DE2801477C2 - Verfahren und analytisches Element für die Bestimmung von Bilirubin - Google Patents

Description

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mungsmethode unter Verwendung einer organischen Säure oder eines Säuresalzes und eines Ferrllons im allgemeinen erforderlich, daß etwa bis zu iO Minuten gewartet wird, damit die Umsetzung zwischen der Säure und dem Billrubin vollständig ablaufen kann. Des weiteren ist eine zusätzliche Zeitspanne für die Abtrennung des Endproduktes von dem ursprünglichen Reaktionsmedium erforderlich, damit das Reaktionsprodukt spektrophotometrlsch analysiert werden kann. Schließlich treten bei dieser Bestimmungsmethode verschiedene Komponenten auf, die Absorptlonsmaxlma im blauen Bereich des Spektrums haben, wie beispielsweise Hämoglobin und die verschiedensten Karotinoide.

Abgesehen von den beschriebenen klinischen analytischen Verfahren, die für die Bestimmung von Bilirubin entwickelt wurden, 1st bekannt, daß verschiedene Verbindungen, wie beispielsweise Bilirubin, die eine hohe Bindungsaffinität für Proteine haben, beispielsweise für menschliches Serumalbumin, eine farbige Verbindung, wie beispielsweise Phenolrot, das an Albumin gebunden ist, jedoch eine vergleichsweise Bindungsaffinität für Albumin besitzt, vollständig verdrängen können. So weist beispielsweise Bilirubin eine Bindungskonstante erster Ordnung K_A(M^-1) gegenüber menschlichem Serumalbumin von größer als 10⁸ auf, wohingegen Phenolrot eine entsprechende Bindungskonstante erster Ordnung K_A(M') gegenüber menschlichem Serumalbumin von etwa 10⁴ hat (verwiesen wird beispielsweise auf die Arbeit von V. Kragh-Hansen und Mitarbeiter »Relation Between Bindung of Phenolsulfophthaleln Dyes and Other Ligands With A High Affinity For Human Serum Albumin«, veröffentlicht in der Zeitschrift Blochemica et Blophyslca Acta, Band 365 (1974), Seiten 360 bis 371, insbesondere Selten 366 und 367).

Es sind ferner, z. B. aus den Literaiurstellen Analytical Chemistry, Band 4, Seite 560 (1960); The Journal of Pediatrics, Band 86, Nr 2, Seite 280 (1975) und Scand. J. din. Lab. Invest, Band 35, Seite 545 (1975) fiuorimetrlsche und spektrometrlsche Verfahren zur Bestimmung der Bilirubln-Bindungskapazität von Serumalbumin mittels Farbstoffen wie beispielsweise dem fluoreszierenden Farbstoff Vasofiavin und anderen Farbstoffen wie beispielsweise Bromphenolblau bekanntgeworden.

Bis heute ist jedoch noch kein befriedigendes klinisch anwendbares Verfahren für die Bestimmung des Gesamt-Bilirubingehaltes einer biologischen Flüssigkeitsprobe bekanntgeworden. Auch sind bis heute noch keine mehrschichtigen analytischen Elemente des aus der US-PS 39 92 158 und der BE-PS 8 31660 bekannten Typs bekanntgeworden, die sich für Billrubln-Bestimmungsverfahren eignen und die ein auf Bilirubin ansprechbares Reagenz enthalten, dessen Verwendbarkeit auf unterschiedlichen Bindungskapazitäten für Bilirubin und anderen Stoffen, ζ Β. Farbstoffen beruht.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur Bestimmung von Billrubin In einer wäßrigen Probe sowie ein analytisches Element für die Durchführung des Verfahrens anzugeben.

Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren mit den im Anspruch 1 gekennzeichneten Merkmalen und durch ein analytisches Element mit den im Anspruch gekennzeichneten Merkmalen.

Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens bzw. des analytischen Elements ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich Insbesondere für die Bestimmung von Bilirubin in biologischen Flüssigkelten, wie beispielsweise Blut, Blutserum, Urin und dergleichen, Insbesondere Blutserum, da bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens der Effekt von die Blllrubln-Bestlmmung störenden Komponenten, wie beispielsweise Hämoglobin, Karotlnoide, Billverdin und dergleichen auf ein Minimum herabgedrückt werden kann. Wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Analyse des Bilirublngehaltes von derartigen biologischen Flüssigkelten verwendet, so kann es vorteilhaft oder zweckmäßig sein vom Bilirubin verschiedene höher

ίο molekulare Proteinkomponenten an die Bilirubin gebunden werden kann, beispielsweise Albumin, zu entfernen oder abzudlssoziieren, so daß eine quantitative Analyse des Gesamt-Bllirubingehaltes der Testflüssigkeit erleichtert wird. Aus diesem Grunde kann gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die zu untersuchende Flüssigkeitsprobe zunächst einer Vorbehandlung unterworfen werden, urn derartige die BÜirubln-Bestlmmung störende Komponenten abzutrennen oder zu entfernen. Eine derartige Vorbehandlung kann in der Anwendung üblicher bekannter Verfahren bestehen, die zur Entfernung hochmolekularer Komponenten, die die Bllirubin-Bestimmung stören, angewandt werden, beispielsweise einer Proteinausfüllung, einer Probenverdünnung und dergleichen.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung erfolgt die Billrubln-Bestlmmung mittels eines analytischen Elementes gemäß der Erfindung auf »trockenem« chemischem Wege.

Ein zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendbares Element weist eine Reagens-Zone auf, die beispielsweise aus einer Schicht mit dem definierten Blllrubin-aktiven Komplex bestehen kann, und gegebenenfalls eine Ausbreitzone, oder -schicht, welche die zu untersuchende Flüssigkeitsprobe verteilt und der Reagenz-Zone zuführt.

Gegebenenfalls kann eine oberflächenaktive Verbindung in der Ausbreitzone untergebracht werden, die normalisierend auf den Transport des Bilirubins durch diese Zone einwirkt, und zwar auch In Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen an hoch-molekularen Protein-Störungskomponenten für Bilirubin, wie beispielsweise Albumin und dergleichen.

Wird die zu untersuchende Flüssigkeitsprobe zunächst einer Vorbehandlung unterworfen, mit dem Ziel, praktisch alle Protein-Störungskomponenten für Bilirubin zu entfernen, z. B. einer Protein-Ausfällung oder einer Probenverdünnung, so läßt sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ein analytisches Element verwenden, das im einfachsten Falle lediglich eine Reagenz-Zone des angegebenen Typs aufweist.

Gemäß einer weiteren besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung 1st die Reagenz-Zone des analytischen Elementes iFfipcfiTicäbel tür 5US höch-molckülaren Proteinen bestehenden Störungskomponenten beispielsweise für Proteine mit einem Molekulargewicht von etwa 60 000 (Dalton-Einheiten) oder darüber, wodurch weitere Störungen durch derartige Komponenten ausgeschaltet werden.

Gemäß einer weiteren besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sogenannte Integrierte oder integrale Elemente verwendet, bei denen eine Ausbreitzone, sofern eine solche vorhanden 1st, und eine Reagenz-Zone in Form von Ausbreit- und Reagenzes schichten vorliegen, die sich auf einem geeigneten Träger befinden, beispielsweise einen für Strahlungen durchlässigen Träger. Unter »für Strahlungen durchlässig« oder »strahlungsdurchlässig« sind hler Zonen und Träger

/analytischer Elemente zu verstehen, die einen Durchtritt elektromagnetischer Strahlung ermöglichen, die zur analytischen Bestimmung verwendet werden. In vorteilhafter Welse sind derartige Zonen und Träger für elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge oder Wellenlängen innerhalb eines Bereiches von etwa 200 nm und 900 nm durchlässig. Die Zonen oder Träger können jedoch beispielsweise auch für eine bestimmbare Strahlung durchlässig sein, wie. sie durch Radioaktivität erzeugt wird.

Gegebenenfalls kann ein erfindungsgemäßes analytisches Element eine separate Registrierschicht aufweisen, die zwischen der Reagenzschicht und dem Schichtträger angeordnet 1st und den freigesetzten, diffusionsfähigen, bestimmbaren Liganden aufnimmt, der von dem Billrubln-aktiven Komplex in der Reagenzschicht des Elementes verdrängt worden ist.

Gegebenenfalls kann ein erfindungsgemäßes analytisches Element des weiteren eine Strahlung blockierende Schicht aufweisen, die in vorteilhafter Weise zwischen der Reagenzschicht und der Registrierschicht angeordnet sein kann. Eine solche Strahlung blockierende Schicht Ist eine Schicht, die ein oder mehrere Trübungsmittel enthält und den Durchtritt von elektromagnetischer Strahlung verhindert, z. B. von der Wellenlänge oder den Wellenlängen, die zur Anregung und/oder Bestimmung des bestimmbaren Liganden innerhalb der Registrierschicht verwendet werden.

Die einzelnen Zonen oder Schichten eines analytischen Elementes nach der Erfindung befinden sich mindestens bei Verwendung des Elementes In einem Strömungskontakt miteinander. Der Ausdruck »Strömungskontakt« besagt, daß ein Strömungsmittel, z. B. eine Flüssigkeit von einer Zone eines analytischen Elementes in eine andere angrenzende Zone des analytischen Elementes gelangen kann oder entsprechend von einer Schicht In eine andere. Dies bedeutet anders ausgedrückt, daß die Bestandteile einer Flüssigkeit die Grenzflächen zweier Zonen, die sich im Strömungskontakt miteinander befinden, passieren können. Obgleich Zonen oder Schichten, die sich im Strömungskontakt miteinander befinden, einander benachbart sein können, können sie doch auch durch Zwischenzonen bzw. Zwischenschichten voneinander getrennt sein. Dabei gilt jedoch, daß Zonen oder Schichten, die Zonen bzw. Schichten, die sich in Strömungskontakt miteinander befinden, physikalisch trennen, auch im Strömungskontakt mit diesen Zonen bzw. Schichten befinden und den Übertritt von Flüssigkeiten zwischen derartigen Zonen bzw. Schichten nicht behindern.

