゲル濾過、疎水クロマトグ
ラフィーなどで精製する。性能としてはバックグランド
が小さくカルシウムへの特異性が高いものが望まれる。
アポ型トランスグルタミナーゼの調製には特別な工程は
必要なく精製工程中に使用するバッファーのなかにキレ
ート剤を加えておけば良い。精製した酵素のバックグラ
ンドが高いような場合には再精製するかカルシウムの除
去工程を追加する。キレート剤としては、形態について
特に問わないが、カルシウムに対するキレート安定度定
数が大きなもの（ＬｏｇＫ ML≧１０）が良く、ＥＤＴ
Ａ（エチレンジアミン四酢酸）、ＣｙＤＴＡ（トランス
−１，２−シクロヘキサンヂアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，
Ｎ’−四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢
酸）、ＧＥＤＴＡ（グリコールエーテルジアミン四酢
酸）、ＴＴＨＡ（トリエチレンテトラミン六酢酸）、メ
チルＥＤＴＡ（ジアミノプロパン四酢酸）などが有効で
ある。０．０１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは、０．１ｍＭ〜
１００ｍＭのキレート剤をトランスグルタミナーゼが失
活しないような条件にて使用する。本発明の方法に使用
するために最終的に透析あるいはセファデックスＧ−２
５のようなゲル濾過にてキレート剤を完全に除去する。
【００１０】トランスグルタミナーゼ反応は以下の化１
に示す通りである。
に示す通りである。
【００１１】
【化１】
【００１２】トランスグルタミナーゼの基質としては供
与体単独で加えるか、または、供与体と受容体の複合で
加えるか、いずれでもトランスグルタミナーゼは酵素活
性を発現する。トランスグルタミナーゼは供与体には特
異性が高く、Ｌ−グルタミンの誘導体、Ｌ−グルタミン
を含むトリペプチド〜ポリペプチドやＬ−グルタミンを
含むジペプチド〜オリゴぺプチドの誘導体などが基質と
なり得るが、好適な基質としては、ベンジルオキシカル
ボニル（Ｚ）−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、Ｚ−Ｌ−Ｇｌｎ、
Ｚ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｌ−Ｖａｌ、ｔ−ブチルオキシカルボ
ニル（Ｂｏｃ）−Ｌ−Ｇｌｎ、９−フルオレニールメト
キシカルボニル（Ｆｍｏｃ）−Ｌ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙなどが挙げられる。一方、ト
ランスグルタミナーゼは受容体には特異性が低いので、
入手しやすく安価な炭素鎖が３コ以上のアミンもしくは
ヒドロキシルアミンを用いる。推奨すべき基質として
は、供与体にＺ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、または、Ｚ−Ｌ
−Ｇｌｎ、Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌ
ｎ、受容体にｎ−プロピルアミンまたは、ｎ−ブチルア
ミン、ｎ−アミルアミン、ｎ−ヘキシルアミン、もしく
は、Ｌｙｓ、もしくはヒドロキシルアミンが良く、ま
た、供与体単独で測定するよりも、供与体と受容体の複
合で測定した方が大きな酵素活性が得られるので両基質
の使用が好ましい。
与体単独で加えるか、または、供与体と受容体の複合で
加えるか、いずれでもトランスグルタミナーゼは酵素活
性を発現する。トランスグルタミナーゼは供与体には特
異性が高く、Ｌ−グルタミンの誘導体、Ｌ−グルタミン
を含むトリペプチド〜ポリペプチドやＬ−グルタミンを
含むジペプチド〜オリゴぺプチドの誘導体などが基質と
なり得るが、好適な基質としては、ベンジルオキシカル
ボニル（Ｚ）−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、Ｚ−Ｌ−Ｇｌｎ、
Ｚ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｌ−Ｖａｌ、ｔ−ブチルオキシカルボ
ニル（Ｂｏｃ）−Ｌ−Ｇｌｎ、９−フルオレニールメト
キシカルボニル（Ｆｍｏｃ）−Ｌ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙなどが挙げられる。一方、ト
ランスグルタミナーゼは受容体には特異性が低いので、
入手しやすく安価な炭素鎖が３コ以上のアミンもしくは
ヒドロキシルアミンを用いる。推奨すべき基質として
は、供与体にＺ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、または、Ｚ−Ｌ
−Ｇｌｎ、Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌ
ｎ、受容体にｎ−プロピルアミンまたは、ｎ−ブチルア
