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Photometrisches Hilfsmittel und Teststreifen
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zur Bestimmung der Konzentration von verschiedenen, in einer Lösung
enthaltenen Analyten
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren
und ein Hilfsmittel für die quantitative Bestimmung der einzelnen Blutkomponenten
und für die Durchführung anderer turbinometrischer und nephelometrischer Untersuchungen.
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Für die Analyse der Partikel- oder Zellenkonzentration im Blut stehen
bis jetzt automatisierte Apparaturen zur Verfügung, durch welche entweder die Reaktion
der Blutpartikel mit elektrischen Feldern oder die Reaktion der Blutpartikel mit
einer sichtbaren Strahlung gemessen werden. Die Apparaturen, bei denen die Blutanalyse
mittels elektrischer Felder durchgeführt wird, weisen einen ziemlich komplizierten
Aufbau im Vergleich zu den Apparaturen auf, mit denen die Blutanalyse optisch durchgeführt
wird, wobei aber diese optische Blutanalyse häufig ungenauer ist.
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Ein Nachteil der Apparaturen, bei denen die Blutanalyse zur Bestimmung
der Partikelkonzentration optisch durchgeführt wird, ist in der Tatsache begründet,
daß die zur Bestimmung der Partikelkonzentration benutzte Intensität der sichtbaren
Strahlung sich nicht linear mit den Veränderungen der Partikelkonzentration ändert.
Die Apparaturen, welche das nephelometrische und/oder turbinometrische Phänomen
nutzen, haben nämlich als Folge der zufälligen Lichtstreuung nichtlineare Kennlinien,
womit ihre Meßwerte nur sehr schwierig und damit entsprechend ungenau gedeutet werden
können. Wenn die optische Ausrüstung solcher Apparaturen für eine Linearisierung
der Meßwerte vervollständigt wird, dann wird damit sehr rasch ein Gesamtaufbau erhalten,
dessen komplexe Ausführung mit den Apparaturen vergleichbar ist, bei denen die Blutar.alyse
mittels elektrischer Felder durchgeführt wird. Für die Blutanalyse besteht daher
in der Bereitstellung einer einfachen optischen Apparatur mit sich in Abhängigkeit
von der Partikelkonzentration linear verändernden Meßergebnissen ein entsprechend
gesteigertes Bedürfnis.
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Zur Durchführung solcher Untersuchungen war es bis jetzt auch erforderlich,
die Proben getrennt mit den erforderlichen Testreagenzien zu vermischen, was einerseits
zeitaufwendig war und andererseits die Gefahr einer Verunreinigung der Proben bracht
Um diese Nachteile zu vermeiden, wurden Versuche mit einem Teststreifen oder mit
einem Gefäß durchgeführt, der bzw. das mit den tatsächlichen Testreagenzien imprägniert
wurde. Auch dabei ergab sich jedoch eine Reihe von Nachteilen, unter welchen vorrangig
der Nachteil zu benennen ist, daß es sehr schwierig und häufig unmöglich war, das
Gefäß und/oder das Material des Teststreifens zum Absorbieren und halT en in einem
stabilen Zustand der notwendiger Testreagenzien, Farbstoffe oder Enzyme anzupassen.
Wegen des Typs der entweder benutzten oder erzeugten Farbstoffe und aufgrund der
Tatsache, daß diese Farbstoffe nicht an das Gefäß oder an das Material des Teststreifens
molekular gebunden werden, erzeugen diese Farbstoffe auch keine stabile und dauerhafte
Farbe, womit die Untersuchungen bereits innerhalb einer relativ kurzen Zeit nach
Beendigung dor Reaktion ausgewertet werden müssen.
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Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine einfache optische
Apparatur für eine automatische Analyse des Partikelgehaltes in Blut enthaltenden
Lösungen bereitzustellen, wobei es die Apparatur vorzugsweise ermöglichen soll,
gleichzeitig zwei Bestandteile der Lösungen zu analysieren und nachzuweisen und
das Ausmaß der Agglutination der roten Blutzellen mit linearen Meßergebnissen zu
erfassen. Die lineare Ansprechempfindlichkeit einer solchen optischen Apparatur
soll zur Bestimmung der Partikelkonzentration im Blut und in anderen Lösungen gesteigert
werden können, wobei es auch möglich erscheinen sollte, gleichzeitig mit verschiedenen
Testreagenzien und Enzymen zu arbeiten, die dann ausgelaugt werden, wenn sie mit
der jeweiligen Probe in Berührung gebracht werden, wobei die verschiedenen
Testreagenzien
durch eine Farbänderung die Konzentration eines spezifischen Analyten nachzuweisen
erlauben. Die Farbveränderung soll vorzugsweise an einem Teststreifen dauerhaft
sein, damit auch noch nach einer längeren Zeit die jeweilige Analyse nachweisbar
ist.
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Zur Lösung dieser Aufgabe werden unter einem ersten Gesichtspunkt
der Erfindung die Partikelkomponenten des Blutes gezählt und das Ausmaß der Agglutination
mittels einer Apparatur bzw. mittels eines photometrischen Hilfsmittels bestimmt,
die bzw. das die Konzentration der Partikel oder die Geschwindigkeit, mit der sich
diese Konzentration ändert, und/oder eines anderen Materials, das als Folge einer
interaktiven Strahlung ein sichtbares Spektrum entwickelt, ermittelt. Die interaktive
Strahlung kann ein sichtbares Licht oder eine von radioaktiven Quellen ausgehende
Strahlung sein und kann entweder extern oder intern erzeugt werden. Dieser interaktiven
Strahlung wird eine transparente Küvette mit der Blut enthaltenden Lösung ausgesetzt,
wobei die Küvette in einer zentralen inneren Aushöhlung eines im breitesten Sinn
absorbierenden Körpers angeordnet und von diesem umgeben ist, der einen relativ
verengten Kanal aufweist, über welchen eine visuelle Verbindung zwischen der inneren
Aushöhlung und dem Äußeren dieses Körpers hergestellt ist. Ein Detektor, der ein
elektrisches Ausgangssignal aufweist und der wenigstens einen Teil des reagierenden
sichtbaren Strahlungsspektrums ermitteln läßt, ist dabei weiterhin so angeordnet,
daß er die über diesen relativ verengten Kanal vermittelte Strahlung auswerten kann.