Ein Strömungskontakt zwischen Zonen bzw. Schichten läßt sich durch Herstellung von Elementen mit Zonen oder Schichten erreichen, die von Anfang an einander benachbart sind. Andererseits ist es jedoch auch möglich Elemente herzustellen, die Zonen bzw. Schichten aufweisen, die zunächst einander nicht benachbart sind und die des weiteren voneinander getrennt werden können, beispielsweise durch Zwischenschichten oder Zwischenblätter, wie es beispielsweise aus der US-PS 3511608 bekannt ist. Andererseits können sie auch durch ein federndes absorbierendes Material oder deformierbare Träger getrennt sein, wie es beispielsweise aus den US-PS 39 17 453 und 39 33 594 bekannt ist. Weist ein Element keine von Anfang an einander benachbarte Zonen auf, so kann es erforderlich sein, die Zonen des Elementes durch Einwirkung eines Druckes oder auf andere Weise In Flüssigkeitskontakt miteinander zu bringen, wenn sie verwendet werden.

Unter »diffusionsfähig« Ist hler die Fähigkeit einer Verbindung zu verstehen, sich effektiv Innerhalb eines analytischen Elementes durch Diffusion zu bewegen, wenn die Verbindung von der In dem Element vorhandenen Flüssigkeit aufgenommen wird, z. B. dem Lösungsmittel oder Disperstonsmedium einer Flüssigkeitsprobe, die dem Element zugeführt wird. In entsprechender Weise kennzeichnet das Wort »permeabel« die Fähigkeit einer Zone von einer Verbindung durchdrungen zu werden, die in einer Flüssigkeit gelöst oder dlspergiert ist, öder entsprechend die Fähigkeit einer Substanz durchdrungen zu werden. .

Bei Gebrauch eines erfindungsgemäßen Elementes wird auf dieses eine Flüssigkeitsprobe aufgebracht, die, Ist sie Bllirubin-positiv, mit dem Blllrubin-aktlven Komplex der Reagenz-Zone reagiert, und zwar unter Freisetzen eines diffusionsfähigen, vorzugsweise radiometrisch bestimmbaren Liganden, der von der Reagenz-Zone in die Registrier-Zone diffundiert. Eine selektive Bestimmung des bestimmbaren Liganden kann dadurch erfolgen, daß las analytische Element derart aufgebaut wird, daß der nicht freigesetzte bestimmbare Ligand selektiv in der Reagenz-Schicht bestimmt wird, und zwar ohne Störung durch den freigesetzten Liganden In der Reglstrier-Zone oder indem der umgekehrte Weg beschrltten wird. Dies läßt sich durch eine geeignete strukturelle Anordnung der verschiedenen Zonen des analytischen Elementes erreichen oder durch geeignete Auswahl von bestimmbaren Liganden. Beide dieser Verfahren werden später beschrieben werden. Falls erforderlich oder wünschenswert, kann eine Strahlung blockierende Zone Im Element zwischen der Reagenz-Zone und der Registrier-Zone angeordnet werden, beispielsweise um rote Blutkörperchen abzuschirmen, wenn Blut analyslert wird, oder um andere Stoffe, während der analytischen Bestimmung in der Reglstrier-Zone fernzuhalten. Weist das Element eine Ausbreit-Zone auf, so passiert die Probe zunächst diese Zone, bevor sie In die Reagenz-Zone gelangt, wobei das Bilirubin in der Ausbrelt-Zone verteilt wird, unter Erzeugung einer gleichförmigen Konzentration der Verbindung an der Oberfläche der Ausbrelt-Zone, die der Reagenz-Zone gegenüberliegt. Es ist möglich, eine derartige gleichförmige Konzentration bei verschiedenen Probenvolumina zu erzielen, die auf das Element aufgebracht werden. Aufgrund des Flüssigkeitskontaktes zwischen der Ausbreit-Zone und der Reagenz-Zone und aufgrund der vorzugsweise gleichförmigen Permeabilität der Reagenz-Zone gegenüber dem in der Ausbreit-Zone ausgebreiteten Bilirubin, werden aus der Ausbreit-Zone der Reagenz-Zone die Bestandteile der auf das Element aufgebrachten Probe gleichmäßig verteilt zugeführt, so daß diese die Reagenz-Zone zu jedem Zeitpunkt durchdringen können, ohne daß ins Gewicht fallende Unterschiede in der Billrubinkonzentration auftreten.

Auf Grund des Vorhandenseins des Bilirubin-aktiven Komplexes in der Reagenz-Zone und weil die Ausbreit-' Zone der Reagenz-Zone das Bilirubin in gleichförmiger Konzentration zuführt, läßt sich im Element eine gleichförmige, quantitativ bestimmbare Veränderung herbeiführen. Eine solche Veränderung, die auf der Freisetzung eines vorgebildeten Liganden beruht, der beispielsweise durch einen Anstieg oder eine Abnahme der Färbung oder Fluoreszenz bestimmbar ist, läßt sich quantitativ durch Tadiometrische Verfahren bestimmen, gegebenen-Tails durch Verwendung von automatisch arbeitenden radiometrischen Abtast-Vorrichtungen, beispielsweise photornetrischen oder fluorimetrischen Geräten.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren

mit analytischen Elementen des beschriebenen Typs durchgeführt, die sich »trockener chemischer Verfahren« 'bedienen. Das Verfahren der Erfindung läßt sich jedoch andererseits auch auf »naß-chemischen Wege«, z. B. unter Verwendung von Lösungs-Bestlmmungsmethoden durchführen. In einem solchen Falle wird der Blllrublnaktlve Komplex, der in einem geeigneten flüssigen Medium vorliegt, mit einer Flüssigkeitsprobe, die auf ihren Bllirubingehalt analysiert werden soll, In Kontakt gebracht. Bei Anwendung dieser »naß-chemischen Methode« oder Lösungsmethode hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die auf Ihren Billrubingehalt zu untersuchende flüssige Probe zunächst einer Vorbehandlungsstufe zu unterwerfen, um hoch-molekulare Proteine zu elemlnleren, die sich störend auf die Bllirubln-Bestlmmung auswirken können. Bei dieser Vorbehandlung können die störenden Proteine nach einem der beschriebenen Trennverfahren abgetrennt werden.

Die Erfindung wird Im Folgenden durch Ausführungsbeispiele anhand der Zeichnungen näher erläutert.

Die Flg. 1,2 und 3 stellen vorteilhafte analytische Elemente nach der Erfindung vergrößert und vereinfacht dar.

In Fig. 4 1st eine Elchkurve dargestellt, die für ein mehrschichtiges analytisches Element nach der Erfindung erhalten wurde.

Wie bereits dargelegt, 1st ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines reaktionsfähigen Reagenz mit oder aus einem Bilirubln-aktlven Komplex mit mindestens einem diffusionsfähigen, durch Bilirubin verdrängbaren und bestimmbaren Liganden, der an einen geeigneten Träger gebunden ist. Kommt ein solches Reagenz In einen Flüssigkeitskontakt mit einer Bilirubin enthaltenden Flüssigkeit, so verdrängt das Bilirubin den bestimmbaren Liganden aus seiner Bindung an den Träger.

Es wurde gefunden, daß durch Auswahl geeigneter Liganden und Träger unter Erzeugung eines Blllrubinaktlven Komplexes eine genaue, quantitative Bestimmung von Bilirubin, beispielsweise In Blutserum möglich 1st, und zwar aufgrund einer direkten, praktisch stöchlometrlschen Verdrängung des bestimmbaren Liganden durch Bilirubin.

Durch Auswahl von geeigneten, bestimmbaren Liganden und Trägern für die Herstellung des Bilirubin-aktiven Komplexes wird eine Bilirubin-Bestimmungsmethode geschaffen, die nicht nur genau arbeitet, sondern auch schnell durchführbar 1st, empfindlich ist und sich zur Bestimmung von sehr verschiedenen Konzentrationen an Bilirubin eignet, das In verschiedenen Flüssigkeitsproben zugegen sein kann, z. B. in Blutserum, ohne daß es erforderlich ist, die zu analysierende Probe zu verdünnen. Überdies 1st es hei Verwendung von erfindungsgemäßen analytischen Elementen möglich, das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bilirubin, beispielsweise in Blutserum zu verwenden, wobei die Bestimmung keinen Störungen unterliegt, die im Hinblick auf das Vorhandensein von höher molekularen Proteinen In derartigen Proben, wie beispielsweise Albumin und auch die spektrale Bestimmung von Bilirubin störenden Komponenten, wie beispielsweise Hämoglobin und Gallenpigmenten (die Karotlnoide enthalten) und bestimmten Arzneimitteln, die alle nachteilige Effekte auf eine Bllirubln-Bestimmung haben können und wie sie bei den bekannten Verfahren des Standes der Technik auftreten, zu erwarten gewesen wären.

