DE69223289T2

DE69223289T2 - Einstufentest für aspartat-aminotransferase

Info

Publication number: DE69223289T2
Application number: DE69223289T
Authority: DE
Inventors: Paul Maupin
Original assignee: Xytronyx Inc
Current assignee: Xytronyx Inc
Priority date: 1991-01-31
Filing date: 1992-01-31
Publication date: 1998-05-20
Anticipated expiration: 2012-02-01
Also published as: DE69223289D1; JP2509429B2; AU1376292A; CA2079321A1; KR937000679A; JPH05509002A; WO1992013966A1; KR960007744B1; US5834226A; ATE160590T1; EP0523227B1; AU655971B2; EP0523227A1; EP0523227A4

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Testkits zur Identifizierung von Erkrankungen bei Säugern, die mit erhöhten Spiegeln des Enzyms Aspartataminotransferase (AST) verbunden sind. Insbesondere ist die Erfindung auf den Nachweis von Krankheitszuständen beim Menschen wie Herz-, Leber- und Zahnwurzelhauterkrankungen anwendbar.

Hintergrund

Mehrere Herz- und Lebererkrankungen wurden in Zusammenhang mit abnormal hohen Spiegeln an Serum-AST gebracht. Beispiele für solche Zustände umfassen akuten Myokardinfarkt, Lungenembolie, akute Pankreatitis, virale und toxische Hepatitis und akute Zirrhose. Allgemein ausgedrückt ist die AST bei Erkrankungen, die AST-reiche Gewebe betreffen, erhöht.
Ausgedehnte Untersuchungen zeigten, daß 92 bis 98 % der Patienten mit einem akuten Myokardinfarkt erhöhte Serum-AST-Spiegel haben. Die gemessenen Werte entsprechen üblicherweise dem 4- bis 10fachen der Obergrenze der normalen Werte. Die erhöhten AST-Werte entwickeln sich 6 bis 12 h nach dem Zeitpunkt des Infarkts und kehren üblicherweise am dritten oder vierten Tag auf den Normalwert zurück. Sekundäranstiege können mit anderen Eigenschaften im Zusammenhang gebracht werden, was eine Verlängerung oder ein Rezidiv des Myokardinfarkts nahelegt. Ebenso wurden bei Patienten mit Lungeninfarkt leichte Erhöhungen der Serum-AST-Spiegel beschrieben. Bei Patienten mit dekompensierter Herzinsuffizienz und solchen mit ausgeprägter Tachykardie kann eine geringe bis mäßige Erhöhung des AST-Spiegels eintreten. Diese wurde auf eine Lebernekrose als Folge einer Leberstauung zurückgeführt. Es wurde auch beschrieben, daß Perikarditispatienten eine 50%ige Inzidenz leicht erhöhter AST-Werte haben.
Ausgeprägte Erhöhungen der AST-Spiegel werden im Serum von fast allen Patienten mit akuter Lebernekrose beobachtet. Bei Patienten mit Leberzirrhose besteht eine 60- bis 70%ige Inzidenz erhöhter AST-Spiegel. Offensichtlich kann der frühe Nachweis eines abnormalen Anstiegs der AST-Spiegel zu einer rascheren und genaueren Diagnose einer Herz- und Lebererkrankung führen.
Erhöhte AST-Spiegel wurden im Zusammenhang mit verschiedenen Krebsformen gebracht. Etwa die Hälfte der Patienten mit metastasierenden Karzinomen haben erhöhte Serum-AST-Spiegel im gleichen Bereich wie Patienten mit Zirrhose und posthepatischer Gelbsucht. Weniger häufig werden solche mäßig erhöhten AST-Spiegel bei Lymphom- und Leukämiepatienten beobachtet, vgl. Todd-Sanford, Clinical Diagnosis By Laboratory Methods, W.B. Saunders Co., 14. Aufl., S.693-723 (1969).
Erhöhte AST-Spiegel wurden auch in Zusammenhang mit aktiver Zahnwurzelhauterkrankung gebracht. Zahnwurzelhauterkrankungen sind entzündliche Zustände mikrobieller Ätiologie, die die die Zahnstützgewebe befallen. Typischerweise umfassen Zahnwurzelhauterkrankungen zwei Hauptunterklassen von Erkrankungen, die Gingivitis und die Periodontitis. Gingivitis ist durch eine Entzündung des Zahnfleisches ohne Knochen- und Befestigungsverlust gekennzeichnet. Periodontitis gilt allgemein als ein fortgeschrittenes Stadium einer Gingivitis und ist weiter durch die Bildung von periodontalen Taschen zwischen Zahnfleischgewebe und Zahn gekennzeichnet. Schwere Fälle von Periodontitis sind mit Knochenverlust vom Zahn und einer Schwächung der Zahnbefestigung, die schließlich zu Zahnverlust führt, gekennzeichnet. Die häufigste Form der Periodontitis bei amerikanischen Erwachsenen ist die chronische entzündliche Periodontitis (CIPD) und ist durch einen Verlust der Befestigung des Periodontalligaments an dem Zement, eine apikale Wanderung des Saumepithels und einen Verlust des Alveolarknochens gekennzeichnet. Sowohl Gingivitis als auch Periodontitis sind weiter durch eine Anreicherung der krevikulären Flüssigkeit (ein Serumtranssudat) an der Verbindung zwischen Zahn und Zahnfleisch gekennzeichnet.
Gegenwärtig verfügbare Methoden zur Identifizierung von Zahnwurzelhauterkrankungen sind in hohem Maße subjektiv und umfassen Kriterien, wie Bluten bei vorsichtiger Untersuchung, Taschentiefe, Befestigungsverlust und den radiographischen Nachweis des Knochenverlusts. Es ist allgemein anerkannt, daß diese klinischen Indikatoren mit Ausnahme des Blutens bei Untersuchung leider eine vergangene Erkrankung und vorherige Schädigung statt einer aktiven Erkrankung widerspiegeln. Ferner wurde der diagnostische Wert des Blutens bei Untersuchung in Frage gestellt, siehe Haffajee, A.D., et al., J. Clin. Perio. 10:257-265 (1983).
Andere Methoden wurden zur Diagnose von Zahnwurzelhauterkrankungen vorgeschlagen. Weil sowohl Gingivitis als auch Periodontitis durch eine Anreicherung und einen Fluß der krevikulären Flüssigkeit an der Zahnfleischfürche und an den Zahnfleischtaschen gekennzeichnet sind, wurde die Volumenmessung der krevikulären Flüssigkeit, die an dieser Stelle vorhanden ist, zur Diagnose für eine Zahnwurzelhauterkrankung vorgeschlagen. Beispielsweise mißt ein Gerät mit der Bezeichnung Periotron (Harco Electronics Ltd., Winnipeg, Kanada) das Volumen der durch kleine, in den Krevikularraum zwischen Zahn und Zahnfleisch eingeführte Streifen aus porösem Papier (Periopaper) absorbierten Flüssigkeit.
Nach den vorstehenden Beobachtungen, daß AST-Spiegel mit verschiedenen Erkrankungszuständen korrelieren, wurden verschiedene Tests auf AST vorgeschlagen. Diese Tests betreffen typischerweise die chemische Derivatisierung von Oxalacetat, ein Produkt der AST-katalysierten Umsetzung von Aspartat (Asp) mit 2-Ketoglutarat:
Asp + 2-Ketoglutarat < > Oxalacetat + Glutamat
Folglich schlägt die EPA-Anmeldung Nr. 151 536 analytische Verfahren vor, wie
(i) Bildung des stark gefärbten 2,4-Dinitrophenylhydrazon (DNP)-derivats von Oxalacetat; (ii) Bildung des DNP-Derivats von Pyruvat, das durch die Reaktion von Oxalacetat mit Anilincitrat gebildet wird; (iii) Umwandlung von Oxalacetat in Malat in Gegenwart von Malatdehydrogenase und NADH, wobei die Geschwindigkeit des Verschwindens von NADH spektrophotometrisch verfolgt wird (vgl. auch US-Patent 4 059 407, erteilt an Hochstrasser); und (iv) immunologischer Test auf AST, wobei Anti- AST-Antikörper verwendet werden, die einen AST-Antikörperkomplex bilden, der aus der Lösung ausgefällt werden kann.
Jedoch besitzen die vorstehenden Methoden mehrere Nachteile. Verfahren unter Verwendung von DNP benötigen typischerweise lange Inkubationszeiten, und die Anreicherung von Oxalacetat neigt dazu, die ablaufende Reaktion zu hemmen. Das NADH-Verfahren kann visuell nicht verfolgt werden und benötigt die Verwendung eines Spektrophotometers. Ferner wurde geffinden, daß NADH signifikant die AST-Aktivität stört. Schließlich benötigt das immunologische Testverfahren die Verwendung von teuren und in hohem Maße selektiven AST-Antikörpern.