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Die vorliegende Erfindung zeichnet sich damit in ihrem Hauptmerkmal
darin aus, daß der im breitesten Sinne absorbierende Körper bei der sichtbaren Strahlungswellenlänge
eine Strahlung als Meßgröße absorbiert, womit der bezüglich des Körpers bestehende
Streueeffekt der Strahlung ausgeschaltet und damit gleichzeitig die Linearität
der
Ansprechempfindlichkeit des Detektors vorteilhaft gesteigert wird.
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Unter einem anderen Gesichtspunkt der Erfindung werden Strahlungsquellen
benutz die in einer Anordnung außerhalb des Körpers vielfache Strahl, erzeugen,
um bezüglich wenigstens zweier Blutkomponenten gleichzeitig ein sichtbares Spektrum
zu erzeugen. Eine transparente Küvette enthält die Lösung mit den Blutpajtikelkomponenten
und ist in einer inneren Aushöhlung angepaßter Größe eines im breitesten Sinne absorbierenden
Körpers angeordnet und von diesem Körper umgeben. Der im breitesten Sinne absorbierende
Körper hat vier planparallele relativ verengte Kanäle, die eine Verbindung zwischen
der inneren Aushöhlung des Körpers und dessen Äußerem ergeben. Ein erster und ein
zweiter Kanal mit fluchtenden Achsen, die sich nach entgegengesetzten Richtungen
bezüglich der Aushöhlung ersirecken, und ein dritter und ein vierter Kanal mit ebenfalls
fluchtenden Achsen, die planparallel zu dem ersten und dem zweiten Kanal angeordnet
sind und sich ebenfalls in entgegengesetzten Richtungen bezüglich der Aushöhlung
erstrekken, sind für diesen Körper vorgesehen, außerhalb von welchem zwei Detektoren
mit elektrischen Signalausgängen angeordnet sind, von welchen der eine Detektor
für einen Empfang der Strahlung iiber den zweiten Kanal und der andere Detektor
für einen Empfang der Strahlung über den vierten Kanal angeordnet ist und beide
Detektoren wenigstens einen Teil des ermittelnden Strahlungsspektrums aufzeichnen
können.
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Ein weiteres kennzeichnendes Merkmal der Erfindung besteht mithin
darin, daß jedes zu zählende Partikel eine Strahlung bei der Wellenlänge on nur
einem der äußeren Strahlungsquellen absorbiert und/oder streut und daß jeder Detektor
nur auf eine der äußeren Strahlungsquellen
anspricht, wodurch jeder
Detektor die Konzentration eines bestimmten Partikels mißt.
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Unter einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung kann die Linearität
und die Stabilität der auf die Partikelkonzentration in dem Blut reagierenden sichtbaren
Strahlung'damit vergrößert werden, daß die roten Blutzellen mit einem bestimmten
Reagenzmittel gekerbt werden und die roten Zellenmembranen auf das Reac,znzmittel
in der optischen Brechungskraft angepaßt werten.
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Die Erfindung ist weiterhin darin vorteilhaft auszubilden, daß der
für die Analyse benutzte Körper mit einem Testreagens und/oder mit einem Enzym imprägniert
und getrocknet wird. Das Reagens und/oder das Enzym wird aus dem damit imprägnierten
Material des Körpers durch Wasser oder durch die Lösung einer Probe ausgelaugt,
womit ein für die Untersuchung zur Verfügung stehendes Testreagens erhalten wird.
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Wie bei den meisten Tests dieser Art kann eine quantitative Bestimmung
des anwesenden Analyten durch eine über wachung der Intensität der resultierenden
Farbe in übereinstimmung mit den vorerwähnten Merkmalen der Erfindung durchgeführt
werden.
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Nach einem anderen Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Teststreifen
aus demselben Material wie der vorerwähnte Körper bereit gestellt und mit Enzymen
und/oder anderen Reagenzien imprägniert. Wenn dieser Teststreifen in die zu untersuchende
Lösung eingetaucht wird, dann absorbiert er diese Lösung, so daß als Folge davon
die Reagenzien reagieren und eine Farbe erzeugt wird, deren Intensität zu der Konzentration
des Analyten in Beziehung steht, für dessen Nachweis die Untersuchung durcngeführt
wird. Der Teststreifen kann dann visuell oder mittels einer Apparatur ausgewertet
werden, um die Intensität der Farbe quantitativ zu messen.
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Die Erfindung wird nachfolgend für verschiedene Ausführungsformen
anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigt Fig. 1 e;. Schnit ansicht von oben
einer Zahlkammer, in welcher die ermittelte Strahlung aus dem radioaktiven Zerfall
von Isotopen resultiert, die der Lösung hiI>zugefügt sind, Fig. 2 eine Schnittansicht
von oben einer Zählkammer, blii welcher die einfallend- Strahlung durch eine außen
angeordnete, einzige monochromatische Quelle erzeugt wird und die gemessene Strahlung
die übermittelte Strahlung ist, Fig. 3 eine Schnittansicht von oben einer Zählkammer,
bei welcher die von einer äußeren monochromatischen Quelle erzeugte einfallende
Strahlung durch die Partikel eine Fluoreszenz erfährt, die gemessen wird, und Fig.
