DE2801476A1 - Kolorimetrisches verfahren fuer die bestimmung von bilirubin - Google Patents

Description

Kolorimetrisches Verfahren für die Bestimmung von Bilirubin.

Die Erfindung betrifft ein kolorimetrisches Verfahren für die Bestimmung von Bilirubin in einer wäßrigen Flüssigkeit sowie ein analytisches Element zur Durchführung des Verfahrens.

Bilirubin ist bekanntlich ein Abbauprodukt des Hämoglobins. Es ist des weiteren bekannt, daß täglich ungefähr 6 bis 7 g Hämoglobin von beschädigten oder alten roten Blutkörperchen freigesetzt werden. Von diesem Hämoglobin, das innerhalb der Leber, Milz und des Knochenmarkes rasch abgebaut wird, werden vom normalen erwachsenen Menschen täglich ungefähr 200 bis 230 mg Bilirubin sowie Bilirubinderivate erzeugt. Infolge normaler metabolischer Verfahren, die sich im menschlichen Körper abspielen, wird der größte Teil des täglich erzeugten Bilirubins ausgeschieden oder zu anderen Derivaten abgebaut.

In einigen Fällen jedoch treten innerhalb des menschlichen Körpers übermäßige Mengen an Bilirubin auf, und zwar als Folge einer Überproduktion desselben, z.B. im Falle einer übermäßigen Hämolyse oder durch Zurückhaltung des Bilirubins, z.B. als Folge eines Leberversagens.

Die Folge einer übermäßigen Bilirubinmenge im menschlichen Körper ist die Gelbsucht. Diese bekannte pathologische Erscheinung ist gekennzeichnet durch merklich erhöhte Serum-Biirubin-Spiegel, beispielsweise 10 mg Bilirubin pro dl Serum oder noch größere Mengen, im Vergleich zu dem normalen erwachsenen Menschen, der ungefähr 0,1 bis etwa 1 mg Bilirubin pro dl Serum enthält. Die erhöhte Bilirubinkonzentration ist dabei in der Regel durch eine bräunlich-gelbe Pigmentation der Haut und/oder der Schleimhäute begleitet. Des weiteren gibt es mehr und mehr Anhaltspunkte dafür, daß größere Mengen an Bilirubin im Blut zu einem unerwünschten Anstieg der Bilirubinkonzentration innerhalb der Körperzellen führen und störend in verschiedene Zellularprozesse eingreifen. So ist beispielsweise Bilirubin ein potenter Inhibitor vieler enzymatischer Reaktionen, die Energie

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erzeugen, die für die Zellen lebenswichtig ist. Aus dem vorstehenden ergibt sich, daß die klinische Diagnostizierung von Bilirubin in Untersuchungen der Leberfunktion und anderen Organen von großer Bedeutung ist.

In der Literatur werden zahlreiche Verfahren zur Bestimmung von Bilirubin beschrieben. Eine gute Obersicht über verschiedene bekannte Bilirubin-Bestimmungsmethoden findet sich beispielsweise in dem Buch von R.J. Henry, D.C. Cannon und J.W. Winkelman "Clinical Chemistry-Principles and Technics", Verlag Harper and Row Publishers, 2. Ausgabe (1974), Seiten 1042 bis 1079. Eine weitere Obersicht über Bilirubin-Bestimmungsverfahren findet sich in dem Buch von N.W. Tietz, "Fundamentals of Clinical Chemistry", Verlag W.B. Saunders Co. (1970), Seiten bis 762.

Das vielleicht am häufigsten angewandte analytische Verfahren für die Bestimmung von Bilirubin ist die sogenannte Diazomethode. Dieser Diazomethode liegt eine Kupplungsreaktion des Bilirubins mit einem Diazoniumsalz, z.B. der Diazosulfanilsäure zugrunde, unter Bildung eines Pigmentes mit einem Extinktionskoeffizienten, der größer ist als der Extinktionskoeffizient des Bilirubins selbst (das eine gelbe Färbung aufweist).

In typischer Weise besteht das Diazoreaktionsverfahren der BiIirubinbestimmung aus zwei kinetischen Phasen: Zunächst läuft eine sogenannte "direkte Reaktion" ab, in der rasch eine Farbbildung auftritt, worauf sich eine "indirekte Reaktion" anschließt, in der ein Farbton lediglich nach Zugabe von Methanol entwickelt wird.

Wie sich aus den zitierten Literaturübersichten ergibt, insbesondere der Übersicht in dem Buch "Clinical Chemistry-Principles and Technics", besteht eine gewisse Unklarheit in bezug auf was diese beiden kinetischen Phasen tatsächlich aussagen. Einige Forscher betrachten die direkte Reaktion als Maß für ungebundenes oder freies Bilirubin, während die indirekte Reaktion als Maß für Albumin-gebundenes Bilirubin betrachtet wird.

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Andere Forscher sind der Auffassung, daß die direkte Reaktion ein Maß für konjugiertes Bilirubin ist, wohingegen bei der indirekten Reaktion die unkonjugierte Form des Bilirubins gemessen wird.

Abgesehen von der beschriebenen Unklarheit, die bezüglich der Diazo-Bilirubin-Bestimmungsmethode besteht, ergibt sich aus dem zitierten Buch "Clinical Chemistry-Principles and Technics", daß im Hinblick auf die vielen Varianten der Diazomethode und der Komplexizität der Diazoreaktion selbst oftmals sehr verschiedene analytische Ergebnisse erhalten werden. Im übrigen ist das Diazo-Bestimmungsverfahren auch deshalb nachteilig, weil zu seiner Durchführung verschiedene Reagenzien erforderlich sind, die erst kurz vor Durchführung des Verfahrens miteinander vermischt werden können und weil das Bestimmungsverfahren zeitaufwendig ist. Hinzu kommt schließlich noch, daß es auch störanfällig ist, weil andere Komponenten im. menschlichen Serum und anderen biologischen Flüssigkeiten auf eine Diazotierung ansprechen.

Abgesehen von dem beschriebenen Diazo-Bestimmungsverfahren und Varianten hiervon für die Bestimmung von Bilirubin sind eine Anzahl anderer Bilirubin-Bestimmungsverfahren bekannt geworden. So sind beispielsweise verschiedene direkte, spektrophotometrische (d.h. kolorimetrische) Bestimmungsverfahren für Bilirubin bekannt geworden, die die dem Bilirubin eigene molare Absorptionsfähigkeit ausnutzen. D.h., freies Bilirubin ist ein gelbes Pigment mit einer molaren Absorption von etwa 5 χ 10 , gemessen bei 435 Nanometern. Obgleich jedoch die molare Absorption des Bilirubins groß genug ist, um in verschiedenen direkten spektrophotometrischen Lösungsmethoden ausgenutzt werden zu können, ist sie jedoch nicht hoch genug, um eine gute quantitative Bestimmung des Billirubins unter Verwendung "trocken arbeitender" analytischer Testelemente zu ermöglichen, beispielsweise eine Anwendung solcher analytischer Elemente, tfie sie beispielsweise aus der US-PS 3 992 158 bekannt sind. Dies bedeutet, daß die bis heute bekannt gewordenen direkten spektrophotometri-

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sehen Bestimmungsverfahren für Bilirubin im allgemeinen auf Lösungs-Bestimmungsverfahren beschränkt sind, und zwar insbesondere in den Fällen, in denen genaue quantitative Ergebnisse erwünscht sind.

Des weiteren ergibt sich aus den zitierten Obersichten über die verschiedensten Bilirubin-Bestimmungsverfahren, daß direkte spektrophotometrische Bestimmungsverfahren für Bilirubin darunter, leiden, daß spektrale Störungen auftreten, und zwar auf Grund des Vorhandenseins von Hämoglobin, welches Absorptionsspitzen bei 414, 540 und 576 Nanometer hat. Des weiteren können auch andere Komponenten, die in Bilirubin enthaltenden biologischen Flüssigkeiten, wie beispielsweise menschlichem Serum enthalten sind, zu spektralen Störungen bei Anwendung derartiger direkter spektrophotometrischer Bestimmungsverfahren führen. So können beispielsweise Carotinoide die Bilirubinbestimmung stören, da ß-Carotin, d.h. eine der hauptsächlichen Carotinoid-Komponenten, eine Absorptionsspitze bei etwa 450 nm aufweist, die in dem Bereich des Spektrums liegt, der der Absorptionsspitzendes Bilirubins sehr nahe ist.

Abgesehen von den erwähnten spektralen Störungsquellen bei der Bestimmung von Bilirubin auf direktem spektrophotometrischem Weg hat sich gezeigt, daß derartige Verfahren des weiteren durch das Vorhandensein von anderen Proteinen im menschlichen Serum, wie beispielsweise Albumin, gestört werden können. So kann Albumin Bilirubin binden, wobei als Folge einer solchen Bindung eine Verschiebung der Absorptionsintensität und Absorptionsspitze des Bilirubins erfolgt. Trotz der beschriebenen Probleme hat man bisher im wesentlichen der beschriebenen Diazo-Bestimmungsraethode für Bilirubin oder verschiedenen Modifikationen der beschriebenen direkten spektrophotoMetrischen Bestimmung für Bilirubin vertraut. So ist beispielsweise aus der US-PS 3 569 ein weiteres direktes spektrophotonetrisches Verfahren für die Bestimmung von Bilirubin bekannt geworden, bei dem die spektrale

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Störung durch Hämoglobin ausgeschaltet wird, indem die zu untersuchende Flüssigkeitsprobe bei einer Wellenlänge der maximalen Bilirubinabsorption getestet wird und bei einer zweiten Wellenlänge, bei der Hämoglobin allein eine Absorptionsspitze aufweist. In diesem Falle muß man die Absorptionsspitze der Bilirubinkonzentration um einen Wert berichtigen, der äquivalent ist der Hämoglobinmenge, die in der Flüssigkeitsprobe vorhanden ist.

Ein weiteres Verfahren, das für die Bestimmung von Bilirubin angewandt worden ist, beruht auf der Verwendung eines Reagens für Bilirubin, das aus einer organischen Säure oder einem Salz hiervon, z.B. Trichloressigsäure oder einer organischen Sulfonsäure und Ferriionen besteht. Bei diesem Bestimmungsverfahren wird Bilirubin durch die organische Säure oder ihr Salz in Gegenwart der Ferriionen zu einem Reaktionsprodukt, wie beispielsweise Biliverdin und/oder Cholecyanin oxidiert, das einen charakteristischen blauen oder blaugrünen Farbton aufweist, wobei die Farbintensität der Konzentration des ursprünglich vorhandenen Bilirubins entspricht. Derartige Bilirubin-Bestimmungsverfahren sind beispielsweise aus den US-PS 3 348 920 und 3 607 093 sowie der BE-PS 816 927 bekannt. Dieses bekannte Bestimmungsverfahren leidet jedoch unter vielen der Nachteile, unter denen auch die bekannte Diazo-Bestimmungsmethode und die direkten spektrophotometrischen Bestimmungsmethoden leiden. So ist beispielsweise nachteilig an diesem Bistimmungsverfahren unter Verwendung einer organischen Säure oder einem Salz hiervon und Ferriionen, daß im allgemeinen eine Zeitspanne von bis zu etwa 10 Minuten erforderlich ist, damit die Reaktion zwischen der Säure und dem Bilirubin vollständig ablaufen kann. Außerdem ist es erforderlich, das Endprodukt von dem ursprünglichen Reaktionsmedium abzutrennen, damit das Reaktionsprodukt spektrophotometrisch analysiert werden kann. Auch treten bei diesem Verfahren verschiedene die spektrale Bestimmung störende Komponenten auf, die Absorptionsmaxima im blauen Bereich des Spektrums aufweisen, wie beispielsweise Hämoglobin, verschiedene Carotinoide und dergleichen.

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Aufgabe der Erfindung war es demzufolge, ein kelorimetrisch.es Verfahren für die Bestimmung von Bilirubin in einer wäßrigen Flüssigkeit anzugeben, bei dem die beschriebenen Nachteile der bekannten Bilirubin-Bestimmungsverfahren ausgeschaltet sind.

Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß sich die gestellte Aufgabe dadurch lösen läßt, daß man die Bilirubin-Bestimmung unter Verwendung eines reaktionsfähigen Beizmittels für Bilirubin mit einem oder mehreren Bindungszentren für Bilirubin durchführt, und wenn man als reaktionsfähiges Beizmittel ein solches mit einer hydrophoben Matrix und mindestens einer eine Ladung aufweisenden kationischen Gruppe verwendet. Es wurde gefunden, daß als Folge der Reaktion oder Einwirkung zwischen dem Bilirubin in der zu testenden Flüssigkeitsprobe und dem Beizmittel das Bilirubin gebeizt wird, d.h. von dem Beizmittel gebunden wird und daß dabei eine Verschiebung der Absorptionsspitze von mindestens etwa 10 nm auftritt und ein mindestens 50 liger Anstieg der molaren Extinktionskoeffizienten des Bilirubins (gemessen bei der neuen AbsorptionsspitzeJ.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein kolorimetrisches Verfahren für die Bestimmung von Bilirubin in einer wäßrigen Flüssigkeit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

(a) die zu analysierende' Flüssigkeit in einer Reagens-Zone mit einem reaktionsfähigen Beizmittel mit einem oder mehreren BindungsZentren für Bilirubin mit einer hydrophoben organischen Matrix und mindestens einer eine Ladung aufweisenden kationische Gruppe in Kontakt bringt und dadurch beizt, wobei das gebeizte Bilirubin eine Absorptionsspitze aufweist, die gegenüber der Absorptionsspitze des freien Bilirubins um mindestens 10 nm verschoben ist und einen molaren Extinktionskoeffizienten, der um mindestens 50 \ höher ist als der des freien Bilirubin/?,, und daß man

(b) das gebeizte Bilirubin kolorimetrisch bestimmt.

