DE69226940T2

DE69226940T2 - Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Serumeisen oder von der Bindungsfähigkeit des ungesättigten Eisens durch Verwendung von Akonitase

Info

Publication number: DE69226940T2
Application number: DE69226940T
Authority: DE
Inventors: Tsuyoshi 2-16 Satsukigaoka 2-Chome Osaka-Fu 563 Fujita; Hozumi 11-43 Kasuga 3-Chome Osaka-Fu 567 Hamasaki; Masatsugu 2-23 Tsutsujigaokaminami Hyogo-Ken 669-13 Nonobe
Original assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Current assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Priority date: 1991-12-02
Filing date: 1992-11-30
Publication date: 1999-05-27
Anticipated expiration: 2012-12-01
Also published as: EP0570588A4; EP0570588A1; US5420008A; WO1993011259A1; EP0570588B1; DE69226940D1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Analyseverfahren für Serumeisen und insbesondere auf ein hochempfindliches enzymatisches Analyseverfahren, bei dem an Transferrin gebundenes Eisen freigesetzt wird, Apo-Aconitase (EC. 4.2.1.3), die ohne Eisen inaktiv ist, zur Aktivierung damit in Kontakt gebracht wird, und ein Isocitrat, das aus Zitronensäure gewonnen wird, einer Reaktion mit Isocitrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.41, EC 1.1.1.42) ausgesetzt wird, um den Serumeisengehalt zu analysieren, und auf ein Reagenz, das zum Messen verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein enzymatisches Analyseverfahren für die ungesättigte Eisen- Bindungsfähigkeit (im folgenden mit UIBC abgekürzt), und insbesondere auf ein hochempfindliches enzymatisches Analyseverfahren für UIBC, bei dem eine Eisenüberschußmenge bekannter Konzentration einer Körperflüssigkeits-Testprobe etc. hinzugefügt wird, und das Eisen an Transferrin bis zur Sättigung gebunden wird, nach der das ungebundene, verbleibende Eisen mit der Apo-Aconitase (EC 4.2.1.3) in Berührung gebracht wird, die ohne Eisen inaktiv ist, und ein Isocitrat, das aus Zitronensäure mit Hilfe einer katalytischen Wirkung der Aconitase gewonnen wird, bezüglich ihrer Aconitaseaktivität gemessen wird, wobei eine Isocitrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.41, EC 1.1.1.42) als Nachweisenzym verwendet wird, um die UIBC zu ermitteln, und bezieht sich weiter auf ein Reagenz, das bei der Analyse verwendet wird.

STAND DER TECHNIK UND DAMIT VERBUNDENE PROBLEME

Die Gesamtmenge von Eisen im Körper beträgt etwa 4 g, wobei zwei Drittel davon im Erythrozyten-Hämoglobin vorkommen und das verbleibende Drittel im Gewebe der Leber und der Milz sowie im Knochenmark etc. als Speichereisen gehalten wird. Die Gesamtmenge von Serumeisen beträgt 3-4 mg, wobei alles an Transferrin gebunden ist, das zu einem Serum-β-Globulin gehört (ein Molekül des Transferrin verbindet sich mit zwei Eisenmolekülen). Die Serumeisenkonzentration wird durch die Rate der Erzeugung und Zerstörung von Erythrozyten reguliert, und liegt eine Abnahme von Hämatopoesis im Knochenmark vor, stagniert der Serumeisenfluß, wodurch die Serumeisenkonzentration ansteigt, während sich die Serumeisenkonzentration im umgekehrten Fall verringert. Dies führte zu der Schlußfolgerung, daß die Serumeisenkonzentration ein Abbild der Funktion der hämatogenen Organe ist. Darüber hinaus beeinflußt die Dynamik des Speichereisens auch das Serumeisen. Bei Krankheiten, wie beispielsweise Hepatitis, wandert das Speichereisen in der Leber zu anderen Geweben und verursacht einen Anstieg des Serumeisens. Wie es oben erläutert wurde, spielt Serumeisen nicht nur bei Hämodiskrasie (Eisenmangel-Anämie, aplastischer Anämie, Pernicöser Anämie, Hämolytischer Anämie, Leukämie, Polycythämia rubra) eine Rolle, sondern auch bei einer Vielzahl weiterer Krankheiten (Infektionskrankheiten, akute Hepatitis, Leberzirrhose, Hämochromatose, Nephrose, etc.), weshalb die Eisenmessung bei medizinischen Untersuchungen als wichtig erachtet wird.
Analyseverfahren für Serumeisen beinhalten das Matsubara-Verfahren, das Standardverfahren des Internationalen Komitees zur Standardisierung der Hämatolobie (ICSH), das Autoanalyse- Verfahren, die Atomabsorptions-Spektrometrie und so weiter. Das Prinzip des Matsubara-Verfahrens und des Standardverfahrens des Internationalen Komitees zur Standardisierung der Hämatolobie (ICSH) beinhaltet das Freisetzen von Eisen mit einer Säure, Denaturierung und Reduktion des Eisens mit einem Reduktionsreagenz, gefolgt von einer Einfärbung mit einem Indikator. Der molare Absorptionskoeffizient von BPT ist jedoch klein und die Empfindlichkeit gering, weshalb eine große Menge des Serums erforderlich ist. Da es interferenzempfindlich ist, bereitet es aufgrund der manuellen Handhabung Schwierigkeiten, mehrere Proben gleichzeitig zu bearbeiten. Das Autoanalyse-Verfahren basiert auf einer einfachen Automatisierung des Prinzips, das beim Matsubara- Verfahren und beim Standardverfahren des Internationalen Komitees zur Standardisierung der Hämatolobie (ICSH) Anwendung findet, ohne das Problem der Empfindlichkeit zu lösen, und somit kann eine Interferenz durch Hämoglobin, Bilirubin, etc. beobachtet werden. Die Atomabsorptions-Spektrometrie ist in der Hinsicht nachteilig, daß sie eine Vorbehandlung verlangt und große Unterschiede der Meßwerte erzeugt, die von Differenzen bei der angewendeten Vorgehensweise abhängen, und ihre Empfindlichkeit ist gering. Darüber hinaus erfordert sie eine besondere, teure Ausrüstung.