Die Träger, die die gemeinsamen Träger oder Bindemittel darstellen, an die sich die bestimmbaren Liganden und Bilirubin binden lassen, können aus den verschiedensten Verbindungen bestehen, einschließlich aus Proteinen, z. B. Albumin; Albuminfragmenten, z. B. Abbauprodukten des Albumins und Albuminderivaten, wie beispielsweise quervernetzten Albumin-Molekülen, z. B. Carboxy-methyllertem Albumin; verschiedenen Serumglobulinen, z. B. α-, β- und φ-Globulln sowie Macroglobulln; Llpoprotelnen, wie sie beispielsweise In den verschiedensten handelsüblichen Blomembranmaterlalien vorliegen, sowie Glycoprotelnen.

Des weiteren können als Träger beispielsweise auch die verschiedensten Agarosen verwendet werden, die oftmals als Polysaccharide bezeichnet werden. So lassen sich in vorteilhafter Weise beispielsweise Polyglucosen verwenden. Auch können des weiteren die verschiedensten polymeren Beizmittel als Träger verwendet werden.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren stehen zwei Liganden, nämlich Bilirubin und der bestimmbare Ligand, Im Wettbewerb um die Bindung an entweder die gleiche oder topologisch ausgeprägte Stelle(n) des gleichen macromolekularen Trägers, wobei die Gegenwart oder Konzentration des Liganden, der fester gebunden wird, d. h. des Bilirubins bestimmt wird durch Veränderungen in physico-chemlschen Parametern des weniger leicht bestimmbaren Liganden, der sukzessive durch ansteigende Konzentrationen des Billrubln-Liganden verdrängt wird. Infolgedessen 1st der auszuwählende Träger eine Verbindung, die eine stärkere Bindungsaffinität für Bilirubin aufweist als für den bestimmbaren Liganden.

Dies bedeutet, daß als Träger eine Verbindung auszuwählen ist, der gegenüber der bestimmbare Ligand eine kleinere Bindungskonstante aufweist, als das Billrubin. Des weiteren ist der verwendete Träger oder das verwendete Bindemittel ein Träger mit Bindungszentren, um die sowohl der bestimmbare Ligand als auch das Bilirubin wetteifern.

Es ist bekannt, daß biologische Flüssigkeiten, wie beispielsweise Blut und Blutserum eine Anzahl von Verbindungen einschließlich verschiedene Proteine enthalten, wie beispielsweise Hämoglobin und Albumin; Lipide, z. B. Oleate und Palmitate; sowie Hormone, z. B. L-Thyroxin, L-Tryptophan, Estradlol, Progesteron, Cortison, Aldosteron, Testosteron, Prostaglandin, Urat und dergleichen, die sämtlich eine gewisse Bindungsaffinität gegenüber vielen macromolekularen Trägern aufweist, die Bilirubin zu binden vermögen.

Aus diesem Grunde hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, als Träger oder Binder für den Komplex eine Verbindung auszuwählen, deren Bindungsaffinität gegenüber Bilirubin besonders ausgeprägt 1st. Es wurde gefunden, daß geeignete Träger oder Binder solche sind, denen gegenüber Bilirubin eine Bindungskonstante von über 10⁷, vorzugsweise größer als 10⁸ aufweist. Die Bindungskonstanten können dabei nach der Methode von Kiagh-Hansen und Moller, veröffentlicht in der Zeitschrift »Blochem. Biophys. Acta«, Band 295, Selten 438 bis 446 (1973) gemessen werden.

Als besonders vorteilhafte Träger oder Binder haben sich die bereits erwähnten Albumine erwiesen, einschließlich der verschiedensten Abbauprodukte und Derivate. Durch Verwendung dieser bevorzugt verwendeten Träger lassen sich praktisch die meisten, wenn nicht alle der erwähnten Proteine, Lipide und Hormone als potentielle Störfaktoren ausschalten, da die meisten dieser Verbindungen Bindungskonstanten gegenüber Albuminen haben, die weit unter 10⁷ liegen.

Wie sich beispielsweise aus der folgenden Tabelle I ergibt, weisen viele dieser störenden Verbindungen Bin-

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dungskonstanten gegenüber Albumin, d. h. einem bevorzugt verwendeten Träger auf, die unter 10⁵ liegen.

Tabelle I

Bindungs-Konstanten bestimmter Liganden gegenüber menschlichem Serumalbumin

Ligand oder	Bindungs-	pH	Tempera
Blutkomponente	Konstante		tur
	1. Ordnung		("C)
	■ K0 (M-1)
Billrubin	1,4 XlO8	7,4	37
	2,4 xlO8	7,4	25
Oleat und Palmltat	106	7,4	23
L-Thyroxln	106	7,4	24
L-Tryptophan	1,6 xlO4	7,4	2
Estradiol	IxIO5	7,4	5
Progesteron	3,7 χ 104	7,4	5
Cortison	5 xlO3	7,4	5
Aldosteron	<5xlO3	7,4	5
Testosteron	4,2x10"	7,4	25
Prostaglandin	7 xlO4	7,5	37
Urat	3xl02	7,4	37
Phenylbutazon	4,3 xlO4	7,4	37
Sulflsoxasol	1,9x10"	7,4	37
Sulfadiazin	8,2 xlO2	7,4	37
Sulfanllamid	<2xlO>	7,4	37
Natriumsallcylat	9,2 xlO3	7,4	37
Acetylsalicylat	5,3 xlO2	7,4	37
Natriumbenzoat	1,7 xlO3	7,4	37
Gentamicinsulfat	<lxl0'	7,4	37
Polymyxln-B-sulfat	<lxl02	7,4	37
Diphenylhydantoin	6 xlO3	-	37

Der diffusionsfähige, durch Bilirubin verdrängbare und bestimmbare Ligand, der zur Herstellung eines Bilirublnaktiven Komplexes verwendet werden kann, kann aus sehr verschiedenen Verbindungen bestehen. Geeignet sind, wie bereits dargelegt, Liganden, die eine Bindungsaffinität gegenüber dem Träger des Komplexes aufweisen, die nicht so groß ist wie die Bindungsaffinität des Trägers gegenüber Bilirubin. Dies bedeutet, daß derartige Liganden eine Bindungskonstante erster Ordnung gegenüber dem Träger aufweisen, die unter 10⁷ liegt. Des weiteren sollen geeignete Liganden eine Mindest-Bindungskonstante 1. Ordnung gegenüber dem Träger haben, die größer als etwa 10⁵ ist, so daß die verschiedensten Proteine, Lipide, Hormone und dergleichen, wie sie in der Tabelle I aufgeführt sind, die Bilirubin-Bestimmung nicht stören können. Selbstverständlich müssen des weiteren die Liganden durch Bilirubin verdrängbar sein, d. h. sie müssen eine oder mehrere Bindungsstellen auf dem Träger haben, die auch Bindungsstellen für Bilirubin darstellen (es sind diese gemeinsamen Bindungsstellen, auf die sich die erwähnten Bindungskonstanten beziehen).

In typischer Weise stellt der bestimmbare Ligand eine chemische Verbindung oder Vorläuferverbindung hiervon oder Gruppe dar, deren Gegenwart radiometrisch bestimmt werden kann. Zur Durchführung radiometrischer Analysen können die verschiedensten Bestimmungsmittel verwendet werden, z. B. Abiastgeräte, die Radioemissionen von derartigen bestimmbaren Verbindungen oder Gruppen erfassen, z. B. bestimmbare Liganden, die phosphoreszieren, fluoreszieren oder die durch radioaktive Emissionen gekennzeichnet sind. Des weiteren gehören zu derartigen radiometrischen Analysegeräten kolorimetrlsche Geräte, bei deren Verwendung das Vorhandensein der Liganden auf Grund charakteristischer Absorptionsspektren oder Extinktionskoeffizienten festgestellt wird.

Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, kolorimetrisch bestimmbare Verbindungen oder Liganden zu verwenden, welche eine spektrale Verschiebung Im Falle einer Wellenlänge von größer als ungefähr 460 Nanometer bewirken, da freies Bilirubin eine Absorptionsspitze

1P bei ungefähr 435 Nanometem und »gebundenes« Bilirubin (d. h. Billrubin, das an. einen üblichen Proteinträger gebunden ist, wie beispielsweise Albumin) eine Absorptionsspitze bei etwa 460 Nanometem aufweist. Überdies sind viele bekannte Billrubin-Störungskomponenten,

z. B. die verschiedensten hochmolekularen Proteine und andere biologische Störkomponenten dafür bekannt, daß sie Im Bereich des Spektrums unterhalb 460 Nanometem absorbieren. So enthalten beispielsweise die verschiedensten Gallenpigmente ß-Karotin, d. h. eine Verbindung, die die übliche Billrubinbestimmung stört. Das ß-Karotln absorbiert dabei bei etwa 450 Nanometer. Auch weist beispielsweise Hämoglobin eine kräftige Absorptionsspitze bei etwa 414 nm auf.
Als besonders vorteilhaft bestimmbare Liganden haben sich beispielsweise solche erwiesen, die in Ihrem gebundenen Zustand, d. h., wenn sie an den Träger des Bllirubin-aktlven Komplexes gebunden sind, einen vergleichsweise starken Fluoreszenzgrad aufweisen und die in freiem Zustand nach Verdrängung und Freisetzung aus dem Bllirubin-aktiven Komplex keine oder eine nur höchstens geringe Fluoreszenz zeigen. Derartige bestimmbaren Liganden lassen sich leicht bestimmen durch Beobachtung der Abnahme der Fluoreszenz-Emission des Billrubln-aktlven Komplexes, die durch die Frelsetzung des Liganden bewirkt wird, der, wie bereits angegeben, keine oder höchstens eine geringe Fluoreszenz aufweist.