In vorteilhafter Weise wird die Absorptionsspitze des gebeizten

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Bilirubins nach einer Wellenlänge von 460 nm oder darüber versShoben, und der molare Extinktionskoeffizient des gebeizten Bilirubins wird auf einen Wert von 7,5 χ 10 oder darüber erhöht.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich für die Bestimmung von Bilirubin in biologischen Flüssigkeiten, wie beispielsweise Blut, Blutserum, Urin und dergleichen, insbesondere Blutserum, da das erfindungsgemäße Verfahren die Effekte von die Bilirubinbestimmung normalerweise störenden Komponenten, wie beispielsweise Hämoglobin^ Carotinoidenund anderen&uf ein Minimum herabdrückt. Erreicht wird dies teilweise durch den beträchtlichen Anstieg des molaren Extinktionskoeffizienten des gebeizten Bilirubins und teilweise durch die Verschiebung der Absorptions spitze des gebeizten Bilirubins, wobei die beiden spektralen Veränderungen als Folge der Bilirubinbindung an das Beizmittel auftreten. Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens für die Bestimmung des Bilirubingehaltes verschiedener biologischer Flüssigkeit/ kann es trotzdem vorteilhaft oder wünschenswert sein, verschiedene aus höhermolekularen Proteinen bestehende Störungskomponenten, die Bilirubin zubinden vermögen, zu entfernen (oder vom Bilirubin abzutrennen), beispielsweise Albumin, so daß eine quantitative Analyse des Gesamt-Bilirubingehaltes der zu untersuchenden Flüssigkeit »öglich ist. Demzufolge wird gemäß einer Ausgestaltung der Erfindung die Testflüssigkeit zunächst einer Vorbehandlung unterworfen, in der derartige die Bilirubinbestimmung störende Komponenten abgetrennt werden. Eine derartige Vorbehandlung kann aus üblichen Methoden bestehen, die im vorliegenden Falle zur Entfernung von hochmolekularen Protein-Störungskomponenten angewandt werden, beispielsweise einer Proteinausfällung, einer Probenverdünnung und dergleichen.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird das Verfahren unter Verwendung eines erfindungsgemäßen analytischen Elementes für die Bestimmung von Bilirubin durchgeführt.

Ein solches analytisches Element ist durch eine Reagens-Zone gekennzeichnet, Ai» in vorteilhafter Weise aus einer Schicht

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bestehen kann, welche das beschriebene Beizmittel für Bilirubin enthält. Des weiteren weist das analytische Element eine Ausbreitzone oder Ausbreitschicht auf, welche die zu analysierende Testprobe verteilt oder ausbreitet und in ausgebreiteter Form der Reagens-Zone zuführt.

Gegebenenfalls kann in der Ausbreitzone oder Ausbreitschicht eine oberflächenaktive Verbindung zugegen sein, und zwar in einer Konzentration, die den Transport des Bilirubins durch die Zone normalisiert, und zwar auch in Gegenwart von sehr verschiedenen Mengen an hochmolekularen Protein-Störungskomponenten für Bilirubin, wie beispielsweise Albumin und dergleichen. Wird die zu analysierende Flüssigkeitsprobe zunächst einer unabhängigen Vorbehandlung zur Entfernung von praktisch sämtlichen Protein-Störungskomponenten für Bilirubin unterworfen, z.B. durch Proteinausfällung oder Probenverdünnung, so läßt sich für die Durchführung des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens ein analytisches Element verwenden, dessen einziges Merkmal eine Reagens-Zone oder Reagens-Schicht des beschriebenen Typs ist.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird ein analytisches Element mit einer Reagens-Zone oder Reagens-Schicht verwendet, die impermeabel oder undurchlässig für höhermolekulare Protein-Störungskomponenten ist, z.B. für Albumin und andere Proteine, mit Molekulargewichten von etwa 60000 oder darüber, wodurch sich Störungen durch diese Stoffe weiterhin ausschalten lassen.

In besonders vorteilhafter Weise bestehen die erfindungsgemäß verwendbaren analytischen Elemente aus sogenannten integralen oder integrierten Elementen mit einer Ausbreitzone und einer Reagens-Zone oder übereinander angeordneten Ausbreit- und Reagensschichten, die auf einem geeigneten Schichtträger angeordnet sind, z.B. einem für Strahlung durchlässigen Schichtträger.

Unter "strahlungsdurchlässigen" oder "für Strahlung durchlässigen" oder "für Strahlung durchlässigen" Zonen, Schichten und Trägern sind hier solche zu verstehen, die den Durchtritt elektro-

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magnetischer Strahlung ermöglichen, die zur Bestimmung eines analytischen Ergebnisses, das im Element erzeugt wurde, verwendet werden. Besonders vorteilhaft oder zweckmäßig sind dabei Durchlässigkeiten für elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge oder von Wellenlängen innerhalb eines Bereiches von etwa 300 nm bis 700 nm.

Gegebenenfalls können zwischen Reagens-Schicht und Schichtträgern oder zwischen Ausbreitschicht und Reagens-Schicht separate Zwischenschichten angeordnet sein. Derartige Zwischenschichten können zusätzliche Reagenzien enthalten, beispielsweise zur Entfernung verschiedener möglicher Störungskomponenten aus einer zu analysierenden wäßrigen Flüssigkeitsprobe. Andererseits können derartige Zwischenschichten auch hydrophile, in Wasser quellbare Stoffe enthalten oder aus solchen aufgebaut sein, z.B. aus Gelatine, um den Transport der zu analysierenden Flüssigkeitsprobe durch das mehrschichtige Testelement zu erleichtern oder zu beschleunigen.

Die veischiedenen Zonen oder Schichten eines erfindungsgemäßen analytischen Elementes befinden sich mindestens unter den Anwendungsbedingungen des Elementes in Strömungs- oder Flüssigkeitskontakt miteinander. Dies bedeutet, daß eine Flüssigkeit im Falle von übereinander angeordneten Zonen oder Schichten oder aneinander angrenzenden Zonen oder Schichten von einer Zone in eine andere Zone oder von einer Schicht in eine andere Schicht gelangen kann. Anders ausgedrückt, bedeutet "Strömungskontakt" oder "Flüssigkeitskontakt", daß für die Komponenten einer Flüssigkeitsprobe die Möglichkeit gegeben ist, aus einer Zone oder einer Schicht in eine andere Zone bzw. Schicht, die sich in dem Kontakt miteinander befinden, übertreten. Obgleich Zonen oder Schichten, die sich in Strömungskontakt oder Flüssigkeitskontakt miteinander befinden, einander benachbart sein können, können sie doch auch/lurch dazwischenliegende Zonen oder Schichten voneinander getrennt sein. Derartige Trennzonen oder Trennschichten befinden sich jedoch auch im Strömungskontakt oder Flüssigkeitskontakt mit den anderen Zonen bzw. Schich-

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ten und verhindern den Durchtritt oder den Übergang von Flüssigkeit zwischen den Zonen bzw. Schichten nicht.

Ein derartiger Strömungskontakt oder Flüssigkeitskontakt zwischen Zonen oder Schichten läßt sich erreichen durch Herstellung von Elementen mit entsprechenden Zonen oder Schichten, die von Anfang an einander benachbart sind oder aneinander angrenzen. Andererseits kann es jedoch auch zweckmäßig sein, Elemente herzustellen, die Zonen oder Schichten aufweisen, die zunächst nicht einander benachbart sind und die voneinander getrennt sind, beispielsweise durch Verwendung von Zwischenschichten oder Zwischenblättern, wie es beispielsweise aus der US-PS 3 511 608 bekannt ist oder durch Verwendung eines federnden absorbierenden Materials oder durch Verwendung von deformierbaren Trägern, wie sie beispielsweise aus den US-PS 3 917 453 und 3 933 594 bekannt sind. Weisen die erfindungsgemäß verwendbaren Elemente zunächst einander nicht benachbarte oder nicht miteinander in Berührung stehende Zonen bzw. Schichten auf, so kann es erforderlich sein, Druckkräfte anzuwenden oder andere Maßnahmen zu treffen, um die Zonen oder Schichten des Elementes in Strömungs- oder Flüssigkeitskontakt miteinander zu bringen, wenn die Elemente verwendet werden sollen.

Substanz, Der Ausdruck "permeabel" oder "durchlässig" besagt, daß eine / Schicht bzw. Zone für eine Verbindung oder einen Stoff durchlässig ist, der in einer Flüssigkeit dispergiert oder gelöst ist.

Wird auf ein erfindungsgemäßes analytisches Element eine Flüssigkeitsprobe aufgebracht, die Bilirubin-positiv ist, so reagiert das Beizmittel der Reagens-Zone oder Reagens-Schicht mit dem Bilirubin, wobei eine Verschiebung der Absorptionsspitze gegenüber dem freien Bilirubin von mindestens etwa 10 nm auftritt und der molare Extinktionskoeffizient des Bilirubins (gemessen bei der verschobenen Absorptionsspitze) erhöht wird, und zwar vorzugsweise auf einen Wert von über etwa 7,5 χ 10 .

Unter "freiem Bilirubin" ist hier Bilirubin einschließlich kon-

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jugiertem oder unkonjugiertem Bilirubin zu verstehen, das nicht an Serumprotein gebunden ist. Freies Bilirubin weist in typischer Weise eine Absorptionsspitze bei einer Wellenlänge von etwa 435 bis etwa 440 nm auf sowie eine molare Absorption (E )

von etwa 5 χ 10 , gemessen in wäßriger Lösung bei einer Temperatur von 22⁰C und einem pH-Wert von etwa 7,4. Sofern nichts anderes angegeben ist, wurden die molaren Absorptionswerte, die hier angegeben sind, in einem wäßrigen Medium bei ungefähr 22°C und einem pH-Wert von etwa 7,4 gemessen.

Weist ein erfindungsgemäßes analytisches Element eine Ausbreitzone oder Ausbreitschicht auf, so gelangt die aufgebrachte Probe zunächst durch diese Zäne bzw. Schicht, bevor die Probe in die Reagens-Zone bzw. Reagens-Schicht gelangt, und das Bilirubin wird innerhalb der Ausbreitzone oder Ausbreitschicht verteilt, wodurch eine gleichförmige offensichtliche Konzentration der Verbindung an der Oberfläche der Ausbreitzone oder Ausbreitschicht erzeugt wird, die der Reagens-Zone bzw. Reagens-Schicht gegenüberliegt. Rs ist möglich, eine derartige gleichförmige offensichtliche (apparent) Konzentration innerhalb eines breiten Probenvolumenbereiches zu erzielen. Auf Grund des Strömungskontaktes zwischen der Ausbreitzone und der Reagens-Zone bzw. den entsprechenden Schichten und auf Grund der vorzugsweise gleichförmigen Permeabilität der Reagens-Zone oder Reagens-Schicht gegenüber dem in der Ausbreitzone oder Ausbreitschicht verteilten Bilirubin werden gleichförmig verteilte Bestandteile von der Ausbreitzone oder Ausbreitschicht in die Reagens-Zone bzw. Reagens-Schicht überführt und können die Reagens-Zone bzw. Reagens-Schicht durchdringen, ohne daß zu irgendeinem Zeitpunkt ins Gewicht fallende Veränderungen der offensichtlichen Bilirubinkonzentration auftreten. Auf Grund des Vorhandenseins des Beizmittels in der Reagens-Zone oder Reagens-Schicht und infolge einer gleichförmig zugeführten Bilirubinkonzentration wird in dem Element eine gleichförmige, quantitativ bestimmbare Veränderung erzeugt. Diese Veränderung läßt sich quantitativ auf radiometrischem Wege erfassen, gegebenenfalls durch automatisch arbeitende radiometrische Abtastgeräte, wie beispielsweise photometrische Geräte.