PROBLEME, DIE MIT DER ERFINDUNG GELÖST WERDEN SOLLEN

Mit der vorliegenden Erfindung wird beabsichtigt, alle oben beschriebenen Nachteile der Verfahren nach dem Stand der Technik zu überwinden, indem ein neuartiges, hochempfindliches Analysesystem zum Messen der Eisenmenge im Körper, insbesondere im Serum, auf einfache und schnelle Art und Weise ohne die Notwendigkeit von Spezialkenntnissen angegeben wird, das eine Automatisierung oder eine gleichzeitige Bearbeitung mehrerer Proben zuläßt.

EINRICHTUNGEN ZUM LÖSEN DER PROBLEME

Die vorliegende Erfindung wurde ausgearbeitet, um das oben beschriebene Ziel zu erreichen, wobei eine detaillierte Untersuchung der Beziehung zwischen Eisen und unterschiedlichen Enzymaktivitäten durchgeführt wurde, um eine schnelle und genaue Analyse des Serumeisengehalts durchzuführen. Als Folge davon hat sich gezeigt, daß Eisen für die Aconitase nötig ist, um seine Enzymaktivität auszudrücken, wobei sich die Enzymaktivität in Korrespondenz mit dem Anstieg im Serumeisengehalt ändert, und es hat sich bestätigt, das es möglich ist, den Serumeisengehalt durch Messung dieser Änderung zu messen, wodurch die vorliegende Erfindung vervollständigt wird.
Es ist hinreichend bekannt, daß Eisen für die Aconitase nötig ist, um seine Aktivität anzuwenden (Proteins, Nucleic Acids and Enzymes, Vol. 22, No. 12, 1293-1302, 1977; THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 236, No. 12, 3086-3092, Dezember 1961: THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 242, No. 8, Ausgabe 25. April, pp. 1870-1979, 1967; THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHMISTRY, Vol. 246, No. 3, Ausgabe 10. Februar, pp. 772-779, 1971; Cell, Vol. 64, 881-883, 8. März 1991). In keiner dieser Veröffentlichungen sind jedoch Verfahren zum Messen geringer Konzentrationen von Eisen, wie etwa Serumeisen (normaler Gehalt im Serum: männlich = 11.6-34.9 uM, weiblich = 7,29-29,5 uM) erwähnt, um eine derart lineare Standardkurve zu erhalten, wie sie normalerweise bei medizinischen Untersuchungen verwendet wird. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erlaubt eine reproduzierbare, hochempfindliche Messung geringer Konzentrationen von Serumeisen unter Verwendung einer ausreichend linearen Standardkurve.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine Eisen-Meßkurve, die in Übereinstimmung mit dem Verfahren aus Beispiel 1 gemessen wurde.
Fig. 2 ist eine Eisen-Meßkurve, die in Übereinstimmung mit dem Verfahren aus Beispiel 4 gemessen wurde.
Fig. 3 ist eine UIBC-Meßkurve, die in Übereinstimmung mit dem Verfahren aus Beispiel 5 gemessen wurde.
Fig. 4 zeigt eine UIBC-Meßkurve, die in Übereinstimmung mit dem Verfahren aus Beispiel 6 gemessen wurde, und die Serum- UIBC-Werte, die man dadurch erhält.
Das Grundprinzip, das bei der vorliegenden Erfindung Anwendung findet, beinhaltet die Messung eines Serumeisengehalts bei einer Serumeisenanalyse, durch Lösen des an Transferrin gebundenen Eisens, Bildung einer aktiven Aconitase und erfassen der Aconitaseaktivität, die sich in einer von der Serumeisenkonzentration abhängigen Art und Weise ändert, mit einer Isocitrat-Dehydrogenase, die auf die das Isocitrat wirkt, gebildet durch eine Reaktion der Aconitase, hinsichtlich des Grades der Umwandlung einer oxidierten Nikotinamid- Adenin-Dinukleotid-Gruppenverbindung (im folgenden NAD-Gruppenverbindung genannt) und/oder einer oxidierten Nikotinamid- Adenin-Dinukleotid-Phosphat-Gruppenverbindung (im folgenden NADP-Gruppenverbindung genannt) in eine reduzierte NAD-Gruppenverbindung (im folgenden NADH-Gruppenverbindung genannt) und/oder eine reduzierte NADP-Gruppenverbindung (im folgenden NADPH-Gruppenverbindung genannt), um den Serumeisengehalt zu messen. Konkret gesagt wird Eisen, das an Transferrin gebunden ist, in einer Lösung mit einem sauren pH freigesetzt und einer Pufferlösung hinzugefügt, in der wenigstens eine Apo- Aconitase aufgelöst wurde, um die Apo-Aconitase in eine Holo- Aconitase umzuwandeln, und die Menge oder Rate einer NADH- Gruppenverbindung und/oder einer NADPH-Gruppenverbindung wird mit einer geeigneten Pufferlösung gemessen, die wenigstens eine Zitronensäure enthält, um den Serumeisengehalt zu messen.
Im Gegensatz zum Matsubara-Verfahren, dem Standardverfahren des Internationalen Komitees zur Standardisierung der Hämatolobie (ICSH), dem Autoanalyse-Verfahren und der Atomabsorptionspektrometrie, mit denen man nur ein Ergebnis je Eisen erhält, kann man mit dem enzymatischen Analyseverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung mehrere Ergebnisse je Eisen aufgrund des durch das Enzym verstärkten Effektes erhalten, so daß eine hohe Empfindlichkeit und Präzision liefert. Es ist auch den momentan verwendeten Meßverfahren hinsichtlich seiner hohen Spezifität für Eisen überlegen.
Das gesamte Eisen im Serum ist an Transferrin gebunden. Gemäß der vorliegenden Erfindung, wird das Eisen durch Messung der Aconitaseaktivität gemessen, entweder nachdem das Eisen vom Transferrin im Serum gelöst und an die Aconitase gebunden ist, oder während es dem Eisen, das vom Transferrin im Serum gelöst wurde, gestattet wird, sich an die Aconitase zu binden.
Als Ergebnis einer facettenreichen Untersuchung, um ein Verfahren zum Lösen von Eisen von Transferrin im Serum auf quantitative Art und Weise zu finden, das absolut keine nachteilige Auswirkung auf die anschließend durchgeführte Eisenmessung hat und einfach zu Handhaben ist, fanden wir heraus, daß das gewünschte Ziel in einem sauren Milieu erreicht werden kann. Deshalb wird bei der vorliegenden Erfindung ein saurer pH-Wert-Bereich für den Schritt der Lösung aufrechterhalten, wobei jedes Verfahren für diesen Zweck verwendet werden kann, wie beispielsweise die Verwendung einer sauren Pufferlösung.