Unter einem »bestimmbaren Liganden« oder einer »bestimmbaren Gruppe« sind hier somit Verbindungen zu verstehen, die in ihrem freien Zustand oder in ihrem gebundenen Zustand bestimmbar sind, wobei das wesentliche Erfordernis derartiger »bestimmbarer« Verbindungen darin zu sehen 1st, daß eine bestimmbare Differenz zwischen ihrem »gebundenen Zustand« im Bilirubin-aktiven Komplex und ihrem freien Zustand besteht (und, wie im folgenden noch erläutert werden wird, dem Reaktionsprodukt, das aus der freigesetzten Verbindung und einem weiteren Reagenz erzeugt wird).

Unter einem »bestimmbaren Liganden« oder einer »bestimmbaren Verbindung« sind auch solche Liganden bzw. Verbindungen zu verstehen, die, obgleich selbst nach ihrer Freisetzung nicht bestimmbar, doch bestimmbar gemacht werden können, und zwar durch Umsetzung von freigesetztem Liganden mit einer anderen geeigneten Verbindung. So kann beispielsweise ein bestimmbarer Ligand aus einer photographisch verwendbaren oder geeigneten Verbindung bestehen, beispielsweise einer Farbstoffvorläuferverbindung, z. B. einem Farbkuppler, der nach Freisetzung und nach einer Kupplungsreaktion einen bestimmbaren Farbstoff oder ein bestimmbares Pigment liefert. Derartige Verbindungen sind bekannt, beispielsweise auf dem Gebiet der üblichen Silberhalogenidphotographie, weshalb hier eine weitere Diskussion überflüssig ist. Weitere Informationen bezüglich derarti-

65- ger Verbindungen finden sich beispielsweise in Paragraph XXII der Zeitschrift »Research Disclosure«, Band 92, Publikation 9232, Seite 110 vom Dezember 1971 unter der Überschrift »Photographic Elements and Processes«.

Aus der vorstehenden Diskussion eigibt sich, daß es ein weiteres Merkmal eines »bestimmbaren Liganden« ist, der sich zur Herstellung eines Bilirubin-aktiven Komplexes eignet, daß der Ligand nicht das Ergebnis einer chemischen Reaktion ist. Vielmehr handelt es sich bei dam Liganden um eine vorgebildete Verbindung, die in intaktem Zustand auf physikalischem oder chemischem Wege von dem Komplex freigesetzt wird, an die der Ligand gebunden ist, worauf das Vorhandensein des Liganden oder der Verbindung direkt feststellbar ist (oder feststellbar gemacht werden kann) ohne Störung durch die Verdrängung oder Freisetzung des Liganden von dem Bilirubin-aktiven Komplex.

Als spezifische Beispiele für bestimmbare Liganden, die sich erfindungsgemäß verwenden lassen, seien genannt:

Geeignete, bestimmbare Liganden, die bestimmbar sind durch auftretende Veränderungen in der Fluoreszenz zwischen den Liganden im gebundenen Zustand und in freier Form sind beispielsweise 8-Anilino-l-naphthaiinsulfonatsalze (im foigenden kurz als ANS bezeichnet), o-p-Toluidino^-naphthalinsulfonatsalze (TNS), 5-Dimethylamino-1-naphthalinsulfonatsalze (DANS) wie auch die verschiedensten Thioflavinfarbstoffe, z.B. Thioflavin S, ein sulfoniertes, methyliertes Benzothiazolderivat. Andere geeignete fluoreszierende Verbindungen sind Acridinorange, 5-[N-(2-Jodoacetylaminoäthyl)amino]-l -naphthalinsulfonatsalze, m-Trimethylammoniumphenylanthranilat sowie die Sulfonylchloridsalze von TNS und DANS. Viele dieser durch Fluoreszenz bestimmbaren Verbindungen, wie beispielsweise ANS, TNS, DANS und dergleichen sind bekannte fluoreszierende Verbindungen und im Handel erhältlich. Eine nicht vollständige Liste von geeigneten, kolorimetrisch bestimmbaren Liganden, die sich zur Durchführung des erfindi.ngsgemäßen Verfahrens eignen, sind Farbstoffe, wie beispielsweise Bromphenolblau, Chlorphenolrot und dergleichen. Vorzugsweise weisen diese kolorimetrisch bestimmbaren Liganden einen molaren Extinktionskoeffizienten von 75 000 oder darüber auf, so daß sie leicht durch übliche kolorimetrische Bestimmungsvorrichtungen ermittelt werden können.

Die im einzelnen optimale Konzentration an Bllirublnaktivem Komplex für die Durchführung einer Bestimmungsmethode kann verschieden sein. In vielen Fällen läßt sich auf Grund der Verdrängung und Freisetzung von bestimmbaren Liganden auf Grund einer stöchlometrischen Beziehung zur Menge des Bilirubins, das den Liganden verdrängt, die Menge an Bllirubin-aktlvem Komplex leicht auf Grund dieser stöchiometrlschen Beziehung bestimmen. In Abhängigkeit von jeweils dem speziellen Bilirublngehalt, d. h. dem »dynamischen Bereich«. In dem die spezielle Bllirubln-Bestlmmung durchführbar ist. Im allgemeinen verdrängt ein Mol Bilirubin mindestens 1 Mol Liganden von dem Bilirubinaktiven Komplex eines Testelementes, so daß ausreichend Komplex vorhanden sein solue, um mindestens eine äquivalente molare Menge an Ligand, entsprechend der maximalen Anzahl von Molen von Bilirubin, das das Element zu analysieren vermag, zu erzeugen.

Gemäß verschiedenen bevorzugten Ausgestaltungen der Erfindung ist 1 MoI Bilirubin in der Lage, 2 oder mehr Mole bestimmbaren Liganden aus dem Billrubinaktiven Komplex zu verdrängen.

Es hat sich gezeigt, daß vorzugsweise der Träger Im Bilirubin-aktiven Komplex in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 10 oder mehr Molen Träger pro Mol BiIirubin-Analyt vorliegt. In einem aus einem bestimmbaren Liganden und einem Träger gebildeter Komplex hängt die Menge an bestimmbaren Llgnnden und Träger von dem im Einzelfalle verwendeten Träger und dem im Einzelfalle verwendeten Liganden ab.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung, bei der ANS verwendet wird, d. h. eine fluoreszierende Verbindung, als bestimmbarer Ligand und Albumin als Träger, hat sich gezeigt, daß der ANS-Albuminkomplex 2 bis etwa 7 Mole ANS pro Mol Albumin enthalten kann. Es hat sich gezeigt, daß man den »dynamischen Bereich« eines Testelementcs gemäß der Erfindung leicht erweitern kann durch Erhöhung der absoluten Menge an sowohl bestimmbarem Liganden als auch Träger, die zur Herstellung eines speziellen BiH-rubin-aktiven Komplexes verwendet werden, anstatt zu versuchen, entweder die absolute Konzentration an bestlmmoarem Liganden oder Träger konstant zu halten und die molare Konzentration an der anderen Komponente des Komplexe«, d. h. den Träger oder den bestimmbaren Liganden, zu verändern.

Wie bereits dargelegt, läßt sich das Verfahren der Erfindung in verschiedener Weise durchführen, und zwar in Form einer nassen Bestimmungsmethode oder in besonders vorteilhafter Weise auf trockenem Wege unter Verwendung von beispielsweise einem integralen analytischen Element nach der Erfindung. Wird die »nasse« Bestimmungsmethode angewandt, so stellt man zunächst in einer geeigneten »nassen« Reaktionszone, z. B. einem für Strahlungen durchlassigen Behälter, ein geeignetes Reagenz der angegebenen Zusammensetzung, gelöst oder dispergiert in einem nicht-storenden flüssigen Medium, her. Derartige nicht-stOrende Flüssigkeiten sind solche, die bei Durchführung des Verfahrens die Verdrängung und die Freisetzung des bestimmbaren Liganden nicht oder höchstens unbeträchtlich stören. Des weiteren sollte das flüssige Medium derart ausgewählt werden, daß es die im Einzelfalle angewandte radiometrische Bestimmungsmethode zur Bestimmung des freigesetzten Liganden nicht stört. Nicht-storende Flüssigkeiten können aus wäßrigen wie auch aus organischen Flüssigkeiten bestehen. In typischer Weise, insbesondere im Hinblick auf die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die Analyse von biologischen Flüssigkeiten, ist es vorteilhaft, als nicht-störende Flüssigkeit, die in der Reaktionszone verwendet wird, eine wäßrige Flüssigkeit, wie beispielsweise Wasser, zu verwenden oder ähnliche polare organische Lösungsmittel, wie beispielsweise kurzkettlge Alkylalkanole. Gegebenenfalls, je nach dem Im Einzelfalle verwendeten Reagenz kann es vorteilhaft sein, in der Reaktions-Zone zusätzlich zu dem Reagenz Puffersubstanzen zu verwenden. Ganz allgemein hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei Durchführung einer BlIirubin-Bestimmung auf nassem Wege die Bestimmung in einer abgepufferten wäßrigen Flüssigkeit mit einem pH-Wert von etwa 6,8 bis etwa 9,5 bei einer Temperatur von etwa 15 bis etwa 6O⁰C, vorzugsweise etwa 22 bis etwa 50° C durchzuführen. Es ist jedoch möglich, je nach dem im Einzelfalle verwendeten Reagenz bei anderen pH-Werten und anderen Temperaturen der Reagenz-Zone zu arbeiten, d. h. bei niedrigeren oder höheren pH-Werten und niedrigeren oder höheren Temperaturen. Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens als Lösungs-Bestlmmungsverfahren hat es sich des weiteren als zweckmäßig erwiesen, die Bestimmung im Dunkeln oder bei gelbem Sicherheitslicht durchzuführen, um einen durch Licht induzierten Abbau des Bilirubins zu verhindern.
Wird das erfindungsgemäße Verfahren als »nasses«

Billrubln-Bestimmungsverfahren durchgeführt, so hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wie bereits dargelegt, zunächst die Bilirubin enthaltende Flüssigkeitsprobe einer Vorbehandlung zu unterwerfen, um das Bilirubin von verschiedenen Verbindungen, an die es gebunden sein kaan, abzudissoziieren eier abzutrennen. Handelt es sich beispielsweise bei der zu analysierenden Probe um eine Blutserumprobe, so liegt ein großer Anteil des Bilirubins im Serum an Albumin gebunden vor.