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Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Bilirubin-Bestimmungsverfahren unter Verwendung von analytischen Elementen des beschriebenen Typs durchgeführt, bei deren Verwendung die Bestimmung auf "trockenem Wege" erfolgt und die eine Ausbreitzone oder Ausbreitschicht aufweisen. Es wurde gefunden, daß sich bei Verwendung derartiger analytischer Elemente die eingangajbeschriebenen Störungskomponenten für Bilirubinanalysen wirksam ausschalten lassen. So ist es nicht nur möglich, bei Verwendung derartiger Elemente Störungen durch Carotinoide und Hämoglobin auszuschalten. Vielmehr sind die erfindungsgemäßen analytischen Elemente auch nicht oder nur wenig störanfällig gegenüber Natriumchlorid oder dem Gesamtproteingehalt einer zu analysierenden Flüssigkeitsprobe.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich jedoch auch auf "nassem Wege" oder in Lösung durchführen. In einem solchen Falle befindet sich das reaktionsfähige Beizmittel für Bilirubin in einem geeigneten flüssigen Medium, das mit der zu analysierenden Probe in Kontakt gebracht wird. Wird das "nasse" Bestimmungsverfahren angewandt, so hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die Bilirubin enthaltende Flüssigkeitsprobe zunächst einer Vorbehandlung unterworfen wird, bei der hochmolekulare Proteine, die die Bilirubinbestimraung stören können, entfernt werden. Die Entfernung dieser Proteine von vergleichsweise hohem Molekulargewicht kann nach den bereits erwähnten üblichen Trennungsmethoden erfolgen.

Die Verwendung von mehrschichtigen integralen analytischen Elementen mit einem Beizmittel und einem strukturellen Aufbau, der dem Aufbau erfindungsgemäßer Elemente ähnlich ist, für die Durchführung analytischer Verfahren ist an sich bereits bekannt, beispielsweise aus der BE-PS 831 660. Das aus der BE-PS 831 bekannte analytische Element enthält jedoch kein spezifisches Reagens für die Bestimmung von Bilirubin. Im Falle des bekannten analytischen Elementes wird das Beizmittel zum Beizen eines Stoffes verwendet, bei dem es sich nicht um den zu analysierenden Stoff handelt. Im Gegensatz zu dem bekannten analytischen Element enthält die Reagens-Zone oder Reagens-Schicht des erfindungsge-

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mäßen Elementes ein Beizmittel, das speziell für die Bestimmung der zu analysierenden Substanz, d.h. für die Bestimmung von Bilirubin bestimmt ist.

Die Zeichnungen dienen der näheren Erläuterung der Erfindung.· Im Einzelnen sind dargestellt in:

Fig. 1 und Fig. 2 vergrößerte Ansichten vorteilhafter analytischer Elemente der Erfindung und in

Fig. 3 ein Diagramm, aus dem sich das spektrophdto-

metrische Ansprechvermögen eines vorteilhaften mehrschichtigen analytischen Elementes nach der Erfindung gegenüber verschiedenen Bilirubinkonzentrationen ergibt.

Kennzeichnend für das zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Beizmittel ist eine hydrophobe organische Matrix und mindestens eine Ladungen tragende kationische Gruppe. Es wurde gefunden, daß Stoffe mit diesen Eigenschaften Bilirubin zu binden vermögen und infolgedessen als Beizmittel für Bilirubin wirken. Derartige Stoffe wirken jedoch nicht nur als Beizmittel für Bilirubin, sondern durch das Beizen des Bilirubins wird in dem gebeizten Bilirubin eine beträchtliche Veränderung der spektralen Charakteristika im Vergleich zum freien ungebundenen Bilirubin hervorgerufen. Ganz speziell trifft eine bemerkenswerte Verschiebung der Absorptionsspitze des gebeizten Bilirubins im Vergleich zum freien Bilirubin auf und eine beträchtliche Erhöhung des molaren Extinktionskoeffizienten des gebeizten Bilirubins, im Vergleich zum freien Bilirubin.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden Polymere als Beizmittel für das Bilirubin verwendet. Als vorteilhaft hat sich die Verwendung von polymeren Beizmitteln erwiesen, die bereits zur Herstellung verschiedener photographischer Filmmaterialien und photographischer Papiere verwendet wurden und die durch wiederkehrende Einheiten gekennzeichnet sind, die Ladungen tragende kation~ische Gruppen aufweisen und

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die in den gleichen oder anderen wiederkehrenden Einheiten organische Gruppen aufweisen, die zu der Hydrophobizität der Beizmittel führen. Außer diesen polymeren Beizmitteln können jedoch auch die verschiedensten anderen polymeren Stoffe verwendet werden, die die angegebenen Eigenschaften und chemische Zusammensetzung haben und von denen bisher nicht bekannt geworden ist, daß sie sich als photographische Beizmittel auf dem photographischen Gebiet verwenden lassen.

Besonders vorteilhafte aus Polymeren bestehende Beizmittel für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Beizmittel mit einer Polymerkette mit oder aus monomeren Einheiten der folgenden Formel I:

Q
i.

Μ® Χ^θ

worin bedeuten:

A einen organischen Rest, der einen Teil der Polymerkette bildet;

Q eine chemische Bindung oder chemische Bindungen oder ein chemischer Rest, der M an A bindet;

M einen kationischen Rest, vorzugsweise einen quaternären Ammonium- oder Phosphoniumrest und

X ein Säureanion, z.B. ein Halogenidion, beispielsweise ein Chlorid- oder Bromidion oder ein Nitrat-, Methosulfat- oder p-Toluolsulfonatrest oder dergleichen.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung steht M für einen quaternären Ammonium- oder Phosphoniumrest der Formeln II oder III:

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II. R¹— N* R²

III. _R1

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worin R , R und R die gleiche oder eine voneinander verschiedene Bedeutung haben können und für jeweils einen Aryl-, Aralkyl- oder Alkarylrest mit 5 bis weniger als 20 C-Atomen, z.B. 1 bis 19 C-Atomen oder einen Alkylrest mit 1 bis weniger als 10 C-Atomen, z.B. 1 bis 9 C-Atomen stehen.

In der Formel I steht Q vorzugsweise für einen Kohlenwasserstoffrest, insbesondere einen Arylen-, Arylenalkylen-, Alkylenarylen-, Arylenbisalkylen- oder Alkylenbisarylenrest. In typischer Weise, jedoch nicht notwendigerweise, enthält Q etwa 5 bis etwa 10 C-Atome..

A in Formel I kann sehr verschieden sein je nach dem Typ des verwendeten Polymeren. Besonders vorteilhafte Ergebnisse werden mit Polymeren erhalten, in denen A für einen Alkylenrest steht. Derartige Alkylenreste können dabei in vorteilhafter Weise 2 bis etwa 10 C-Atome; aufweisen, insbesondere 2 bis 4 C-Atome.

Bei den polymeren Beizmitteln kann es sich um Homopolymere oder Copolymere handeln. Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von Copolymeren erwiesen.

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Typische vorteilhafte Copolymere sind solche mit wiederkehrenden Einheiten der Formel I sowie bis zu etwa 75 Gew.-$ wiederkehrenden Einheiten aus nicht störenden Monomeren. Der Ausdruck "nicht störenden Monomeren" bezieht sich dabei auf solche Monomere, die zur Ausbildung von Einheiten führen, die weder chemisch noch physikalisch das Beizen des Bilirubins stören. Typische geeignete Monomere, welche sich zur Ausbildung von derartigen nicht störenden wiederkehrenden Einheiten eignen und die des weiteren für eine Hydrophobizität des herzustellenden Beizmittels sorgen, sind aliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe, wie beispielsweise Olefine, substituierte Olefine, Styrol sowie substituierte Styrole, Alkylacrylate und Alky!methacrylate sowie Derivate hiervon und andere übliche bekannte Monomere, die üblicherweise zur Herstellung von Copolymeren des angegebenen Typs verwendet werden können.

Gegebenenfalls können die polymeren Beizmittel quervernetzt werden, in welchem Falle polymere Ketten beispielsweise covalent quervernetzt werden durch difunktionelle Quervernetzungsmittel, beispielsweise Divinylbenzol, Äthylendimethacrylat und andere übliche bekannte difunktionelle Quervernetzungsmittel. Werden derartige difunktionelle Quervernetzungsmittel verwendet, so werden sie vorzugsweise in Konzentrationen von bis zu etwa 5 Gew.-I, vorzugsweise von etwa 0,1 bis etwa 2 Gew.-I, bezogen auf das Gesamtgewicht der in der copolymerisierenden Monomeren-Mischung vorhandenen Monomeren verwendet.

Besonders vorteilhafte und typische erfindungsgemäß verwendbare Copolymere lassen sich herstellen dutch Copolymerisation von monomeren Mischungen, die enthalten:

(a) etwa 25 bis etwa 90 Gew.-\ Monomere für die Erzeugung von wiederkehrenden Einheiten der Formel I;

(b) etwa 10 bis etwa 75 Gew.-t Monomere für die Erzeugung von nicht störenden wiederkehrenden Einheiten und

(c) 0 bis 5 Gew.-* eines difunktionellen Quervernetzungsmittels.

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Obgleich sich in vorteilhafter Weise Polymere als Beizmittel verwenden lassen, lassen sich erfindungsgemäß jedoch auch nichtpolymere Stoffe als Beizmittel verwenden, wenn sie die erforderliche Hydrophobizität und mindestens eine kationische Gruppe für das Beizen des Bilirubins aufweisen. Werden derartige nichtpolymere Beizmittel zur Herstellung analytischer Elemente verwendet, mit denen sich eine Bilirubinbestimmung auf "trockenem Wege" durchführen läßt, so hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn derartige nicht-polymere Beizmittel eine molekulare Konfiguration oder ein ausreichend hohes Molekulargewicht haben, so daß die Verbindungen in der Reagens-Zone des Elementes oder Reagens-Schicht des Elementes immobilisiert werden können.

Im folgenden werden typische, erfindungsgemäß verwendbare polymere Beizmittel für Bilirubin angegeben:

Tabelle I

Name

1. Poly(N,N,N-trimethyl-N-vinyl-benzylammoniumchlorid)

Struktur

CH₂-CH

CH, -

- CH,

3 -J

Cl'

8Ö9S29/0ÖÖ0

290147

Fortsetzung von Tabelle I

Name

2. Poly^styrol-co-benzyl-(dimethyl)-p-vinyl-benzylamraoniumchlorid7

CH₇-CH

Struktur

CH₂CH

CH₃-N-CH₃

+ CH-

3. PoIy(N,N,N-trioctyl-N-vinylbenzylphosphoniumchlorid) CH₂-CH-

^C8^H17~? "^C8^H17

^C8^H17

Fortsetzung von Tabelle I

Name

Struktur

4. Poly/Ityrol-co-(vinylbenzyl)-(trihexyl)-ammoniumchloridj

-■ CH₀-CH CH₀-CH

?6^H13

6 13

5. Poly(N,N,N-trimethyl-N-vinylbenzylammoniumchlorid-co-styrol) CH₀-CH-

CH₂-CH-

CH

CH₉-N-CH, ^L 19 * CH,

28QH76

Fortsetzung von Tabelle I

Name

Struktur

6. Poly(styrol-co-N-vinylbenzyl-N.N-dimethylbenzylammoniumchlorid-co-divinylbenzol)

-CH₂-CH-

-CH₂-CH-

CH,-N-CH,

Ί. CH,

-CH₉-CH-

Cl

-CH-CHw-

Die erfindungsgemäß verwendbaren Beizmittel lassen sich nach üblichen bekannten Methoden herstellen, die bereits ausführlich im Zusammenhang mit der Verwendung von diesen Stoffen oder ähnlichen Stoffen auf dem Gebiet der Photographie beschrieben wurden. Infolgedessen erübrigt sich eine detaillierte Beschreibung der Herstellung verschiedener Beizmittel, die sich erfindungsgemäß verwenden lassen. Bezüglich Einzelheiten der Herstellung derartiger Beizmittel sei beispielsweise verwiesen auf die folgenden Patentschriften: GB-PS 1 261 925; US-PS 3 488 706; 3 557 066; 3 625 694; 3 709 690; 3 770 439; 3 758 445; 3 773 509; 3 859 096; 3 898 088; 3 944 424 und 3 958 995.

Die Konzentration an Beizmittel für die Bindung des Bilirubins bei der Durchführung einer Bilirubinbestimmung nach der Erfindung kann verschieden sein. Die im Einzelfalle optimale

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Konzentration an Beizmittel hängt von dem speziellen Bilirubingehalt der zu analysierenden Probe ab, d.h. dem "dynamischen Bereich" der der Bilirubin-Bestimmungsmethode zugrundegelegt werden soll.

Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung, bei der 1 Mol Bilirubin an ein Beizmittel mit einem molaren Äquivalent an BindungsZentren für Bilirubin gebunden wird, sollte eine ausreichende Menge an Beizmittel vorliegen, so daß mindestens ein molares Äquivalent an BindungsZentren für Bilirubin im Beizmittel für die maximale Anzahl von Molen an Bilirubin vorliegt, zu deren Bestimmung das Element bestimmt ist. Besteht das Beizmittel für Bilirubin aus einem Polymeren, so hängt die optimale oder geeignete Menge an Polymer von der durchschnittlichen Anzahl von wiederkehrenden Einheiten mit BindungsZentren für das Bilirubin ab und, wie bereits dargelegt, von dem dynamischen Bereich, der der Bilxrubinbestimmung zugrundegelegt werden soll.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung, bei der ein polymeres Beizmittel verwendet wird, beispielsweise ein Beizmittel des in der Tabelle I erwähnten Typs und im Falle von Beizmitteln, die aus einem Copolymeren aus Styrol und Vinylbenzylchlorid hergestellt werden und eine Inherent-Viskosität (gemessen bei 25⁰C in Benzol in einer Konzentration von 0,25 g/dl) von etwa 0,15 bis etwa 1,0 aufweisen, verwendet man die Polymeren in typischer Weise in einer Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 1,0 g/dl Beizmittel bei einem dynamischen Bereich von etwa 0,1 bis 50 mg/dl Bilirubin.