Die Puffer, die beim Schritt der Lösung des an Transferrin gebundenen Eisens verwendet werden, beinhalten einen Acetatpuffer, einen GTA-Puffer, einen Oxalsäure-Puffer, einen Phosphat Puffer, einen Glyzin-Puffer, einen HCl-KCl-Puffer, einen Kalium-Biphtalat-Puffer, einen Succinat-Puffer, etc., jedoch gibt es keine speziellen Begrenzungen, so lange sich der optimale pH-Wert der Pufferlösung im Bereich von 1-5, vorzugsweise 2-4, liegt und die Konzentration des verwendeten Reagenz 1-1.000 mM, vorzugsweise 10-500 mM ist. Zudem kann ein Tensid, Reduktionsmittel usw. dazu hinzugefügt werden, um die Wirkung zu erhöhen. Beispiele für Tenside umfassen, anionische Tenside, kationische Tenside, ampholytische Tenside, nonionische Tenside, steroidale Tenside, etc.
Die Reduktionsreagenzien, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, enthalten Ascorbinsäure, Thioglycolsäure, Thiomalat, Zystein, N-Acetylzystein, Hydroxylamin, 2-Merkaptoethanol, reduziertes Glutathion, Dithiothreitol, Dithioerythritol, 2-Aminoethylisothioronium-Bromid und Thioglycerol, etc. wie auch andere ReduktionsReagenzien, die die Bindung von Eisen an der Aconitase fördern. Die Reagenz-Konzentration beträgt 0-1.000 mM, vorzugsweise 0,1-500 mM.
Es gibt keine speziellen Beschränkungen der Aconitase, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, so lange ihre Aktivität in Abhängigkeit der Zugabe oder Nicht-Zugabe von Eisen variiert. Zudem kann eine Behandlung mit einem chelatbildenden Reagenz angewendet werden, um die Apo-Aconitase einzustellen. Wirkungsvolle chelatbildende Reagenzien enthalten Ethylendiamin-Tetraacetylsäuren (EDTA), Hydroxyethylethylendiamin-Triacetylsäure (EDTA-OH), Cyclohexandiamin- Tetraacetylsäure (CyDTA), Diethylentriamin-Pentaacetylsäure (DTPA), Glycolätherdiamin-Tetraacetylsäure (GEDTA), Triethylentetraamin-Hexaacetylsäure (TTHA), Diaminopropanol-Tetra acetylsäure (DPTA-OH), O-Phenantrolin, etc., aber ist vorzuziehen, einen möglichst geringen Hintergrund zu haben, dem kein Eisen hinzugefügt ist. Weiterhin können die Ethylendiamin-Tetraacetylsäuren (EDTA) ein Alkoholniederschlag oder Kristalle einer freien Säure oder ein Salz mit einem Alkali, wie etwa Natrium, Ammonium, etc. sein und sind nicht speziell eingeschränkt. Das Enzym wird in einer Konzentration von 0,01-100 u/ml, vorzugsweise aber 0,1-30 u/ml hinzugefügt.
Die Isocitrat-Dehydrogenase, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, hat vorzugsweise einen geringen Km-Wert im Bezug auf das Isocitrat, ist jedoch nicht darauf beschränkt, so lange sie in der Lage ist, mit dem Isocitrat zu reagieren, daß durch die Reaktion gebildet wird. Sie kann entweder für eine NAD-Gruppenverbindung oder für eine NADP-Gruppenverbindung spezifisch sein. Die Konzentration des hinzugefügten Enzyms beträgt 0,01-200 u/ml, vorzugsweise aber 0,1-20 u/ml. Zudem sind Magnesiumionen oder Manganionen für den Einsatz der Enzymaktivität der Isocitrat-Dehydrogenase und die Aconitase nötig, wobei die Konzentration eines Reagenz dieser Art 0,5 uM-100 nM, vorzugsweise aber 5 uM-10 mM beträgt.
Die NAD- und/oder NADP-Gruppenverbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können ein Alkoholniederschlag oder Kristalle einer freien Säure oder ein Salz mit einem alkalischen Metall, Ammonium, etc. sein und sollten eine hohe Reinheit haben, jedoch sind käuflich erwerbbare NAD- und NADP-Gruppenverbindungen wird die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet. Die NAD- und NADP-Grup penverbindungen, die für die Verwendung als Koenzyme für die Isocitrat-Dehydrogenase beim Verfahren nach vorliegender Erfindung verfügbar sind, enthalten natürlich NAD und NADP wie auch Thio-NAD und Thio-NADP. Es können weitere NAD- und NADP-Gruppenverbindungen, die mit der Isocitrat-Dehydrogenase reagieren können, beim Verfahren nach vorliegender Erfindung verwendet werden. Die Konzentration von Reagenzien dieser Art beträgt 0,01-100 mM, vorzugsweise jedoch 0,1-10 mM.
Die Pufferlösung für die Verwendung beim Schritt des Bindens von Eisen an die Aconitase und beim Schritt der Messung der Aconitaseaktivität ist nicht speziell festgelegt, und Beispiele enthalten einen PIPES-Puffer, einen Tris-Puffer, einen Triethanolamin-Puffer, einen Glycin-Puffer, einen GTA-Puffer, einen Phosphat-Puffer, einen Borat-Puffer, etc. Der optimale pH-Wert der Pufferlösung liegt im Bereich von 5-9, vorzugsweise aber 6-8, während die Konzentration des Reagenz 1-1.000 mlvi, vorzugsweise jedoch 10-500 mM beträgt.
Die Zusammensetzung für die Serumeisen-Messung nach vorliegender Erfindung enthält ein erstes Reagenz mit einem pH-Wert von 1-5 und vorzugsweise mit einem pH-Wert von 2-4, ein zweites Reagenz, das wenigstens 0,01-300 u/ml, vorzugsweise jedoch 0,1-30 u/ml Aconitase enthält und ein drittes Reagenz, das wenigstens 0,01-1.000 mM, vorzugsweise jedoch 0,1-100 mM Zitronensäure enthält. Ein Reduktionsreagenz, Isocitrat-Dehydrogenase, eine NAD- und/oder eine NADP-Gruppenverbindung sowie Magnesiumionen und Manganionen sind einem oder mehreren der drei Reagenzien hinzugefügt. Es empfiehlt sich, das Reduktionsreagenz dem ersten und zweiten Reagenz und die Iso citrat-Dehydrogenase, eine NAD- und/oder NADP-Gruppenverbindung sowie die Magnesium- oder Manganionen dem dritten Reagenz hinzuzufügen.