Ein zum Nachweis von AST in Seren vorgeschlagenes Verfahren verwendet ein farbloses Diazoniumsalz in einer Reaktion mit Oxalacetat, wobei ein gefärbtes Produkt erhalten wird, vgl. beispielsweise US-Patent 3 875 014, erteilt an Forgione. Die Reaktion von Oxalacetat mit Diazoniumsalzen ist im allgemeinen schneller als mit DNP. Jedoch reagiert das Diazoniumsalz mit AST, wodurch das Enzym inaktiviert wird. So muß die Reaktion mit dem Substrat vor der Reaktion zur Farbentwicklung unter Verwendung des Diazoniumsalzes durchgeflährt werden. Alternativ können die Substratreagenzien physikalisch von dem Indikator getrennt werden, bis die AST-Probe getestet wird. Beispielsweise werden bei dem Verfahren gemäß dem US-Patent 3 875 014 zwei aneinanderhaftende Teststreifen verwendet, so daß eine AST-haltige Probe dem sauren Streifen exponiert wird, auf dem sie mit L-Aspartat und 2-Ketoglutarat unter Erhalt von Oxalacetat reagiert. Das Oxalacetat diffundiert zusammen mit nichtumgesetzter AST und Substrat in den Indikatorstreifen, in dem die Reaktion mit der Diazoverbindung stattfindet. Es ist klar, daß man mit diesem Verfahren erwartungsgemäß nur teilweise die Störungen vermeidet, die in den Tests aufgrund der Reaktion von AST mit der Diazoverbindung eingebracht wurden.
Das US-Patent Nr.4 801 535, erteilt an Babler et al., beschreibt auch ein Verfahren zum Nachweis von AST unter Verwendung von Diazoniumsalzen. Bei diesem Verfahren wird die Modifikation der Reaktionsbedingungen sowohl der Säure als auch der Indikatorlösungen vorgeschlagen, so daß keine visuell nachweisbaren gefärbten Produkte in Anwesenheit von unter einem Schwellenwert liegenden AST-Werten beobachtet werden. Da jedoch der Diazoniumsalzindikator die AST-Aktivität hemmt, ist es wiederum notwendig, den Indikator und die AST-haltige Probe bis zur Vollendung der Reaktion mit dem Substrat physikalisch getrennt zu halten. Folglich müssen die Ergebnisse der Analyse subjektiv interpretiert werden.
Angesichts der Probleme im Zusammenhang mit analytischen Verfahren, bei denen DNP oder Diazoniumfarbstoffe verwendet werden, sind alternative Verfahren zur Bestimmung von AST erwünscht. Ein Ansatz ist in der Arbeit von Recasens, M., et al., Biochemistry, 19, 4563 (1980), vorgeschlagen, die beschreiben, daß AST mit Cysteinsulfinataminotransferase identisch ist. Diese Beobachtung legte die Verwendung von L-Cysteinsulfinsäure (CSA) als Substrat anstelle von L-Aspartat in Tests auf AST nahe. Wenn CSA als Substrat in Gegenwart von 2-Ketoglutarat verwendet wird, katalysiert AST die Umwandlung von CSA in β-Sulfinylpyruvat, das sich nichtenzymatisch in Pyruvat und ein Sulfition zersetzt:
Direkte Testtechniken wurden zur Bestimmung von AST unter Verwendung von CSA als Substrat vorgeschlagen. Solche Techniken betreffen die direkte Überwachung des Substrats oder der Produkte ohne Zwischenschaltung irgend eines anderen Reagenzes. Jedoch ist eine autwendige Apparatur notwendig, um eine derartige direkte Beobachtung der beteiligten Teilchen zu erlauben. Ein solches Verfahren ist in dem japanischen Patent 62272998 zur Bestimmung von Mitochondrien-AST beschrieben.
Ein einfacheres Verfahren, das zur Bestimmung von AST unter Verwendung eines CSA-Substrats vorgeschlagen wurde, betrifft die Kopplung der enzymatischen Reaktion mit einer nichtenzymatischen Reaktion, die ein leicht nachweisbares Produkt erzeugt, beispielsweise ein fluoreszierendes Produkt. Ein derartiges Verfahren schlägt die Reaktion der Sulfition-Produktspezies als Ergebnis der Reaktion von AST mit CSA mit einem fluoreszierenden Reagenz wie N-9-Acrylidinylmaleimid (NAM) vor, Akasaka, K., et al., Anal. Lett., 18(133), 357-68 (1985). Es wird berichtet, daß dieses Verfahren in hohem Maße empfindlich ist, aber eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie sowie ein Fluorimeter benötigt, um die Reaktion zu überwachen, vgl. auch japanisches Patent 60188099.
Ein weiteres Verfahren zur Bestimmung von AST unter Verwendung von CSA als Substrat schlägt die Verwendung eines kolorimetrischen Indikators, Nitroblautetrazolium, in Gegenwart eines Kupplungsreagenzes, Phenazinmethosulfat, vor, Yagi, T., et al., Anal. Biochem., 110, 146-49 (1981). Das Phenazinmethosulfat dient als ein Elektronentransfermediator zur Katalyse der Reduktion des Indikators. Nach der Bildung gefärbter Formazanprodukte wird Essigsäurelösung verwendet, um die Reaktion zu löschen, und ein Dünnschichtchromatographie-Scanner mit zwei Wellenlängen wird verwendet, um die Enzymaktivität quantitativ zu bestimmen. Daher wird ein Mehrstufenverfahren mit aufwendiger Apparatur ebenfalls benötigt. Auch sind die verwendeten Elektronentransfermediatoren gegenüber Licht und Luft empfindlich.
Leinweber und Monty, Methods in Enzymology 143:160-163 (1987) beschreiben einen Test zur Bestimmung der CSA-Menge in einer Probe durch Umsetzung mit AST und α-Ketoglutarat. Die Reaktion wird durch Zugabe von KOH und dann HgCl&sub2; beendet, und die Lösung wird zentrifugiert, um eine klare Schicht zu erhalten, die dann mit Fuchsin umgesetzt wird.
Es besteht eindeutig ein Bedarf nach einem einfachen und schnelleren Verfahren zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung der Anwesenheit von AST in Seren und krevikulärer Flüssigkeit Ein solches Verfahren sollte mit Testkits, die mit dem Auge ablesbar sind, kompatibel sein, d.h. es sollte die Verwendung eines Spektrophotometers nicht benötigen. Das Verfahren sollte frei von Störungen durch Verunreinigungen in den untersuchten Flüssigkeiten sein. Am signifikantesten sollten das Verfahren und die dazu gehörigen Kits keine subjektive Bewertung durch den Verwender erforderlich machen, so daß relativ ungeschulte Personen die benötigten Tests zuhause oder im Büro unter minimaler Überwachung ausführen können.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verfahren und Kits zur Durchführung von Tests an biologischen Geweben und Flüssigkeiten mit erhöhten Spiegeln an Aspartataminotransferase (AST). Es wurde gezeigt, daß erhöhte AST-Spiegel mit einer Reihe von Erkrankungen bei Säugern, wie Zahnwurzelhauterkrankungen, Herzerkrankungen und Leberzirrhose, verbunden sind. So können die erfindungsgemäßen Verfahren und die erfindungsgemäßen Kits zur Identifizierung dieser Erkrankungen beim Menschen verwendet werden. Wenn eine Zahnwurzelhauterkrankung nachgewiesen werden soll, wird eine krevikuläre Flüssigkeitsprobe des Patienten untersucht, und wenn eine Krankheit, die ein Körperorgan betrifft, nachgewiesen werden soll, wird eine Körperfiüssigkeitsprobe untersucht.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Körperfiüssigkeitsprobe eines Säugers mit einem vorgewählten Substrat für AST und einem vorgewählten Indikator unter vorbestimmten Reaktionsbedingungen in Kontakt gebracht. Der Indikator wird so ausgewählt, daß er im wesentlichen sowohl mit AST als auch dem Substrat unter den Reaktionsbedingungen nicht reagiert. In Anwesenheit von AST wird mindestens ein Teil des Substrats in eine Produktspezies umgesetzt, die mit dem Indikator reagiert, so daß eine Signalspezies erzeugt wird. Die Menge der im Verlauf der Reaktion gebildeten Signalspezies wird bestimmt, die in Beziehung zu der AST-Menge in der Probe steht.
Das vorgewählte Substrat ist Cysteinsulfinsäure (CSA). Die Wirkung von AST auf CSA unter den Reaktionsbedingungen bewirkt die Bildung eines Sulfitions, das anschließend nachgewiesen wird.