Ganz allgemein hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn in der Reagens-Zone oder Reagens-Schicht eines erfindungsgemäßen Elementes ein Oberschuß an Beizmittel vorliegt, wodurch die Reaktion zwischen Bilirubin und Beizmittel beschleunigt und infolgedessen die erwünschte Veränderung der spektralen Eigenschaften des gebeizten Bilirubins beschleunigt herbeigeführt werden kann.

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Wie bereits dargelegt, läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren als Lösungs-Bestimmungsverfahren (nasses Verfahren) durchführen oder auf "trockenem Wege", beispielsweise unter Verwendung eines analytischen Elementes nach der Erfindung.

Wird das erfindungsgemäße Verfahren auf nassem Wege durchgeführt, so wird zunächst eine "nasse" Reaktionszone hergestellt, indem man beispielsweise in einen strahlungsdurchlässigen Behälter ein Beizmittel gibt und dieses in einem nicht störenden flüssigen Medium löst oder dispergiert. Zur Bereitung derartiger Lösungen und Dispersionen sind die verschiedensten flüssigen Stoffe geeignet, die unter den Anwendungsbedingungen die Reaktion zwischen Bilirubin und Beizmittel nicht stören und auch die Absorptionsspitze des freien wie auch des gebeizten Bilirubins nicht beeinträchtigen. Geeignet sind somit die verschiedensten wäßrigen wie auch organischen Flüssigkeiten. Im Hinblick auf die Analyse biologischer Flüssigkeiten hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, als flüssiges Medium in der Reaktionszone ein wäßriges Medium zu verwenden, beispielsweise Wasser oder verschiedene polare organischen Lösungsmittel, z.B. kurzkettige Alkylalkanole. Gegebenenfalls kann es vorteilhaft sein, je nach der Zusammensetzung des Beizmittels der Reaktionszone Puffersubstanzen zuzusetzen.

Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, im Falle der Anwendung der nassen Ausführungsform, in abgepufferten, wäßrigen Medien mit einem pH-Wert von etwa 6,8 bis etwa 9,5 und einer Temperatur von etwa 15 bis etwa 60⁰C, vorzugsweise von etwa 22 bis etwa 50⁰C, zu arbeiten. Es ist jedoch möglich, je nach dem im Einzelfalle verwendeten Beizmittel auch bei anderen pH-Werten und/oder anderen Temperaturen zu arbeiten, und zwar bei höheren oder tieferen Temperaturen. Wesentlich ist lediglich, daß man nicht bei pH-Werten und/oder Temperaturen arbeitet, die zurunerwünschten Nebenreaktion oder zu einem Abbau des Bilirubins oder des verwendeten Beizmittels führen. Wird das erfindungsgemäße Verfahren als Lösungs-Bestimmungsmethode durchgeführt, so kann es des weiteren vorteilhaft sein, die

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Bestimmung im Dunkeln oder unter gelbem Sicherheitslicht durchzuführen, um einen durch Licht induzierten Abbau des Bilirubins zu vermeiden.

Im Falle der "nassen" Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens hat es sich, wie bereits dargelegt, oftmals als vorteilhaft erwiesen, die Bilirubin enthaltende Testprobe zunächst vorzubehandeln, um das Bilirubin von verschiedenen Stoffen, an die es gebunden sein kann, abzudissoziieren oder abzuspalten. Besteht die zu analysierende Flüssigkeitsprobe beispielsweise aus Blutserum, so liegt ein beträchtlicher Anteil des Bilirubins im Serum an Albumin gebunden vor.

Es sind verschiedene Verfahren bekannt, um Bilirubin von Stoffen, wie Albumin abzuspalten. Derartige Methoden können hier angewandt werden, so daß das nachfolgende Bestimmungsverfahren eine genaue Bestimmung des Gesamt-Bilirubingehaltes in der Serumprobe ermöglicht. Zu den bekannten Verfahren zur Abspaltung von Bilirubin von verschiedenen Serumprateinen, insbesondere Albumin, gehören die verschiedensten bekannten Protein-Fällungsmethoden, Proben Verdünnungsmethoden und dergleichen, wie sie beispielsweise in der bereits zitierten Literaturstelle "Clinical Chemistry-Principles and Technics", 2. Ausgabe, 1974, Seiten 1042 bis 1079 beschrieben werden.

Im Hinblick auf die leichte Handhabung und Bequemlichkeit, mit der sich quantitative analytische Ergebnisse erzielen lassen, hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens analytische Elemente zu verwenden, beispielsweise solche, wie sie in den Fig. 1 und 2 beispielsweise dargestellt sind, und die für die "trockene" Analyse von Bilirubin bestimmt sind.

Ein solches Element weist, wie sich aus Fig. 1 ergibt, eine praktisch trockene Reagens-Zone 7 oder Reagens-Schicht 7 auf, die das beschriebene Beizmittel enthält. In vorteilhafter Weise weist das Element des weiteren eine praktisch trockene Aus-

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breitzone oder Ausbreitschicht 6 auf. Des weiteren können zusätzlich Zwischenschichten vorhanden sein. Das Element weist somit mindestens zwei diskrete Zonen oder Schichten auf, die sich in Strömungs- oder Flüssigkeitskontakt miteinander unter Verwendungsbedingungen befinden. In besonders vorteilhafter Weise sind die Zonen zu übereinanderliegenden, einander benachbarten Schichten ausgebildet. In typischer Weise befinden sich diese Schichten auf einem Schichtträger 8, der vorzugsweise aus einem strahlungsdurchlässigen Schichtträger besteht.

Obgleich besonders vorteilhafte analytische Elemente nach der Erfindung aus übereinander angeordneten, einander benachbarten Schichten aufgebaut sind, lassen sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens jedoch auch andere Elemente einer anderen Struktur verwenden, beispielsweise Elemente des in

an
Fig. 2 dargestellten Typs mit zwei/einander angrenzenden Zonen, nämlich einer Ausbreitzone 6 und einer Reagens-Zone 7, die beide auf einem Träger 8, sofern ein solcher erforderlich ist, angeordnet sind.

Zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im folgenden die Verwendung von analytischen Elementen beschrieben, bei denen differenzierte Zonen zu übereinander angeordneten, einander benachbarten Schichten ausgebildet sind, die auf einen strahlungsdurchlässigen Schichtträger aufgetragen sind.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird tür Durchführung des Verfahrens ein analytisches Element verwendet, das eine Ausbreitschicht und eine Reagens-Schicht aufweist, die vorzugsweise strahlungsdurchlässig sind. In vorteilhafter Weise weisen die Elemente einen Schichtträger auf, der ebenfalls vorzugsweise strahlungsdurchlässig ist. Die Anordnung der Schichten auf einem Schichtträger ist jedoch nicht erforderlich, wenn die Schichten selbst die erforderliche Festigkeit und Integrität aufweisen.

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Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird ein Element verwendet, das einen strahlungsdurchlässigen Schichtträger aufweist, auf dem aufgetragen sind:

(1) eine Reagens-Schicht, die mindestens für Bilirubin durchlässig ist und die ein Beizmittel des beschriebenen Typs für Bilirubin enthält und

(2) eine Ausbreitschicht, die für Bilirubin durchlässig ist.

Die Reagens-Schicht ist dabei zwischen Schichtträger und Ausbreitschicht angeordnet. Die Ausbreitschicht weist vorzugsweise eine praktisch gleichförmige Durchlässigkeit für Bilirubin auf. Vorzugsweise ist die Reagens-Schicht praktisch undurchlässig für Proteine mit einem Molekulargewicht, das größer ist als das Molekulargewicht des Bilirubins, d.h. für Albumin und andere Proteine mit einem Molekulargewicht von 60000 (Dalton-Einheiten) oder darüber.

Gemäß einer weiteren, besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung besteht die Ausbreitschicht aus einer nicht-faserigen und vorzugsweise isotrop porösen Schicht.

In besonders vorteilhafter Weise sind sämtliche Schichten eines erfindungsgemäßen Elementes als nicht-faserige Schichten ausgestaltet, wodurch die Eignung der Elemente zur Durchführung quantitativer analytischer Ergebnisse weiter verbessert wird. Unter "nicht-faserigen" Schichten sind hier Schichten zu verstehen, die von faserigen Materialien frei oder praktisch frei sind, d.h. keine faserigen Komponenten in solchen Mengen enthalten, die ein Ausbreiten der Proben stören würden oder die die Bestimmung des analytischen Ergebnisses auf radiometrischem Wege beeinträchtigen könnten.

Wie bereits dargelegt, sind Ausbreitschicht und Reagens-Schicht eines erfindungsgemäßen Elementes vorzugsweise gleichförmig durchlässig oder permeabel für Bilirubin, jedoch praktisch un-

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durchlässig bzw. impermeabel und nicht porös für Proteine von höherem Molekulargewicht. Der Ausdruck "Durchlässigkeit" oder "Permeabilität" bezieht sich dabei beispielsweise auf eine Permeabilität auf Grund einer Porosität, Fähigkeit zur Quellung oder auf Grund anderer Charakteristika.

Die Reagens-Schichten können eine Matrix aufweisen, in der das Beizmittel verteilt ist, d.h. gelöst oder dispergiert ist. Besteht das Beizmittel selbst aus einem Polymer und hat es filmbildende Eigenschaften oder läßt es sich in anderer Weise leicht in Form einer gleichförmigen Schicht oder einer Zone auftragen, so ist die Verwendung einer zusätzlichen Matrix nicht erforderlich. Zur Herstellung der Schichten können die verschiedensten Matrixmaterialien verwendet werden, je nach dem im Einzelfalle verwendeten Beizmittel, das in der Matrix verteilt ist. In jedem Fall sollte das Matrixmaterial "nicht-störend" auf das Beizmittel einwirken, d.h. es sollte ein Matrixmaterial verwendet werden, das selbst nicht in der Lage ist, das Beizmittel zu binden oder zu beizen. Vorteilhafte Matrix-Materialien für die Ausbildung der Reagens-Schichten sind nicht-faserige Stoffe, beispielsweise nicht-störende, hydrophile Stoffe, einschließlich Säure-hydrolysierte: Gelatinen (z.B. Schweins-Gelatine) und Derivate hiervon mit einem isoelektrischen Punkt von etwa 9,1, hydrophile Cellulosederivate, Polysaccharide, wie beispielsweise Dextran, Gummi arabicum, Agarose und dergleichen sowie synthetische Stoffe, wie beispielsweise in Wasser lösliche Polyvinylverbindungen, wie beispielsweise Poly (vinylalkohol) und Polyvinylpyrrolidon) , Acrylamidpolymere und dergleichen. In vorteilhafter Weise lassen sich auch nicht-störende organophile Stoffe, wie beispielsweise Celluloseester und dergleichen verwenden. Um die Permeabilität einer Reagens-Schicht zu steigern, falls diese nicht porös ist, kann es oftmals vorteilhaft sein, ein Matrixmaterial zu verwenden, das in dem Lösungsmittel oder Dispersionsmedium der zu analysierenden Flüssigkeit quellbar ist. Gegebenenfalls kann es des weiteren zweckmäßig oder erforderlich sein, ein solches Material auszuwählen, das das Aufbringen einer benachbarten Schicht nicht stört oder beeinträchtigt, d.h. die Be-

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schichtung während des Herstellungsprozesses des Elementes nicht beeinträchtigt. Ist beispielsweise die Ausbildung von diskreten, kontinuierlichen Schichten erwünscht und ist beabsichtigt, mit dem analytischen Element wäßrige Flüssigkeiten zu analysieren, so kann es zweckmäßig sein, eine im wesentlichen oder praktisch wasser-lösliche Matrix für die Reagens-Schicht auszuwählen und praktisch organolösliche oder organodispergierbare:;Komponenten oder Ingredienzien für eine benachbarte Schicht, wie beispielsweise eine Ausbreitschicht. Auf diese Weise wird eine wechselseitige Lösungsmitteleinwirkung auf ein Minimum vermindert, und es wird eine klar definierte Schichtenstruktur erhalten. In manchen Fällen kann es vorteilhaft sein, um eine Diffusion von hochmolekularen Proteinen in die Reagens-Schicht zu vermeiden, (bei den Proteinen kann es sich um potentielle Bilirubin-Störkomponenten handeln) eine Reagens-Schicht zu verwenden, die eine geringere Durchlässigkeit oder Permeabilität hat als die Ausbreitschicht. Dies läßt sich beispielsweise dadurch erreichen, daß man die effektive Porengröße der Reagens-Schicht vermindert.

Die relative Durchlässigkeit oder Permeabilität oder Porosität einer Schicht läßt sich nach üblichen bekannten Methoden ermitteln.

Die Verteilung des Beizmittels in der Reagens-Schicht kann durch Lösen oder Dispergieren des Beizmittels in einem Matrixmaterial erfolgen, sofern ein solches verwendet wird. Obgleich es oftmals vorteilhaft ist, wenn die Verteilung des Beizmittels gleichförmig ist, ist eine solche gleichförmige Verteilung jedoch nicht unbedingt erforderlich.