Weiterhin enthält die Zusammensetzung zum Messen von Serumeisen durch Messen der Aconitaseaktivität während zugelassen wird, daß sich das vom Transferrin gelöste Eisen im Serum an die Aconitase bindet nach vorliegender Erfindung ein erstes Reagenz mit einem pH-Wert von 1-5, vorzugsweise jedoch mit einem pH-Wert von 2-4, ein zweites Reagenz, das wenigstens 0,01-300 u/ml, vorzugsweise jedoch 0,1-30 u/ml Aconitase und 0,01-200 u/ml, vorzugsweise jedoch 0,1-20 u/ml Isocitrat- Dehydrogenase enthält. Ein Reduktionsreagenz, eine NAD- und/oder NADP-Gruppenverbindung, Magnesium- oder Manganionen sind entweder einem oder beiden Reagenzien hinzugefügt.
Nun folgt die Erläuterung eines enzymatischen Analyseverfahrens für ungesättigte Eisenbindungsfähigkeit nach vorliegender Erfindung.
Normalerweise ist das gesamte Serumeisen im Blut an Transferrin gebunden, und bei gesunden Menschen ist etwa ein Drittel des Transferrins mit Eisen gesättigt, während die verbleibenden zwei Drittel in einem ungesättigten Zustand verbleiben und nicht an Eisen gebunden sind. UIBC bezieht sich auf die Menge des nicht gesättigten Transferrins, das nicht an Eisen gebunden ist, und wird mit Begriffen hinsichtlich der Menge zur Bindung von Eisen ausgedrückt. Wie es hinreichend bekannt ist, wird die Summe von Serumeisen und UIBC totale Eisenbindungsfähigkeit (im folgenden bisweilen "TIBC" genannt) genannt. Es wurde bereits erwähnt, daß die Messung von Serumeisen bei medizinischen Untersuchungen wichtig ist, aber in Kombination mit einer Messung der UIBC ist es möglich, ein detaillierteres Verständnis des Krankheitszustandes zu erhalten. Die UIBC-Messung ist insbesondere bei der Diagnose der Eisenmangel-Anämie wirkungsvoll, bei der eine Bestätigung der Abnahme des Serumeisengehalts und des Anstiegs von UIBC/TIBC erfolgt. Da andere Krankheiten, wie etwa eine chronische Infektion und bösartige Tumore, die eine Abnahme des Serumeisens bewirken, zudem eine Abnahme von UIBC/TIBC verursachen, können diese somit auf einfache Weise von der Eisenmangel- Anämie unterschieden werden. Bei der aplastischen Anämie wird ein Anstieg des Serumeisens und eine Abnahme von UIBC/TIBC beobachtet. Die ausschließliche Messung von UIBC ist bei medizinischen Untersuchungen von großer Signifikanz, aber die Messung sowohl des Serumeisens wie auch der UIBC oder des Serumeisens und des TIBC liefert detailliertere Informationen und hat somit eine tiefere Aussagekraft.
Um das Verfahren nach vorliegender Erfindung zufriedenstellend durchzuführen, ist es zunächst nötig folgendes vorzubereiten: (1) eine stabile, alkalische Überschußeisenlösung bekannter Konzentration, um das Transferrin vollständig mit Eisen zu sättigen; (2) eine Eisenlösung, die das Transferrin vollständig mit Eisen kurz nach dem Mischen der Körperflüssigkeit mit der Eisenlösung sättigt, um für die Autoanalyse vorbereitet zu sein; und (3) eine Eisenlösung, die keine nicht-spezifische Adsorption des darin enthaltenen Eisens an anderen Substanzen als Transferrin verursacht.
Von den oben genannten Punkten ist (1) der schwierigste, da die inhärenten Eigenschaften von Eisen derart beschaffen sind, daß das Eisen stabil unter pH-sauren Bedingungen existieren kann, wie etwa in einer wasserhaltigen Lösung von Salpetersäure, Salzsäure, etc., aber unter leicht sauren bis alkalischen Bedingungen Eisenhydroxid bildet, was zu einer Sedimentierung oder Adsorption an den Geräten führt und somit Eisen nicht stabil bei einem pH-Wert existieren kann, der für die Bindung von Eisen an Transferrin günstig ist, wie beispielsweise ein pH-Wert von 7-10 und vorzugsweise 8-9. Gewöhnlich wird jedoch eine etwas stabile, zweiwertige Eisenverbindung (Ammonium-Eisen-(II)-Sulfat oder Eisen-II-Chlorid) einer dreiwertigen Eisenverbindung für die Verwendung in einer Pufferlösung aus Tris-Hydroxylmethylaminomethan (im folgenden "Tris" genannt) in Gegenwart eines Reduktionsreagenz, wie etwa Ascorbinsäure, etc. zum Stabilisieren vorgezogen. Ist dies dennoch unzureichend, kann Nitrilotriacetat hinzugefügt werden, und das Verfahren zur weiteren Verbesserung der Stabilität (japanische Patentanmeldung JP-B SHO 52- 9160) kann zum Verfähren nach vorliegender Erfindung angepaßt werden. Wie es in der japanischen Patentanmeldung JP-A HEI 2- 167476 zwar für einen anderen Zweck beschrieben wurde, ist es zudem wirkungsvoll, ein chelatbildendes Reagenz hinzuzufügen, wie beispielsweise Ethylendiamin-N,N'-Diacetylsäure, Hydroxyethylimino-Diacetylsäure, Nitrilo-Triacetylsäure, etc. In der japanischen Patentanmeldung JP-A- HEI 2-167476 gestattet das Hinzufügen dieser chelatbildenden Reagenzien die vollständige Sättigung des Transferrin mit Eisen, kurz nach Mischung einer zu testenden Probe mit der Eisenlösung, wodurch ebenfalls oben genannter Punkt (2) erfüllt wird.
Ein weiteres Verfahren zur Erfüllung von Punkt (2), das wirkungsvoll beim Verfahren nach vorliegender Erfindung angewendet werden kann, besteht in einem Verfahren, bei dem eine Hydroxysäure, wie etwa Glycolsäure, Milchsäure, α-Oxybutyrylsäure, Glycerinsäure, Tartronylsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure oder Mandelsäure als Puffer anstelle von Tris verwendet wird, um eine schnellere Sättigung des Transferrin zu erreichen als mit Tris (japanische Patentanmeldung JP-A SHO 60-69557). Zudem ist Punkt (3) essentiell, um eine nichtspezifische Adsorption von Albumin im besonderen zu vermeiden, wobei ein Verfahren bekannt ist, mit dem dies durch die Hinzugabe von beispielsweise einem Tensid vermieden wird (Japanische Patentveröffentlichung No. JP-A-2-156160 (1990)).
