JP3113025B2 - 鉄の定量方法 - Google Patents
鉄の定量方法Info
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- JP3113025B2 JP3113025B2 JP03341808A JP34180891A JP3113025B2 JP 3113025 B2 JP3113025 B2 JP 3113025B2 JP 03341808 A JP03341808 A JP 03341808A JP 34180891 A JP34180891 A JP 34180891A JP 3113025 B2 JP3113025 B2 JP 3113025B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は鉄の定量方法に関し、さ
らに詳しくは、鉄を加えないと活性を発現しないアポ型
アコニターゼ（ＥＣ ４．２．１．３）に試料中の鉄を
接触せしめて活性型とし、クエン酸から生じるイソクエ
ン酸をイソクエン酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．４
１，ＥＣ １．１．１．４２）の反応によって鉄量を定
量する高感度な酵素定量方法に関する。
らに詳しくは、鉄を加えないと活性を発現しないアポ型
アコニターゼ（ＥＣ ４．２．１．３）に試料中の鉄を
接触せしめて活性型とし、クエン酸から生じるイソクエ
ン酸をイソクエン酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．４
１，ＥＣ １．１．１．４２）の反応によって鉄量を定
量する高感度な酵素定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】体内鉄の総量は４ｇ前後で、その２／３
は赤血球ヘモグロビン中に、残りの１／３は貯蔵鉄とし
て肝・脾・骨髄その他の組織に存在する。血清鉄の総量
は３〜４ｍｇであり、すべて血清のβ−グロブリンに属
するトランスフェリンに結合（その１分子は鉄２原子を
結合）して存在する。血清鉄濃度は、赤血球の生成と崩
壊の程度によって左右され、骨髄における造血が減退す
れば血清鉄の流れは停滞して、血清鉄濃度は上昇し、逆
の場合は低下する。このことより血清鉄濃度は造血器の
機能を反映すると考えられている。また貯蔵鉄の動態も
血清鉄に関係があり、肝炎などでは肝から貯蔵鉄が動員
されて他の組織に移動するため、血清鉄は上昇する。上
述のように血清鉄は血液疾患（鉄欠乏性貧血、再生不良
性貧血、悪性貧血、溶血性貧血、白血病、真性多血症な
ど）のみでなく、多種の疾患（感染症、急性肝炎、肝硬
変症、ヘモクロマトーシス、ネフローゼなど）と関係が
あり、その測定は臨床検査上重要視されている。
は赤血球ヘモグロビン中に、残りの１／３は貯蔵鉄とし
て肝・脾・骨髄その他の組織に存在する。血清鉄の総量
は３〜４ｍｇであり、すべて血清のβ−グロブリンに属
するトランスフェリンに結合（その１分子は鉄２原子を
結合）して存在する。血清鉄濃度は、赤血球の生成と崩
壊の程度によって左右され、骨髄における造血が減退す
れば血清鉄の流れは停滞して、血清鉄濃度は上昇し、逆
の場合は低下する。このことより血清鉄濃度は造血器の
機能を反映すると考えられている。また貯蔵鉄の動態も
血清鉄に関係があり、肝炎などでは肝から貯蔵鉄が動員
されて他の組織に移動するため、血清鉄は上昇する。上
述のように血清鉄は血液疾患（鉄欠乏性貧血、再生不良
性貧血、悪性貧血、溶血性貧血、白血病、真性多血症な
ど）のみでなく、多種の疾患（感染症、急性肝炎、肝硬
変症、ヘモクロマトーシス、ネフローゼなど）と関係が
あり、その測定は臨床検査上重要視されている。
【０００３】血清鉄の定量方法としては、松原法、国際
標準法、オートアナライザー法、原子吸光度法などがあ
る。松原法、国際標準法の原理は、酸で鉄を遊離後、除
タンパクし、還元剤で鉄を還元した後、発色剤で発色さ
せる方法であるが、ＢＰＴのモル吸光係数が小さく、感
度が低いため多量の血清を必要とし、干渉を受けやす
く、用手法であるため多検体処理は困難である。オート
アナライザー法は、松原法、国際標準法の原理を単に自
動化したものであるので、感度的問題はまったく解決さ
れておらずヘモグロビン、ビリルビンなどの干渉がみら
れる。原子吸光度法は、前処理が必要なうえ処理方法の
違いにより測定値にかなりのばらつきがみられ、感度が
悪いなどの問題の他に、高価な特殊機器が必要であるな
ど多くの問題点をかかえている。
標準法、オートアナライザー法、原子吸光度法などがあ
る。松原法、国際標準法の原理は、酸で鉄を遊離後、除
タンパクし、還元剤で鉄を還元した後、発色剤で発色さ
せる方法であるが、ＢＰＴのモル吸光係数が小さく、感