Wie im Falle des "nassen" Verfahrens kann auch bei der "trockenen" Arbeitsweise, d.h. bei Verwendung eines analytischen Elementes, eine pH-Puffersubstanz oder Puffersubstanzen verwendet werden. Diese Puffersubstanz oder Puffersubstanzen können in das analytische Element eingearbeitet werden, beispielsweise in die Reagensschicht oder in eine oder mehrere der anderen Schichten, und zwar vorzugsweise in Mengen, daß die Reagens-Schicht unter

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den Anwendungsbedingungen des Elementes einen pH-Wert aufweist, der identisch oder praktisch identisch ist mit dem pH-Wert, der vorzugsweise bei der "nassen" Methode angewandt wird. Zur Herstellung der Elemente können die verschiedensten üblichen bekannten Puffersubs tanzen verwendet werden, beispielsweise Phosphatpuffer und andere, wie sie z.B. von Good in der Zeitschrift "Biochemistry", £, (1966), Seite 467 beschrieben werden.

Bei der Ausbreitschicht handelt es sich um eine Schicht, die eine Flüssigkeitsprobe aufzunehmen vermag, gleichgültig ob die Probe der Schicht direkt zugeführt wird oder von einer Schicht oder Schichten, die sich in Strömungskontakt oder Flüssigkeitskontakt mit der Ausbreitschicht befinden. Des weiteren ist die Ausbreitschicht eine Schicht, in der das Lösungsmittel oder Dispersionsmedium der zu analysierenden Probe und das Bilirubin verteilt werden, so daß eine gleichförmige oder praktisch gleichförmige Konzentration an Bilirubin an· der Oberfläche der Ausbreitschicht, die der Reagens-Schicht gegenüberliegt, erzeugt wird. Derartige Konzentrationen können unter Ausbildung von Kon-

Z · B. zentrationsgradienten/über die Dicke der Ausbreitschicht erzeugt werden. Derartige Konzentrationsgradienten stellen keinerlei Probleme bei der Durchführung quantitativer Analysen dar und lassen sich unter Anwendung üblicher Eichmethoden berücksichtigen.

Der Ausbreitmechanismus ist noch nicht vollständig geklärt. Es wird jedoch angenommen, daß die Ausbreitung auf einer Kombination von Kräften, wie z.B. hydrostatischem Druck einer Flüssigkeitsprobe, der Kapillarwirkung innerhalb de* Ausbreitschicht, dtr Oberflächenspannung der Probe, einer Dochtwirkung der Schichten, die sich im Strömungskontakt mit der Ausbreitschicht befinden und dergleichsn hervorgerufen wird. Das Ausmaß der Ausbreitung hängt teilweis· von dem Volumen der auszubreitenden Flüssigkeit ab. Die gleichförmige oder offensichtlich gleichförmige Konzentration, die bei der Ausbreitung erreicht wird, ist jedoch unabhängig oder praktisch unabhängig von den Volumen der Flüssigkeitsprobe und läßt sich bei verschiedenen Graden der Ausbreitung erzielen. Dies bedeutet, daß bei der Verwendung erfindungsgemäßer

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Elemente keine genaue Zudosierung der zu analysierenden Flüssigkeitsproben erforderlich ist. Jedoch kann im Einzelfalle die Verwendung eines speziellen Probenvolumens vorteilhaft sein, z.B. aus Gründen einer vorteilhaften Ausbeeitzeit oder dergleichen. Da sich bei der Verwendung erfindungsgemäßer Elemente quantitative Ergebnisse unter Verwendung sehr geringer Probenvolumina erzielen lassen,die vollständig von einem Bereich geeigneter Größe der Ausbreitschicht aufgenommen werden können, (z.B. 1 cm ) besteht keine Notwendigkeit zur Entfernung überschüssiger Flüssigkeit oder Feuchtigkeit vom Element nach Aufbringung der Flüssigkeitsprobe. Daj die Ausbreitung in der AusbreitscHcht erfolgt und die ausgebreitete Substanz der Reagens-Schicht zugeführt wird, und zwar praktisch ohne Einwirkung eines lateralen hydrostatischen Druckes, tritt kein "Ringing"-Problem auf, das oftmals bei den analytischen Elementen des Standes der Technik zu beobachten ist.

Die Ausbreitschicht braucht lediglich eine gleichförmige offensichtliche (apparent) Konzentration der ausgebreiteten Substanz pro Flächeneinheit auf ihrer Oberfläche, die der Reagens-Schicht gegenüberliegt, zu erzeugen. Dabei ist es sehr einfach zu bestimmen, ob sich eine spezielle Schicht für Ausbreitzwecke eignet oder rieht. Eine derartige Gleichförmigkeit der offensichtlichen (apparent) Konzentration läßt sich unter Anwendung densitometrischer oder anderer analytischer Methoden ermitteln, beispielsweise nach Testmethoden, wie sie in der US-PS 3 992 158 beschrieben werden.

Vorteilhafte Ausbreitschichten sind isotrop poröse Schichten. Unter einer isotropen Porosität ist eine Porosität in allen Richtungen einer Ausbreitschicht zu verstehen. Der Grad der Porosität kann dabei verschieden sein je nach der Porengröße, dem Prozentsatz an Porenvolumina und dergleichen. Weitere Angaben bezüglich des Merkmales der isotropen Porosität finden sich beispielsweise in der US-PS 3 992 158.

In vorteilhafter Weise lassen sich di· Ausbreitschichten aus-

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gehend von einer Vielzahl von Stoffen nach Verfahren herstellen, wie sie aus der US-PS 3 992 158 bekannt sind. So lassen sich Ausbreitschichten beispielsweise ausgehend von teilchenförmigen Stoffen herstellen, in welchem Falle die isotrope Porosität durch die Zwischenräume zwischen den Teilchen erzeugt wird. Zur Herstellung derartiger Schichten lassen sich verschiedene Typen von teilchenförmigen Stoffen verwenden, die in vorteilhafter Weise gegenüber den Komponenten der zu analysierenden Proben chemisch inert sind. Zu nennen sind beispielsweise Pigmente, wie beispielsweise Titandioxid, Bariumsulfat, Zinkoxid und Bleioxid. Auch können beispielsweise in vorteilhafter Weise Teilchen aus Diatomeenerde und mikrokristallinen kolloidalen Materialien, die sich von natürlichen und synthetischen Polymeren ableiten, z.B. mikrokristalline Cellulosen verwendet werden. Auch können beispielsweise kugelige oder kugelförmige Teilchen gleichförmiger Größe oder Größen verwendet werden, z.B. Harzoder Glaskügelchen, wobei derartige Kügelchen in den Fällen besonders vorteilhaft sein können, wo es auf eine gleichförmige Porengröße ankommt, beispielsweise im Falle von selektiven Filtrationsverfahren. Treten bei Verwendung von teilchenförmigen Stoffen Haftungsprobleme auf, wie beispielsweise im Falle von Glaskügelchen, so können diese entsprechend behandelt werden, damit sie an den Kontaktpunkten aneinander haften, so daß die Ausbildung einer isotrop porösen Schicht erleichtert wird.

Alternativ oder zusätzlich zu solchen teilchenförmigen Stoffen können zur Ausbildung der Ausbreitschicht isotrop poröse Polymermassen verwendet werden. So ist es beispielsweise möglich, die Ausbreitschicht ausgehend von Polymeren herzustellen, wie sie zur Herstellung von sogenannten "Blushed-Polymeren" angewandt werden, d.h. beispielsweise nach Methoden, wie sie aus den US-PS 3 555 129 und 3 992 158 bekannt sind. Des weiteren können isotrop poröse Polymerschichten unter Verwendung von Gasen oder anderen quellbaren Bestandteilen, die Poren erzeugen, hergestellt werden, beispielsweise nach Methoden, wie sie aus den US-PS 2 960 728 und 2 946 095 bekannt sind. Schließlich können auch Methoden angewandt werden, bei denen innerhalb der Polymer-

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phase ein löslicher fester Stoff verwendet wird, der unter Porenausbildung gelöst werden kann. Derartige Methoden sind beispielsweise aus der US-PS 3 816 575 bekannt. Zur Herstellung von isotrop porösen ^MBlushed-Polymer"-Ausbreitschichten können die verschiedensten Polymeren, und zwar allein oder in Kombination miteinander verwendet werden, beispielsweise Polycarbonate, Polyamide, Polyurethane, Celluloseester, wie beispielsweise Celluloseacetat und dergleichen.

Verschiedene mikroporöse Filter sind oder bestehen teilweise aus "Blushed-Polymeren", beispielsweise die verschiedenen Membranfilter der Firma Millipore Corporation, USA, die beispielsweise näher in den US-PS 2 783 894 und 2 772 322 beschrieben werden.

Die Dicke der Ausbreitschicht ist variabel und hängt wenigstens teilweise von dem Volumen der zu analysierenden Probe ab, das aus Zweckmäßigkeits- und Sauberkeitsgründen von der Ausbreitschicht absorbiert werden sollte und von dem Porenvolumen der Schicht, das ebenfalls die Probenmenge beeinflußt, die von der Schicht absorbiert werden kann. Als besonders vorteilhaft haben sich Ausbreitschichten einer Dicke, trocken gemessen, von etwa 50 Mikron bis etwa 300 Mikron, erwiesen. In vorteilhafter Weise können die Schichtstärken doch auch unter und oberhalb der angegebenen Grenzen liegen.

Bei der Herstellung einer isotrop porösen Ausbreitschicht hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn das Porenvolumen mindestens etwa 25 % des Gesamtvolumens der Schicht ausmacht. In vorteilhafter Weise können Schichten mit Porenvolumina von 50 bis 95 % verwendet werden. Veränderungen des Porenvolumens der porösen Ausbreitschicht können in vorteilhafter Weise dazu herangezogen werden, um die Charakteristika des Elementes zu verändern, beispielsweise die Gesamtdurchlässigkeit oder Gesamtpermeabilität der Ausbreitschicht oder die Zeitspanne, die erforderlich ist, damit die aufgebrachte Probe ausgebreitet wird. Das Porenvolumen innerhalb der Schicht läßt sich steuern, beispielsweise durch Auswahl bestimmter teilchenförmiger Stoffe geeigneter Größe oder

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durch Veränderung der Lösungsmittel oder Trockenbedingungen bei der Herstellung von isotrop porösen "Blushed-Polyaer"-Schichten. Bezüglich weiterer Informationen, das Porenvolumen der Ausbreitschicht betreffend, sowie die Berechnung des Porenvolumens betreffend, wird auf die US-PS 3 992 158 verwiesen.

Bei der Herstellung integraler analytischer Elemente nach der Erfindung können die Schichten in Form von separaten Schichten vorgebildet werden, die dann später vor Verwendung des Elementes zusammenlaminiert werden können. Dies bedeutet, daß die einzelnen Schichten getrennt voneinander aufbewahrt werden können, bis die Schichten in Strömungs- oder Flüssigkeitskontakt miteinander gebracht werden. Derartige vorgebildete Schichten oder separate Schichten lassen sich in typischer Weise herstellen durch Auftragen einer entsprechenden Lösung oder Dispersion auf eine Oberfläche, von der die erzeugte Schicht nach ihrer Auftrocknung physikalisch abgestreift werden kann. Ein vorteilhaftes Verfahren, das die Probleme eines mehrfachen Abstreifprozesses und eine Laminierung vermeidet, wenn es gilt, ein Material miteinander benachbarten Schichten herzustellen, besteht darin, zunächst eine Schicht auf eine abstreifbare Oberfläche oder einen Schichtträger aufzutragen, worauf die andere oder anderen Schichten successive auf die zunächst aufgebrachte Schicht aufgetragen werden. Eine Beschichtung läßt /hach Üblichen bekannten Beschichtungsverfahren durchführen, wie sie beispielsweise aus der US-PS 3 992 158 bekannt sind. Haftungsprobleme zwischen den einzelnen Schichten lassen sich ohne nachteilige Effekte beheben, beispielsweise durch Oberflächenbehandlungen einschließlich der Anwendung extrea dünner Haftschichten, wie sie beispielsweise im Falle photographischer Aufzeichnungsmaterialien angewandt werden.

Die Herstellung der Reagens-Schichten kann in der Weise erfolgen, daß zunächst eine Beschichtungslösung oder Beschichtungsdispersion einschließlich des Matrixmaterial, sofern ein solches verwendet wird, hergestellt wird, worauf die BeSchichtungsmasse in der beschriebenen Weise aufgetragen und getrocknet wird, und zwar unter Ausbildung einer dieensionsstabilen Schicht. Die Dicke der Reagensachicht und ihr Perraeabilitätegrad oder ihr Durch-

lässigkeitsgrad können sehr verschieden sein, je nach der Art der Verwendung der Schicht. Trockendicken von etwa 10 Mikron bis etwa 100 Mikron haben sich als besonders vorteilhaft erwiesen, obgleich die Reagens-Schicht gelegentlich auch eine Dicke von unter 10 Mikron oder über 100 Mikron aufweisen kann.