ミン、ｎ−アミルアミン、ｎ−ヘキシルアミン、もしく
は、Ｌｙｓ、もしくはヒドロキシルアミンが良く、ま
た、供与体単独で測定するよりも、供与体と受容体の複
合で測定した方が大きな酵素活性が得られるので両基質
の使用が好ましい。
【００１３】酵素活性の測定は、トランスグルタミナー
ゼが上記の反応を触媒するので反応によって生成するＸ
−（Ｌ−Ｇｌｕ−ＮＨ−Ｒ）−ＹもしくはＮＨ3を検出
すれば良い。その際、基質として供与体単独もしくは、
供与体とヒドロキシルアミンを除く受容体の複合で測定
する場合には、ＮＨ3を、そして基質として供与体とヒ
ドロキシルアミンで測定する場合には、Ｘ−（Ｌ−Ｇｌ
ｕ−ＮＨＯＨ）−Ｙ（ヒドロキサム酸）を検出するのが
よい。ＮＨ3の検出は公知の方法ならばどの方法を用い
てもよいが、推奨する方法としてはＧＩＤＨ法が挙げら
れる。もちろん、すでに多くの検査センターで実績があ
りアンモニアの消去系が考慮されたＩＣＤＨ法（応用例
としては、グアニジノ酢酸（特開平０２−２５５０９
８）、尿素（特開昭６１−２４７９６３）、クレアチニ
ン（特開昭５９−３１６９８）など）も応用することが
できる。ヒドロキサム酸の検出も公知の方法でよく、例
えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１５９，ｐ−２１，
１９５４にもあるような、つまり、ヒドロキサム酸がＦ
ｅ3+と錯体を形成し赤色を呈するという性質を利用した
もので５２５ｎｍの吸収を測定する、などの方法が利用
できる。
ゼが上記の反応を触媒するので反応によって生成するＸ
−（Ｌ−Ｇｌｕ−ＮＨ−Ｒ）−ＹもしくはＮＨ3を検出
すれば良い。その際、基質として供与体単独もしくは、
供与体とヒドロキシルアミンを除く受容体の複合で測定
する場合には、ＮＨ3を、そして基質として供与体とヒ
ドロキシルアミンで測定する場合には、Ｘ−（Ｌ−Ｇｌ
ｕ−ＮＨＯＨ）−Ｙ（ヒドロキサム酸）を検出するのが
よい。ＮＨ3の検出は公知の方法ならばどの方法を用い
てもよいが、推奨する方法としてはＧＩＤＨ法が挙げら
れる。もちろん、すでに多くの検査センターで実績があ
りアンモニアの消去系が考慮されたＩＣＤＨ法（応用例
としては、グアニジノ酢酸（特開平０２−２５５０９
８）、尿素（特開昭６１−２４７９６３）、クレアチニ
ン（特開昭５９−３１６９８）など）も応用することが
できる。ヒドロキサム酸の検出も公知の方法でよく、例
えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１５９，ｐ−２１，
１９５４にもあるような、つまり、ヒドロキサム酸がＦ
ｅ3+と錯体を形成し赤色を呈するという性質を利用した
もので５２５ｎｍの吸収を測定する、などの方法が利用
できる。
【００１４】
【実施例】以下、実施例により本発明の方法をさらに具
体的に説明するが、本発明はこれによってなんら制限さ
れるものではない。
体的に説明するが、本発明はこれによってなんら制限さ
れるものではない。
【００１５】
【実施例１】
【００１６】
【００１７】第１試薬；
【００１８】Ｚ−Ｇｌｎをトリエタノールアミンに溶解
し、それに、Ｌ−リジン、還元型グルタチオン、塩化カ
ルシウム、α−ケトグルタル酸、ＡＤＰ、ＮＡＤＨ、グ
ルタミン酸脱水素酵素（牛肝臓由来）を加え、ｐＨが
７．５になるように調整する。蒸留水を加え各成分の濃
度が、それぞれ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、２０ｍＭ、
１０ｍＭ、２５０μＭ、１０ｍＭ、２００μＭ、３００
μＭ、３０Ｕ／ｍｌとしたものを第１試薬とする。
し、それに、Ｌ−リジン、還元型グルタチオン、塩化カ
ルシウム、α−ケトグルタル酸、ＡＤＰ、ＮＡＤＨ、グ
ルタミン酸脱水素酵素（牛肝臓由来）を加え、ｐＨが
７．５になるように調整する。蒸留水を加え各成分の濃
度が、それぞれ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、２０ｍＭ、
１０ｍＭ、２５０μＭ、１０ｍＭ、２００μＭ、３００
μＭ、３０Ｕ／ｍｌとしたものを第１試薬とする。
【００１９】第２試薬；
【００２０】モルモット肝臓より精製したトランスグル
タミナーゼを２ｍＭのＤＴＴを含む１０ｍＭのトリス酢
酸バッファー（ｐＨ７）で希釈し１０Ｕ／ｍｌとする。
タミナーゼを２ｍＭのＤＴＴを含む１０ｍＭのトリス酢
酸バッファー（ｐＨ７）で希釈し１０Ｕ／ｍｌとする。
【００２１】試料；
【００２２】塩化カルシウムを蒸留水に溶解・希釈し０
ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭとした
ものを試料とする。
ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭとした
ものを試料とする。
【００２３】
【００２４】日立７１５０型自動分析機を用いＲ−１に
第１試薬を、Ｒ−２に第２試薬を入れた。第１試薬２０