Die Bildung eines Sulfitionprodukts wird visuell durch seine Umsetzung mit einem gefärbten Triarylmethlnfarbstoff überwacht. Geeignete Farbstoffe umfassen Malachitgrün, Methylgrün, Guineagrün B, Ethylviolett, saures Fuchsin, basisches Fuchsin, Pararosanilinchlorid, Pararosanilinacetat und Aurinnatriumsalz. Die Ergebnisse des AST- Tests korrelieren mit dem Vorliegen und der Schwere der Erkrankung in den befallenen Geweben.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann weiterhin die Messung der anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeit des Indikators mit einem Produktteilchen umfassen, wenn die Geschwindigkeit der Produktbildung mit der AST-Konzentration in der Flüssigkeitsprobe korreliert. In einer anderen Ausführungsform erlaubt das Verfahren, daß die Reaktion vollständig abläuft und dann bestimmt wird, ob die Indikatorantwort einen vorher definierten Schwellenwert überschreitet. Wenn die Indikatorantwort einen solchen "Endpunkt" überschreitet, wird ein positiver Befünd eines erhöhten AST-Spiegels mit gleichzeitiger Indikation einer aktiven Erkrankung in dem untersuchten Gewebe angegeben.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Testkits zur Identifizierung von Erkrankungen im Zusammenhang mit AST, z.B. Herz- oder Lebererkrankungen, beim Menschen. Ein erfindungsgemäßer Kit umfaßt eine gepufferte wäßrige Cysteinsulfinsäurelösung (CSA) als Substrat für AST. Ein Kit umfaßt auch eine Testplatte mit vielen Vertiefüngen, die jeweils ein Volumen definieren, das ausreichend ist, einen festen Indikatorträger und einen Teil der CSA-Lösung aufzunehmen, die ausreicht, mindestens einen Test durchzuführen, d.h. einen Test, bei dem ein Indikatorträger verwendet wird. Ein Kit kann auch eine Vielzahl von festen Indikatorträgern umfassen, bei denen ein Triarylmethinfarbstoff an eine feste Matrix fixiert ist, wobei der Farbstoff mit dem Sulfition reagiert, aber im wesentlichen sowohl mit CSA als auch AST nicht reagiert.
Ein Kit kann auch Mittel zur Gewinnung von Testflüssigkeiten aus dem Patienten wie im Handel erhältliches Periopaper umfassen. Die gewonnene Flüssigkeit wird mit der CSA in Anwesenheit des Farbstoffs in Kontakt gebracht. Sichtbare Veränderungen der optischen Dichte des Farbstoffs korrelieren mit der Schwere der Erkrankung des Patienten. Bevorzugte Medien zur Abgabe des Farbstoffs umfassen imprägierte Polymerfilme und saugfähige Materialien, wie Filterpapier.
Ein erfindungsgemäßer Kit umfaßt ggf ein Farbkontrastmittel, das neben dem Farbstoff vorhanden ist oder mit ihm vermischt wird, um den sichtbaren Kontrast des Mittels zu verstärken. Wenn der ausgewählte Farbstoff eine Malachitgrünverbindung ist ist ein geeignetes Farbkontrastmittel Rhodamin B.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Testkits umfassen ein Netzmittel, um den quantitativen Transfer der gewonnenen Flüssigkeit in das Testmedium zu unterstützen. Auch umfassen die Testkits üblicherweise einen Chelatbildner, wie Ethylendiamintetraacetat (EDTA), um Störungen durch Metallionen in der Lösung zu verhindern. Noch weiter bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Kits umfassen ein Ketoglutaratsalz im Gemisch mit der CSA als Akzeptorsubstrat. Auch können die Kits eine Zinksalzverbindung im Gemisch mit dem Indikator umfassen, um die Verwendungsdauer des Indikators zu verlängern.
Die erfindungsgemäßen Verfahren und Kits erlauben so vereinfachte und dennoch empfindliche Testanordnungen zur AST-Bestimmung. Der Test kann leicht als Teststreifen oder Indikatorfilm ausgearbeitet sein. Die Verfahren können rasch von relativ ungeschulten Personen unter Verwendung von tragbaren mit dem Auge ablesbaren Testkits sowie Standard-Kolorimeter- oder Reflektometervorrichtungen durchgeführt werden. Weil die erfindungsgemäßen Verfahren und Kits Analysen auf AST ergeben, die objektiver sind als die im Stand der Technik vorgeschlagenen Techniken, wird die Wahrscheinlichkeit von falsch-negativen oder falsch-positiven Angaben signifikant reduziert.
Die vorstehend beschriebenen neuen Verfahren und Kits werden aus der folgenden Diskussion, die spezielle Beispiele der Erfindung umfaßt, und den beigefügten Patentansprüchen besser verstanden werden.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Ein erfindungsgemäßes Verfahren betrifft die Bestimmung des AST-Spiegels in einer Körperflüssigkeitsprobe eines Säugers. Die Flüssigkeitsprobe kann krevikuläre Flüssigkeit, Serum oder eine einem speziellen Organ entnommene Flüssigkeit, z.B. Zerebrospinalflüssigkeit, sein. Die Körperflüssigkeitsprobe wird mit einem vorgewählten Substrat (CSA) für AST und einem vorgewählten Indikator (Triarylmethinfarbstoff) unter vorbestimmten Reaktionsbedingungen in Kontakt gebracht. Der Indikator wird so ausgewählt, daß er im wesentlichen sowohl mit AST als auch dem Substrat unter den gewählten Reaktionsbedingungen nicht reagiert. Ein Indikator ist "im wesentlichen nicht reaktiv" mit einer anderen Komponente der vorliegenden Erfindung, wenn die nachgewiesene physikalische Eigenschaft, z.B. die Farbe, des Indikators in Gegenwart der Komponente unter den Reaktionsbedingungen des Tests nicht wesentlich verändert wird. Jedoch wird in Anwesenheit von AST mindestens ein Teil des Substrats in ein Produktteilchen umgewandelt, das mit dem Indikator reagiert. Eine Antwort auf das Produktteilchen durch den Indikator wird im Reaktionsverlauf beobachtet, und das so bestimmte Ausmaß der Indikation kann mit einem vorbestimmten Stadium der Erkrankung korreliert werden.
Das Enzym Aspartataminotransferase [AST; EC 2.6.1.1; L-Aspartat:2- Oxoglutarataminotransferase](auch bekannt als Glutamat-Aspartattransaminase, Glutamat- Aspartataminotransferase, Glutamat-Aspartataminopherase, Glutamat-Oxalacetattransaminase, GOT, G.O.T. oder GO-T) (nachstehend als AST bezeichnet) katalysiert die Reaktion von L-Aspartat mit 2-Ketoglutarat unter Erhalt von Oxalacetat und Glutamat. Pyridoxalphosphat wird als prosthetische Gruppe benötigt.
AST kommt sowohl in den Mitochondrien als auch dem Cytosol eukaryontischer Zellen vor. Die mitochondrialen und extramitochondrialen Formen von AST unterscheiden sich in ihren physikalischen und chemischen Eigenschaften und der Aminosäurezusammensetzung, d.h. sie sind Isozyme. Beide Formen haben ein Molekulargewicht von etwa 90.000 Dalton und bestehen aus zwei Untereinheiten mit annähernd gleicher Größe.
Die Bestimmung der Fraktionen der cytosolischen und der mitochondrialen AST ist für die klinische Diagnose von Hepatitis, eines Myokardinfarkts etc. nützlich. Die Freisetzung von AST in den Blutstrom in erhöhten Mengen tritt vermutlich nach dem Zelltod infolge des Erkrankungszustands ein.
AST ist an einer Vielzahl von katabolischen und anabolischen Stoffwechselwegen für Aminosäuren beteiligt, vgl. z.B. Lehninger, A.L., Biochemistry, 2. Auf (Worth Publishers, New York, 1975). AST kommt in nachweisbaren Mengen im Plasma, der Galle, der Zerebrospinalflüssigkeit, dem Speichel und dem Zahnfleisch vor, vgl. z.B. J. King, Practical Clinical Enzymology (D. Van Nostrand Co. Ltd., Toronto, (1965), S.122. Erhöhte Spiegel an Blutserum-AST wurden mit akutem Myokardinfarkt, Lungenembolie, akuter Prankreatitis, viraler und toxischer Hepatitis, aktiver Zirrhose, obstruktiver Gelbsucht, Muskeldystrophie, akuter Dermatomyositis, Polymyositis, paroxysomaler Myoglobinurie und anderen Erkrankungen in verschiedenen Körperorganen korreliert. Erhöhte AST-Spiegel in der Zerebrospinalflüssigkeit wurden für Glioblastom, Schlaganfall und idiopathische epileptische Anfälle berichtet, vgl. King, a.a.O., S. 135-136. Jedoch wurde die Tatsache, daß erhöhte Spiegel an AST in krevikulärer Flüssigkeit mit einer aktiven Zahnwurzelhauterkrankung korrelieren, erst jüngst entdeckt.
Der in einer untersuchten Serumprobe vorhandene AST-Spiegel ist "erhöht", wenn die AST-Menge in einem wesentlichen Überschuß, bezogen auf den AST-Spiegel, der normalerweise im Blutserum von gesunden Erwachsenen der getesteten Art vorkommt, vorliegt. Der normale Bereich bei menschlichen Erwachsenen an Serum-AST beträgt typischerweise etwa 6 bis 40 internationale Einheiten (I.E.) in Abhängigkeit von der Temperatur beim Messen nach den vorstehend beschriebenen Verfahren, siehe King, a.a.O., S 134. Eine I.E. ist als die Menge AST definiert, die 1 nMol Substrat pro min umwandelt.