Im Falle der Verwendung von faserigen Reagens-Schichten können diese durch Imprägnierung einer faserigen Matrix nach üblichen bekannten Methoden hergestellt werden.

Wie bereits dargelegt, kann es sich bei den erfindungsgemäßen analytischen Elementen um selbsttragende Elemente oder Elemente mit einem Schichtträger handeln. Werden zur Herstellung der Elemente Schichtträger verwendet, so können hierzu die üblichen bekannten Schichtträgermaterialien verwendet werden, beispielsweise Polymere, wie z.B. Celluloseacetat, Poly(äthylenterephthalat), Polycarbonate und Polyviny!verbindungen, wie beispielsweise Polystyrol und dergleichen. Als besonders vorteilhafte Schichtträger haben sich strahlungsdurchlässige Schichtträger erwiesen, und zwar insbesondere solche, die für eine elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge oder von Wellenlängen innerhalb eines Bereiches zwischen etwa 300 nm und etwa 700 nm durchlässig sind. Gegebenenfalls kann es vorteilhaft sein, einen Schichtträger zu verwenden, der für eine oder mehrere enge Wellenlängenbanden durchlässig ist, und gegenüber benachbarten Wellenlängenbanden undurchlässig ist. Dies läßt sich beispielsweise erreichen durch Imprägnieren oder Beschichten des Schichtträgers mit einem oder mehreren Farbstoffen oder färbenden Komponenten mit geeigneten Absorptionscharakteristika. Die Komponenten oder Bestandteile einer speziellen Schicht eines erfindungsgemäßen Elementes sowie die Schichtenkonfiguration können verschieden sein. Wie bereits dargelegt, kann die Porengröße der Ausbreitschicht derart bemessen werden, daß die Schicht unerwünschte Probenkomponenten, wie beispielsweise Proteine, mit einem höheren Molekulargewicht als Bilirubin abfiltriert, d.h. beispielsweise Probenkomponenten, die die analytische Reaktion oder

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die Bestimmung des Testergebnisses innerhalb des Elementes beeinträchtigen oder verfälschen könnten.

Im Falle der Anal)se von Blut beispielsweise haben sich poröse Schichten mit einer Porengröße von 1 bis etwa 5 Mikron als besonders vorteilhaft zur Ausfiltrierung oder Abscheidung von Blutkörperchen erwiesen, die in typischer Weise eine Größe von etwa 7 bis etwa 30 Mikron haben.

Gegebenenfalls kann ein erfindungsgemäßes Element auch mehr als eine oder eine Vielzahl von Ausbreitschichten aufweisen, deren Fähigkeit zur Ausbreitung und Filtration verschieden sein kann.

Wie bereits dargelegt, kann es des weiteren vorteilhaft sein, Elemente mit Schichten herzustellen, die ein oder mehrere oberflächenaktive Verbindungen enthalten, z.B. anionische oder nichtionogene oberflächenaktive Verbindungen. Diese können beispielsweise die Beschichtungseigenschaften der Beschichtungsmassen verbessern und des weiteren das Ausmaß und die Geschwindigkeit der Ausbreitung in den Ausbreitschichten erhöhen, die bei Abwesenheit eines Hilfsmittels, beispielsweise einer oberflächenaktiven Verbindung, nicht leicht durch flüssige Proben benetzbar sind. Insbesondere kann es vorteilhaft sein, eine vergleichsweise große Menge an oberflächenaktiver Verbindung, beispielsweise eine nicht-ionogene oberflächenaktive Verbindung in der Ausbreitschicht eines erfindungsgemäßen Elementes unterzubringen, um den Transport des Bilirubins in einer wäßrigen Protein enthaltenden Flüssigkeit in und durch die Schicht des Elementes zu normalisieren. Unter einer solchen Normalisierung ist gemeint, daß innerhalb der Ausbreitschicht eine äquivalente Durchdringung durch das Lösungsmittelmedium und das Bilirubin erreicht wird, unabhängig von Variationen oder Veränderungen im Proteingehalt zwischen verschiedenen Proben. Im übrigen hat sich gezeigt, daß im Falle einer Gesamt-Bilirubinbestimmung die Verwendung von oberflächenaktiven Verbindungen vorteilhaft sein kann, da das

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Bilirubin oftmals in einem gebundenen Zustand vorliegt, z.B. an andere Proteine gebunden, z.B. an Serumalbumin, in welchem Falle die oberflächenaktive Verbindung offensichtlich eine Abspaltung des an Protein gebundenen Bilirubins bewirkt oder begünstigt. Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, zur Erreichung eines normalisierten Bilirubintransportes die oberflächenaktiven Verbindungen in Konzentrationen von etwa 1 bis etwa 15 Gew.-I, bezogen auf das Trockengewicht der Schicht zu verwenden.

Erfindungsgemäße analytische Elemente eignen sich nicht nur für das Gebiet der klinischen Chemie, sondern vielmehr auch für die chemische Forschung und lassen sich des weiteren in vorteilhafter Weise in chemischen Kontroll-Laboratorien einsetzen. Sie eignen sich in besonders vorteilhafter Weise für die klinische Untersuchung von Körperflüssigkeiten, beispielsweise Blut, Blutserum und Urin, da hierbei in der Regel die Durchführung einer größeren Anzahl von sich wiederholenden Untersuchungen erforderlich ist und weil häufig Testergebnisse in einer sehr kurzen Zeitspanne nach der Probenahme vorliegen sollen.

Bei der Analyse von Blut unter Verwendung eines analytischen Elementes nach der Erfindung können die Blutkörperchen zunächst vom Serum abgetrennt werden, beispielsweise durch Abzentrifugieren, worauf das Serum auf das Element aufgebracht wird. Eine Solche Abtrennung der Blutkörperchen ist jedoch nicht erforderlich, und zwar beispielsweise dann nicht, wenn eine spektrophotometrischen Reflexionsanalyse angewandt wird, um das gebeizte Bilirubin zu ermitteln oder quantitativ zu erfassen. So kann Blut direkt auf das Element aufgebracht werden, in welchem Falle die Blutkörperchen abfiltriert und von der Reagens-Schicht ferngehalten werden, und zwar durch die Einwirkung einer separaten Zwischenschicht, die als Filterschicht dient und die gleichzeitig eine Strahlung blockierende Schicht darstellt. Das Vorhandensein der Blutkörperchen auf dem Element stört die spektrophtometrische Analyse nicht, wenn Reflexionsmethoden angewandt werden, bei denen Licht durch den Schichtträger und eine Registrier-

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schicht geführt wird und von der Strahlung blockierenden Schicht oder einer anderen reflektierenden Schicht reflektiert wird, derart, daß die ermittelnde Strahlung nicht auf die Blutkörperchen auftrifft. Ein besonderer Vorteil eines integralen analytischen Elementes nach der Erfindung beruht somit auf der Verwendbarkeit des Elementes für die Analyse von sowohl Serum als auch Blut.

Wie bereits erwähnt, können erfindungsgemäße Elemente eine Strahlung blockierende Schicht aufweisen, die, sofern vorhanden, vorzugsweise zwischen der Reagens-Schicht und dem Schichtträger angeordnet ist. Strahlung blockierende Schichten dienen dazu, den Durchtritt elektromagnetischer Strahlung zu inhibieren, wie beispielsweise dem Durchtritt der Wellenlänge oder der Wellenlängen, die für die analytische Bestimmung benötigt werden. Derartige Schichten enthalten ein Trübungsmittel, das auf Grund seiner Absorptionsfähigkeit, Reflexion oder dergleichen einen Strahlung inhibierenden Effekt ausübt, wenn es in die Schicht eingearbeitet wird. Beispielsweise kann die Strahlung blockierende Schicht aus einer Schicht mit einer Matrix und einem Trübungsmittel bestehen, beispielsweise einem Pigment, wie Ruß, oder einem anderen anorganischen Pigment, z.B. einem Metallsalz oder Metalloxid, wie beispielsweise Bariumsulfat, Titandioxid oder Zinkoxid. Blushed-Polymere, die im allgemeinen von Natur aus reflektierend sind, können ebenfalls das Trübungsmittel darstellen und Schichten aus oder mit derartigen "Blushed-Polymeren", wie sie zur Herstellung von Ausbreitschichten verwendet werden, können ebenfalls zur Herstellung von Strahlung blockierenden Schichten verwendet werden.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung enthalten aus "Blushed-Polymeren" aufgebaute Ausbreitschichten zusätzlich ein reflektierendes anorganisches Pigment, beispielsweise eines der hochreflektierenden Pigmente des bereits erwähnten Typs, um die Ausbreitung und/oder Reflexionsfähigkeit des analytischen Elementes zu steigern. Die Pigmentmenge, die in einer Schicht zusammen mit einem "Blushed-Polymeren" untergebracht

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werden kann, kann sehr verschieden sein. Beispielsweise können Konzentrationen von etwa 5 bis etwa 1000 Gew.-I Pig»«nt, bezogen auf das Gewicht des "Blushed-Polymeren" verwendet werden. Als besonders vorteilhaft haben sich Pignientkonzentrationen von etwa 100 bis etwa 600 Gew.-I, bezogen auf das Gewicht des vorhandenen "Blushed-Polymeren¹¹ erwiesen.

Abgesehen von einer Strahlung blockierenden Schicht kann ein erfindungsgemäßes analytisches Element gegebenenfalls noch andere Zwischenschichten aufweisen. So kann beispielsweise eine separate Zwischenschicht vorgesehen werden, die in dem Lösungsmittel oder Dispersionsmedium der zu analysierenden Flüssigkeit quellbar ist. Eine solche quellbare Zwischenschicht, vorzugsweise eine strahlungsdurchlässige quellbare Zwischenschicht, z.B. eine quellbare Gelatineschicht, kann zwischen der Reagens-Schicht und dem Schichtträger des Elementes angeordnet werden und kann dazu dienen, die Durchdringung der Ausbreitschicht zu beschleunigen oder die "Ausbreitungsgeschwindigkeit'¹ einer Bilirubin enthaltenden Serumprobe zu erhöhen. Des weiteren kann eine Zwischenschicht beispielsweise zwischen der Ausbreitschicht und der Reagens-Schicht angeordnet sein. Eine solche Schicht sollte natürlich für Bilirubin durchlässig sein und kann dazu verwendet werden, Reagenzien unterzubringen, die verschiedene Störungskomponenten für die Bilirubinbestimmung inaktivieren können. Andererseits kann eine derartige Zwischenschicht auch dazu dienen, derartige störende Komponenten abzufiltrieren und zu entfernen. Schließlich kann eine derartige Zwischenschicht auch dazu verwendet werden, eine Reagens aufzunehmen, das sich mit dem Bilirubin umsetzen kann. So läßt sich beispielsweise eine Gelatine-Zwischenschicht mit dem Enzym Glucoronidase zwischen der Ausbreitschicht und der Schicht mit dem Beizmittel anordnen, in welchem Falle die enzymatische Aktion der Glucoronidase ausgenutzt wird, um konjugiertes Bilirubin der zu analysierenden Flüssigkeitsprobe in die nicht konjugierte Form des Bilirubins zu überführen. Andererseits kann das Enyzm Glucoronidase auch in der Ausbreitschicht eines analytischen Elementes nach der Erfindung untergebracht werden, zum Zwecke einer direkteren und wirksameren Einwirkung des Enzyms auf die konjugierte Form des

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Bilirubins.

Die erfindungsgemäßen analytischen Elemente können in verschiedenen Formen hergestellt werden, beispielsweise in Form von praktisch endlosen Bändern jeder gewünschten Breite, in Form von Blättern oder in Form von kleineren Chips.

Vorzugsweise werden die analytischen Elemente beim Aufbringen der zu analysierenden Flüssigkeitsprobe in einer bestimmten Lage festgehalten. In typischer Weise hat das Element dabei einen solchen Aufbau, daß eine aufgebrachte Probe zunächst mit einer Ausbreitschicht in Kontakt gelangt, bevor die Probe in Kontakt mit der Reagens-Schicht gelangt, wobei die Probe zunächst auf die Oberfläche der Ausbreitschicht auftrifft, die am weitesten von der Reagens-Schicht entfernt ist. Da die analytische Genauigkeit der erfindungsgemäßen Elemente nicht wesentlich durch Veränderungen im Probenvolumen beeinträchtigt wird, kann das Aufbringen der zu analysierenden Probe per Hand oder auf maschinellem Wege erfolgen. Aus Zweckmäßigkeitsgründen und Bequemlichkeitsgründen jedoch hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn bei der Durchführung mehrerer Analysen das Probenvolumen gleich oder praktisch gleich ist. Wie bereits dargelegt, ist die Ausbreitschicht des/weiteren auch extrem vorteilhaft in bezug auf die Verminderung des Auftretens des "Ringing-Problems", wenn lösliche reaktionsfähige Komponenten in einer Reagens-Schicht verwendet werden.