4 eine Schnittansicht von oben einer Zählkammer, bei welcher die einfallende Strahlung
durch zwei äußere monochromatische Quellen erzeugt wird.
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Bei der Ausführungsform gemäß Fig.1 ist eine transparente Hülle oder
Küvette 10 vorgesehen, die von einem rechteckigen Körper 12 umgeben und durch diesen
abgestützt ist, der eine äußere Oberfläche 14 und eine zentral angeordnete innere
Aushöhlung 16 aufweist. Die innere Aushöhlung 16 ist so dimensioniert, daß sie für
die Aufnahme der Küvette 10 genügend groß ist, andererse:s jedoch nur so genügend
klein, daß
für die Küvette eine ausreichende Abstützung zur Verfügung
steht. Der rechteckige Körper 12 ist mit einem realtiv verengten Kanal 18 versehen,
der eine Verbindung zwischen der inneren Aushöhlung 16 und der äußeren Oberfläche
14 des rechteckigen Körpers 12 herstellt. Ein für eine Photovervielfachung ausgebildeter
Detektor 20 ist bezüglich dieses relativ verengten Kanals 8 so angeordnet, daß er
jede über diesen Kanal übermit1elte Strahlung empfangen kann.
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Der Körper 12 muß nicht zwingend rechteckig ausgebildet sein, wie
es auch nicht zwingend ist, die Aushöhlung 16 kreisförmig auszubilden. ;sowohl der
Körper 12 als auch die Aushöhlung 16 können vielmehr jede beliebige Formgebung und
Größe aufweist, um damit eine Anpassung an den Typ des jeweils durchgeführten Tests
und auch an die Menge der für den Test benutzten Probe zu ergeben.
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Eine abgemessene Menge der zu untersuchenden Flüssigkeit wird einschließlich
eines Materials, das ein radioaktives Isotop wie C14 enthält, in der Küvette 10
angeordnet. Die Flüssigkeit enthält auch noch ein Material, das bezüglich des radioaktiven
Isotops eine Fluoreszenz entwickeln kann.
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Das Isotop C14 erzeugt eine charakteristische Strahlung, welche das
fluoreszierende Material in der Flüssigkeit erregt und eine Fluoreszenz bei Wellenlängen
zwischen 380 nm und 420 nm entwickelt. Diese Strahlung wird über den relativ verengten
Kanal 18 an den Detektor 20 übermittelt.
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Der Detektor 20 erfaßt die durch die Partikel in der Lösung erzeugte
Strahlung und erzeugt in Abhängigkeit davon ein elektrisches Ausgangssignal, dessen
Größe zu der Konzentration des Isotops C14 und damit auch zu der Konzentration des
dieses Isotop enthaltenden Materials proportional ist, womit dieses Ausgangssignal
des Detektors 20 in bekannter Weise durch eine Anzeigeeinrichtung für eine Anzeige
der Konzentration des Materials ausgewertet werden kann. Das Material können rote
Blutzellen oder ein anderes organisches Material sein, das sich mit dem Isotop C14
indizieren läßt.
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Das innerhalb der Küvette 10 enthaltene Material, wie das Material
21, ist nicht auf Zellenpartikel beschränkt, vielmehr ist damit jedes ein Isotop
enthaltendes Material gemeint, das in der Flüssigkeit durch das Isotop zur Fluoreszenz
erregt wird.
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Ein sehr wichtiges Merkmal der Erfindung besteht darin, daß der im
breitesten Sinne bzw. sehr ausgedehnt absorbierende Körper 12 aus einem Material
besteht, das nach einer Einfärbung eine Strahlung bei Wellenlängen zwischen 340
und 640 nm stark absorbiert. Jede durch den Detektor 20 erfaßte Strahlung besteht
daher aus der in der Flüssigkeit durch das erregte Material erzeugten Strahlung
und umfaßt folglich nicht eine Sekundärstrahlung, die durch eine Reflektion der
von den Seiten des Körpers 12 übermittelten Strahlung verursacht wird. Die Unterdrückung
dieser reflektierten Strahlung ist damit möglich, daß der Körper aus einem Material
besteht, das die Strahlung bei der Wellenlänge stark absorbiert, welche durch das
erregte Material erzeugt wird. In dieser Einzelheit unterscheidet sich die vorliegende
Erfindung sehr wesentlich vom Stand der Technik, in welchem ein nicht zur Absorption
fähiger Körper verwendet wird, der daher auch eine Streuung der erzeugten Strahlung
verursacht.
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Diese bezüglich der Wände des Körpers bestehende Streuung oder Reflektion
bewirkt ein Ansprechen des Detektors teilweise als Folge einer reflektierten Komponente
der Strahlung, wodurch das Ausgangssignal des Detektors unerwünscht nichtlinear
wird. Wenn demgegenüber erfindungsgemäß ein absorbierender Körper mit einem Absorptionsband
benutzt wird, das mit der Wellenlänge des durch den Detektor erfaßten Lichts übereinstimmt,
dann wird damit für den Detektor eine Ansprechempfindlichkeit erhalten, die insgesamt
eine Funktion des durch das erregte Material erzeugten Lichts erster Ordnung ist,
so daß sich das Ausgangssignal des Detektors linear mit der Konzentration des Isotops
C14 ändert.