Es sind verschiedene Methoden bekannt, um Bilirubin von Verbindungen, wie beispielsweise Albumin abzutrennen. Derartige Methoden können auch dem erfindungsgemäßen Verfahren vorangestellt werden, so daß bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eine genaue Bestimmung des Gesamt-Bilirubingehaltes der Serumprobe möglich ist. Die bekannten Verfahren zur Abtrennung oder Dissoziation von Billrubin von verschiedenen Serumproteinen, insbesondere Albumin, beruhen auf der Anwendung von verschiedenen Protein-Fäliungsverfahren, Verdünnungsverfahren und dergleichen. Eine Übersicht über derartige Verfahren findet sich beispielsweise in dem Buch von Wlnkelman, Cannon und Henry, »Clinical Chemistry-Principles and Technics«, 2. Ausgabe, 1974, Selten 1042 bis 1079.

Das »trockene« Bestimmungsverfahren hat auf Grund seiner besonders einfachen Durchführbarkeit und Bequemlichkeit sowie auf Grund der Tatsache, daß sich leicht quantitativ Analysen durchführen lassen, besondere Vorteile. Als besonders vorteilhaft hat es sich dabei erwiesen, bei Durchführung des Verfahrens auf »trockenem « Wege analytische Elemente, wie sie beispielsweise In den Fig. 1 bis 3 dargestellt sind, zu verwenden.

Das In F1 g. 1 schematisch dargestellte Element weist eine zu Beginn des Verfahrens trockene Reagenz-Zone 6 auf, die den beschriebenen Bllirubln-aktlven Komplex enthält. Obgleich nicht unbedingt erforderlich, kann das Element des weiteren eine zunächst trockene Ausbreitzone 7 und/oder Reglstrler-Zone 8 aufweisen. Dies bedeutet, daß ein besonders vorteilhaftes analytisches Element nach der Erfindung mindestens zv»^i ausgeprägte Zonen aufweist, die sich unter den Verwendungsbedingungen des Elementes in Flüssigkeitskontakt miteinander befinden. Vorzugsweise liegen die verschiedenen Zonen eines Elementes Im Element übereinander angeordnet In Form von einander benachbarten Schichten vor. In typischer Welse sind die beiden Schichten auf einem Schichtträger 9 aufgetragen, der vorzugsweise aus einem für Strahlungen durchlässigen Schichtträger besteht.

Obgleich besonders vorteilhafte analytische Elemente gemäß der Erfindung übereinander angeordnete, zueinander benachbarte Schichten aufweisen, können zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens doch auch Elemente eines anderen Aufbaues verwendet werden, beispielsweise solche, wie sie in Fig. 2 dargestellt sind.

Das in F1 g. 2 dargestellte analytische Element weist mindestens zwei aneinanderstoßende Zonen auf, z. B. eine Ausbreitzone 7 und eine Reagenz-Zone 6, die sich, wie in Fig. 2 dargestellt, auf einem Schichtträger 9 befinden können.

Aus Einfachheitsgründen soll die Erfindung im folgenden anhand eines mehrschichtigen integralen analytischen Elementes beschrieben werden, bei dem die verschiedenen Zonen übereinander angeordnet sind und einander benachbarte Schichten bilden, die auf einem für Strahlungen durchlässigen Träger angeordnet sind. In einfachster Welse braucht ein analytisches Element nach der Erfindung lediglich eine Reagenz-Schicht aufzuweisen. Als vorteilhaft hat es sich jedoch erwiesen, wenn das Element des weiteren eine Ausbreitschicht und/oder Registrierschicht aufweist, in welchem Fall die Reglstrierschicht, sofern vorhanden, vorzugsweise für Strahlungen durchlässig ist. Im Falle derartiger Elemente sind die Schichten vorzugsweise auf einem vorzugsweise strahlungsdurchlässigen Schichtträger angeordnet. Die Verwendung eines Schichtträgers ist jedoch nicht unbedingt erforderlich, wenn die Schichten selbst die erforderliche Festigkeit und Dauerhaftigkeit aufweisen.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung besteht das analytische Element aus slnem für Strahlungen durchlässigen Schichtträger, auf dem aufgetragen sind:

(1) eine Reagenz-Schicht, die mindestens für Billrubin permeabel ist und die ein Reagenz mit einem Billrubin-aktiven Komplex des beschriebenen Typs enthält,

(2) eine Strahlung-blockierende Schicht, die für den zu bestimmenden Liganden, der von dem Biltrubfnaktlven Komplex freigesetzt wird, permeabel ist und

(3) eine für Strahlungen durchlässige Registrierschicht, die für den von dem Bllirubin-aktiven Komplex freigesetzten bestimmbaren Liganden permeabel ist und in der der bestimmbare Llgand bestimmt werden kann.

Gegebenenfalls kann die Registrierschicht ein Beizmittel für den zu bestimmenden Liganden aufweisen. Vorzugsweise befindet sich die Registrierschicht zwischen dem Schichtträger und der Strahlung-blocklerenden Schicht, wobei sich die Strahlung-blockierende Schicht zwischen der Registrierschicht und der Reagenz-Schicht befindet. Des weiteren weist die Reagenz-Schicht vorzugsweise eine praktisch gleichförmige Permeabilität gegenüber Bilirubin und dem diffusionsfähigen, bestimmbaren Liganden auf und 1st praktisch Impermeabel gegenüber Proteinen mit einem Molekulargewicht, das größer 1st als das Molekulargewicht des Billrubins, z. B. Albumin. Die Registrierschicht weist eine gleichförmige Permeabilität bezüglich des bestimmbaren Liganden auf. Die Strahlung blockierende Schicht 1st, obgleich sie normalerweise nicht als die Konzentration des bestimmbaren Liganden, der der Strahlung blockierenden Schicht von der Reagenz-Schicht zugeführt wird, auseinanderreißend betrachtet wird, vorzugsweise von gleichförmiger Permeabilität gegenüber dem bestimmbaren Liganden.

Vorzugsweise enthält die Strahlung blockierende so Schicht ein Trübungsmittel, beispielsweise ein Pigment, oder ein In geeigneter Welse vorliegendes Polymer, beispielsweise ein sogenanntes »blushed-polymer« oder sowohl ein Pigment wie auch ein Polymer. In vorteilhafter Welse bestehen die Strahlung blockierende Schicht und die Registrierschicht aus nicht-faserigen Schichten.

In vorteilhafter Welse kann ein erfindungsgemäßes Integrales analytisches Element des weiteren beispielsweise aufgebaut sein aus einem Träger mit einer hierauf angeordneten Registrierschicht, einer Reagenz-Schicht fao und gegebenenfalls einer Strahlung-blocklerenden Schicht, wobei diese Schichten, wie bereits angegeben, aufgebaut sein können, wobei jedoch diesmal zusätzlich eine nicht-faserige Ausbreitschicht vorhanden 1st, die vorzugsweise Isotrop porös ist und derart im Element angeordnet 1st, daß die Reagenz-Schicht zwischen der Registrierschicht und der Ausbreitschicht zu liegen kommt.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung

eines erfindungsgemäßen analytischen Elementes sind sämvliche Schichten nlcht-faserlge Schichten. Derartige Elemente eignen sich insbesondere für die Durchführung quantitativer analytischer Bestimmungsverfahren. Der Ausdruck »nicht-faserig«, der hler im Zusammenhang mit Schichten und/oder Stoffen verwendet wird, besagt, daß derartige Schichten bzw. Stoffe frei oder praktisch frei von faserigen Stoffen sind, d. h. sie enthalten keine faserigen Komponenten in solchen Mengen, die das Ausbreiten einer aufgebrachten Probe oder die Bestimmung des analytischen Ergebnisses auf radiometrischem Wege stören wurden.

Werden Reagenz-Schichten In Verbindung mit einer Ausbreitschicht verwendet, so sind sie vorzugsweise gleichförmig permeabel gegenüber Bilirubin, jedoch praktisch impermeabel und nicht porös für andere hochmolekulare Proteine, die durch die Ausbreitschicht ausgebreitet werden können. Der Begriff der »Permsabilität« schließt hler eine Permeabilität auf Grund einer Porosität, der Fähigkeit zur Quellung oder auf Grund anderer Charakterlstlka ein.

Reagenz-Schichten können eine Matrix aufweisen, In ?;der das Reagenz verteilt ist, d. h. in der das Reagenz gelöst oder dlspergiert ist. Ist jedoch der Blllrubin-aktive /Komplex selbst filmbildend oder läßt er sich leicht in Form einer gleichförmigen Schicht oder Zone auftragen, so ist eine solche zusätzliche Matrix nicht erforderlich. Bei Verwendung einer Matrix kann diese aus verschiedenen Verbindungen oder Stoffen bestehen, je nach den Komponenten des Bllirubin-aktiven Komplexes, der in der Matrix verteilt ist. Auf jeden Fall soll die Matrix nicht störend auf den Blllrubln-aktlven Komplex wirken, d. h. das Matrixmaterial soll selbst keine Bindungsfähigkeit für den bestimmbaren Liganden des Billrubin-aktiven Komplexes haben und den bestimmbaren Liganden auch nicht verdrängen können.