Das Hinzufügen eines Tensides, wie es in der japanischen Patentanmeldung JP-A HEI 2-156160 beschrieben wird, wurde als wirkungsvoll beim Verfahren nach vorliegender Erfindung bestätigt. Der pH-Wert der Tris- oder Hydroxysäure-Pufferlösung sollte im Bereich von 7-10 liegen, vorzugsweise jedoch 8-9 betragen, die Konzentration im Bereich von 1-1.000 mM, vorzugsweise jedoch bei 10-500 mM liegen, und die Konzentration des chelatbildenden Reagenz sollte derart beschaffen sein, daß es nicht die Bindung von Eisen an Transferrin verhindert und nicht die Bindung des freien Eisens an die Aconitase beendet. Die optimale Konzentration variiert in Abhängigkeit des chelatbildenden Reagenz, ist jedoch normalerweise 0,01-100 mM, vorzugsweise jedoch 0,1-10 mM. Die optimale Konzentration des Tensides variiert zudem in Abhängigkeit des verwendeten Typs, aber eine nicht-spezifische Adsorption wird beträchtlich durch die Hinzugabe desselben in einer Konzentration von 0,001-10%, vorzugsweise jedoch 0,01-5% unterdrückt.
Die Bindung von Eisen an die Aconitase erfordert das Vorhandensein eines Reagenz. Es ist einfach, die Bindung von Eisen an die Aconitase durch die Reduktionsfähigkeit eines bestimmten Reduktionsreagenz zu verursachen, das der Eisenlösung zur Stabilisierung dieses Eisens hinzugefügt wird, wobei es jedoch kein Problem mit der weiteren Hinzufügung des Reduktionsreagenz zur Aconitaselösung gibt. Wirkungsvolle ReduktionsReagenzien, die für die Verwendung zur Verfügung stehen, enthalten Ascorbinsäure, Thioglycolsäure, Thiomalat, Zystein, N-Acetylzystein, Hydroxylamin, 2-Mercaptoethanol, reduziertes Glutathion, Dithiothreitol, Dithioerythritol, 2-Aminoethylisothiouronium-Bromid und Thioglycerol, etc. wie auch jedes andere Reduktionsreagenz, das die Bindung von Eisen an der Aconitase unterstützt. Die Reagenzkonzentration beträgt 0- 1.000 mM, vorzugsweise jedoch 0,1-500 mM.
Es gibt keine speziellen Beschränkungen auf die Aconitase, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, so lange ihre Aktivität in Abhängigkeit der Zugabe und Nicht-Zugabe von Eisen variiert. Zudem kann eine Behandlung mit einem chelatbildenden Reagenz angewendet werden, um die Apo-Aconitase einzustellen. Wirkungsvolle chelatbildende Reagenzien umfassen Ethylendiamin-Tetraacetylsäuren, Hydroxyethylethylendiamin-Triacetylsäure, Zyklohexandiamin-Tetraacetylsäure, Diethylentriamin-Pentaacetylsäure, Glycoltherdiamin-Tetraacetylsäure, Triethylentetraamin-Hexaacetylsäure, Diaminopropanol- Tetraacetylsäure, O-Phenanthrolin, etc., aber es ist ein möglichst geringer Hintergrund vorzuziehen, dem kein Eisen hinzugefügt ist. Weiterhin kann die Ethylendiamin-Tetraacetylsäure ein Alkoholniederschlag oder Kristalle einer freien Säure oder ein Salz mit einem alkalischen Metall, wie etwa Ammonium etc. sein, wobei es keine spezielle Beschränkung gibt. In Fällen, in denen der Hintergrund selbst durch eine Behandlung mit einem chelatbildenden Reagenz nicht verkleinert werden kann, kann er mit cm-Sepharose® etc. wieder in reinen Zustand versetzt werden. Das Enzym wird mit einer Konzentration von 0,01-100 u/ml, vorzugsweise jedoch 0,1-30 u/ml hinzugefügt.
Die Isocitrat-Dehydrogenase, die verwendet wird, um die Aconitaseaktivität zu erfassen, hat vorzugsweise einen niedrigen Km-Wert im Bezug auf das Isocitrat, ist jedoch nicht darauf begrenzt, so lange sie im Stande ist, mit dem Isocitrat zu reagieren, das durch die Reaktion erzeugt wird. Sie kann entweder für NAD-Gruppenverbindungen oder für NADP-Gruppenverbindungen spezifisch sein. Die Konzentration des hinzugefügten Enzyms beträgt 0,01-200 u/ml, vorzugsweise jedoch 0,1-20 u/ml. Zudem sind Magnesium- oder Manganionen für die Anwendung der Enzymaktivität der Isocitrat-Dehydrogenase und der Aconitase notwendig, wobei die Konzentration eines derartigen Reagenz 0,5 uM-100 mM, vorzugsweise jedoch 5 uM-10 mM beträgt.
Die verwendeten NAD- und/oder NADP-Gruppenverbindungen können ein Alkoholniederschlag oder Kristalle einer freien Säure oder ein Salz mit einem alkalischen Metall, Ammonium etc. sein und sollten vorzugsweise eine hohe Reinheit haben, dennoch sind herkömmlich käuflich erwerbbare NAD- und NADP-Gruppenverbindungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet. NAD- und NADP-Gruppenverbindungen, die für die Verwendung beim Verfahren nach vorliegender Erfindung verfügbar sind, enthalten natürlich NAD und NADP wie auch Thio-NAD und Thio-NADP. Andere NAD- und NADP-Gruppenverbindungen, die mit der Isocitrat-Dehydrogenase reagieren können, können beim Verfahren nach vorliegender Erfindung Anwendung finden. Die Konzentration derartiger Reagenzien beträgt 0,01-100 mM, vorzugsweise jedoch 0,1-10 mM.
Die Zusammensetzung für eine UIBC-Messung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung enthält ein erstes Reagenz mit einem pH-Wert von 7-10, vorzugsweise jedoch mit einem pH-Wert von 8-9, das zumindest Eisen enthält, ein zweites Reagenz, das wenigstens 0,01-300 u/ml, vorzugsweise jedoch 0,1-30 u/ml Aconitase enthält, und ein drittes Reagenz, das wenigstens 0,01-1.000 mM, vorzugsweise jedoch 0,1-100 mM Zitronensäure enthält. Ein Reduktionsreagenz, Isocitrat-Dehydrogenase, eine NAD- und/oder eine NADP-Gruppenverbindung, Magnesium- oder Manganionen sind einem oder mehreren der drei Reagenzien hinzugefügt. Es empfiehlt sich, ein Reduktionsreagenz dem ersten und zweiten Reagenz und Isocitrat-Dehydrogenase, eine NAD- und/oder NADP-Gruppenverbindung, Magnesium- oder Manganionen dem dritten Reagenz hinzuzufügen. Die vorliegende Erfindung ist, wie oben erläutert, ein Analyseverfahren für UIBC, gekennzeichnet durch die Verwendung eines Enzyms im Reaktionssystem. Die vorliegende Erfindung bezieht sich zudem auf ein Reagenz und eine Meßvorrichtung.
Beispiele gemäß der vorliegenden Erfindung sind im folgenden aufgeführt.