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Der Körper 12 kann für diese weitgehende Absorption der Strahlung
aus einem Material wie Nylon IV gegossen oder geformt werden, wie es in Übereinstimmung
mit den US-PS'en 3 174 951 und 3 721 625 hergestellt wird. Dieses Nylon IV kann
mit handelsüblichen Farbstoffen gefärbt werden, um es über das gesamte sichtbare
Spektrum und das ultraviolette Spektrum für eine Strahlung stark absorbierend zu
machen.
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Um das Nylon IV über einen so breiten Bereich an Wellenlängen stark
absorbierend zu machen, kann es insbesondere mit den handelsüblichen Farbstoffen
der Firmen Crompton & Knowles Corporation, Reading, Pennsylvania, oder Barson
Corporation, Stamford, Connecticut, gefärbt werden. Um das Nylon IV für Wellenlängen
zwischen 340 nm bis 640 nm absorbierend zu machen, können dafür insbesondere die
folgenden Farbstoffe dieser Firmen benutzt werden: Altco Fast Black, Super Nylite
Black 40R, Intralow Black BGL, Nylonthrene Black GLRT, Azoanthrene Jet Black K,
Direct Black E und Intrachrome Black WA.
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Zum Einfärben des Nylon IV werden die von diesen Firmen für die einzelnen
Farbstoffe empfohlenen Verfahren benutzt. Damit ist sichergestellt, daß das mit
solchen Farbstoffen eingefärbte Nylon IV bei den sichtbaren und ultravioletten Wellenlängen
stark absorbierend ist, so daß alle von dem Detektor 20 gesammelte Strahlung nur
die von den erregten Partikeln in der Lösung ausgehende Strahlung ist und mithin
nicht eine Strahlung, die von den Wänden des Körpers 12 reflektiert wird.
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Bei der Ausführungsform gemäß Fig.2 ist wiederum eine transparente
Küvette oder Hülle 10 vorgesehen, die von einem rechteckigen Körper 12 umgeben ist,
der eine äußere Oberfläche 14 und eine zentral angeordnete innere Aushöhlung 16
aufweist. Die zentrale Aushöhlung 16 ist wiederum so genügend groß bemessen, daß
darin die Küvette 10 mit einer genügenden Abstützung angeordnet werden kann. Der
Körper 12 unterscheidet sich bei dieser Ausführungsform darin von
der
Ausführungsform gemäß Fig.1, daß hier zwei relativ verengte Kanäle 18 und 24 ausgebildet
sind, die axial fluchtend zueinander angeordnet sind und bezüglich der inneren Aushöhlung
16 nach entgegengesetzten Richtungen eine Verbindung zwischen der Aushöhlung 16
und der äußeren Oberfläche 14 des rechteckigen Körpers 12 herstellen. Nahe der äußeren
Oberfläche 14 des Körpers 12 ist ein Feststoffdetektor 20' so angeordnet, daß er
die über den Kanal 18 übermittelte Strahlung erfassen kann. Auch solche Feststoffdetektoren
20' sind handelsüblich, so daß dafür beispielsweise eine Silizium-Photozelle der
Firma Hammatmatsu verwendet werden kann.
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Bei der Ausführungsform gemäß Fig.2 wird eine gemessene Menge einer
Blut enthaltenden Lösung, in welcher die Partikelkomponente beliebig verteilt ist,
in der Küvette 10 angeordnet. Ein außerhalb erzeugtes monochromatisches Licht mit
einer Wellenlänge von 420, 540 oder 578 nm wird über den ersten relativ verengten
Kanal 24 in die Aushöhlung 16 gelenkt. Das monochromatische Licht durchdringt die
Zellenmembran und wird durch das Oxyhämoglobin in der roten Zelle stark absorbiert,
womit die Partikelanzahl in dem Lichtpfad dann direkt proportional zu der Menge
des absorbierten Lichts ist. Das durch die Lösung hindurch übermittelte Licht wird
über den relativ verengten Kanal 18 in Richtung des Feststoffdetektors 20' gelenkt,
womit die durch den Detektor 20' empfangene Intensität der Strahlung in dem Ausmaße
abnimmt, wie die Konzentration der Partikel zunimmt. Der Ausgang des Detektors kann
daher wiederum mittels einer Anzeigeeinrichtung für eine Anzeige der Zellenkonzentration
des Blutes ausgewertet werden.
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Um die Zellenkonzentration des Blutes unter Verwendung einer äußeren
Strahlungsquelle in der Ausführungsform gemäß Fig.2 bestimmen zu können, muß auch
noch die Formgebung der Zellen zusätzlich berücksichtigt werden. Die Blutzellen
sind gewöhnlich flach und gegenüber Licht
transparent, womit ihre
Ansprechempfindlichkeit auf einfallendes Licht abhängig ist von der Orientierung
jeder Zelle in bezug auf die Achse des übermittelten Lichts und auch abhängig von
der Wirbelbewegung der Zellen innerhalb der Lösung. Eine vermehrt lineare Ansprechempfindlichkeit
des Detektors auf das übermittelte Licht kann damit erhalten werden, daß die Blutzellen
zuerst mit einem geeigneten Reagenzmittel gekerbt werden. Eine vollständige Kerbung
der Zellen ist damit erreichbar, daß zu etwa einem Teil Blut etwa 250 bis 2000 Teile
und vorzugsweise etwa 300 bis 750 Teile einer hypertonischen Lösung hinzugefügt
werden, die destilliertes Wasser enthält, welchem etwa 1 Gew.-% bis 9 Gew.-% und
vorzugsweise 2 Gew.-% bis 4 Gew.-% eines Salzes und etwa 1 Gew.-% bis 8 Gew.-% und
vorzugsweise 4 Gew.-% bis 6 Gew.-% eines Polysaccharids hinzugefügt sind, wobei
der gesamte Anteil des Alzes und des Polysaccharids etwa 2 Gew.-% bis 17 Gew.-%
und vorzugsweise etwa 6 Gew.-bis 10 Gew.-% beträgt. Es wurde festgestellt, daß eine
Lösung mit einem Teil Blut und 500 Teilen einer hypertonischen Lösung, die aus destilliertem
Wasser mit etwa 3 Gew.-% Natriumbenzoat und 6 Gew.-% Dextran und einem mittleren
Molekulargewicht von etwa 200000 bis 300000 befriedigende Ergebnisse bringt. Diese
Lösungen können im übrigen etwa 1 Gew.-% bis etwa 4 Gew.-% eines Plasmaexpanders,
wie Polyvinylperrolidon, enthalten. Das Blut wird mit dieser hypertonischen Lösung
stark vermischt und das Gemisch wird dann über wenigstens eine Minute stehen gelassen,
damit alle Zellen genügend gekerbt sind.