度が低いため多量の血清を必要とし、干渉を受けやす
く、用手法であるため多検体処理は困難である。オート
アナライザー法は、松原法、国際標準法の原理を単に自
動化したものであるので、感度的問題はまったく解決さ
れておらずヘモグロビン、ビリルビンなどの干渉がみら
れる。原子吸光度法は、前処理が必要なうえ処理方法の
違いにより測定値にかなりのばらつきがみられ、感度が
悪いなどの問題の他に、高価な特殊機器が必要であるな
ど多くの問題点をかかえている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した従
来法の欠点を一挙に解決して、生体内その他各種サンプ
ル中における鉄の量を正確に且つ熟練を要することなく
簡便、迅速に測定することができ、自動化ないし多検体
処理を可能とする、鉄の高感度分析システムを新規に開
発することを、目的とするものである。
来法の欠点を一挙に解決して、生体内その他各種サンプ
ル中における鉄の量を正確に且つ熟練を要することなく
簡便、迅速に測定することができ、自動化ないし多検体
処理を可能とする、鉄の高感度分析システムを新規に開
発することを、目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、本発明者らは、鉄
量をすみやかに、かつ、正確に定量するために、鉄と各
種酵素活性との関係を詳細に検討した結果、アコニター
ゼがその酵素活性を発現するために、鉄を要求し、鉄濃
度の増加に応じてアコニターゼの活性が変化することを
知り、そしてその変化を測定することによって鉄量が測
定できることを確認し、本発明を完成するに至った。
成するためになされたものであって、本発明者らは、鉄
量をすみやかに、かつ、正確に定量するために、鉄と各
種酵素活性との関係を詳細に検討した結果、アコニター
ゼがその酵素活性を発現するために、鉄を要求し、鉄濃
度の増加に応じてアコニターゼの活性が変化することを
知り、そしてその変化を測定することによって鉄量が測
定できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００６】アコニターゼがその活性発現に鉄を要求す
ることは良く知られている［蛋白質核酸酵素，Ｖｏｌ．
２２，Ｎｏ．１２，１２９３−１３０２（１９７７）；
ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ
ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．２３６，Ｎｏ．１２，
Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９６１；ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ
ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，
Ｖｏｌ．２４２，Ｎｏ．８，Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ａｐｒ
ｉｌ ２５，ｐｐ．１８７０−１８７９，１９６７；Ｔ
ＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ
ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．２４６，Ｎｏ．３，Ｉｓ
ｓｕｅ ｏｆ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １０，ｐｐ．７７２
−７７９，１９７１；Ｃｅｌｌ．Ｖｏｌ．６４，８８１
−８８３，Ｍａｒｃｈ ８，１９９１］。しかしながら
いずれの文献も、例えば、血清鉄のような低濃度な鉄
（正常値；血清 男性１１．６〜３４．９μＭ、女性；
７．２〜２９．５μＭ）を測定できるものでもなく、臨
床検査で日常使用されているような直線的なスタンダー
ドカーブも得られてはいない。本発明の方法は、上記の
ような低濃度な鉄を直線性の良好なスタンダードカーブ
によって、再現性よく高感度に測定することを可能とし
たものである。
ることは良く知られている［蛋白質核酸酵素，Ｖｏｌ．
２２，Ｎｏ．１２，１２９３−１３０２（１９７７）；
ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ
ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．２３６，Ｎｏ．１２，
Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９６１；ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ
ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，
Ｖｏｌ．２４２，Ｎｏ．８，Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ａｐｒ
ｉｌ ２５，ｐｐ．１８７０−１８７９，１９６７；Ｔ
ＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ
ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．２４６，Ｎｏ．３，Ｉｓ
ｓｕｅ ｏｆ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １０，ｐｐ．７７２
−７７９，１９７１；Ｃｅｌｌ．Ｖｏｌ．６４，８８１
−８８３，Ｍａｒｃｈ ８，１９９１］。しかしながら
いずれの文献も、例えば、血清鉄のような低濃度な鉄
（正常値；血清 男性１１．６〜３４．９μＭ、女性；
７．２〜２９．５μＭ）を測定できるものでもなく、臨
床検査で日常使用されているような直線的なスタンダー
ドカーブも得られてはいない。本発明の方法は、上記の
ような低濃度な鉄を直線性の良好なスタンダードカーブ
によって、再現性よく高感度に測定することを可能とし
たものである。
【０００７】本発明は、鉄の定量を行うに際し、アコニ
ターゼの反応より生じるイソクエン酸をイソクエン酸脱
水素酵素によって酸化型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド類（以降ＮＡＤ類という）または／および、酸
化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸類
（以降ＮＡＤＰ類という）から、還元型ＮＡＤ類（以降
ＮＡＤＨ類という）または／および、還元型ＮＡＤＰ類
（以降ＮＡＤＰＨ類という）への変化量として鉄濃度に
依存して変化するアコニターゼ活性を検出することによ
って鉄量を測定することを基本的測定原理とするもので
ある。具体的には、少なくともアポ型アコニターゼと還
元剤を溶解した緩衝液に検体を加え、アポ型アコニター
ゼをホロ型アコニターゼとし、クエン酸、イソクエン酸
脱水素酵素、ＮＡＤ類または／およびＮＡＤＰ類を少な
くとも含む適当な緩衝液で、ＮＡＤＨ類または／および
ＮＡＤＰＨ類の生成量あるいは生成速度を測定すること
によって鉄量を測定するものである。
ターゼの反応より生じるイソクエン酸をイソクエン酸脱
水素酵素によって酸化型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド類（以降ＮＡＤ類という）または／および、酸
化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸類
（以降ＮＡＤＰ類という）から、還元型ＮＡＤ類（以降
ＮＡＤＨ類という）または／および、還元型ＮＡＤＰ類
（以降ＮＡＤＰＨ類という）への変化量として鉄濃度に
依存して変化するアコニターゼ活性を検出することによ
って鉄量を測定することを基本的測定原理とするもので
ある。具体的には、少なくともアポ型アコニターゼと還
元剤を溶解した緩衝液に検体を加え、アポ型アコニター
ゼをホロ型アコニターゼとし、クエン酸、イソクエン酸
脱水素酵素、ＮＡＤ類または／およびＮＡＤＰ類を少な
くとも含む適当な緩衝液で、ＮＡＤＨ類または／および
ＮＡＤＰＨ類の生成量あるいは生成速度を測定すること
によって鉄量を測定するものである。
【０００８】松原法、国際標準法、オートアナライザー
法、原子吸光度法は１個の鉄に対して１個の応答しか得
られないのに対して、本発明の酵素的定量法は、酵素が
増幅作用を示すことにより１個の鉄に対して多数の応答
が得られるという点で高感度化、精密性につながる。ま
た鉄への特異性が高いという点で現行の測定法より優れ
ている。
法、原子吸光度法は１個の鉄に対して１個の応答しか得
られないのに対して、本発明の酵素的定量法は、酵素が
増幅作用を示すことにより１個の鉄に対して多数の応答
が得られるという点で高感度化、精密性につながる。ま
た鉄への特異性が高いという点で現行の測定法より優れ
ている。
【０００９】本発明に使用できるアコニターゼとしては
鉄の添加無添加によって活性が変化するものであれば良
く、特に規定されることはない。また、アポ型アコニタ
ーゼの調整法としては、キレート剤処理があげられる。
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸類（ＥＤ
ＴＡ類）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸
（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸
（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰ
Ａ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴ
Ａ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、ジ
アミノプロパノール四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ｏ−フ
ェナントロリンなどが有効であり、鉄を加えていない状
況でのバックグランドができるだけ小さなものが好まし
い。また、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ類）は、
遊離酸型、アルカリ、ナトリウム、アンモニウムなどの
塩型のアルコール沈殿物でも結晶物でもよく、特に規定
されることはない。
鉄の添加無添加によって活性が変化するものであれば良
く、特に規定されることはない。また、アポ型アコニタ
ーゼの調整法としては、キレート剤処理があげられる。
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸類（ＥＤ
ＴＡ類）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸
（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸
（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰ
Ａ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴ
Ａ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、ジ
アミノプロパノール四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ｏ−フ
ェナントロリンなどが有効であり、鉄を加えていない状
況でのバックグランドができるだけ小さなものが好まし
い。また、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ類）は、
遊離酸型、アルカリ、ナトリウム、アンモニウムなどの
塩型のアルコール沈殿物でも結晶物でもよく、特に規定
されることはない。
【００１０】本発明に使用できるイソクエン酸脱水素酵
素としては、イソクエン酸へのＫｍ値が小さいものが好
まれるが本反応によって生成されるイソクエン酸と反応
でき得るものであれば、特に規定されることはない。Ｎ
ＡＤ類に特異的なものでも、ＮＡＤＰ類に特異的なもの
でも差し支えない。
素としては、イソクエン酸へのＫｍ値が小さいものが好
まれるが本反応によって生成されるイソクエン酸と反応
でき得るものであれば、特に規定されることはない。Ｎ
ＡＤ類に特異的なものでも、ＮＡＤＰ類に特異的なもの
でも差し支えない。
【００１１】本発明に使用できる還元剤としては、アス
コルビン酸、チオ−グリコール酸、チオ−マレート、シ
ステイン、Ｎ−アセチルシステイン、ヒドロキシルアミ
ン、２−メルカプトエタノール、還元型グルタチオン、
ジチオトレイトール、ジチオエリトリオール、臭化２−
アミノエチルイソチオウロニウム及びチオ−グリセロー
ルなどのほかに、アコニターゼへの鉄の結合を促進する
ものであれば何を使っても構わない。
コルビン酸、チオ−グリコール酸、チオ−マレート、シ
ステイン、Ｎ−アセチルシステイン、ヒドロキシルアミ
ン、２−メルカプトエタノール、還元型グルタチオン、
ジチオトレイトール、ジチオエリトリオール、臭化２−
アミノエチルイソチオウロニウム及びチオ−グリセロー
ルなどのほかに、アコニターゼへの鉄の結合を促進する
ものであれば何を使っても構わない。
【００１２】本発明に使用できるＮＡＤ類または／およ
びＮＡＤＰ類は、遊離酸型またはアルカリ金属やアンモ
ニウムなどの塩型のアルコール沈殿物でも結晶物でもよ
く、純度の高いものほど望まれるが、一般に市販されて
いるＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類は十分に本発明に使用でき
る。ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類としてＮＡＤ、ＮＡＤＰは言
うまでもなく、チオ−ＮＡＤ、チオ−ＮＡＤＰも本発明
の方法に使用できる。他のＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類もイソ
クエン酸脱水素酵素と反応できうるものは本発明の方法