Bei der Durchführung eines typischen analytischen Verfahrens nach der Erfindung, das manuell oder auf automatischem Wege durchgeführt werden kann, wird das analytische Element einem Vorratsbehälter, beispielsweise einer Vorratsrolle, einem Chip-Paket oder einem anderen Vorratsbehälter entnommen und in eine entsprechende Position gebracht, in der ein freier Tropfen, Kontakt-Tüpfel oder eine andere Form der Flüssigkeitsprobe aufgebracht werdenkann. Das Aufbringen der Flüssigkeitsprobe kann beispielsweise mit einer geeigneten Dosiervorrichtung erfolgen. Nach Aufbringung der Flüssigkeitsprobe und vorzugsweise, nachdem die aufgebrachte Probe von der Ausbreitschicht aufgenommen

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worden ist, kann das Element konditioniert werden, beispielsweise erwärmt oder erhitzt werden oder befeuchtet oder dergleichen, d.h. in einer Weise behandelt werden, durch die die Erzielung eines Testergebnisses beschleunigt oder in anderer Weise erleichtert werden kann. Im Falle eines automatisierten Verfahrens kann es des weiteren wünschenswert sein, wenn die Ausbreitschicht ihre Funktion innerhalb von einigen Sekunden erfüllt. Jedoch sollte eine solche Zeitspanne vorgesehen werden, die eine Verteilung der Probe ermöglicht, im Gegensatz zu der praktisch sofortigen, unregelmäßigen Diffusion einer Probe, die beispielsweise im Falle der Verwendung eines absorbierenden faserigen Papieres beobachtet werden kann. Dies läßt sich in geeigneter Weise erreichen durch geeignete Auswahl oder Abstimmung der verschiedenen Parameter, beispielsweise der Schichtdicke, des Porenvolumens von porösen Schichten und dergleichen.

Nachdem das analytische Ergebnis in Form einer meßbaren Veränderung vorliegt, wird es ermittelt, in der Regel durch eine geeignete Vorrichtung, wie sie auf dem Gebiet der Reflexions- oder Transmissionsspektrophotometrie verwendet wird. Bei Verwendung einer solchen Vorrichtung wird ein Energiestrahl, z.B. ein Lichtstrahl, durch den Schichtträger und die Reagens-Schicht geführt. Das Licht wird dann reflektiert, beispielsweise durch ein Trübungsmittel in der Ausbreitschicht oder einer Strahlung blockierenden Schicht des Elementes, und zwar zurück zum Gerät oder aber es gelangt durch das Element zu einem Detektor, wenn Durchlässigkeitsmessungen durchgeführt werden. In besonders vorteilhafter Weise wird das analytische Ergebnis in einem Bereich des Elementes ermittelt, der vollständig innerhalb des Bereiches liegt, in dem ein solches Ergebnis erzeugt wird. Ganz allgemein hat sich elektromagnetische Strahlung eines Bereiches von etwa 300 bis etwa 700 nm als vorteilhaft für die Durchführung derartiger Messungen erwiesen, obgleich praktisch jede Strahlung angewandt werden kann, der gegenüber das Element durchlässig ist und die zu einer quantitativen Erfassung der in der Reagens-Schicht erzeugten Veränderung geeignet ist.

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Es können die verschiedensten üblichen üichmethoden angewandt werden, um einen Vergleichsstandard zu erhalten. So kann beispielsweise eine Probe einer Standardlösung benachbart zu der Zone aufgebracht werden, auf die der Tropfen der zu analysierenden Probe aufgebracht wird, um Vergleichsmessungen zu ermöglichen.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen.

Beispiel 1: Bestimmung von Bilirubin in Lösung

Aus diesem Beispiel ergibt sich, daß Bilirubin in einem flüssigen Bestimmungsmedium und in Gegenwart von bestimmten Beizmitteln seinen λ -Wert (die maximale Absorptionsspitze) von 435 bis 440 nm.auf 460 nm verschiebt, unter einer bemerkenswerten Steigerung der molaren Extinktion bei dieser neuen Absorptionsspitze.

Um dies zu zeigen, wurden die Absorptionsspektren (360 nm, abgelesen mittels eines Spektrophotometers bei 37⁰C) von vier Flüssigkeitsproben, im folgenden als Flüssigkeitsproben A bis D bezeichnet, aufgezeichnet.

A) 0,05 M Natriumdihydrogenphosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,4;

B) 0,012 lige Lösung (Gewicht/Volumen) des Beizmittels Nr. 6 der Tabelle I in einer Natriumdihydrogenphosphatpufferlösung eines pH-Wertes von 7,4;

C) 1 mg Bilirubin/dl in einer Natriumdihydrogenphosphatpufferlösung eines pH-Wertes von 7,4;

D) 1 mg Bilirubin/dl + 0,012 % (Gewicht/Volumen) des Beizmittels

6 der Tabelle I in einer Natriumdihydrogenphosphatpufferlösung eines pH-Wertes von 7,4.

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Die erhaltenen Absorptionsspektren zeigen folgendes:

1. bei den getesteten Konzentrationen beeinflußt weder die Phosphatpufferlösung (Lösung A) noch das Beizmittel Nr. 6 allein (Lösung B) die Absorption innerhalb des angegebenen Spektralbereiches;

2. das Bilirubin allein (Lösung C) hat ein Absorptionsmaximum

(λ ) bei 435 bis 440 nm: und

max

3. Bilirubin in Gegenwart des Beizmittels 6 von Tabelle I (Lösung D) führt zu einer Verschiebung seines λ -Wertes auf 460 nm, wobei die Verschiebung begleitet ist von einem 2-fachen Anstieg der Absorption bei der neuen Spitze, d.h.:

^Em46O ^{40 X 1}°³ > ^Ε\ι46Ο ^{80 X 1}^

*■ m46O stellt den molaren Extinktionskoeffizienten von Bilirubin allein dar);

(E .,~ stellt den molaren Extinktionskoeffizienten von Bilirubin und Beizmittel 6 der Tabelle I dar).

Beispiel 2: Bilirubin-Bestimmung unter Verwendung eines erfindungsgemäßen analytischen Elementes.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wurde ein integrales analytisches Element wie folgt hergestellt:

Auf einen transparenten, bandförmigen Polyäthylenterephthalat-Schichtträger wurde zunächst eine Reagens-Schicht aus dem Beizmittel 4 der Tabelle I in einer Schichtstärke von 0,54 g/m aufgetragen. Auf die Reagens-Schicht wurde eine Haftschicht aus 0,32 g Poly(n-isopropylacrylamid) pro m Schichtträgerfläche aufgebracht. Hierauf wurde dann eine Ausbreitschicht aus einem Blushed-Polymeren aus 6,45 g Celluloseacetat, 45,6 g TiO₂, 2,51 g Octylphenoxypolyäthoxyäthanol (Triton X-405, Hersteller Rohm &

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-SO-

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Haas Company) und 0,64 g eines Polyäthylenglykol-Oleyläthers, jeweils pro m Schichtträgerfläche aufgetragen.

Das hergestellte analytische Element wurde dann wie folgt getestet:

Zunächst wurde eine Reihe von Bilirubinlösungen mit 7 g menschlichem Serumalbumin/dl und 100 mM einer Salzlösung (Saline) und verschiedene Mengen von Bilirubin (0 bis 20 mg Bilirubin pro dl Lösung) hergestellt. Die Lösungen wurden dann auf das hergestellte Element aufgetüpfelt, und zwar in Form von 10 Mikroliter Tropfen.

Ermittelt wurde die Veränderung der Reflexionsdichte, AD„ des analytischen Elementes (gemessen bei 460 um und 37⁰C) nach 7 Minuten.

Aus Fig. 3 ergibt sich das Ansprechvermögen des Elementes im Falle des getesteten Bilirubin-Konzentrationsbereiches von 0 bis 20 mg/dl.

Mit dem analytischen Element ließen sich ausgezeichnet reproduzierbare Ergebnisse erhalten.

Beispiel 3: Bilirubin-Beizmittel-Reaktion in einem analytischen Element mit Beizmittel und Gelatine.

Es wurde ein weiteres analytisches, bandförmiges Element nach der Erfindung wie folgt hergestellt:

Auf einen bandförmigen transparenten Polyäthylenterephthalat-Schichtträger wurde zunächst eine Reagens-Schicht mit 2,2 g des Beizmittels Nr. 6 von Tabelle I und 4,1 g Gelatine, jeweils pro m Schichtträgerfläche aufgetragen. Anschließend wurde eine Ausbreitschicht der in Beispiel 2 angegebenen Zusammensetzung aufgetragen.

Das hergestellte analytische Element wurde dann, wie in Beispiel 2

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beschrieben, gextestet.

Verwendet wurde eine Reihe wäßriger Lösungen mit verschiedenem Bilirubingehalt und einem pH-Wert von 7,4 sowie eine Reihe von Salzlösungen mit einem pH-Wert von 7,4 und 7 g/dl Albumin sowie verschiedenen Konzentrationen an Bilirubin.

Hs zeigte sich, daß das analytische Element dieses Beispieles durch ein sehr lineares spektrophotometrisches Ansprechvermögen auf verschiedene Bilirubinkonzentrationen gekennzeichnet war. Die Unempfindlichkeit des Elementes gegenüber Albumin ergab sich aus den übereinstimmenden analytischen Werten, die bei Verwendung von Testlösungen mit und ohne Albumin erhalten wurden.

Beispiel 4: Bilirubin-Beizmittel-Reaktion in einem analytischen Element unter Verwendung eines Gel-Pads.

Zunächst wurde ein weiteres analytisches Element der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

Ein Schichtträger, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde mit einem Gel-Pad mit 1,1 g Rinder-Serumalbumin und 2,3 g Gelatine

2
pro in Schichtträgerfläche beschichtet. Auf die aufgetragene Schicht wurde dann eine Reagens-Schicht aus 1,1 g des Beizmittels Nr. 6 von Tabelle I und 1,1 g Gelatine, jeweils pro m Schichtträgerfläche aufgetragen. Auf die aufgetragene Reagensschicht wurde dann eine Ausbreitschicht, wie in Beispiel 2 beschrieben, aufgebracht.

Das hergestellte, bandförmige Aufzeichnungsmaterial wurde dann, wie in Beispiel 2 beschrieben, getestet.

Wäßrige Lösungen (erhalten von der Firma American Monitor Corp., Indianapolis, Indiana), die 7 g/dl menschliches Serumalbumin in einer Salzlösung und verschiedene Konzentrationen an Bilirubin enthielten, wurden zum Eichen des Elementes verwendet.

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Das geeichte Element wurde dann zur Untersuchung von verschiedenen, im Handel erhältlichen menschlichen Serumsurrogaten verschiedener Zusammensetzung mit bekanntem Bilirubingehalt verwendet. Die bei Verwendung des Elementes gemessenen Bilirubinwerte (bei Bilirubinkonzentrationen von 0,5 bis 20,0 mg/dl) stimmten ausgezeichnet mit den Bilirubinkonzentrationswerten überein, die die Hersteller der Serumsurrogate angegeben hatten.

Beispiel 5: Keine spektralen Störungen auf Grund von Hämoglobin.

Die meisten bekannten, wenn nicht alle bekannten, direkt-spektrophotometrischen Bestimmungsverfahren für Bilirubin leiden unter spektralen Störungen auf Grund des Vorhandensein von Hämoglobin, das im Serum in Konzentrationen von weniger als 20 mg/dl vorhanden ist. Um zu veranschaulichen, daß erfindungsgemäße mehrschichtige analytische Elemente praktisch von spektralen Störungen auf Grund des Hämoglobins sind, wurden auf mehrere Elemente des in Beispiel 3 beschriebenen Aufbaues Flüssigkeitsproben aufgetüpfelt, die entweder 1 mg oder 15 mg Bilirubin pro dl sowie verschiedene Konzentrationen an Hämoglobin von 0 bis 150 mg/dl enthielten. Von jedem Element wurde die Reflexionsdichte, D_n, bei

460 nm gemessen. Es wurden keine Veränderungen im Ansprechvermögen der Elemente über den angegebenen weiten Hämoglobinkonzentrationsbereich festgestellt, woraus sich ergibt, daß Hämoglobin das Bestimmungsverfahren bei 460 nm nicht stört.

Beispiel 6: Einfluß von pH-Wertsveränderungen.

Um die Unempfindlichkeit des erfindungsgemäßen Bilirubin-Bestim- mungsverfahrens gegenüber pH-Wertsveränderungen zu veranschau lichen, die bei verschiedenen Proben, wie beispielsweise Blutserumproben, auftreten können, wurden zwei Reihen von Bilirubin-Standardlösungen mit Bilirubinkonzentrationen von 0 bis 20 mg/dl getestet. Die Lösungen der einen Reihe hatten einen pH-Wert von 7,4 und die Lösungen der anderen Reihe einen pH-Wert von 8,2. Die Lösungen enthielten pro dl 7 g menschliches Serumalbumin, Salz (Saline) und einen Natriumdihydrogenphosphatpuffer in einer

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0,05 molaren Konzentration. Die Lösungen wurden auf analytische Elemente des in Beispiel 2 beschriebenen Typs aufgetüpfelt. Die Kiemente wurden dann in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise untersucht. Aus den erhaltenen Meßergebnissen ergab sich keine Empfindlichkeit der Elemente gegenüber pH-Wertsveränderungen iia angegebenen Bereich.

Beispiel 7: Einfluß von Temperaturveränderungen.