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Mit einer Lösung der vorerwähnten Zusammensetzung können nicht nur
die roten Blutzellen gekerbt werden, vielmehr wird damit auch ein Lösung bereit
gestellt, die einen im wesentlichen mit der roten Blutmembrane übereinstimmenden
Brechungsindex aufweist, womit das reflektierte Licht verringert und somit die lineare
Ansprechempfindlichkeit des Detektors verbessert wird. Es muß weiterhin gewährleistet
sein, daß die wirksame Gesamtfläche des in dem Lichtpfad
konzentrierten
Hämoproteins der roten Zellen im Vergleich zu der Gesamtfläche des einfallenden
Lichtstrahls klein ist.
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Ein geeignetes Verhältnis der Fläche des Hämoproteins zu der Fläche
des Lichtstrahls ist 1:10. Dieses Verhältnis ist mit einer geeigneten Verdünnung
der Lösung erreichbar und stellt sicher, daß mit einem größer oder kleiner werdenden
Zellenvolumen keine Zählfehler entstehen. Auch bei Veränderungen des mittleren korpuskularen
Volumens werden bei Einhaltung dieses Verhältnisses, das im übrigen auch bei der
Ausführungsform gemäß Fig.4 sichergestellt werden sollte, Zählfehler auf ein Minimum
reduziert.
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Auch bei der Ausführungsform gemäß Fig.2 wird der Körper 12 vorteilhaft
aus einem Material gefertigt, das bei der Wellenlänge der Strahlung absorbierend
ist, die durch die äußere monochromatische Lichtquelle übermittelt wird. Als geeignetes
Material erweist sich auch hier wiederum das Nylon IV in der Zusammensetzung und
in der Herstellung gemäß den US-PS'en 3 174 951 und 3 721 625 und in einer Einfärbung
mit den vorerwähnten Farbstoffen. Da das Material des Körpers 12 bei der Wellenlänge
der übermittelten Strahlung absorbierend ist, ändert sich die Intensität der gemessenen
Strahlung linear mit der Partikelkonzentration und wird nicht durch Reflektionen
von den Wänden des Körpers 12 beeinflußt, weil die Wände des Körpers ebenfalls absorbierend
sind.
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Bei der Ausführungsform gemäß Fig.3 ist eine Küvette 10 in einer inneren
Aushöhlung 16 eines wahlweise absorbierenden Körpers 12 angeordnet, der noch zusätzlich
mit einem Filter 22 versehen ist. Im Gegensatz zu der vorbeschriebenen Ausführungsform
ist hier der relativ verengte Kanal 24' senkrecht zu dem relativ verengten Kanal
18 ausgerichtet, wobei er aber wie dieser eine Verbindung zwischen der Aushöhlung
16 und der äußeren Oberfläche 14 des Körpers 12 herstellt. Diese Ausführungsform
eignet sich insbesondere bei der Verwendung einer außerhalb angeordneten monochromatischen
Lichtquelle,
durch welche eine Probe zur Erzeugung einer Fluoreszenz erregt wird. Wenn eine Lichtquelle
benutzt wird, durch welche eine Fluoreszenz erzeugt werden soll, dann besteht damit
immer das Problem, daß der Detektor eine Unterscheidung zwischen der Lichtquelle
und der durch die Fluoreszenz erzeugten Strahlung vornimmt. Diese Unterscheidung
ist nötig, damit der Ausgang des Detektors genau übereinstimmt mit der Partikelkonzentration.
Wenn die relativ verengten Kanäle 18 und 24' rechtwinklig zueinander ausgebildet
werden, dann ist damit sichergestellt, daß der Detektor 20' gegen den direkten Strahl
der äußeren monochromatischen Lichtquelle abgeschirmt ist und damit seine lineare
Ansprechempfindlichkeit verbessert wird, weil alles auf den Detektor einfallende
Licht durch die Fluoreszenz erzeugt wird, die aus der Lösung erhalten wird. Durch
den Filter 22 wird außerdem die Strahlung in der Frequenz des einfallenden Lichts
blockiert, wodurch ebenfalls die Genauigkeit der Auswertung verbessert wird. Bei
dieser Ausführungsform kann das einfallende Licht beispielsweise eine Wellenlänge
von 366 nm und die Fluoreszenz eine Wellenlänge von 450 nm haben.
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Der Körper 12 besteht im übrigen auch bei dieser Ausführungsform wiederum
aus einem bei den Wellenlängen des fluoreszierten Lichts und des einfallenden Lichts
stark absorbierenden Material. Dadurch wird die lineare Ansprechempfindlichkeit
des Detektors in Übereinstimmung mit den vorstehenden Hinweisen verbessert. Wenngleich
es möglich ist, das Material so zu wählen, daß es sowohl bezüglich der Wellenlänge
des fluoreszierten Lichts als auch des äußeren Lichts absorbierend ist, sollte sein
Absorptionsvermögen hauptsächlich auf die Wellenlänge des fluoreszierten Lichts
abgestimmt werden.