Beispiel 1

Es wurden die Reagenzien R-1 und R-2 mit den unten in Tabelle 1 aufgeführten Zusammensetzungen vorbereitet.

Tabelle 1

Reagenz R-1:

50 mM Natriumacetat, pH-Wert 3,0
50 mM Ascorbinsäure
2 mM Natriumcitrat

Reagenz R-2:

100 mM PIPES-Puffer, pH-Wert 7,4
1,5 u/ml Aconitase
2,5 u/ml Isocitrat-Dehydrogenase
0,6 mM NADP&spplus;
0,6 mM Magnesiumsulfat

Analyseverfahren:

Die verwendete Standard-Eisenlösung war eine 0-60 uM-Ammoniumeisen-(II)-Sulfatlösung. 60 ul des Reagenz wurde 20 ul der Probe (Serumprobe und Standard-Eisenlösung) hinzugefügt, wobei die Mischung durchgerührt und bei einer Temperatur von 37ºC für fünf Minuten inkubiert wurde, worauf 200 ul des Rea genz R-2 dazu hinzugefügt, bei derselben Temperatur durchgerührt und 4 Minuten stehen gelassen wurde. Danach wurde der Grad der Absorptionsänderung während einer Minute mit einem Hitachi-7150-Autoanalysator gemessen. Der Grad der Absorptionsänderung von 0 uM der Ammonium-Eisen-(II)-Sulfatlösung wurde davon subtrahiert und eine Kurve gezeichnet. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. Wie aus Figur ·1 deutlich wird, erhielt man eine günstige Linearität vom Ursprung, wenn das Verfahren nach vorliegender Erfindung angewendet wurde.

Beispiel 2

Die Reagenzien sind jenen aus Tabelle 1 von Beispiel 1 identisch.

Analyseverfahren:

Das Analyseverfahren ist dasselbe wie bei Beispiel 1 und wurde angewendet, um Serumproben zu messen. Die Anzahl von "n" betrug 10. Zudem sind die Änderungskoeffizienten der Serumproben in Tabelle 2 gezeigt. Die CV-Werte der Serumproben waren günstige Werte von unter 3%, wie es in Tabelle 2 gezeigt ist. Tabelle 2

Beispiel 3

Die Messung der Serumeisen-Proben erfolgte sowohl mit dem vorliegenden Verfahren als auch mit einer Vorrichtung, die von Wako Junyaku hergestellt wird (Nitroso-PSAP-Direktverfahren Fe-Tr).
Die Reagenzien R-1 und R-2, die beim vorliegenden Meßverfahren verwendet wurden, waren dieselben wie jene, die in Beispiel 1 (Tabelle 1) verwendet wurden.

Meßverfahren:

Es wurde dasselbe Meßverfahren wie in Beispiel 1 zur Messung der Serumproben angewendet. Die Anzahl der Proben betrug 10. Wie aus Tabelle 3 ersichtlich wird, ist es möglich, eine präzise Messung des Serumeisens mit der vorliegenden Erfindung durchzuführen. Tabelle 3

Beispiel 4

Es wurden die Reagenzien R-1, R-2 und R-3 mit den unten in Tabelle 4 aufgeführten Zusammensetzungen vorbereitet. Tabelle 4

Reagenz R-1:

200 mM Natriumacetat, pH-Wert 3,0
200 mM Ascorbinsäure

Reagenz R-2:

150 mM PIPES-Puffer, pH-Wert 6,3
50 mM Ascorbinsäure
1 u/ml Aconitase

Reagenz R-3:

100 mM PIPES-Puffer, pH-Wert 7,4
1 mM Natriumcitrat
4 u/ml Isocitrat-Dehydrogenase
1 mM NADP&spplus;
1 mM Magnesiumsulfat

Analyseverfahren

Die verwendete Standard-Eisenlösung war eine 0-50 uM-Ammonium-Eisen-(II)-Sulfatlösung. Die gleiche Menge des Reagenz R-1 wurde einer Serumprobe und der Standard-Eisenlösung hinzugefügt und die Mischung umgerührt und in einen Probenbehälter gestellt. 20 ul der Mischung wurde 100 ul des Reagenz R-2 hinzugefügt und die daraus folgende Mischung umgerührt und bei einer Temperatur von 37ºC für fünf Minuten inkubiert, gefolgt von der Hinzugabe von 90 ul des Reagenz R-3. Als nächstes wurde die so entstandene Mischung bei derselben Temperatur weiter umgerührt und zwei Minuten stehen gelassen. Dann wurde der Grad der Absorptionsänderung während einer Minute mit einem Hitachi 7150-Autoanalysator gemessen. Die "n"-Anzahl betrug 15. Davon wurde der Grad der Absorptionsänderung einer 0-uM-Ammonium-Ferrosulfatlösung abgezogen und eine Kurve gezeichnet.
Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt. Wie unter Bezugnahme auf Fig. 2 verständlich wird, erhielt man eine günstige Linearität vom Ursprung, wenn das Verfahren nach vorliegender Erfindung verwendet wurde. Zudem sind die Änderungskoeffizienten der Serumproben und der Standard-Eisenlösung in Tabelle 5 gezeigt. Die CV-Werte der Serumproben und der Standard- Eisenlösung waren günstige Werte unter 3%, wie es in Tabelle 5 gezeigt ist. Tabelle 5