を応用できる。
びＮＡＤＰ類は、遊離酸型またはアルカリ金属やアンモ
ニウムなどの塩型のアルコール沈殿物でも結晶物でもよ
く、純度の高いものほど望まれるが、一般に市販されて
いるＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類は十分に本発明に使用でき
る。ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類としてＮＡＤ、ＮＡＤＰは言
うまでもなく、チオ−ＮＡＤ、チオ−ＮＡＤＰも本発明
の方法に使用できる。他のＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類もイソ
クエン酸脱水素酵素と反応できうるものは本発明の方法
を応用できる。
【００１３】本発明に使用できる緩衝液は、特に規定さ
れることはなく、ＰＩＰＥＳバッファー、トリスバッフ
ァー、トリエタノールアミンバッファー、グリシンバッ
ファー、ＧＴＡバッファー、リン酸バッファー、ホウ酸
バッファーなどがあげられるが、緩衝液の最適ｐＨが、
５〜９、好ましくは６〜８の範囲のものであれば良い。
れることはなく、ＰＩＰＥＳバッファー、トリスバッフ
ァー、トリエタノールアミンバッファー、グリシンバッ
ファー、ＧＴＡバッファー、リン酸バッファー、ホウ酸
バッファーなどがあげられるが、緩衝液の最適ｐＨが、
５〜９、好ましくは６〜８の範囲のものであれば良い。
【００１４】以上のように、本発明は、反応系に酵素を
用いることを特徴とする鉄の定量方法である。また本発
明は、それに用いるための試薬ないし測定キットにも関
するものである。
用いることを特徴とする鉄の定量方法である。また本発
明は、それに用いるための試薬ないし測定キットにも関
するものである。
【００１５】
【発明の効果】本発明は、（１）酵素を用いることによ
って鉄の高感度測定が可能である、（２）測定精度が上
がる、（３）酵素を用いることによって温和な条件での
測定が可能である、（４）レートアッセイもできる、
（５）操作が簡便であるという大きな効果がある。
って鉄の高感度測定が可能である、（２）測定精度が上
がる、（３）酵素を用いることによって温和な条件での
測定が可能である、（４）レートアッセイもできる、
（５）操作が簡便であるという大きな効果がある。
【００１６】
【実施例】以下に本発明の実施例を挙げてさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定さ
れるものではない。
に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定さ
れるものではない。
【００１７】
【実施例１】下記表１に示す組成にしたがって、試薬Ｒ
−１、試薬Ｒ−２を調製した。
−１、試薬Ｒ−２を調製した。
【００１８】
【表１】
【００１９】
【測定方法】検体としては、鉄標準液（０〜１００μＭ
硫酸第一鉄アンモニウム液）を用いた。この検体２０μ
ｌ及び試薬Ｒ−１ ５０μｌを攪拌し、３７℃にて５分
間インキュベーションした後、試薬Ｒ−２ ３５０μｌ
を加え攪拌、３７℃にて２分間後２分間の吸光度変化量
を日立７１５０型自動分析器で測定した。
硫酸第一鉄アンモニウム液）を用いた。この検体２０μ
ｌ及び試薬Ｒ−１ ５０μｌを攪拌し、３７℃にて５分
間インキュベーションした後、試薬Ｒ−２ ３５０μｌ
を加え攪拌、３７℃にて２分間後２分間の吸光度変化量
を日立７１５０型自動分析器で測定した。
【００２０】その結果を図１に示す。図１を見て分かる
ように本発明の方法を用いると、原点を通る良好な直線
性が得られた。
ように本発明の方法を用いると、原点を通る良好な直線
性が得られた。
【００２１】
【実施例２】下記表２に示す組成にしたがって、試薬Ｒ
−１、試薬Ｒ−２を調製し、検体として実施例１で用い
た検体を使用し、実施例１と同様の測定方法をくり返し
て鉄の測定を行った。その結果を図２に示す。図２を見
て分かるように本発明の方法を用いると、原点を通る良
好な直線性が得られた。
−１、試薬Ｒ−２を調製し、検体として実施例１で用い
た検体を使用し、実施例１と同様の測定方法をくり返し
て鉄の測定を行った。その結果を図２に示す。図２を見
て分かるように本発明の方法を用いると、原点を通る良
好な直線性が得られた。
【００２２】
【表２】
【００２３】
【実施例３】下記表３に示す組成にしたがって、試薬Ｒ
−１、試薬Ｒ−２−１（本試験１）、試薬Ｒ−２−２
（本試験２）を調製した。
−１、試薬Ｒ−２−１（本試験１）、試薬Ｒ−２−２
（本試験２）を調製した。
【００２４】
【表３】
【００２５】
【測定方法】実施例１で調製した検体２０μｌ及び試薬
Ｒ−１ ５０μｌを攪拌し、３７℃にて５分間インキュ