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Bei der Ausführungsform gemäß Fig.4 ist wiederum ein absorbierender
Körper 12 mit einer Aushöhlung 16 vorgesehen, in der eine Küvette 10 angeordnet
wird. Weiterhin ist ein
Filter 22 an dem zu dem Kanal 24 fluchtend
angeordneten Kanal 18 vorgesehen. Diese Ausführungsform unterscheidet sich darin
von der Ausführungsform gemäß Fig.3, daß hier zwei weitere relativ verengte Kanäle
26 und 32 vorgesehen sind, wobei an dem Kanal 26 ein weiterer Filter 28 und ein
weiterer Detektor 30 in der gleichen Beziehung zu dem Kanal 32 angeordnet sind,
wie der Filter 22 und der Detektor 20' an dem Kanal 18 in bezug auf den Kanal 24
angeordnet sind. über den Kanal 32 wird der außerhalb erzeugte Strahl einer zweiten
monochromatischen Lichtquelle in die Aushöhlung 16 gelenkt.
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Mit der Ausführungsform gemäß Fig.4 ist die gleichzeitige Messung
der Konzentration von zwei Blutkomponenten, so insbesondere die Konzentration der
weißen Blutzellen und die Konzentration der Plättchen, möglich. Es wird dafür die
Wellenlänge der äußeren Lichtquelle A auf 420 nm und die Wellenlänge der äußeren
Lichtquelle B auf 460 nm eingestellt. Vor der Messung der Konzentration der weißen
Blutzellen und der Plättchen müssen die roten Blutzellen aus der Lösung entfernt
werden, da sie sich nachteilig auf die Reflektion und die Absorption der zur Bestimmung
der Konzentration der weißen Blutzellen und der Plättchen benutzten Lichtquellen
auswirken. Wenn die das Blut enthaltende Lösung mit dem Reagenzmittel behandelt
worden ist, das oben in Verbindung mit der Ausführungsform gemäß Fig.2 beschrieben
wurde, und die roten Blutzellen entfernt wurden, dann reflektieren die Blutplättchen
das Licht bei einer Wellenlänge von 420 nm und sind bei einer Wellenlänge von 460
nm bezüglich des Lichts vollständig transparent. Das von der Lichtquelle A mit einer
Wellenlänge von 420 nm ausgestrahlte Licht wird daher von den Blutplättchen reflektiert
und von dem Material des Körpers 12 absorbiert, so daß an dem Detektor 20' nur die
Konzentration der Plättchen ausgewertet werden kann.
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Gleichartig wird das von der Lichtquelle B mit einer Wellenlänge von
460 nm ausgestrahlte Licht von den weißen
Blutzellen absorbiert,
so daß an dem Ausgang des Detektors 30 die Konzentration der weißen Blutzellen ermittelt
werden kann. Die Filter 22 und 28 dienen dem Zweck, das Licht der Wellenlängen von
460 nm bzw. von 420 nm auszufiltern, womit die Messungen an den Detektoren 20' und
30 genauer werden.
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Auch bei dieser Ausführungsform ist wiederum das Material des Körpers
12 so gewählt, daß es bei diesen maßgeblichen Wellenlängen von 420 nm und 460 nm
absorbierend wirkt, um damit in Verbindung mit einer entsprechenden Einfärbung die
lineare Ansprechempfindlichkeit der Detektoren für eine entsprechend genaue Messung
der Konzentrationen zu verbessern.
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Die einzelnen vorbeschriebenen Ausführungsformen können auch für die
Bestimmung des Grades der Agglutination der roten Blutzellen benutzt werden. Da
die roten Blutzellen agglutinieren, wird ihre gezählte Anzahl in dem Ausmaß abnehmen,
wie sich diese roten Blutzellen bei einer bestimmten Rate vereinigen. Wegen der
verbesserten linearen Ansprechempfindlichkeit kann daher der Grad der Agglutination
der roten Blutzellen wesentlich genauer bestimmt werden.
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Für eine vorteilhafte Ausbildung der Erfindung wird das Nylon IV des
Körpers 12 mit einem oder mehreren Enzymen oder Reagenzien imprägniert, um damit
unterschiedliche Blutuntersuchungen oder auch Untersuchungen an Urinproben durchführen
zu können. Ein Hinweis auf diese Möglichkeiten, die nachstehend nur beispielhaft
näher erläutert werden, ist jedoch nicht einschränkend zu verstehen, vielmehr kann
die Erfindung generell für eine Bestimmung der Konzentration einer Vielzahl von
Komponenten und/oder Verunreinigungen in zahlreichen Lösungen benutzt werden.
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Die Imprägnierung des Nylon IV wird damit erhalten, daß das Nylon
IV zunächst in die Reagens lösung eingetaucht und von ihm dann der Feuchtigkeitsgehalt
entfernt wird, wodurch das Nylon IV mit einem trockenen Reagensmittel
imprägniert
ist. Wenn Wasser oder eine zu untersuchende Lösung mit dem Nylon IV in Berührung
gebracht wird, dann werden aus diesem die Enzyme und andere Reagensbestandteile
ausgelaugt, womit ein arbeitsfähiges Testreagens zur Verfügung steht. Wenn die Reaktion
zwischen der Probe und dem Testreagens abgeschlossen ist, dann weist das Testreagens
eine Farbe auf, nach deren Intensität sich die Konzentration des Analyten bestimmen
läßt.