Beispiel 5

Jedes Reagenz wurde mit den Zusammensetzungen vorbereitet, die unten in Tabelle 6 aufgeführt sind, wobei die Messung unter Verwendung eines Autoanalysators gemäß der unten beschriebenen Vorgehensweise durchgeführt wurde. Tabelle 6

Vorgehensweise:

Das Reagenz-1'b und das Reagenz-1's wurden in den Verhältnissen 5 : 0, 4 : 1, 3 : 2, 2 : 3, 1 : 4 und 0 : 5 zusammengemischt und reines Wasser dazu in einem Verhältnis von 1 : 1/10 (Mischung zu Wasser) hinzugefügt, um die Proben für den Autoanalysator (Hitachi 7150) vorzubereiten. Sieben ul jeder Probe wurde dem Reagenz-2 (100 ul) hinzugefügt und eine Inkubation bei 37ºC für fünf Minuten durchgeführt. Daraufhin wurde das Reagenz-3 (NAD- oder NADP-System, 90 ul) hinzugefügt und eine Inkubation bei derselben Temperatur für zwei Minuten durchgeführt und die Anstiegsrate der Absorption bei 340 nm während einer Minute gemessen. Die Absorptionsänderung mit dem Reagenz-1'b und dem Reagenz-1's bei einem Verhältnis von 5 : 0 wurde als Blindwert definiert und die Differenz zwischen den Messungen jeder Probe und dem Blindwert graphisch aufgetragen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt.
Wie in Fig. 3 gezeigt, zeigte sich beim Verfahren nach vorliegender Erfindung eine günstige Linearität für einen UIBC- Wert von 0-190 uM.

Beispiel 6

Jedes Reagenz wurde mit den unten in Tabelle 7 aufgeführten Zusammensetzungen vorbereitet und die Messung unter Verwendung eines Autoanalysators gemäß der unten beschriebenen Vorgehensweise durchgeführt. Tabelle 7

Vorgehensweise:

Reagenz-1b und Reagenz-1s wurden mit dem gleichen Volumen dreier Serumtypen gemischt und die Mischung als Testprobe für den Autoanalysator (Hitachi 7150) verwendet. Zudem wurden Reagenz-1b und Reagenz-1s mit dem gleichen Volumen 0,9% NaCl gemischt, um eine Blind-Testprobe und eine Standardprobe für den Autoanalysator (Hitachi 7150) vorzubereiten. Fünf ul der Probe wurde dem Reagenz-2 (100 ul) hinzugefügt und eine Inkubation bei 37ºC für 5 Minuten ausgeführt. Anschließend wurde das Reagenz-3 (90 ul) hinzugefügt und die Inkubation weiter bei derselben Temperatur für zwei Minuten durchgeführt und anschließend die Anstiegsrate der Absorption bei 340 nm für eine Minute gemessen. Die Anstiegsrate der Absorption, die man aus der Mischung der Reagenz-1b mit einem gleichen Volumen 0,9%iger Kochsalzlösung erhielt, wurde als Blindwert definiert und eine Standardkurve mit Hilfe der UIBC gezeichnet, die durch Subtraktion des Blindwertes von der Anstiegsrate der Absorption errechnet wurde, die man aus der Mischung 0,9%iger Kochsalzlösung und einem gleichen Volumen des Reagenz-1s erhielt. Für die Testproben wurde die Anstiegsrate der Absorption, die man durch Zugabe des Reagenz-1b zum Serum erhielt, als Blindwert von der Anstiegsrate der Absorption abgezogen, die man durch Zugabe des Reagenz-1s zum Serum erhielt, wobei auf die Standardkurve Bezug genommen wurde. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt. In dieser Zeichnung sind die Serumorte mit Pfeilen gekennzeichnet.
Wie in Fig. 4 gezeigt, wurden drei Typen von Serum-UIBC unter Verwendung des Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung bestimmt, wobei diese mit 4, 5 uM, 13,4 uM bzw. 18,3 uM ermittelt wurden.

Claims

1. Verfahren zur Messung der Menge an Eisen in einer Serumprobe, umfassend das Freisetzen von Eisen in der genannten Serumprobe, die Zugabe einer effektiven Menge Aconitase zur Bindung des freigesetzten Eisens an Aconitase zur Probe und die Messung der sich ergebenden Aconitaseaktivität.

2. Enzymatisches Analyseverfahren für Serumeisen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Eisen von Transferrin freigesetzt wird bei einem sauren pH, bei dem Eisen am Serum gebunden ist.

3. Enzymatisches Analyseverfahren für Serumeisen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Reduktionsmittel zur Bindung des aus Transferrin, an das Eisen im Serum gebunden ist, freigesetzten Eisens an Acotinase verwendet wird.

4. Enzymatisches Analyseverfahren für Serumeisen gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Reduktionsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Ascorbinsäure, Thioglycolsäure, Thiomalat, Cystein, N-Acetylcystein, Hydroxylamin, 2-Mercaptoethanol, reduziertes Glutathion, Dithiothreitol, Dithioerythrit, 2-Aminoethylisothiuroniumbromid und Thioglycerin besteht.

5. Enzymatisches Analyseverfahren für Serumeisen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Serumeisen- Level durch Feststellung der Aconitaseaktivität unter Verwendung von Isocitratdehydrogenase gemessen wird.

6. Enzymatisches Analyseverfahren für Serumeisen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nicotinamid-adenin-dinucleotid-Klassenverbindung und/oder eine Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat- Klassenverbindung als Coenzym für Isocitratdehydrogenase verwendet wird.

7. Reagenz für die Messung von Serumeisen, das wenigstens aus Aconitase, einem Reduktionsmittel, Citronensäure, Isocitratdehydrogenase und einer Nicotinamid-adenindinucleotid-Klassenverbindung (oder einer Nicotinamidadenin-dinucleotidphosphat-Klassenverbindung) besteht.

8. Reagenz für die enzymatische Messung von Serumeisen, wobei das Reagenz Aconitase enthält und einen sauren pH aufweist.