Vorteilhafte Matrix-Materialien für die Herstellung von Reagenz-Schichten sind nicht-faserige Materialien, wozu beispielsweise nicht störende hydrophile Stoffe gehören, einschließlich durch Säure hydrollsierter Gelatinen, beispielsweise Schweinshaut-Gelatinen und Derivate hiervon mit einem isoelektrischen Punkt von etwa 9,1. Zu erwähnen sind des weiteren beispielsweise hydrophile Cellulosederivate. Polysaccharide, z. b. Dextran, Gummiarablcum, Agarose und dergleichen sowie synthetische Substanzen, wie beispielsweise in Wasser lösliche Polyvlnylverbindungen, wie beispielsweise Poly(vlnylalkohol) und Poly(vinylpyrrolidon) sowie Acrylamldpolymere. Geeignet sind des weiteren nicht störende organophile Stoffe, wie beispielsweise Celluloseester und dergleichen. Um die Permeabilität der Reagenz-Schicht zu erhöhen, sofern diese nicht porös 1st, ist es oftmals vorteilhaft, ein Matrix-Material zu verwenden, das in dem Lösungsmittel- oder Dispersionsmedium der zu analysierenden Flüssigkeit quellbar ist. Des weiteren kann es erforderlich sein, ein solches Material auszuwählen, das das Aufbringen einer benachbarten Schicht während der Herstellung des Elementes nicht stört. Sollen beispielsweise diskrete, einander benachbarte Schichten erzeugt werden und sollen zur Analyse wäßrige Flüssigkelten verwendet werden, so kann es vorteilhaft sein zum Aufbau der Reagenz-Schicht eine praktisch wasserlösliche Matrix zu verwenden und praktisch oder Im wesentlichen organo-lösliche oder organo-dlspergierbare Bestandteile für eine benachbarte Schicht beispielsweise eine Ausbreitschicht, Auf diese Weise wird eine wechselseite Lösungsmitteleinwirkung auf ein Minimum vermindert und es läßt sich eine klar abgegrenzte Schichten-Struktur erzeugen. In vielen Fällen kann es des weiteren vorteilhaft sein, um eine Diffusion von vergleichsweise hochmolekularen Proteinen in die Reagenz-Schicht zu verhindern (diese Verbindungen können potentielle Störungskomponenten für die Bilirdblnbestlmmung sein), eine Reagenz-Schicht zu verwenden, die eine geringere Permeabilität als die Ausbreitschicht hat. Dies läßt sich leicht erreichen durch Verminderung der effektiven Porengröße der Reagenz-Schicht. Die relative PermeablH-tat oder Porosität läßt sich nach bekannten Verfahren ermitteln.

In der Reagenz-Schicht wird das Reagenz mit ein oder mehreren der beschriebenen Bilirubin-aktlven Komplexe durch Lösen oder Dispergieren des oder der Komplexe in einem Matrix-Material, sofern ein solches verwendet wird, verteilt. Obgleich es oftmals vorteilhaft 1st, den oder die Bllirubin-aktiven Komplexe gleichförmig zu verteilen, ist dies doch nicht unbedingt erforderlich. Ist das Reagenz in der zu analysierenden Flüssigkeit löslich, so kann es vorteilhaft sein, das Reagenz In der Reagenz-Schicht unlöslich zu machen, und zwar insbesondere dann, wenn die Reagenz-Schicht porös ist.

Erfindungsgemäß 1st der bestimmbare Ligand des Reagenz derart diffusionsfähig, daß er In die permeable Registrierschicht diffundieren kann. Ist der Ligand nicht von Natur aus diffusionsfähig, so kann er diffusionsfähig gemacht werden, gewöhnlich durch Einführung von chemischen Resten, die die gewünschte Löslichkeit herbeiführen. Gilt es, wäßrige Flüssigkeiten zu analysieren, so können löslich machende Gruppen wie Hydroxylgruppen, Carboxylgruppen und Sulfonsäuregruppen in den Liganden eingeführt werden.

Wie Im Falle des »nassen« Verfahrens oder der Bestimmung In Lösung, kann auch bei dem »trockenen« Verfahren unter Verwendung eines analytischen Elementes eine geeignete pH-Wert-Puffersubstanz verwendet werden. Eine solche Puffersubstanz kann beispielsweise In der Reagenz-Schicht untergebracht werden oder in einer oder mehreren der anderen Schichten eines analytisehen Elementes, und zwar in solchen Mengen, daß die Reagenz-Schicht bei Verwendung des Elementes einen pH-Wert erreicht, der praktisch identisch ist mit dem pH-Wert, der bei der »nassen« Methode angewandt wird. Typische Puffersubstanzen, die verwendet werden können, werden beispielsweise in den später folgenden Beispielen beschrieben. Geeignete Puffersubstanzen zur Herbeiführung des erforderlichen pH-Wertes sind beispielsweise des weiteren bekannt aus einer Arbeit von Good, veröffentlicht in der Zeitschrift »Biochemistry«, 5 (1966),

Zur Erleichterung der Ermittlung einer Verdrängung, die im Element erzeugt wird, z. B. zur Ermittlung einer Farbveränderung, einer Veränderung der optischen Dichte oder Fluoreszenz und dergleichen, können die erfindungsgemäßen Elemente gegebenenfalls eine für Strahlungen durchlässige Schicht aufweisen, welche den aus der Reagenz-Schicht freigesetzten bestimmbaren Liganden aufnimmt, wobei die relative Gegenwart oder Abwesenheit desselben die Bestimmung eines analytlsehen Ergebnisses ermöglicht. Eine solche Schicht, die hier als Registrierschicht bezeichnet wird, ist frei von anzeigenden Reagenzien, jedoch permeabel für die bestimmbaren Liganden, die freigesetzt werden und befindet sich in Flüssigkeitskontakt mit einer Reagenz-Schicht, mindestens unter den Verwendungsbedingungen des Elementes. Die Registrierschicht kann gegebenenfalls von einer oder mehreren Reagenz-Schichten durch eine Strahlung blockierende Schicht getrennt sein.

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ζ. B. eine reflektierende und/oder opake Schicht, um die Bestimmung des analytischen Ergebnisses auf radiometrischem Wege zu erleichtern. Die Verwendung einer Registrierschicht uad einer Strahlung blockierenden Schicht ist insbesondere in den Fällen vorteilhaft, in denen der bestimmbare Ligand eine farbige Verbindung 1st und auf colorimetrischem Wege bestimmt wird.

In solchen Fällen 1st es oftmals vorteilhaft ein analytisches Element wie beispielsweise in F1 g. 3 schematisch dargestellt zu verwenden, das eine Registrierschicht 8 und eine Strahlung blockierende Schicht 10 aufweist, so daß der farbige Ligand, der nicht freigesetzt im Billrubinaktiven Komplex der Reagenz-Schicht b verbleibt, die colorimetrische Bestimmung des freigesetzten farbigen Liganden nicht stört. Wird der bestimmbare Ligand fluorimetrisch durch Veränderung der Fluoreszenz zwischen dem gebundenen und freigesetzten oder ungebundenen Liganden bestimmt, so ist die Maskierung der Reagenz-Schicht, obgleich in bestimmten Fällen vorteilhaft, im allgemeinen nicht so wichtig wie im Falle eines colorimetrisch bestimmbaren Liganden. Die Registrier-.; schicht, die In vorteilhafter Weise in der zu analysierenden Flüssigkeit quellbar ist, kann ein oder mehrere hydrophile Kolloide aufweisen, beispielsweise solche, wie sie auch zur Herstellung einer Reagenz-Schicht verwendet werden können. Die Schicht ist ebenfalls vorzugsweise nicht-faserig. Ist eine Reagenz-Schicht faserig, so verbessern eine Strahlung-blockierende und eine Registrierschicht die Gleichförmigkeit eines analytischen Ergebnisses, das in einer solchen Reagenz-Schicht erzeugt wird.

Ist die bestimmbare Komponente, die im Element erzeugt wird, ein Farbstoff oder eine andere beizbare Verbindung, so kann die Registrierschicht ein Beizmittel aufweisen, beispielsweise ein solches, wie es üblicherweise zum Beizen von Bildfarbstoffen auf dem Gebiet der Herstellung farbphotographischer Filme und Papiere verwendet wird. Geeignete Beizmittel sind beispielsweise Polyvinylpyridmverbindungen, z. B. Poly-4-vinylpyridln und die 2-Vlnylpyrldinpolymeren des aus der US-PS 24 98 430 bekannten Typs sowie Cetyltrlmethylammonlumbromid.

Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, die Registrierschicht unter Verwendung eines basischen polymeren Beizmittels herzustellen, beispielsweise eines solchen des aus der GB-PS 12 61925 oder der US-PS 36 25 694, 37 09 690, 37 73 509, 38 59 096, 38 98 088, 39 58 995 bekennten Typs.

Besonders vorteilhafte polymere Beizmittel sind solche, die in ihrer Polymerkette monomere Einheiten der folgenden Formel enthalten:

M®
worin bedeuten:

Χ^θ

einen organischen Rest, z. B. einen Alkylenrest, der einen Teil der Polymerkette bildet;

eine chemische Bindung oder eine organische Gruppe, die Μ^Θ an A bindet;

eine quaternäre Ammonium- oder Phosphoniumgruppe und

ein Anion.