A. Testverfahren

Eine auf den AST-Gehalt zu untersuchende Körperflüssigkeitsprobe kann aus jedem äußeren oder inneren Gewebe, das Körperflüssigkeiten produziert, erhalten werden. Geeignete Proben werden aus Galle, Blutserum, Speichel, Zerebrospinalflüssigkeit etc. erhalten. Zum Erhalt solcher Proben verwendete Verfahren sind einem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt.
Orale Flüssigkeitsproben werden aus Speichel oder krevikulärer Flüssigkeit erhalten. Speichelproben können aus dem Mund durch eine Vielzahl von Mitteln, wie Adsorption an poröse feste Trägermaterialien, wie Filterpapier, gewonnen werden. Krevikulartlüssigkeit kann aus der Grenzfläche zwischen Zahnfleisch und Zahn durch eine Vielzahl von Mitteln einschließlich einer Mikrospritze mit einer feinen (bevorzugt stumpfen) Nadel oder einem Kapillarröhrchen (bevorzugt kalibriert) entnommen werden. Proben können auch mit Wattebausch, Baumwolltupfern oder faserartigen Materialien, wie Zahriseide, erhalten werden. Bevorzugt wird eine solche Flüssigkeit mit absorbierenden Papier- oder Gewebestreifen und am meisten bevorzugt mit Endodontalpapierspitzen, wie beispielsweise Periopaper (Harco Chemical Co.; Tustin, Kalifornien) entnommen. Die Probe wird durch direkten Kontakt der Probenahmevorrichtung mit der krevikulären Flüssigkeit an der Grenzfläche zwischen Zahn und Zahnfleisch gewonnen. Das Volumen der gewonnenen Probe wird durch Kalibrierung des Probenehmers oder alternativ durch anschließende Messung bestimmt. Geringe Variationen der Volumina der absorbierten Flüssigkeiten (z.B. 10%ige Variationen) sollten die Genauigkeit des Testverfahrens nicht wesentlich ändern. Natürlich spiegeln die für krevikuläre Flüssigkeitsproben erhaltenen Ergebnisse den Zustand des Zahnfleisches an der speziell getesteten Position genauer wider als die Ergebnisse für Speichelproben, die einen Durchschnittszustand des Zahnfleisches im Zahnbereich widerspiegeln, von dem die Probe erhalten wurde.
Erfindungsgemäß umfassen geeignete AST-Substratmaterialien Substanzen, die durch AST in Produkte, die mit einem vorgewählten Indikatormaterial nachweisbar sind. leicht umgewandelt werden. Solche Substrate haben eine Sulfinsäuregruppe in "beta"- Position zu einer Aminogruppe, 2-Ketoglutarat, und Salze davon. Das vorgewählte Substratmaterial umfaßt Cysteinsulfinsäure (CSA) als "Donor"-Substrat. Die Reaktion von AST mit CSA in Anwesenheit eines "Akzeptor"-Substrats, wie 2-Ketoglutarat führt zur Bildung von β-Sulfinylpyruvat, das sich nichtenzymatisch unter Bildung eines Sulfitions zersetzt.
Erfindungsgemäß verwendete Substratlösungen umfassen typischerweise weiter ein oder mehrere pH-Puffermaterialien, wie Phosphate, Borate und Barbitole. Bevorzugt wird Tris-HCl mit einem pH-Wert von 6,0 bis 9,0 verwendet. Auch Stabilisatoren, wie Zinkchlorid, können in die Zusammensetzung aufgenommen werden. Eine bevorzugte Substratlösung umfaßt 10 bis 200 mM Cysteinsulfinsäure (CSA), 0,5 bis 10 mM 2-Ketoglutarat in einer 200 mM Tris-HCl-Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 8,0. Weitere Komponenten der Substratlösung umfassen einen Metallchelatatbildner, wie Ethylendiamintetraacetat (EDTA), und eine Salzkomponente, wie NaCl, sowie ein oberflächenaktives Mittel, wie Triton X-100.
Die Substratlösung wird typischerweise dadurch hergestellt, daß man zuerst das Puffermedium, das die Salzkomponente, das Sequestriermittel, die Pufferkomponenten und das grenzflächenaktive Mittel enthält, herstellt. In einer bevorzugten Austührungsform werden CSA und 2-Ketoglutarat der Lösung zugesetzt und dann wird sofort der pH-Wert auf einen vorbestimmten Punkt eingestellt. Der tür den Test ausgewählte Puffer ist für die Pufferung in einem pH-Bereich von 4 bis 11 geeignet. Der ausgewählte pH-Wert kann infolge der AST-Isoenzyme mit verschiedenen Reaktionsgeschwindigkeiten bei verschiedenen pH-Werten und Inkubationstemperaturen variabel sein. Der bevorzugte pH- Bereich für den Test auf die Gesamtenzymaktivität beträgt etwa 6,0 bis etwa 9,0.
Beispiele für Puffer sind Phosphate, Phthalate, "Tris"-Puffer, Glycin, Citratphosphatpuffer, Imidazolpuffer und dgl. Das bevorzugte Puffersystem ist ein "Tris"- Puffer, der in etwa 50 bis etwa 500 millimolaren (mM) Konzentrationen vorhanden ist.
Ein Sequestriermittel wird ebenfalls bevorzugt verwendet. Ein geeignetes Mittel wird ausgewählt aus solchen Mitteln, die auf dem Fachgebiet als Chelatbildner für mehrwertige Metallionen, bevorzugt für einwertige Ionen, bekannt sind. Beispielsweise können solche Mittel Polymere und Copolymere, die Sulfonsäureeinheiten enthalten, oder Salze davon sein, wie beispielsweise Polyvinylsulfonsäurenatriumsalz, Polyacrylamidomethylpropansulfonsäure und Polystyrolsulfonsäure, Polymere und Copolymere, die Carbonsäuren enthalten, und Salze davon sein, und Materialien mit niedrigem Molekulargewicht mit ähnlichen Einheiten. Die am meisten bevorzugten Chelatatbildner umfassen das Dinatriumsalz von Ethylendiamintetraacetat (EDTA) und verwandte Verbindungen, die in Konzentrationen von etwa 1 bis 100 mM vorhanden sind.
Beispiele für geeignete Salzkomponenten, die zur Verhütung der Enzymadsorption an Oberflächen dienen, sind Chloride von Alkalimetallen, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Cäsiumchlorid. Das bevorzugte Salz hierfü ist Natriumchlorid in Konzentrationen von etwa 50 mM bis etwa 500 mM.
Ein grenzflächenaktives Mittel (Netzmittel) kann verwendet werden, um die Oberflächenspannung der Lösung zu reduzieren, wodurch die Benetzbarkeit verbessert wird. Geeignete grenzflächenaktive Mittel umfassen Mittel, die auf dem Fachgebiet als nicht denaturierend für Enzyme bekannt sind. Verbindungen, wie Polyoxyethylene, Polyglycidole, Alkanolamidderivate von Fettsäuren, Aminosäuren und dgl., sind bevorzugt. Die verwendeten Mengen liegen im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 1 Gew.-%. Am meisten bevorzugt ist das grenzflächenaktive Mittel Tritontmx 100 in einer Menge von etwa 0,06 Gew./Vol. (Als Gew./Vol. bezeichnete Konzentrationen können hier austauschbar mit Gew.-% verwendet werden, da wäßrige Lösungen eingesetzt werden.) Das Donorsubstrat für das Aminotransferaseenzym in diesem Testverfahren wird bevorzugt aus Cysteinsulfinsäure (CSA) und Additionssalzen davon ausgewählt. Die bevorzugte CSA-Konzentration in dem Testsystem hängt von der erwarteten Menge des untersuchten Enzyms ab, d.h. sie hängt von dem Volumen und der Aktivität der untersuchten Probe ab. Beispielsweise benötigt in einem Test von menschlichem Blutserum, das einen normalen Bereich von weniger als etwa 40 Einheiten besitzt, die Messung einer abnormalen Aktivität, z.B. bis zu 3000 Einheiten, ausreichend Substrat, so daß die Geschwindigkeits-Aktivitäts-Beziehung zu dem Zeitintervall des Tests nahezu linear ist. So hängt die Minimalmenge des benötigten Substrats von dem Volumen der untersuchten Probe ab. Probenvolumina von nur 0,01 µl können untersucht werden. Der bevorzugte Bereich der Donorsubstratkonzentration für diesen Test ist variabel, liegt aber typischerweise im Bereich von etwa 1 mM bis etwa 500 mM.
Ein Akzeptorsubstrat für das Aminotransferaseenzym in diesem Testverfahren ist jegliche Verbindung, die effektiv eine Aminogruppe von dem Donorsubstrat unter den Reaktionsbedingungen aufnimmt. Das Akzeptorsubstrat umfaßt bevorzugt eine Quelle für 2-Ketoglutarsäure, die üblicherweise als Salz davon bereitgestellt wird. Die Konzentration des verwendeten Akzeptorsubstrats hängt von der entsprechenden Menge des verwendeten Donorsubstrats ab, wobei das Akzeptorsubstrat üblicherweise in geringeren Mengen als der Donor infolge der kompetitiven Substrathemmung verwendet wird. Das bevorzugte Verhältnis von 2-Ketoglutarat zu CSA beträgt etwa 1:15 bis zu etwa 1:20.