Analytische Elemente des in Beispiel 3 beschriebenen Typs wurden dazu verwendet, um die Empfindlichkeit der Elemente gegenüber Temperaturveränderungen zu untersuchen. Für die Untersuchungen wurden Bilirubin-Standardlösungen eines pH-Wertes von 7,4 verwendet. Obgleich das Ansprechvermögen des Elementes bei 27°C etwas geringer war, wurden bei Temperaturen zwischen 37 und 42⁰C praktisch keine Veränderungen festgestellt.

Beispiel 8: Aufbewahrungseigenschaften.

Um die Stabilität der Elemente bei einer 1-monatigen Aufbewahrung bei Raumtemperatur (20°C) zu testen, wurden analytische Elemente und Bilirubin-Standardlösungen, wie in Beispiel 7 beschrieben, verwendet. Es ergab sich, daß die Elemente eine ausgezeichnete Stabilität aufwiesen. Es zeigte sich, daß sich das Ansprechvermögen der gelagerten Elemente gegenüber frisch hergestellten Elementen praktisch nicht veränderte.

Beispiel 9: Keine Störung durch Carotinoide.

Aus der Literatur ergibt sich, daß ß-Carotin, das im menschlichen Serum hauptsächlich vorkommende Carotinoid eine potentielle Störungsquelle bei der direkten spektrophotometrischen Bestimmung für Bilirubin ist, da es bei 450 nm absorbiert.

Im Falle dieses Beispieles wurde das spektrophotometrische Ansprechvermögen analytischer Elemente der Erfindung (hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben) im Falle von vier flüssigen Salztestlösungen mit 7 g Albumin, 1 bis 20 mg Bilirubin und 0,02 oder

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0,2 rag ß-Carotin, jeweils pro dl Lösung ermittelt. Es zeigte sich, daß bei den angegebenen ß-Carotinwerten, die den üblichen Konzentrationen in menschlichen Serum entsprecher., keine nachteiligen Effekte auf Grund des Vorhandenseins von ß-Carotin feststellbar waren.

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Claims (1)

1. PATENTANWÄLTE

   ne Reg.Nr. 125 527 H.Bartels

   Djpi.-Chem. Dr. Brandes Dr.-Ing.HeW

   Eastman Kodak Company, 343 State Street, ^ya

   Rochester, Staat New York, Vereinigte

   8 München 22,Thierschstraße 8

   Staaten von Amerika

   Tel.(089)293297

   Telex 05 23325 (patwo d)

   Telegrammadresse: wolffpatent, münchen

   Kolorimetrisches Verfahren für die Be- ™^™°™ ^{Stuttflart 7}™

   [ρι~Δ. OUU TUU /UJ

   Stimmung von Bilirubin Deutsche Bank ag, 14/2863O

   PLZ 60070070)

   ; Bürozeit: 8-12 Uhr, 13-16.30 Uhr

   ' " außer samstags

   9. Januar 1978 25/93

   Patentansprüche

   1.) Kolorimetrisches Verfahren für die Bestimmung von Bilirubin in einer wäßrigen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man

   (a) die zu analysierende Flüssigkeit in einer Reagens-Zone mit einem reaktionsfähigen Beizmittel mit einem oder mehreren BindungsZentren für Bilirubin mit einer hydrophoben organischen Matrix und mindestens einer eine Ladung aufweisenden kationische Gruppe in Kontakt bringt und dadurch beizt, wobei das gebeizte Bilirubin eine Absorptionsspitze aufweist, die gegenüber der Absorptionsspitze des freien Bilirubins um mindestens 10 nm verschoben ist und einen molaren Extinktionskoeffizienten, der um mindestens 50 I höher ist als der des freien Bilirubins , und daß man

   (b) das gebeizte Bilirubin kolorimetrisch bestimmt.

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   "²" 2101478

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Beizmittel in ein flüssiges Medium einmischt und hierin mit der zu analysierenden wäßrigen Flüssigkeit in einer Reaktionszone bei einem pH-Wert von 6,8 bis 9,5 und einer Temperatur von 15 bis 6O°C in Kontakt bringt.

   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine biologische Flüssigkeit auf ihren Bilirubingehalt untersucht.

   4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Blutserum auf seinen Bilirubingehalt untersucht.

   5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein

   , A^er Verminderung Blutserum verwendet, das zuvor zum Zwecke/des ProteingehaTtes einer Vorbehandlung unterworfen wurde.

   6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Beizmittel für Bilirubin ein Polymer mit wiederkehrenden Einheiten der folgenden Formel verwendet:

   in der bedeuten:

   A einen organischen Rest;

   Q eine chemische Bindung oder chemische Bindungen oder einen chemischen Rest, der M an A bindet;

   M einen quaternären Ammonium- oder Phosphoniumrest und

   X ein Säureanion.

   7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Beizmittel für Bilirubin ein Polymer mit wiederkehrenden Einheiten der folgenden Formel verwendet:

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   280U78

   R¹ - Ν^θ - R²

   h Χ^θ

   R^{3 λ}

   worin bedeuten:

   A einen Alkylenrest;

   Q einen Kohlenwasserstoffrest, der das Stickstoffatom an A bindet und 5 bis 10 C-Atomen aufweist;

   , ο 3 weniger als

   R , R und R jeweils einen Alkylrest mit 1 bis/10 C-Atomen

   oder einen Aryl-, Aralkyl- oder Alkarylrest mit 5 bis mnigmr/ZO C-Atomen, wobei R¹, R² und R³ die gleiche oder eine voneinander verschiedene Bedeutung haben können und

   X ein Säureanion.

   8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Beizmittel für Bilirubin ein Copolymer verwendet, das hergestellt wurde durch Copolymerisation einer monomeren Mischung aus:

   (a) 25 bis 90 Gew.-I einer monomeren Vorläuferverbindung für die Erzeugung von Einheiten der folgenden Formel:

   —"£■ A Q

   R¹ Ν⁹— R²

   I, _γθ

   worin bedeuten:

   A einen Alkylenrest;

   Q einen Kohlenwasserstoffrest, der das Stickstoffatom an A bindet und 5 bis 10 C-Atome aufweist;

   R¹, R² und R³ jeweils einen Alkylrest mit 1 bis weniger als 10 C-Atomen oder einen Aryl-, Aralkyl- oder Alkarylrest mit 5 bis weniger als 20 C-Atomen und

   X ein Säureanion und

   (b) 10 bis 75 Gew.-I co-polymerisierbaren Monomeren, bestehend aus aliphatischen und/oder aromatischen Kohlenwasserstoffen, Alkylacrylaten und/oder Alkylmethacrylaten und

   (c) 0 bis 5 Gew.-I eines di-funktion«llen Quervernetzungsmittels.

   9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Beizmittel verwendet: PoIy(N,N,N-trimethyl-N-vinyl-benzylammonium)chlorid; Poly^styrol-co-benzyl(dimethyl)-p-vinyl-benzylammoniumchlorid7; Poly^styrol-co-vinylbenzyl-N^-dimethylbenzylammoniumchlorid-co-divinylbenzol7; Poly(Ν,Ν,Ν-trimethyl-N-vinylbenzylammoniumchlorid-co-styrol); Poly(Ν,Ν,Ν-trioctyl-N-vinylbenzylphosphoniumchlorid) oder Poly(styrol-co-(vinylbenzyl)-(tridecyl)-ammoniumchlorid).

   10. Analytisches Element für die Durchführung des Verfahrens nach Ansprüchen 1 bis 9, gekennzeichnet durch eine Ausbreitzone und eine Reagens-Zone, die bei Verwendung des Elementes in Strömungskontakt miteinander stehen, wobei die Reagens-Zone ein reaktionsfähiges Beizmittel für Bilirubin mit einem oder mehreren Bindungs-Zentrum für Bilirubin mit einer hydrophoben organischen Matrix und mindestens einer eine Ladung aufweisende kationische Gruppe, aufweist, da· Bilirubin derart beizt, da» das gebeizte Bilirubin eine Absorptionsspitze aufweist, die gegenüber der Absorptions- spitze des freien Bilirubins um mindestens 10 nm verschoben ist und der molare Extinktionskoeffizient um mindestens 50 1 höher itt als der des freien Bilirubin!.

   11. Element nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daft die Aus breitzone und die Reagens-Zone zu übereinander angeordneten

   • 0M2I/0I0G

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   Schichten ausgebildet sind, die auf einem strahlungsdurchlässigen Schichtträger angeordnet sind, wobei die Reagens-Schicht zwischen dem Schichtträger und der Ausbreitschicht liegt.

   12. Element nach einem der Ansprüche 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß es als Beizmittel ein Polymer mit wiederkehrenden Einheiten der folgenden Formel aufweist:

   worin bedeuten:

   A einen organischen Rest;

   Q eine chemische Bindung oder chemische Bindungen oder einen chemischen Rest, der M an A bindet;

   α
   M einen quaternären Ammonium- oder Phosphoniumrest und

   X ein Säureanion.

   13. Element nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausbreitschicht eine oberflächenaktive Verbindung zur Normalisierung des Transportes des Bilirubin durch die Schicht aufweist.

   14. Element nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es eine isotrop poröse, nicht-faserige Ausbreitschicht mit einem Gehalt an einer oberflächenaktiven Verbindung aufweist, die den Transport des Bilirubins durch die Schicht normalisiert und daß die Reagens-Schicht als Beizmittel für Bilirubin ein Polymer mit wiederkehrenden Einheiten der folgenden Formel enthält:

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   "⁶" 2801471

   R¹ - Ν^θ - R²

   3 Χ^θ

   R^{3 λ}

   worin bedeuten:

   A einen Alkylenrest;

   Q einen Kohlenwasserstoffrest, der das Stickstoffatom an A bindet und 5 bis 10 C-Atome aufweist;

   ₁ j , weniger als

   R , R und R·⁵ jeweils einen Alkylrest mit 1 bis/10 C-Atomen

   oder einen Aryl-, Aralkyl- oder Alkarylrest mit 5 bis/28ⁿc-Atomen, wobei R¹, R² und R³ die gleiche oder eine voneinander verschiedene Bedeutung aufweisen können, und

   9
   X ein Säureanion.

   15. Element nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es ein polymeres Beizmittel für Bilirubin enthält, das erhalten wurde durch Copolymerisation einer Mischung von Monomeren aus:

   (a) 25 bis 90 Gew.-I monomeren Verbindungen für die Erzeugung von wiederkehrenden Einheiten der folgenden Formel:

   R¹ - N⁹ - R²

   's χ^θ

   R^{3 X}

   worin bedeuten:

   A einen Alkylenrest;

   ' 809629/0900

   einen Kohlenwasserstoffrest, der das Stickstoffatom an A bindet und 5 bis 10 C-Atome aufweist;

   R¹, R² und R³, die die gleiche oder eine voneinander verschiedene Bedeutung aufweisen können, jeweils einen Alkylrest mit 1 bis/^O^C-Atomen oder einen Aryl-, Aralkyl- oder Alkarylrest mit 5 bis/^ratomen und

   X ein Säureanion;

   (b) 10 bis 75 Gew.-t copolymerisierbarenMonomeren, bestehend aus aliphatischen und/oder aromatischen Kohlenwasserstoffresten, Alkylacrylaten und/oder Alkylmethacrjrlaten und

   (c) 0 bis 5 Gew.-I eines difunktionellen Quervernetzungsmittels.

   16. Element nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß es zwischen Reagens-Schicht und Träger eine Wasserquellbare Zwischenschicht aufweist.

   17. Element nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß es zwischen Ausbreitschicht und Reagens-Schicht eine Zwischenschicht aufweist, die Glucuronidase enthält.

   18. Element nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß es in der Ausbreitschicht Glucuronidase enthält.

   19. Element nach einem der Ansprüche 10 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausbreitschicht aus einer porösen polymeren Masse oder einer teilchenförmigen Masse aufgebaut ist.

   20. Element nach einem der Ansprüche 10 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausbreitschicht aus einen Polymer aufgebaut ist, in dem ein teilchenförmiges Material dispergiert ist.

   21. Element nach einem der Ansprüche 10 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß es als Beizmittel enthält: PoIy(N,Ν,Ν-trimethyl-N-vinyl-

   800629/0000

   280U7I

   benzylammonium)chlorid; Poly^styrol-co-benzyl(dimethyl)-pvinylbenzylammoniurachlorid7; Poly^styrol-co-(vinylbenzyl)-(trihexyl)-ammoniumchlorid; Poly^styrol-co-N-vinylbenzyl-NjN-dimethylbenzylamraoniumchlorid-co-divinylbenzol/; Poly (N,N,N-triraethyl-N-vinylbenzylaramoniumchlorid-co-styrol) oder PoIy-(NjNjN-trioctyl-N-vinylbenzylphosphoniurochlorid).

   22. Element nach einem der Ansprüche 10 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Reagens-Schicht aufweist, die für Stoffe mit einem Molekulargewicht, das größer ist als das Molekulargewicht des Albumins oder gleich ist dem Molekulargewicht des Albumins, durchlässig oder praktisch durchlässig ist.

   23. Element nach einem der Ansprüche 10 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagens-Schicht eine geringere Permeabilität oder Durchlässigkeit aufweist als die Ausbreitschicht.

   Jd#*2ft/0#0l