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Das Nylon IV muß vor seiner Imprägnierung trocken sein, damit es seine
maximale Absorptionsfähigkeit entwickelt.
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Durch diese Trockenheit wird sichergestellt, daß eine genügende Menge
des Enzyms und anderer reagierender Bestandteile bei der Rückbildung zur Verfügung
steht. Als Folge der Reaktion, die normal zwischen den Enzymen, Reagenzien und zu
untersuchenden Proben stattfindet, kann eine überschüssige Menge an Enzymen und/oder
Reagenzien anwesend sein, so daß es folglich nicht erforderlich ist, ihre zur Imprägnierung
benötigte Menge zu beschränken.
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Das Absorptionsvermögen des Nylon IV bei einer solchen Imprägnierung
durch ein Eintauchen kann vorteilhaft durch eine vorhergehende Vakuumtrocknung unterstützt
werden.
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Das Nylon IV sollte in Abhängigkeit von den Abmessungen des Körpers
12 und in Abhängigkeit von dem jeweils gewählten Imprägnierungsmittel zwischen etwa
1 und 90 Minuten und vorzugsweise zwischen 15 und 60 Minuten in das Imprägnierungsmittel
eingetaucht werden. Je größer der Körper 12 ist und daher je mehr Reagensmittel
für die Imprägnierung benötigt wird, desto länger sollte die Eintauchzeit sein.
Nach dem Eintauchen wird das Nylon IV aus der Lösung entfernt und bei Raumtemperatur
getrocknet. Nach dieser Trocknung sollte der Körper 12 bei Temperaturen zwischen
etwa OOC und 49C aufbewahrt werden, um die Stabilität der Reagenzien und Enzyme
zu wahren.
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Für den Gebrauch wird eine abgemessene Menge der zu untersuchenden
Probe, die mit einem geeigneten Lösungsmittel verdünnt sein kann, in dem Körper
angeordnet, wodurch die Enzyme und andere Reagenzien aus dem Nylon IV ausgelaugt
werden und damit eine arbeitsfähige Testlösung zur Verfügung steht, die in Abhängigkeit
von dem Typ der anwesenden Reagenzien einen spezifischen Farbwechsel erfährt. Die
Intensität der Farbe, die wie vorbeschrieben gemessen wird, wird dann für eine quantitative
Berechnung der Konzentration des jeweiligen Analyten benutzt, der für diese Untersuchung
ermittelt werden soll.
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Wenngleich vorstehend davon ausgegangen wurde, daß alle Enzyme und/oder
Reagenzien zur Imprägnierung der Wände des Körpers 12 benutzt werden, soll dieser
Hinweis so verstanden sein, daß zunächst weniger als alle Bestandteile imprägniert
werden können und die restlichen Bestandteile dann erst zum Zeitpunkt der Untersuchung
einer Probe dem Körper hinzugefügt werden. Diese spätere Hinzufügung ist besonders
in den Fällen vorteilhaft, wo ein einziges Enzym für die Bestimmung der Konzentration
von mehreren verschiedenen Analyten in Abhängigkeit von bestimmten Reagenzien in
der Kombination mit diesem Enzym benutzt wird.
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Die Erfindung kann für verschiedene Blut- und Urinanalysen benutzt
werden. Um den Blutharnstoff zu bestimmen, wird das Urease-Verfahren unter Verwendung
von Diazetylmonoxyim angewandt. Bei diesem Verfahren wird das Serum mit dem Enzym
Urease zur Reaktion gebracht, aus dem Stickstoff entweicht, der sich dann mit den
verschiedenen Reagenzien, einschließlich eines Chromogens, zur Bildung einer Farbe
koppelt, deren Intensität spektrophometrisch gemessen wird. Das Nylon IV wird folglich
in diesem Fall mit einer sowohl das Enzym Urease als auch Phenolhypochlorit enthaltenden
Lösung imprägniert, wobei auch noch ein Katalysator anwesend sein kann, um die Reaktion
zu vervollständigen. Unter dem Einfluß des zu untersuchenden Serums werden das Enzym
Urease und die Reagenzien aus dem Nylon IV ausgelaugt, so daß der
in
dem Serum enthaltene Harnstoff mit dem Enzym reagieren kann. Der bei dieser Reaktion
entweichende Stickstoff reagiert mit dem Hypochlorit und bildet nachfolgend eine
Koppelung mit dem Phenol, wodurch ein Chromogen, nämlich Indophenol Blau gebildet
wird. Die Intensität der Farbe ist der Konzentration des Harnstoffes proportional
und kann daher zur Bestimmung dieser Konzentration durch eine Bestrahlung mit Licht
einer Wellenlänge zwischen 580 nm und 640 nm bestimmt werden. Diese Untersuchung
einer Probe kann sowohl einstufig als auch zweistufig durchgeführt werden.
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Die Erfindung kann auch für die Bestimmung des Cholesteringehaltes
im menschlichen Serum benutzt werden. Für diese Untersuchung wird ein Testreagens,
bestehend aus den Enzymen Lipase und Oxydase, Aktivatoren und Phenol vorbereitet.