ベーションした後、試薬Ｒ−２−１または試薬Ｒ−２−
２を加え攪拌、３７℃にて２分間放置後２分間のＡ４０
５ｎｍ（本試験１）、Ａ３４０ｎｍ（本試験２）におけ
る吸光度変化量を、日立７１５０型自動分析器で測定し
た。その結果を図３に示す。図３を見て分かるように本
発明の方法を用いると、本試験１、２とも良好な直線性
が得られたうえ、モル吸光係数の比どおり本試験１の吸
光度変化量は本試験２のそれの約１．８倍の傾きが得ら
れた。
Ｒ−１ ５０μｌを攪拌し、３７℃にて５分間インキュ
ベーションした後、試薬Ｒ−２−１または試薬Ｒ−２−
２を加え攪拌、３７℃にて２分間放置後２分間のＡ４０
５ｎｍ（本試験１）、Ａ３４０ｎｍ（本試験２）におけ
る吸光度変化量を、日立７１５０型自動分析器で測定し
た。その結果を図３に示す。図３を見て分かるように本
発明の方法を用いると、本試験１、２とも良好な直線性
が得られたうえ、モル吸光係数の比どおり本試験１の吸
光度変化量は本試験２のそれの約１．８倍の傾きが得ら
れた。
【図１】実施例１に記載した方法で測定した鉄の測定カ
ーブである。
ーブである。
【図２】実施例２に記載した方法で測定した鉄の測定カ
ーブである。
ーブである。
【図３】実施例３に記載した方法で測定した鉄の測定カ
ーブである。
ーブである。
Ｔｈｉｏ−ＮＡＤＰ+：本試験１ ＮＡＤＰ+：本試験２
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/527 C12Q 1/32 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】 鉄を活性化因子とするアコニターゼを用
いて鉄の定量を行うに際し、アコニターゼの反応時に還
元剤を用いること、を特徴とする鉄の酵素的定量方法。 - 【請求項２】 還元剤が、アスコルビン酸、チオ−グリ
コール酸、チオ−マレート、システイン、Ｎ−アセチル
システイン、ヒドロキシルアミン、２−メルカプトエタ
ノール、還元型グルタチオン、ジチオトレイトール、ジ
チオエリトリオール、臭化２−アミノエチルイソチオウ
ロニウム及びチオ−グリセロールからなる群から選ばれ
たものであること、を特徴とする請求項１に記載の鉄の
酵素的定量方法。 - 【請求項３】 アコニターゼ反応より生じるイソクエン
酸をイソクエン酸脱水素酵素によって検出することによ
り鉄量を測定することを特徴とする請求項１に記載の鉄
の酵素的定量方法。 - 【請求項４】 イソクエン酸脱水素酵素の補酵素とし
て、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類または／
および、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
類を用いることを特徴とする請求項３に記載の鉄の酵素
的定量方法。 - 【請求項５】 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
類または／および、ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドリン酸類として、ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、
または／および、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
リン酸を用いることを特徴とする請求項４に記載の鉄の
酵素的定量方法。 - 【請求項６】 アコニターゼ、還元剤、クエン酸、イソ
クエン酸脱水素酵素、及び、ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド類（若しくはニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドリン酸類）を少なくとも含有することを特徴
とする鉄の測定用試薬。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03341808A JP3113025B2 (ja) | 1991-12-02 | 1991-12-02 | 鉄の定量方法 |
| DE69226940T DE69226940T2 (de) | 1991-12-02 | 1992-11-30 | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Serumeisen oder von der Bindungsfähigkeit des ungesättigten Eisens durch Verwendung von Akonitase |
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