Die bevorzugten polymeren Beizmittel der Formel I eignen sich insbesondere zur Herstellung analytischer Elemente der Erfindung, bei denen als bestimmbare Liganden Farbstoffe verwendet werden.
Wie bereits dargelegt, können erfindungsgemäße analytische Elemente eine Strahlung-blockierende Schicht, vorzugsweise zwischen einer Reagenz-Schicht und der Registrierschicht, aufweisen. Strahlung-blockierende Schichten sind permeabel für den bestimmbaren

ίο Liganden, der freigesetzt wird und dienen dazu, den Durchtritt von elektromagnetischer Strahlung, der Strahlung, die für das Bestimmungsverfahren angewandt wird, zu inhibieren. Bei Verwendung einer solchen Schicht können farbige oder andere störende Komponenten von

is der Registrierschicht ferngehalten werden, so daß sie das analytische Ergebnis nicht verfälschen können. Derartige Schichten enthalten in der Regel ein Trübungsmittel, das auf Grund seiner Absorptionsfähigkeit, Reflexionsfähigkeit oder dergleichen einen Strahlungsinhibierenden Effekt ausübt, wenn es in die Schicht eingearbeitet wird. Die Strahlung-blockierende Schicht kann des weiteren eine Matrix aufweisen, die ein Trübungsmittel enthält, beispielsweise ein Pigment, wie beispielsweise Ruß oder ein anderes anorganisches Pigment, beispielsweise ein Metallsalz, wie beispielsweise Titandioxid, Zinkoxid oder Bariumsulfat. Sogenannte »blushed«-Polymere, die im allgemeinen von Natur aus reflektierend sind, können ebenfalls das Trübungsmittel bilden und Schichten aus derartigen »blushed« Polymeren, wie sie auch zur Herstellung der Ausbreitschichten verwendet werden können, können als Strahlung-blockierende Schichten verwendet werden. Wird eine mikroporöse Schicht aus einem »blushed« Polymeren als Strahlung-blockierende Schicht verwendet, so kann eine solche Schicht auch als Filterschicht wirken. Eine solche Schicht ist insbesondere in dem Falle vorteilhaft, in dem die Registrierschicht permeabel 1st für filtrierbare Substanzen, welche das Bestimmungsergebnis in der Registrierschicht verfälschen könnten, wenn sie aus der Reagens-Schicht in die Registrierschicht gelangen könnten.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung enthalten die aus »blushed« Polymeren aufgebauten Schichten des weiteren ein reflektierendes anorganisches Pigment, beispielsweise ein hoch-reflektierendes Pigment des bereits angegebenen Typs, um die Reflektlvltät und/oder Ausbreitung (wie im folgenden noch näher beschrieben werden wird) zu steigern. Die Menge an Pigment, die in der Schicht mit dem »blushed« Polymeren vorhanden sein kann, kann sehr verschieden sein. Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, etwa 5 bis etwa 1000 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Polymeren zu verwenden. Ganz besonders vorteilhafte Pigmentkonzentrationen liegen bei etwa 100 bis etwa 600 Gew.-% Pigment, bezogen auf das Gewicht des »blushed« PoIymeren.

Wie bereits dargelegt, kann ein erfindungsgemäßes Element gegebenenfalls eine Ausbreitschicht aufweisen. Bei dieser Aufbreitschicht handelt es sich um eine Schicht, die eine Flüssigkeitsprobe aufnehmen kann, sei es nun eine Flüssigkeitsprobe, die direkt auf die Schicht aufgebracht wird oder ihr von einer Schicht oder Schichten, die sich in Flüssigkeitskontakt mit ihr befinden, zugeführt werden, und In der das Lösungsmittel oder Dispersionmedium der Probe und Bilirubin derart verteilt werden, daß eine gleichförmige Konzentration an Bilirubin an der Oberfläche der Ausbreitschicht erzeugt wird, die der Reagenz-Schicht des Elementes gegenüberliegt. Eine solche Konzentration oder offensichtliche Konzen-

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tratlon läßt sich mit Konzentrationsgradienten erreichen, die über die Dicke der Ausbreitschicht oder in anderer Welse vorliegen. Derartige Gradienten verursachen keine Schwierigkelten bei der Gewinnung quantitativer Testergebnisse und lassen sich unter Anwendung üblicher Eichverfahren berücksichtigen.

Der Mechanismus des Ausbreitens ist noch nicht vollständig geklärt. Es wird jedoch angenommen, daß das Ausbreiten durch eine Kombination von Kräften hervorgerufen wird, wie beispielsweise einem hydrostatischen Druck einer Flüssigkeitsprobe, einer kapillaren Wirkung der Ausbreitschicht, einer Oberflächenspannung der Probe, einer Dochtwirkung der Schichten, die sich In Flüssigkeitskontakt mit der Ausbreitschicht befinden und dergleichen. Das Ausmaß der Ausbreitung hängt dabei teilweise vom Volumen der auszubreitenden Flüssigkeit ab. Zu bemerken Ist jedoch, daß die gleichförmige offensichtliche Konzentration, die beim Ausbreiten erreicht wird, praktisch unabhängig Ist von dem Volumen der Flüssigkeitsprobe und bei verschiedenen Graden der Ausbreitung auftritt. Infolgedessen erfordern erfindungsgemäße Elemente keine präzise oder genaue Applikation der zu analysierenden Proben. Jedoch kann ein spezielles Flüssigkeitsvolumen im Einzelfalle aus Gründen bevorzugter Ausbreitzeiten und dergleichen vorteilhaft sein. Da sich bei Verwendung erfindungsgemäßer analytischer Elemente quantitative Ergebnisse bereits bei Verwendung von vergleichsweise sehr geringen Probenvolumina erzielen lassen, die vollständig von einem Bereich der Ausbreitschicht geeigneter Größe aufgenommen werden (z. B. einem Quadratzentimeter), besteht keine Notwendigkeit überschüssige Flüssigkeit vom Element nach Aufbringung einer Flüssigkeitsprobe zu entfernen. Da das Ausbreiten in der Ausbreitschicht erfolgt und die ausgebreitete Substanz der Reagenz-Schicht zugeführt wird, die sich In Flüssigkeitskontakt mit der Ausbreitschicht befindet, ohne daß dabei ein ins Gewicht fallender lateraler hydrostatischer Druck auftritt, tritt im Falle der Verwendung erfindungsgemäßer Elemente kein »Ringing«-Problem auf. das so oft bei analytischen Elementen des Standes der Technik auftritt.

Die Ausbreitschicht braucht lediglich eine gleichförmige Konzentration an ausgebreiteter Substanz pro Flächeneinheit auf der Oberfläche der Schicht, die der Reagenz-Schicht gegenüberliegt und mit der sich die Ausbreitschicht in Flüssigkeitskontakt befindet, zu erzeugen. Dabei ist es dabei einfach zu bestimmen, ob eine spezielle Schicht für Ausbreitzwecke geeignet ist oder nicht Eine derartige Gleichförmigkeit der Konzentration oder offensichtlichen Konzentration läßt sich durch densitometrische oder andere analytische Methoden bestimmen, wie sie im Detail beispielsweise aus der US-PS 39 v2 i58 bekannt sind.

In vorteilhafter Weise bestehen die Ausbreitschichten aus isotropporösen Schichten. Unter einer isotropen Porosität ist eine Porosität in allen Richtungen Innerhalb der Ausbreitschicht zu verstehen. Derartige Schichten werden im übrigen im Detail in der US-PS 39 92158 beschrieben.

Vorteilhafte Ausbreitschichten lassen sich ausgehend von den verschiedensten Ausgangsstoffen herstellen, wie sie beispielsweise in der US-PS 39 92158 beschrieben werden. Geeignete Ausbreitschichten lassen sich des weiteren ausgehend von Lösungen oder Dispersionen herstellen. Wie bereits dargelegt, werden Ausbreitschichten und die anderen Schichten eines Elementes übereinander angeordnet, derart, daß sich die Ausbreitschicht in Flüssigkeitskontakt mit einer Reagenz-Schicht befindet. Zu .