０μｌに試料１０μｌを加え、３７℃にて５分間プレイ
ンキュベーションし、４０μｌの第２試薬を添加した。
同温度にて第２試薬を添加し２分放置した後の１分間の
３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度を測定した。試薬
ブランクを差し引き作図した。その結果を図１に示す。
第１試薬を、Ｒ−２に第２試薬を入れた。第１試薬２０
０μｌに試料１０μｌを加え、３７℃にて５分間プレイ
ンキュベーションし、４０μｌの第２試薬を添加した。
同温度にて第２試薬を添加し２分放置した後の１分間の
３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度を測定した。試薬
ブランクを差し引き作図した。その結果を図１に示す。
【００２５】
【００２６】図１をみてわかるように、本発明の方法を
用いると、直線的な定量曲線にて試料中のカルシウムを
定量出来ることが確認された。
用いると、直線的な定量曲線にて試料中のカルシウムを
定量出来ることが確認された。
【００２７】
【実施例２】
【００２８】
【００２９】第１試薬；
【００３０】Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙを１Ｍのトリス溶液に
溶解し、それに、Ｌ−リジン、還元型グルタチオン、塩
化カルシウム、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤＰＨ、グル
タミン酸脱水素酵素（酵母由来）を加え、ｐＨが９にな
るようにＮａＯＨにて調整する。蒸留水を加え各成分の
濃度が、それぞれ、３０ｍＭ、２００ｍＭ、１００ｍ
Ｍ、１０ｍＭ、１５０μＭ、１０ｍＭ，２５０μＭ，１
０Ｕ／ｍｌとしたものを第１試薬とする。
溶解し、それに、Ｌ−リジン、還元型グルタチオン、塩
化カルシウム、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤＰＨ、グル
タミン酸脱水素酵素（酵母由来）を加え、ｐＨが９にな
るようにＮａＯＨにて調整する。蒸留水を加え各成分の
濃度が、それぞれ、３０ｍＭ、２００ｍＭ、１００ｍ
Ｍ、１０ｍＭ、１５０μＭ、１０ｍＭ，２５０μＭ，１
０Ｕ／ｍｌとしたものを第１試薬とする。
【００３１】第２試薬；
【００３２】実施例１と同一
【００３３】試料；
【００３４】実施例１と同一
【００３５】
【００３６】実施例１と同一、その結果を図２に示す。
【００３７】
【００３８】図２をみてわかるように、本発明の方法を
用いるとカルシウム濃度に依存しトランスグルタミナー
ゼ活性が変化するので、試料中のカルシウム濃度を本方
法によれば定量出来ることが確認された。
用いるとカルシウム濃度に依存しトランスグルタミナー
ゼ活性が変化するので、試料中のカルシウム濃度を本方
法によれば定量出来ることが確認された。
【００３９】
【発明の効果】本発明の方法によれば、除蛋白操作が不
要なために簡便で迅速なカルシウムの定量を可能とし
た。したがって本発明によれば、体液をはじめ各種の試
料中のカルシウムを熟練を要することなく迅速且つ正確
に測定することが可能となり、本発明は例えば臨床診断
において多大の貢献をなすものである。
要なために簡便で迅速なカルシウムの定量を可能とし
た。したがって本発明によれば、体液をはじめ各種の試
料中のカルシウムを熟練を要することなく迅速且つ正確
に測定することが可能となり、本発明は例えば臨床診断
において多大の貢献をなすものである。
【００４０】
【図１】本発明の方法によるＮＡＤＨ系でのカルシウム
の定量曲線を表わす。
の定量曲線を表わす。
【図２】本発明の方法によるＮＡＤＰＨ系でのカルシウ
ムの定量曲線を表わす。
ムの定量曲線を表わす。
Claims (4)
- 【請求項１】 試料中のカルシウムとカルシウムを活性
化因子とするトランスグルタミナーゼを接触させ、試料
中のカルシウム量に依存して変化するトランスグルタミ
ナーゼ活性を測定することを特徴とする試料中のカルシ
ウム量を定量する方法。 - 【請求項２】 トランスグルタミナーゼ活性の変化をト
ランスグルタミナーゼの基質である供与体及び／又は受
容体の変化を測定することによって測定することを特徴
とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 該供与体及び／又は受容体の変化の測定
が、酵素反応の結果生成するアンモニア及び／又はヒド
ロキサム酸誘導体の測定であることを特徴とする請求項
２に記載の方法。 - 【請求項４】 該供与体がＺ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、Ｚ
−Ｌ−Ｇｌｎ、Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ、又はＦｍｏｃ−Ｌ
−Ｇｌｎであり、該受容体がｎ−プロピルアミン、ｎ−
ブチルアミン、ｎ−アミルアミン、ｎ−ヘキシルアミ