Der vorgewählte Indikator, der bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird so ausgewählt, daß er mit einem nach der Reaktion von AST mit dem Substrat gebildeten Produkt reagiert. Der Indikator ist auch dadurch gekennzeichnet, daß er mit entweder AST oder Substrat nicht wesentlich reagiert. So zeigt der Indikator keine wesentliche Wechselwirkung mit AST in einer hemmenden oder abbauenden Weise, noch zeigt der Indikator mit dem Substrat für AST eine derartige Wechselwirkung, daß die Umsetzung von AST mit dem Substrat signifikant verändert oder verschlechtert wird.
Geeignete Indikatoren zur erfindungsgemäßen Verwendung umfassen Substanzen die mit mindestens einem der Reaktionsprodukte von AST mit dem ausgewählten Substrat reagieren können. Wenn CSA das Substrat ist, sind bevorzugte Indikatoren Sulfit-reaktive Verbindungen. Die Suffit-reaktive Verbindung ist ein Indikator, der mit Sulfit unter Bildung eines Signalteilchens reagiert, das anschließend nachgewiesen werden kann. Das Signalteilchen ist üblicherweise ein geometrisches und elektronisches Derivat des Indikators, z.B. ein "Leuco"-Teilchen. Ein bevorzugter Gesichtspunkt der Erfindung betrifft die Verwendung eines Indikators, der eine sichtbare Farbveränderung bei Reaktion mit dem Sulfition erleidet. Alternative erfindungsgemäße Ausführungsformen verwenden Indikatoren, die auf die Anwesenheit des Sulfitions durch Bildung eines sichtbaren Präzipitats, Erzeugung eines fluoreszierenden oder chemilumineszierenden Signals, Hervorrufen einer pH-Wert- oder Ionenstärkeveränderung der Lösung, Erzeugen eines elektrischen Signals durch Reaktion mit einer Elektrode und dgl., antworten. Verfahren zum Nachweis dieser Signale sind einem Fachmann auf dem Gebiet ohne weiteres offensichtlich.
Kolorimeterische erfindungsgemäße Indikatoren sind Triarylmethinverbindungen und reagieren leicht mit Sulfitionen, ändern aber nicht wesentlich die natürliche Aktivität von AST in der Probe.
Besonders bevorzugte Indikatoren umfassen Malachitgrün und dessen Salze, wie Malachitgrüncarbinolhydrochlorid, Malachitgrünoxalat und Malachitgrünzinkchloriddoppelsalz, Methylgrün und Guineagrün B. Ebenfalls bevorzugte Indikatoren umfassen saures Fuchsin, basisches Fuchsin, Pararosanilinchlorid, Pararosanilinacetat, Ethylviolett, Aurin und ihre entsprechenden Salzformen in einer Gewichtskonzentration von etwa 0,0001 bis etwa 1 %. Am meisten bevorzugt wird der gewählte Indikator aus Malachitgrün, Methylgrün und Guineagrün B ausgewählt. Die zuletzt genannten Verbindungen besitzen eine grünliche Farbe, die bezüglich der optischen Dichte bei Reaktion mit dem Sulfition abnimmt, wobei ein farbloses "Leuco"-Teilchen erhalten wird, vgl. z.B. E. Jungreis in Chemical Analysis, Bd. 75, Wiley, S. 185. Eine bevorzugte Konzentration des Indikators beträgt etwa 0,001 bis 0,05 Gew./Vol.
Zusätzlich wurde gefünden, daß die Stabilität der bei den erfindungsgemäßen Tests verwendeten Triarylmethinfarbstoffe durch Zugabe bestimmter Komponenten zu der Indikatorlösung in kleinen Mengen verbessert werden kann. Beispielsweise ergeben bestimmte Metallsalze, die bekanntlich Komplexe mit den erfindungsgemäßen Farbstoffen bilden, Verbesserungen bezüglich der Indikatorfarbstoffstabilität. Bevorzugt werden die Zinksalze in einer Konzentration von etwa 0,001 bis etwa 0,5 Gew./Vol. und am meisten bevorzugt von etwa 0,25 bis 0,35 Gew./Vol. bereitgestellt. Bestimmte Indikatordoppelsalze von Zink, wie Malachitgrün/2ZnCl&sub2;, können ebenfalls verwendet werden. Bevorzugte Stabilisatoren umfassen Chlorid-, Bromid-, Acetat- und Sulfatsalze von Zink.
Das erfindungsgemäße Testverfahren kann unter Verwendung entweder des "Geschwindigkeits"- oder "Endpunkt"-Verfahrens der Messung durchgefilhrt werden. Wenn beispielsweise das Geschwindigkeitsverfahren verwendet wird, wird eine Verdünnugsreihe aus Serum- oder Enzymstandardlösungen hergestellt. Eine "Leerwert"-Probe ohne Enzym wird ebenfalls hergestellt. Die Quelle für den AST-Standard ist nicht kritisch und wird einfach im Handel erhalten, beispielsweise von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Bevorzugte Standards ist menschliche oder Schweineserum-AST. Ein Aliquot einer Standardlösung wird einem Aliquot einer Substrat-/Indikatorlösung, die in einer Küvette in einem Kolorimeter enthalten ist, zugesetzt. Die Küvette wird mit Licht mit einer Wellenlänge, die der maximalen sichtbaren Absorption für den verwendeten Indikator entspricht, bestrahlt, und die Absorptionsveränderung im Verlauf der Zeit wird überwacht. Die beobachtete Veränderung der Absorption (optische Dichte) wird in Beziehung zu der AST-Konzentration in jeder Probe gesetzt. Wenn reflektometrische Verfahren verwendet werden, um den AST-Gehalt zu bestimmen, werden die beobachteten Reflexionsänderungen in ahnlicher Weise zu der AST-Konzentration in Beziehung gesetzt.
Eine graphische Darstellung der Absorption gegen die Zeit für jede Reaktion besitzt einen anfänglichen linearen Bereich, gefolgt von einem Kurvenbereich mit Fortschreiten der Reaktion. Ein Teil dieser graphischen Darstellung wird ausgewählt, in dem alle Verdünnungen des Standards eine gut verlaufende gleichmäßig abnehmende Absorption über diesen Bereich ergeben, und die Geschwindigkeit jeder Reaktion wird über ein geeignetes Zeitintervall bestimmt. Bevorzugt wird das Zeitintervall etwa innerhalb 10 min nach dem Inkontaktbringen der flüssigen AST-haltigen Probe mit dem Substrat und dem Indikator gewählt. Da die gemessene Absorption zu der Indikatorkonzentration proportional ist, ist die Geschwindigkeit der Abnahme der gemessenen Absorption direkt zu der Geschwindigkeit der Abnahme der Indikatorkonzentration proportional. Die gemessene Absorption ist zu der AST-Aktivität proportional, solange die Reaktion von AST mit dem Substrat viel langsamer als andere Reaktionen ist, d.h. die AST-Substratreaktion ist geschwindigkeitsbestimmend. Unter den hier beschriebenen Reaktionsbedingungen ist die Reaktion von AST mit CSA viel langsamer als die Zersetzung von β-Sulfinylpyruvat und die Reaktion des Sulfitions mit dem Indikator.
Eine Standardkurve der beobachteten Reaktionsgeschwindigkeiten gegenüber der Enzymonzentration wird dann hergestellt, aus der eine Regressionsanalyse einen algebraischen Standardausdruck ergibt. Typischerweise hat die erhaltene Kurve Reaktionsgeschwindigkeiten, die im wesentlichen in linearer Beziehung zu der AST-Konzentration stehen. Wenn die aufgetragenen Daten eine nichtzufriedenstellende nichtlineare Kurve ergeben, kann eine lineare Kurve üblicherweise über eine andere Reihe von Verdünnungen erhalten werden. Typischerweise ist die vorstehende Kurve im Bereich von 10 bis 125 AST-Einheiten/l linear.
Eine Probe mit einer unbekannten AST-Konzentration kann dann entweder durch Anwendung einer Standardvolumeneinheit oder durch Reihenverdünnungen der Probe analysiert werden, die zu einem Bereich von Aktivitätswerten bezogen auf die speziellen Verdünnungen der Probe führen. Bei dem zuletzt genannten Verfahren gruppieren sich die festgestellten Enzymmengen entsprechend den geeigneten Verdünnungsfaktoren, so daß AST-Einheiten zuverlässig bestimmt werden können.