9. Reagenz für die enzymatische Messung von Serumeisen gemäß Anspruch 8, wobei der saure pH 1-5, bevorzugt 252-4, ist.

10. Reagenz für die enzymatische Messung von Serumeisen, wobei das Reagenz Aconitase und ein Reduktionsmittel enthält.

11. Reagenz für die enzymatische Messung von Serumeisen gemäß Anspruch 10, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Reduktionsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Ascorbinsäure, Thioglycolsäure, Thiomalat, Cystein, N-Acetylcystein, Hydroxylamin, 2-Mercaptoethanol, reduziertes Glutathion, Dithiothreitol, Dithioerythrit, 2-Aminoethylisothiuroniumbromid und Thioglycerin besteht.

12. Reagenz für die enzymatische Messung von Serumeisen gemäß Anspruch 10, wobei das Reduktionsmittel bei einer Reagenzkonzentration von 0-1000 mM, bevorzugt 0-500 mM verwendet wird.

13. Reagenz für die enzymatische Messung von Serumeisen gemäß Anspruch 7, wobei Aconitase bei einer Enzymkonzentration von 0,01-300 u/ml, bevorzugt 0,1- 30 u/ml, verwendet wird.

14. Reagenz für die enzymatische Messung von Serumeisen gemäß Anspruch 7, wobei Isocitratdehydrogenase bei einer Enzymkonzentration von 0,01-200 u/ml, bevorzugt 0,1-20 u/ml, verwendet wird.

15. Reagenz für die enzymatische Messung von Serumeisen gemäß Anspruch 7, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Nicotinamid-adenin-dinucleotid-Klassenverbindung und/oder eine Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat- Klassenverbindung als ein Coenzym für Isocitratdehydrogenase verwendet wird.

16. Reagenz für die enzymatische Messung von Serumeisen gemäß Anspruch 15, wobei das Coenzym bei einer Reagenzkonzentration von 0,01-100 mM, bevorzugt 0,1- 10 mM, verwendet wird.

17. Reagenz für die enzymatische Messung von Serumeisen, das umfaßt ein erstes Reagenz bei einem pH 1-5, bevorzugt bei pH 2-4, ein zweites Reagenz, das wenigstens 0,01-300 u/ml, bevorzugt 0,1-30 u/ml, 35 Aconitase enthält und ein drittes Reagenz, das wenigstens 0,01-1000 mM, bevorzugt 0,1-100 mM Citronensäure enthält.

18. Reagenz für die enzymatische Messung von Serumeisen, 5 das umfaßt ein erstes Reagenz bei einem pH 1-5, bevorzugt bei pH 2-4, ein zweites Reagenz, das enthält wenigstens 0,01-300 u/ml, bevorzugt 0,1-30 u/ml, Aconitase und 0,01-200 u/ml, bevorzugt 0,1-20 u/ml Isocitratdehydrogenase.

19. Enzymatisches Analyseverfahren zur Bestimmung der latenten (ungesättigten) Eisenbindungskapazität, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Schritt der Zugabe von einem Überschuß Eisen zu einer Versuchsserumprobe zur Bewirkung der Bindung des Eisens an Transferrin in der Versuchsprobe, einen Schritt der Bindung des verbleibenden ungebundenen Eisens an Aconitase und einen Schritt der Messung der Aconitaseaktivität umfaßt.

20. Enzymatisches Analyseverfahren für die latente (ungesättigte) Eisenbindungskapazität gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß eine Chelatbildnerverbindung während des Schritts der Bindung des Eisens an Transferrin zugegeben wird.

21. Enzymatisches Analyseverfahren für die latente (ungesättigte) Eisenbindungskapazität gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß ein oberflächenaktiver Stoff während des Schritts der Bindung des Eisens an Transferrin zugegeben wird.

22. Enzymatisches Analyseverfahren für die latente (ungesättigte) Eisenbindungskapazität gemäß einem der Ansprüche 19-21, dadurch gekennzeichnet, daß die latente (ungesättigte) Eisenbindungskapazität durch Bestimmung der Aconitaseaktivität unter Verwendung von Isocitratdehydrogenase gemessen wird.

23. Enzymatisches Analyseverfahren für die latente (ungesättigte) Eisenbindungskapazität gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nicotinamidadenin-nucleotid-Klassenverbindung und/oder eine Nicotinamid-adenin-nucleotidphosphat-Klassenverbindung als Coenzym für Isocitratdehydrogenase verwendet wird.

24. Analyseausrüstung zur Analyse der latenten (ungesättigten) Eisenbindungskapazität einer Körperflüssigkeitsprobe, umfassend Reagenz 1, das Eisen in Form eines eisenhaltigen Salzes enthält und einen pH von 7-10 hat, Reagenz 2, das 0,01-300 u/ml Aconitase enthält, und Reagenz 3, das 0,01-1000 mM Citronensäure enthält, wobei eines oder mehrere der drei Reagenzien weiter ein Reduktionsmittel, Isocitratdehydrogenase, eine NAD- und/oder NADP-Klassenverbindung und Magnesiumionen oder Manganionen enthält.

25. Analyseausrüstung zur Analyse der latenten (ungesättigten) Eisenbindungskapazität einer Körperflüssigkeitsprobe gemäß Anspruch 24, wobei Reagenz 1 einen pH von 8-9 hat, Reagenz 20,1-30 u/ml Aconitase enthält und Reagenz 30,1-100 mM Citronensäure enthält.

26. Analyseausrüstung zur Analyse der latenten (ungesättigten) Eisenbindungskapazität einer Körperflüssigkeitsprobe gemäß einem der Ansprüche 24 oder 25, wobei

Reagenz 1 und/oder Reagenz 2 das Reduktionsmittel enthält und

Reagenz 3 Isocitratdehydrogenase, die NAD- und/oder NADP-Klassenverbindung und Magnesiumionen oder Manganionen enthält.

27. Analyseausrüstung zur Analyse der latenten (ungesättigten) Eisenbindungskapazität einer Körperflüssigkeitsprobe gemäß Anspruch 26, wobei das Reduktionsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Ascorbinsäure, Thioglycolsäure, Thiomalat, Cystein, N-Acetylcystein, Hydroxylamin, 2-Mercaptoethanol, reduziertes Glutathion, Dithiothreitol, Dithioerythrit, 2-Aminoethylisothiuroniumbromid und Thioglycerin besteht.