ン、リジン、又はヒドロキシルアミンであることを特徴
とする請求項２又は請求項３に記載の方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05604492A JP3164165B2 (ja) | 1992-02-07 | 1992-02-07 | カルシウムの定量方法 |
| EP19930300744 EP0555046B1 (en) | 1992-02-07 | 1993-02-02 | Method for determination of calcium |
| DE1993612518 DE69312518T2 (de) | 1992-02-07 | 1993-02-02 | Verfahren zur Bestimmung von Calcium |
| US08/425,972 US5618684A (en) | 1992-02-07 | 1995-04-20 | Method of determination of calcium |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05604492A JP3164165B2 (ja) | 1992-02-07 | 1992-02-07 | カルシウムの定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05219992A true JPH05219992A (ja) | 1993-08-31 |
| JP3164165B2 JP3164165B2 (ja) | 2001-05-08 |
Family
ID=13016093
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05604492A Expired - Fee Related JP3164165B2 (ja) | 1992-02-07 | 1992-02-07 | カルシウムの定量方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0555046B1 (ja) |
| JP (1) | JP3164165B2 (ja) |
| DE (1) | DE69312518T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002238598A (ja) * | 2001-02-15 | 2002-08-27 | Asahi Kasei Corp | カルシウムイオン測定用組成物および測定方法 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3227486B2 (ja) * | 1993-01-13 | 2001-11-12 | オリエンタル酵母工業株式会社 | 銅の測定方法 |
| JP4416866B2 (ja) * | 1998-07-30 | 2010-02-17 | オリエンタル酵母工業株式会社 | カルシウム測定用液状試薬 |
| US11089828B2 (en) * | 2018-07-25 | 2021-08-17 | Nike, Inc. | Secure pocket structure |
-
1992
- 1992-02-07 JP JP05604492A patent/JP3164165B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-02-02 EP EP19930300744 patent/EP0555046B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-02-02 DE DE1993612518 patent/DE69312518T2/de not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002238598A (ja) * | 2001-02-15 | 2002-08-27 | Asahi Kasei Corp | カルシウムイオン測定用組成物および測定方法 |
| JP4577863B2 (ja) * | 2001-02-15 | 2010-11-10 | 旭化成ファーマ株式会社 | カルシウムイオン測定用組成物および測定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69312518T2 (de) | 1997-12-04 |
| EP0555046A1 (en) | 1993-08-11 |
| DE69312518D1 (de) | 1997-09-04 |
| EP0555046B1 (en) | 1997-07-30 |
| JP3164165B2 (ja) | 2001-05-08 |
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