B. Diagnostische Kits

Diagnostische Kits unter Verwendung des erfindungsgemäßen Test-Verfahrens fallen ebenfalls unter den Umfang der Erfindung. Die Kits sind bevorzugt tragbar und mit dem Auge ablesbar, d.h. sie können visuell vom Verwender ohne die Notwendigkeit eines Geräts überwacht werden. Ein erfindungsgemäßer Kit umfaßt ein Aliquot einer gepufferten wäßrigen CSA-Lösung, die ausreicht, um mindestens einen Test durchzuführen. Ein Kit umfaßt auch eine Testplatte, in der Vertiefungen zur Aufnahme der erfindungsgemäßen Testreagenzien vorhanden sind. Zusätzlich stellt ein Kit einen Triarylmethinfarbstoff bereit, der unter den definierten Reaktionsbedingungen mit dem Sulfition reagiert, aber im wesentlichen mit AST nicht reagiert. Der Triarylmethinfarbstoff wird bevorzugt an eine feste Matrix, beispielsweise durch Imprägnieren, gebunden, wodurch ein fester Indikatorträger erhalten wird. Der feste Indikatorträger kann getrennt von der Testplatte oder neben der Testplatte, beispielsweise mit einem Haftmittel bereitgestellt werden. Bevorzugt werden eine Vielzahl von festen Indikatorträgern fest in den Vertiefungen der Testplatte angebracht.
Die gewonnene Probe, die das AST-Enzym enthält, wird einfach in eine Mikrovorrichtung mit Vertiefungen des Kits gegeben. Die Mikrovorrichtung, z.B. eine Platte, des Kits, ist aus einem geeigneten Material hergestellt, das gegenüber den Test- Reagenzien chemisch inert ist. Beispielsweise kann die Platte aus einem starren Kunststoffmaterial hergestellt sein, z.B. Polycarbonat, Polyvinylchlorid, Polypropylen und dgl., das im wesentlichen frei von Weichmachern ist, die den Test stören könnten. Die Platte kann opak oder klar sein. Eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform verwendet eine Platte mit einer weißen reflektierenden Oberfläche.
Die Mikrovorrichtung mit Vertiefungen ist mit einer Vielzahl von Einbuchtungen versehen, die jeweils ein adäquates Fassungsvermögen haben, um die bei dem Test verwendete Probe und die verwendeten Reagenzien aufzunehmen. Ein Teil der, wie hier beschrieben, hergestellten Substratlösung wird zugesetzt, und man läßt die Reaktion bei einer vorbestimmten Temperatur für eine vorbestimmte Zeitspanne ablaufen. Die Farbe der Testreaktion wird dann mit einer Standardreaktion, die gleichzeitig durchgeführt wird, oder einer Referenzfarbvergleichskarte verglichen, d.h. ein "Endpunkt" wird identifiziert.
Typischerweise enthält der Indikatorträger ein Indikatormedium, das an die feste Matrix gebunden ist, d.h. auf oder darin enthalten ist. Beispielsweise kann ein mit einem Indikatormedium beladener Polymerfilm, z.B. Polyvinylalkohol, verwendet werden. Alternativ kann ein mit einer sulfitreaktiven Indikatorlösung imprägniertes saugfähiges Material, z.B. Filterpapier, verwendet werden. Das Indikatormedium kann weiter Triarylmethinfarbstoffe, Stabilisatoren, Bindeharze, Farbkontrastfarbstoffe und dgl. umfassen.
Bevorzugt wird bei den neuen mit dem Auge ablesbaren Kits, bei denen dieses Testverfahren verwendet wird, eine Indikatorlösung mit einem Triarylmethinfarbstoff, Farbkontrastfarbstoff, Stabilisator, einem grenzflächenaktiven Material und einem Bindeharz verwendet, die in hochreinem Wasser oder einem alternativen Lösungsmittelsystem, in dem alle Komponenten löslich sind, wie niedriger siedenden Alkoholen und Gemischen davon, hergestellt wurde. Die hergestellte Lösung wird dann auf ein saugfähiges Medium imprägniert oder auf eine glatte Oberfläche gegossen und man läßt sie trocknen. Der Trocknungsprozeß kann durch Gebläseluftströmung, Erhitzen oder eine Kombination, die die Entfernung der Lösungsmittel erlaubt, beschleunigt werden. Die substrathaltige Schicht kann auf ähnliche Weise hergestellt werden, ausgenommen daß es als vorteilhaft befünden wurde, in diesem Fall eine Gefriertrocknungslyophilisation zu verwenden.
Wenn ein Polymerfllm verwendet wird, um die erfindungsgemäßen Indikatorreagenzien zu tragen, umfaßt die feste Matrix bevorzugt ein Bindeharz, um die Reagenzien an die Matrix zu binden, z.B. durch Dispergieren der Reagenzien darin Die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Kits verwendeten Bindeharze sind Harze, die in den gleichen Lösungsmittelsystemen wie die Farbstoffe und die anderen Komponenten löslich sind. Sie sind allgemein filmbildende Materialien und können als Gemische aus kompatiblen Harzen oder als Gemische, die die Harze und geeignete Weichmacher enthalten, vorliegen, um die Beschichtungseigenschaften zu verbessern, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist. Beispiele für geeignete Bindeharze umfassen die verschiedenen Gummis, wie Gummi arabicum, Guajak, Guaran, Mastix und Xanthanlösung, sowie lösliche synthetische Harze, wie Polyvinylalkohol und Copolymere davon, die Vinylacetat Vinylether oder ähnliche Comonomere enthalten, Polyvinylpyrrolidon und Copolymere davon, Polyvinylether und Copolymere mit carbonsäurehaltigen Comonomeren, Polyglycole, Polyacrylate, Polymethacrylate, Polyethersulfone und dgl.. Ein bevorzugtes Bindeharz für diese Kits ist Polyvinylalkohol (PVA) verschiedener Viskositätsgrade und Hydrolysegrade und liegt in einer Menge von etwa 0,1 bis etwa 20 Gew.-% vor.
Die Farbkontrastfarbstoffe können ggf in mit dem Auge ablesbaren Kits unter Verwendung dieses Verfahrens bereitgestellt werden. Solche Farbkontrastmittel sind besonders wunschenswert, wenn der Test zu keiner Farbbildung führt, z.B. wenn ein Triarylmethinfarbstoff verbraucht wurde. Das Farbkontrastmittel wird an die feste Matrix des Indikatorträgers entweder durch direktes Beladen des Mittels auf die Matrix oder durch Lokalisieren des Farbkontrastmittels in der Nähe der festen Matrix befestigt. Wenn beispielsweise Malachitgrün der verwendete Triarylmethinfarbstoff ist, verschwindet die bläulich grüne Farbe aus der Beladung des Farbstoffs auf das Imprägnierpapier nach Verbrauch in dem Test. Durch die Zugabe eines zweiten sichtbaren Indikators, der nicht stört und durch das Sulfition und andere Reagenzien in dem Kit nicht beeinträchtigt wird, können die Farbe und die Farbwahrnehmungsschwelle des Endpunkts variiert werden. Bevorzugte zweite Farbindikatoren umfassen Auramin 0, Safranin 0 und Rhodamin B in Konzentrationen von etwa 0,01 bis etwa 1 Gew./Vol. Alternativ kann eine Farbverstärkung hinter der Mikrovorrichtung mit Vertiefüngen, dem Film, dem Imprägnierungspapier etc., die in dem Test verwendet werden, vorgesehen sein.
Die gewonnene Flüssigkeitsprobe, das Substrat und die Indikatorlösung werden vermischt und unter vorbestimmten Bedingungen inkubiert. Diese Bedingungen werden so gewählt, daß kein signifikanter Nachweis des AST-katalysierten Reaktionsprodukts in Anwesenheit einer unterschwelligen AST-Menge in der Flüssigkeitsprobe gebildet wird. Die Bedingungen sind jedoch so, daß die Anwesenheit einer überschwelligen AST-Menge zur Bildung einer ausreichenden Menge eines enzymkatalysierten Reaktionsprodukts führt, um eine nachweisbare Veränderung in einem vorgewählten Indikator zu bewirken. Ein geeigneter Schwellenwert für den Test hängt von dem getesteten Krankheitszustand und den Typen der analysierten Probe ab. Die Menge an vorhandenem AST beeinflußt die Reaktionsgeschwindigkeit mit dem Substrat und daher die Reaktionsgeschwindigkeit des Indikators. Da die Vorwärtsreaktion des Substrats durch die Anwesenheit kompetitiver Substrate gehemmt werden kann, muß Sorge getragen werden, daß die Anwesenheit unerwünschter kompetitiver Substrate ausgeschlossen wird, von denen bekannt ist, daß sie die AST-Aktivität signifikant hemmen. Es wurde gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Verfahren wirksam sind, um AST-Werte von nur 800 Mikroeinheiten nachzuweisen. Folglich kann eine Verdünnung zum Erhalt der gewünschten Schwellenwerte für die Testlösungen geeignet sein.
Optimale Reaktionsbedingungen hängen von der spezifischen Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ab und werden für spezielle Substrate und Indikatoren nach gut bekannten Techniken auf dem Fachgebiet leicht bestimmt. Jedoch liegt der pH-Wert der Reaktion typischerweise im Bereich von 6,0 bis 9,0. Die Reaktionstemperatur liegt üblicherweise im Bereich von etwa 20 bis 35ºC. Ebenso beträgt die zur Analyse benötigte Zeit typischerweise weniger als etwa 1 h.
Die bei den erfindungsgemäßen Kits verwendeten Reaktionsiösungen werden typischerweise unter biologisch sterilen Bedingungen abgepackt und gelagert. Folglich werden die Lösungen üblicherweise in Behältnissen unter einer Inertgasatmosphäre gelagert.
Ein erfindungsgemäßer Testkit kann auch ein geeignetes Enzymgift zum Löschen der Testreagenzien zu einem beliebigen gewünschten Zeitpunkt in dem Test enthalten. Beispielsweise kann eine saure Lösung, die die AST-Aktivität stoppen kann, in einem Behältnis des Kits bereitgestellt werden. Andere Löschreagenzien sind einem Fachmann offensichtlich, wie die verschiedenen Arten der Gififleisetzung. Beispielsweise kann die Testplatte eines erfindungsgemäßen Kits mit einem beweglich befestigten oder ablösbaren Deckel, der das gewünschte Gift enthält, bereitgestellt werden. Die Reaktion wird nach Inkontaktbringen des Gifts mit den Testreagenzien gelöscht.

Beispiele

Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne ihren Umfang zu beschränken.

1. Bestimmung einer AST-Standardkurve

In diesem Beispiel wird eine Standardkurve der optischen Dichte gegen die AST- Aktivität mit einem sichtbaren Spektrophotometer bestimmt. Der Test wird in einer für sichtbares Licht transparenten Küvette durchgeführt.

Herstellung der Substratlösung

Eine wäßrige Lösung des Substrats wird hergestellt, so daß sie die folgenden Komponenten umfaßt:
Donorsubstrat: 91 mM L-Cysteinsulfinsäure (CSA)
Akzeptorsubstrat: 9,1 mM Mononatrium-2-ketoglutarat
Puffer: 157 mM Tris-HCl (pH 8,0)
Sequestriermittel: 4,5 mM EDTA-Dinatriumsalz
Salzkomponente: 125 mM Natriumchlorid
Grenzflächenaktives Mittel: 0,06 Gew.Nol. Triton X-100
Die vorstehenden Komponenten werden in entionisiertem Wasser aufgelöst und heftig vermischt, um sie zu den angegebenen Konzentrationen aufzulösen.

Herstellung einer Indikatorlösung

Eine separate Indikatorlösung wird in entionisiertem Wasser hergestellt, so daß sie die folgenden Komponenten umfaßt:
Triarylmethinindiaktorfarbstoff: 0,014 Gew./Vol. Malachitgrünoxalat
Grenzflächenaktives Mittel: 0,06 Gew.Ivol. Triton X-100
Die vorstehenden Inhaltsstoffe werden heftig vermischt, um sie in dem wäßrigen Medium aufzulösen.

Bestimmung der Standardkurve für AST

Eine Lösung, die 850 Einheiten/l Schweine-AST (Herz) enthält, wie mit einem UV- Kinetiktest bei 340 nm (NAD, Sigma #258-UV) gemessen wurde, wird in 100 mM Tris- Puffer (pH = 7), der 0,5 % Rinderserumalbumin enthält, verdünnt, so daß eine Reihe von Verdünnungen, die 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56, 0,78 und 0,39 Einheiten/l AST-Aktivität enthalten, erhalten wird. Die Verdünnungsreihe wird in drei Ansätzen in einem Beckman DU-50 UV-Vis-Spektrophotometer, ausgestattet mit einer sechszelligen thermostatisierten Küvettenanordnung, unter Verwendung des mit dem Gerät gelieferten Software-Pakets zu den Kinetikdaten analysiert. Die Messungen werden bei 30ºC, bezogen auf einen Reagenzienleerwert, der keine Enzymaktivität enthielt, durchgeführt. Etwa 900 µl der vorstehend hergestellten Substratlösung werden in eine Küvette mit einem Fassungsvermögen von etwa 5 ml gegeben, und anschließend werden 100 µl der Triarylmethinfarbstoffindikatorlösung zugesetzt. Etwa 100 µl einer Probe aus der AST-Enzymverdünnungsreihe werden der Küvette zugesetzt, und die Küvette wird vermischt, und der Test wird sofort durch Ablesen der Differenz in dem Reagenzienleerwert und der Testküvette bei einer Absorption von 614 nm alle 15 s insgesamt 5 min gestartet. Das Verfahren wird für jede AST-Enzymprobe in der Verdünnungsreihe wiederholt, und die Geschwindigkeit der Abnahme der optischen Dichte bei 614 nm wird für jede Probe in dem gleichen Zeitintervall bestimmt. Das Standardisierungsverfahren ergab die in Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse. Tabelle 1
Eine an den vorstehenden Daten durchgetührte Regressionsanalyse ergab die folgende Gleichung mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,999:
Geschwindigkeit = 0,00574 (AST) + 0,038189