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Diese Lösung wird dann zur Imprägnierung des Nylon IV benutzt, das
alternativ auch nur mit den Enzymen Lipase und Oxydase imprägniert werden kann,
während die Aktivatoren und Phenole mit dem Nylon IV erst gemeinsam mit der zu untersuchenden
Probe in Berührung gebracht werden. Die Enzyme und/oder Testreagenzien werden auch
in diesem Fall aus dem Nylon IV ausgelaugt, sobald damit das Serum in Berührung
gebracht ist und die Reaktion einsetzt. Die Cholesterinester werden dabei durch
das Enzym Lipase hydrolysiert, so daß freies Cholesterin und Fettsäure gebildet
werden. Das Cholesterin wird in einer durch das Cholesterin-Oxydase (CO) katalysierten
Reaktion zu Cholest-4-en-3-eins und Wasserstoffperoxyd oxydiert. Das Peroxydase
(POD) katalysiert dann die Reaktion zwischen dem Wasserstoffperoxyd, 4-Aminoantipyrin
und Phenol zur Erzeugung eines Quinineimins, das ein maximales Absorptionsvermögen
bei einer Wellenlänge von 510 nm aufweist.
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Die Intensität der erzeugten Farbe ist direkt proportional zu der
in der Probe vorhandenen Gesamtmenge des Cholesterins.
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Die Intensität wird dann zur Bestimmung des Cholesteringehaltes gemessen.
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Die Erfindung ist weiterhin auch auf die Bestimmung des Glukosegehalts
in einem Serumplasma oder im Urin anwendbar. Das Nylon IV wird für diesen Zweck
mit Glukose-Oxydase, Peroxydase, 4-Aminoantipyrin und Phenol imprägniert. Alternativ
kann das Nylon IV auch mit einem Gemisch aus Glukose-Oxydase und Peroxydase imprägniert
werden, während 4-Aminoantipyrin und Phenol erst später mit dem Nylon IV zusammen
mit der Probe in Berührung gebracht werden. Durch die Glukose-Oxydase wird alles
in der Probe enthaltene Glykose zu Glukonsäure und Wasserstoffperoxyd oxydiert.
Das Wasserstoffperoxyd reagiert in Anwesenheit der Peroxydase mit 4-Aminoantipyrin
und Phenol und bildet eine rote Farbe, deren Intensität zu der Glukose-Konzentration
proportional ist und photometrisch mit einer Wellenlänge von 510 nm gemessen werden
kann.
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Um einen spezifischen Test durchzuführen, wird ein aus Nylon IV bestehender
Teststreifen mit einer Lösung aus Peroxydase, Glukoseoxydase und den zur Bildung
einer roten Farbe bei Anwesenheit von Glukose notwendigen Reagenzien imprägniert
und anschließend getrocknet, verpackt und bis zu seiner Benutzung aufbewahrt. Wenn
dieser Teststreifen dann in das zu untersuchende Serum oder in den Urin eingeführt
wird, dann absorbiert dabei das Nylon IV die Testlösung, wodurch die vorstehend
beschriebene Reaktion stattfindet und sich schließlich eine Farbe ausbildet, die
visuell oder mittels einer Apparatur in Abhängigkeit von der Intensität ausgewertet
werden kann. Der Teststreifen behält dabei abweichend von den bekannten Teststreifen
seine einmal erhaltene Farbgebung dauerhaft bei, weil das Nylon IV dafür ein entsprechendes
molekulares Gefüge und entsprechende Absorptionseigenschaften aufweist. Es ist daher
nicht erforderlich, diese Auswertung sofort anzuschließen, vielmehr kann diese Auswertung
auch erst viel später durchgeführt werden.
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Bei der Auswahl der Enzyme und/oder Reagenzien, die mit dem Nylon
IV zusammengebracht werden, muß berücksichtigt
werden, daß die
Absorption dieser Materialien auf molekularer Ebene stattfindet, so daß ihr Molekulargewicht
und die Größe zwingend beachtet werden müssen, da Materialien mit einer zu großen
Molekulargröße nicht durch das Nylon IV absorbiert werden. So können beispielsweise
verschiedene Lipide wegen ihrer großen Molekulargröße nicht benutzt werden, da sie
nicht in das Gefüge des Nylon IV eindringen, während andererseits Analyte, wie Glukose
oder Cholesterin, ohne weiteres eindringen können.
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Die folgenden Enzyme werden von Nylon IV in befriedigender Weise absorbiert:
Glukoseoxydase, Laktatoxydase, Pyrivatoxydase, Glyzerinoxydase, Alkoholoxydase,
Urease, Lipase und Peroxydase. Gleichartig werden die folgenden Chromogene befriedigend
absorbiert: 4-Aminoantipyrin, 4-Aminophenazon und die Tetrazoliumsalze.
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Es wurde gefunden, daß diese selektive Absorption durch Nylon IV die
Genauigkeit der Testergebnisse vielfach vergrößert, da damit das Ausmaß der lipämischen
Interferenz, die bei solchen Tests gewöhnlich staffindet, begrenzt wird.
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Die lipämische Interferenz ist die Interferenz von großen molekularen
Verbindungen mit der Grenzfläche der Testreagenzien und der zu untersuchenden Serumkomponenten.
Wegen der überragenden Eigenschaften von Nylon IV können diese großen Moleküle an
einem Eindringen in das Material des Teststreifens gehindert werden, womit auch
diese Interferenz mit der Grenzfläche der Serumkomponenten und der Testreagenzien,
mit denen der Teststreifen imprägniert ist, vermieden wird.
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Obwohl die Abmessungen des Teststreifens veränderlich sein können,
sollte für die nachfolgende Auswertung berücksichtigt werden, daß dafür der Teststreifen
einem Lichtstrahl ausgesetzt werden muß, so daß die Streifen nicht zu dick sein
dürfen, um den Lichtpfad nicht wesentlich zu behindern. Eine Dicke der Teststreifen
von etwa o,25 bis 2 mm
ist daher zweckmäßig, weil mit dieser Dicke
der Teststreifen ausreichende Mengen der Reagenzien absorbiert werden können und
das Licht dann noch durch diese Streifen hindurchgehen kann.