2. Bestimmung von Humanserum-AST

In diesem Beispiel wurde die Anwendbarkeit des in Beispiel 1 beschriebenen Testverfahrens für authentisches Humanserum gezeigt. Der Test wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt, ausgenommen daß der Gehalt an L-Cysteinsulfinsäure 100 mM betrug, der Gehalt an Mononatrium-2-ketoglutarat 10 mM betrug, der Gehalt an Tris-Puffer 175 mM betrug und der Gehalt an Dinatrium-EDTA 5 mM betrug.
Eine Verdünnungsreihe einer authentischen Humanserumkontrolle (Accutrol, Sigma) wurde unter Verwendung von 100 mM Tris-Puffer (pH = 7,8) unter Erhalt der nominalen AST-Aktivitäten, wie in Tabelle 2 gezeigt, durchgeführt. Das Testverfahren wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Tabelle 2
Eine Regressionsanalyse der vorstehenden Daten ergab die folgende Gleichung mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,9987:
Geschwindigkeit = 0,01791 (AST) + 0,00237

3. Herstellung und Verwendung des Indikatorfilm-Testkits

In diesem Beispiel wurde ein Testkit auf das Enzym AST so hergestellt, um die Messung der Enzymaktivität in aus dem Mund gewonnenen krevikulären Flüssigkeitsproben mit erhöhter AST-Aktivität als Folge des Vorliegens einer Zahnwurzelhauterkrankung zu erreichen ("emulate"). Der klinische Ausschlußwert für die Indikation der Krankheit wurde als ein Wert entsprechend weniger als 800 Mikroeinheiten/l Aktivität in der Probe bestimmt. Die Substratlösung wurde wie in Beispiel 1 hergestellt, ausgenommen daß der Gehalt an L-Cysteinsulfinsäure 100 mM betrug, der Gehalt an Mononatrium-2-ketoglutarat 10 mM betrug, der Gehalt des Tris- Puffers 200 mM betrug und der Gehalt an EDTA-Dinatriumsalz 5 mM betrug.

Herstellung von Triarylmethinfarbstoffindikatorfilmen

Eine 8 % Polyvinylalkohol-enthaltende Lösung (Air Products V-165) wurde hergestellt, indem 1 l entionisiertes Wasser mit 0,06 % Triton X-100 zum Sieden gebracht wurde und langsam 80 g des Polymers unter gutem Vermischen zugesetzt wurden. Die noch heiße Lösung wurde in zwei 500 ml-Teile in Flaschen mit dicht schließenden Kappen verteilt. Die erste Flasche wurde mit 175 mg Malachitgrünoxalat, 100 mg Rhodamin B-chlorid und 1,0 g Zinkchlorid versetzt. Die zweite Flasche wurde mit 175 mg Malachitgrünoxalat, 250 mg Auramin O-monohydrochlorid und 1,0 g Zinkchlorid versetzt. Die beiden Flaschen, die die Inhaltsstoffe enthielten, wurden auf eine Walzenmühle gegeben und bis zur Homogenität gründlich vermischt. Sie wurden dann von der Mühle genommen und stehengelassen, bis alle eingeschlossenen Luftblasen aus der Lösung diffundiert waren. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde ein 70 ml Aliquot jeder Lösung entnommen und gleichmäßig über Glasplatten mit dem Dimensionen 20,3 x 35,6 mm (8" x 14" inch) gegossen. Die Platten wurden auf einen ebenen Tisch in einem Abzug gegeben und man ließ die Lösung über Nacht zur Trockene eindampfen. Dieses Verfahren führte zu Filmen mit einer Dicke im Bereich von 0,043 bis 0,051 mm (1,7 bis 2,0 mil). Die getrockneten Filme wurden dann in kreisförmige Stücke mit einem Durchmesser von 6,35 mm (0,25 inch) gestanzt.

Herstellung der Testkits

Platten aus opakem Polyethylenausgangsmaterial mit hoher Dichte mit einer Dicke von 3,18 mm (0,125 inch) wurden in Rechtecke mit einer Größe von 76,2 x 101,6 mm (3" x 4") geschnitten. Zwei Reihen zu sechs Löchern mit einem Zentrum von 12,7 mm (0,5 inch) und einem Durchmesser von 6,35 mm (0,25 inch) wurden symmetrisch in die Rechtecke gebohrt. Streifen mit einer Dicke von 0,254 mm (10 mil) aus Acetalkunststoff wurden mit einem Nichtacrylüberträgerhaftmittel mit einer Dicke von 0,051 mm (2 mil) laminiert und in Rechtecke mit einer Größe von 76,2 x 101,6 mm (3" x 4") geschnitten. Die Trennfolie wurde davon entfernt, und die Acetalteile wurden auf die Teile aus Polyethylen mit hoher Dichte laminiert. Dieses Verfahren führte zu einer wasserdichten Konstruktion mit Haftmittel am Boden der so erhaltenen Vertiefungen. In jede dieser Vertiefungen wurde ein vorstehend hergestelltes kreisförmiges Stück des Indikatorfilms so gegeben, daß eine Reihe zu sechs Vertiefungen blaue kreisförmige Stücke (Malachitgrünoxalat und Rhodamin B-chlorid) enthielt, und eine Reihe grüne kreisförmige Stücke (Malachitgrünoxalat und Auramin-O-mono-HCl) enthielt.

Bewertung der Testkits

Eine Reihe von standardisierten Enzymlösungen, die 400, 600, 800, 1000, 1200 Mikroeinheiten/µl AST-Konzentrationen enthielten, wurde frisch hergestellt. 1 µl jeder Probe wurde in eine Vertiefung, die ein kreisförmiges Stück mit dem Farbindikator enthielt, gegeben, daß die zwei Reihen abnehmende Konzentrationen an Enzym-AST- Aktivität und eine Leerwertlösung in jeder Reihe hatten. Eine Zeituhr wurde auf 10 min gestellt und gestartet. In jede der Vertiefungen wurden 25 µl der Substratlösung gegeben.
Nach 10 min wurde der Test visuell bewertet. Für AST-Enzymgehalte von 800 Mikroeinheiten und darüber war die Farbe der kreisförmigen Stücke mit blauem Indikator rosa und die Farbe der grünen kreisförmigen Stücke gelb. Für AST-Enzymgehalte im Bereich von Null bis 600 Mikroeinheiten wurde nur eine Farbabstufung in hellere Blau- oder Grüntöne erhalten. Sowohl bei den blauen als auch bei den grünen Indikatortests wurde eine klare und deutliche kolorimetrische Endpunktschwelle bei einem Gehalt von 800 und darüber überschritten.

4. Bestimmung abnormaler Serum-AST-Spiegel

In diesem Beispiel wurde das kolorimetrische Endpunkttestkit-Verfahren von Beispiel 3 zur Unterscheidung von normalen Seren gegenüber abnormalen Seren, bezogen auf Kontrollen, bewertet. Ein Testkit und eine Substatlösung wurden wie in Beispiel 3 hergestellt. Frisch erhaltene normale und abnormale Accutrol-Chemiestandards (Sigma), die bekanntlich 20 bis 25 Einheiten/l AST-Aktivität in einer Humanserumgrundlage für die normale Kontrolle und 100 bis 120 Einheiten/l für die abnormale Kontrolle enthielten, wurden verwendet. In zwei Vertiefungen jeder Reihe des Testkits wurden Null AST, 10 µl der normalen Kontrolle und 10 µl der abnormalen Kontrolle gegeben. Eine Zeituhr wurde auf 5 min gestellt und gestartet. In jede der Vertiefungen wurden 25 µl der Substratlösung, die entsprechend Beispiel 3 hergestellt worden war, gegeben. Nachdem 5 min verstrichen waren, wurde der Testkit visuell bewertet. Die Leerwertzellen veränderten ihre Farbe nicht, die normalen Kontrollen waren entweder heller blau oder heller grün gefärbt und die abnormalen Kontrollen lagen deutlich jenseits der kolorimetrischen Endpunktschwelle. Im Fall des blauen kreisförmigen Indikatorstücks war die Endpunktfarbe der abnormalen Kontrolle hellrot, und im Falle des grünen Indikatorkreises war die Endpunktfarbe ein tiefes Gelb.

5. Kit mit imprägnierten saugfähigen Medien

In diesem Beispiel wird die Verwendung von imprägnierten saugfähigen Medien für die Triarylmethinfarbstoff-Indikatorkomponente eines Testkits erläutert.

Herstellung eines Triarylmethinfarbstoff-Indikatorpapiers

Eine Lösung, die 1 % Polyvinylalkohol und 0,06 % Triton X-100 enthält, wird in entionisiertem Wasser wie in Beispiel 3 hergestellt. 500 ml dieser Polymerlösung werden mit 150 mg Malachitgrüncarbinolhydrochlorid, 150 mg Rhodamin B-chlorid und 55 mg Zinkchlorid versetzt. Das Gemisch wird bis zum Auflösen aller Komponenten gerührt. Ein Aliquot dieses Gemisches wird in einen Becher gegeben, und 1 inch-große Streifen eines Schleicher und Schnell-Impragnierungspapiers 2043-A mit einem Grundgewicht von 83 g/m² und einer Wasserabsorptionsfähigkeit von 1,3 g/100 cm² werden 1 min in die Lösung eingetaucht. Die Papiere werden entfernt und 30 s lang abtropfen gelassen, dann auf ein Tablett aus rostfreiem Stahl gelegt und in einem Konvektionsofen 30 min bei 65ºC getrocknet. Nach der Entnahme aus dem Ofen werden die imprägnierten Streifen in kreisförmige Stücke mit einem Durchmesser von 6,35 mm (0,25 inch) gestanzt.

Test auf AST

Eine Substratlösung wird wie in Beispiel 1 hergestellt, außer daß der Gehalt an L- Cysteinsulfinsäure 10 mM, an Mononatrium-2-ketoglutarat 1,0 mM, an Tris-Puffer 200 mM und an Dinatrium-EDTA 5,0 mM beträgt. Eine Testplatte wird aus vorgeschnittenen durchbohrten und laminierten Komponenten wie in Beispiel 3 hergestellt. In eine Reihe von Vertiefungen werden die ausgestanzten imprägnierten kreisförmigen Stücke und 1 µl vorstandardisierte AST-Enzymiösungen, die 0, 200, 400, 600, 800 und 1000 Mikroeinheiten/µl Enzymaktivität enthalten, gegeben. Eine Zeituhr wird auf 10 min gestellt und gestartet, und 25 µl Substratlösung werden jeder Vertiefüng zugesetzt. Nach 10 min wird der Test visuell bewertet. Die Farbe der Vertiefüng, die den Leerwert enthielt, war unverändert. Die Vertiefüngen, die weniger als 800 Mikroeinheiten enthielten, waren bei einer Konzentration von 600 heller blau bis fast purpur gefärbt. Die Vertiefüngen, die 800 und mehr enthielten, waren deutlich rosa gefärbt, was anzeigt, daß der Schwellenwert des kolorimetrischen Indikators überschritten worden war.

6. Bewertung alternativer Indikatoren

Andere Farbstoffe wurden auf ihre Anwendung in dem Test auf das Enzym AST bewertet, nachdem gefünden worden war, daß sie ihre Farbe in Anwesenheit eines Sulfitions in einer wäßrigen Lösung verändern. Die Bewertungen wurden durch Herstellen einer 0,03%igen Lösung des jeweiligen Farbstoffs in einer 1%igen Polyvinyllösung mit 0,06 % Triton X-100 und Imprägnieren des 2043-A-Papiers gemäß Beispiel 5 durchgeführt. Nach dem Trocknen wurden die imprägnierten Papiere in kreisförmige Stücke von 0,25 inch gestanzt, und sie wurden paarweise in die wie in Beispiel 3 hergestellte Testvorrichtung gegeben. Eine Substratlösung wurde gemäß Beispiel 5 hergestellt, außer daß der Gehalt an L-Cysteinsulfinsäure 20 mM betrug und der Gehalt an Mononatrium-2-ketoglutarat 2,0 mM betrug. Eine AST-Standardlösung mit einer Aktivität von 1500 Mikroeinheiten/µl wurde hergestellt. Die jeweiligen Farbstoffe wurden durch Abaufen einer Leerwertreaktion parallel zu einer Reaktion mit 1,0 µl Enzymlösung bewertet. Etwa 25 µl des Substrats wurden jeder Vertiefung zugesetzt, und die Reaktionen wurden nach 10 min bewertet. Farbstoffe, die keine sichtbare, mit der Zeit fortschreitende Farbveränderung bezogen auf die Leerwertreaktion zeigten, wurden als ungeeignet für dieses Testverfahren klassifiziert.
Die folgenden Farbstoffe zeigten eine sichtbare mit der Zeit fortschreitende Farbveränderung bezogen auf die Leerwertreaktion und erwiesen sich als geeignet für die Praxis des Testverfahrens: Methylgrün, Guineagrün B, Ethylviolett, saures Fuchsin, basisches Fuchsin, Pararosanilinchlorid, Pararosanilinacetat, Aurinnatriumsalz.

Claims

1. Testkit zur Identifizierung einer Zahnwurzelhauterkrankung in einem Patienten, die mit einem erhöhten Wert der Aspartataminotransferase (AST) in einer krevikulären Flüssigkeitsprobe des Patienten einhergeht, wobei der Kit folgende Bestandteile umfaßt:

ein Aliquot einer gepufferten wäßrigen Cysteinsulfinsäure (CSA) -Lösung, die in einem Behälter für das Aliquot bereitgestellt wird,

eine Vielzahl von festen Indikatorträgern, von denen jeder einen Triarylmethinfarbstoff umfaßt, der an eine feste Matrix gebunden ist, wobei der Farbstoff mit Sulfitionen reagiert, jedoch im wesentlichen nicht mit CSA und AST reagiert; und

eine Testplatte, die mit einer Vielzahl von Vertiefungen versehen ist, wobei jede Vertiefung ein Volumen aufweist, das ausreicht, um einen der festen Indikatorträger und einen Teil der CSA-Lösung aufzunehmen, die ausreicht, um mindestens einen Test durchzuführen.

2. Kit nach Anspruch 1, wobei die feste Matrix ein poröses Papier umfaßt.

3. Kit nach Anspruch 1 oder 2, wobei die feste Matrix Polyvinylalkohol umfaßt.

4. Kit nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein Farbkontrastmittel an die feste Matrix gebunden ist.

5. Kit nach einem der vorangehenden Ansprüche, der ferner proximal zur Testplatte einen Deckel aufweist, wobei der Deckel ein Enzymgift enthält.

16. Testkit zur Identifizierung einer Erkrankung, die mit einem erhöhten Wert an Aspartataminotransferase (AST) in einer Körperflüssigkeitsprobe eines Patienten einhergeht, wobei der Kit folgende Bestandteile umfaßt:

ein Aliquot einer gepufferten wäßrigen Cysteinsulfinsäure (CSA)-Lösung, die in einem Behälter für das Aliquot bereitgestellt wird;

eine Testplatte, die eine Vielzahl von Testvertiefungen aufweist, wobei die Testvertiefungen einen Triarylmethinfarbstoff enthalten, der mit Sulfitionen, je doch nicht mit CSA und AST reagiert, wobei jede der Testvertiefungen ein Volumen aufweist, das ausreicht, um die Flüssigkeitsprobe und einen Teil der CSA-Läsung aufzunehmen, die ausreicht, um mindestens einen Test durchzuführen.

7. Kit nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die CSA-Lösung ferner ein Netzmittel umfaßt.

8. Kit nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die CSA-Lösung ferner ein Akzeptorsubstrat umfaßt.

9. Kit nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die CSA-Lösung ferner ein Seguestriermittel umfaßt.

10. Kit nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Farbstoff Malachitgrün, Methylgrün, Guineagrün B, Ethylviolett, saures Fuchsin, basisches Fuchsin, Pararosanilinchlorid, Pararosanilinacetat oder Aurinnatriumsalz oder ein Additionssalz davon ist.

11. Kit nach einem der Ansprüche 6 bis 10 zur Identifizierung einer Zahnwurzelhauterkrankung, Herzkrankheit, Leberzirrhose, Hepatitis, eines Myocardinfarkts, einer Lungenembolie, akuter Pankreatitis eines Stauungsikterus, von Muskeldystrophie, akuter Dermatomyositis, Polymyositis, paroxysmaler Myoglobinurie, eines Glioblastoms, Schlaganfalls oder genuiner Epilepsie.

12. Verfahren zur Bestimmung der Menge an Aspartataminotransferase (AST) in einer Körperflüssigkeit eines Säugers, umfassend:

Inkontaktbringen einer Körperflüssigkeitsprobe des Säuge mit Cysteinsulfinsäure (CSA) und einem Triarylmethinfarbstoff, der im wesentlichen mit AST und CSA nicht reagiert, unter AST-Reaktionsbedingungen für einen Zeit raum, der ausreicht, um mindestens einen Teil des CSA in eine Produktspezies umzusetzen, die mit dem Farbstoff reagiert, so daß eine Signalspezies erzeugt wird; und

Bestimmung der Menge an erzeugter Signalspezies und damit der Menge an AST in der Probe.

13. Verfahren nach Anspruch 12, ferner umfassend die Messung der Geschwindigkeit der Signalspezieserzeugung.

14. Verfahren nach Anspruch 12, ferner umfassend die Bestimmung des Endpunktes der Reaktion von Indikator mit Produktspezies.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei der Indikator während der Reaktion eine sichtbare Spektraländerung zeigt.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei die AST-Reaktionsbedingungen ein gepuffertes wäßriges Medium mit einem pH-Wert im Bereich von etwa 6,0 bis etwa 9,0 umfassen.

17. Verfahren zum Nachweis einer mit AST im Zusammenhang stehenden Erkrankung in einem Patienten, wobei man eine Flüssigkeitsprobe des Patienten mit Cysteinsulfinsäure (CSA) in Gegenwart eines Triarylmethinfarbstoffes, der im wesentlichen nicht mit CSA und der Flüssigkeitsprobe reagiert, in Kontakt bringt und eine Reaktion der mit Sulfit reagierenden Verbindung nachweist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Erkrankung eine Zahnwurzelhauterkrankung, Herzkrankheit, Leberzirrhose, Hepatitis, ein Myocardinfarkt, eine Lungenembolie, akute Pankreatitis, ein Stauungsikterus, Muskeldystrophie, akute Dermatomyositis, Polymyositis, paroxysmale Myoglobinurie, ein Glioblastom, Schlaganfall oder genuine Epilepsie ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Erkrankung eine Zahnwurzelerkrankung ist und die Probe eine krevikuläre Flüssigkeit umfaßt.

20. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Probe Seren umfaßt.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, ferner umfassend die Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit der Sulfit-reaktiven Verbindung oder des Ausmaßes der Reaktion der Sulfit-reaktiven Verbindung.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 21, wobei das CSA zusammen mit einem Netzmittel, einem Akzeptorsubstrat oder einem Sequestriermittel vorliegt.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 22, wobei der Triarylmethinfarbstoff Malachitgrün, Methylgrün, Guineagrün B, Ethylviolett, saures Fuchsin, basisches Fuchsin, Pararosanilinchlorid, Pararosanilinacetat oder Aurinnatriumsalz oder ein Additionssalz davon ist.