den Stoffen, die zur Herstellung einer Ausbreitschicht geeignet sind, gehören überwiegend Stoffe, die resistent sind, d. h. praktisch unlöslich Im und praktisch nicht quellbar bei Kontakt mit Wasser oder anderen Flüsslgkelten, die untersucht werden sollen. Eine Quellung von etwa 10 bis 14%, bezogen auf die Trockendichte der Schicht wird dabei als normal angesehen. Die Dicke der Ausbreitschicht kann verschieden sein. Die im Einzelfalle optimale Dicke hängt teilweise von dem verwendeten Probenvolumen ab, das aus Gründen der Einfachheit und der Sauberkeit der Ausbreitschicht absorbiert werden sollte sowie von dem Porenvolumen der Schicht, das ebenfalls die Probenmenge beeinflußt, die von der Schicht absorbiert werden kann. Als vorteilhaft haben sich beispielsweise Ausbreitschichten einer Dicke, trokken gemessen, von etwa 50 bis etwa 300 Mikron erwiesen. Jedoch können auch Ausbreitschichten einer größeren oder geringeren Dicke vorteilhaft sein.
Gemäß einer Ausgestaltung der Erfindung wird ein teilchenförmiges Material zur Herstellung derartiger Schichten verwendet, in welchem Falle die isotrope Porosität durch Zwischenräume zwischen den Partikeln erzeugt wird. Zur Herstellung der Schichten können die verschiedensten teilchenförmigen Materialien verwendet werden, die in vorteilhafter Weise chemisch gegenüber der zu analysierenden Probe inert sind. Geeignet sind beispielsweise Pigmente wie Titandloxid, Barlumsulfat, Zinkoxid, Bleioxid und dergleichen. Andere geeignete Partikel sind beispielsweise Diatomeenerde und mlkrokristalline kolloidale Materlallen, die sich von natürli-. chen oder synthetischen Polymeren ableiten, z. B. mikrokristalline Cellulose. Alternativ oder zusätzlich zu solchen teilchenförmigen Stoffen kann eine Ausbreitschicht jedoch beispielsweise auch unter Verwendung von isotrop porösen Polymeren hergestellt werden wie sie beispielsweise aus der US-PS 39 92 158 bekannt sind. Derartige Polymermassen können unter Verwendung von Verfahren hergestellt werden, die zur Herstellung von sog. »blushed«-Polymeren geeignet sind und die beispielsweise aus der US-PS 35 55 129 bekannt sind. Andere geeignete Methoden zur Erzeugung von isotrop porösen Polymermassen sind solche, bei denen ein Gas oder andere quellbare Bestandteile dazu benutzt werden, um Poren zu erzeugen. Derartige Verfahren sind beispielsweise aus den US-PS 29 60 728 und 29 46 095 bekannt. Auch können Verfahren angewandt werden, bei denen innerhalb der Polymerphase ein lösbarer fester Stoff untergebracht wird, der unter Erzeugung von Poren gelöst wird. Derartige Verfahren sind beispielsweise aus

so der US-PS 31 86 575 bekannt.

Die Herstellung erfindungsgemäßer integraler analytischer Elemente kann in der V/eise erfolgen, daß zunächst Schichten in Form VoD Separaten Schichten Vorgebildet werden, die dann zusammenlamlniert werden oder die solange getrennt voneinander gehalten werden, bis bei Gebrauch des Elementes ein Flüssigkeitskontakt erforderlich ist. Vorgebildete, separate Schichten lassen sich, sofern durch Beschichtung herstellbar, in typischer Weise dadurch herstellen, daß man eine Lösung oder Dispersion auf eine Oberfläche aufbringt, von der die »'-erzeugte Schicht dann auf physikalischem Wege nach ihrer Trocknung abgestreift werden kann.

Ein vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Elemente, bei dem das mehrfache Abstreifen und Zusammerilaminieren von einzelnen Schichten vermieden wird, besteht darin, eine Oberflä-

; ehe, von der eine oder mehrere aufgetragene Schichten abgestreift werden können oder einen Schichtträger zu

beschichten, worauf nach Aufbringung der ersten Schicht sukzessiv weitere Schichten auf die zunächst aufgebrachte Schicht aufgetragen werden. Die Beschichtung kann dabei nach üblichen bekannten Methoden erfolgen, beispielsweise durch Handbeschichtung oder durch Verwendung eines Beschichtungsmessers oder eines Beschichtungstrichters, beispielsweise durch sog. Bettbeschichtung oder Tauchbeschlchtung. Im Falle der Anwendung maschineller Beschichtungsverfahren Ist es oftmals möglich mehrere Schichten gleichzeitig aufzutragen, wie beispielsweise Im Falle der Herstellung lichtempfindlicher photographischer Aufzelchnungsmateriailen. In den Fällen, in denen es zweckmäßig oder wünschenswert ist, daß einander benachbarte Schichten in Form von diskreten Schichten vorliegen und die Aufrechterhaltung einer Schichtentrennung durch Einstellung des spezifischen Gewichtes der Seschichtungsrnasse nicht zufriedenstellend ist, was beispielsweise Im Falle der Herstellung poröser Ausbreitschichten der Fall sein kann, so kann die geeignete Auswahl der Komponenten einer jeden Schicht, einschließlich des Lösungsmittels oder Dispersionsmediums die Wanderung von Komponenten zwischen den Schichten eliminieren oder auf ein Minimum vermindern und Lösungsmittel-Lösungsmitteleffekte ausschalten, wodurch die Ausbildung gut definierter, diskreter Schichten gefördert wird. Adhäsionsprobleme zwischen den Schichten lassen sich ohne nachteilige Effekte durch Oberflächenbehandlungen beseitigen, einschließlich einer extrem dünnen Anwendung von Haftschichtmaterialien, wie sie im Falle photographischer Aufzeichnungsmaterialien verwendet werden.

Im Falle von Reagenz-Schichten kann zunächst eine Beschlchtungslösung oder Beschlchtungsdispersion mit dem Matrix-Material und dem Reagenz hergestellt werden, worauf die Masse in der beschriebenen Weise unter Erzeugung einer dimensionsstabilen Schicht auf eine Oberfläche aufgetragen wird. Die Dicke der Reagenz-Schicht sowie ihr Permeabilitätsgrad können sehr verschieden sein und hängen von dem Verwendungszweck der Schicht ab. Als vorteilhaft haben sich Trockendicken von etwa 10 Mikron bis etwa 100 Mikron erwiesen, obgleich auch dünnere oder dickere Schichten verwendbar sind.

Fasrige oder faserartige Reagenz-Schichten lassen sich durch Imprägnierung einer fasrigen oder faserartigen Matrix nach üblichen bekannten Methoden herstellen.

Die Strahlung-blockierenden Schichten und Registrierschichten können nach Methoden und in Dicken hergestellt werden, wie sie im Falle der Herstellung von Reagenz-Schichten angewandt werden, jedoch mit Bestandteilen, die für die spezielle Schicht geeignet sind. Im Falle von Registrierschichten sind die Schichten abgesehen von ihrer Permeabilität und Strahlungsdurchlässigkeit in vorteilhafter Weise frei oder praktisch frei von solchen Charakteristika, welche die Bestimmung analytischer Ergebnisse, die In einem Integralen Element nach der Erfindung erzeugt werden, stören könnten. So können beispielsweise Veränderungen in der Farbe oder In der Textur innerhalb der Registrierschicht, wie sie beispielsweise im Falle der Verwendung von fasrigen Mate-. rialien, z. B. einigen Papieren zur Herstellung eines permeablen Mediums verwendet werden, nachteilig sein, und zwar auf Grund der nicht gleichförmigen Reflexion oder Durchlässigkeit der zur Durchführung des Bestimrnungsverfahrens verwendeten Energie. Dies gilt ebenfalls für Schichten, beispielsweise Strahlung-blockierende Schichten und Reagenz-Schichten, von denen mindestens die untere Oberfläche durch ein Bestimmungsmittel wahrnehmbar Ist, das eine für Strahlungen durchlässige Registrierschicht untersucht. Obgleich fasrige Materialien wie Filterpapiere und andere Papiere Im allgemeinen überall permeabel sind, können doch derartige Mates rlallen In typischer Welse sehr verschiedene Permeabilitätsgrade aufweisen und nicht gleichförmig permeabel sein, beispielsweise auf Grund struktureller Abweichungen, wie beispielsweise Faser-Dimensionen und Faser-Abstände. Infolgedessen sind derartige Stoffe nicht

ίο bevorzugt für den Aufbau von Registrierschichten und anderen Schichten erfindungsgemäßer Elemente für die Durchführung quantitativer Analysen verwendeten Stoffe.

Bei den erfindungsgemäßen analytischen Elementen

kann es sich um sog. selbsttragende Elemente handeln oder solche, die einen tragenden Schichtträger aufweisen. Im Falle der Verwendung eines Trägers kann der Träger aus üblichen bekannten Schichtträgermateriailen bestehen, beispielsweise den verschiedensten polymeren Stoffen, wie z. B. Celluloseacetat, Poly(äthylenterephthalat), Polycarbonaten und Polyvinylverblndungen, wie beispielsweise Polystyrolen.

Der im Einzelfalle optimale Schichtträger hängt von der Art der Verwendung des Elementes ab. Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von strahlungsdurchlässigen Schichtträgern erwiesen, die elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge oder von Wellenlängen Innerhalb eines Bereiches zwischen etwa 200 nm und etwa 900 nm und/oder radioaktive Strahlung durchlassen. Bei der fluorlmetrlschen Bestimmung analytischer Ergebnisse durch den Schichtträger ist es zweckmäßig, daß der Schichtträger für eine etwas breitere Wellenlängebande durchlässig ist als im Falle von nicht-fluoreszierenden Messungen oder alternativ durchlässig ist für die Absorptions- und Emissionsspektra fluoreszierender Stoffe, die für die Bestimmung verwendet werden. Es kann des weiteren zweckmäßig sein, wenn der Schichtträger für eine oder mehrere enge Wellenlängenbanden durchlässig ist und undurchlässig für benachbarte Wellenlängenbanden. Dies läßt sich beispielsweise erreichen durch Imprägnieren oder Beschichten des Schichtträgers mit einer oder mehreren Farbstoffen oder Pigmenten mit entsprechenden Absorptionscharakterlstika. Weist ein analytisches Element einen Schichtträger auf, dann befinden sich die Reagenz-Schicht, die Strahlung-blokkierende Schicht (sofern vorhanden) und die Registrierschicht normalerweise im Element zwischen Schichtträger und Ausbreitschicht (sofern vorhanden), die oftmals die äußerste Schicht des Elementes darstellt. Die Bestandteile einer speziellen Schicht eines erfindungsgemäßen Elementes und die Schichtenstruktur hängen von dem Verwendungszweck des analytischen Elementes ab. So kann beispielsweise die Porengröße der Ausbreitschicht derart ausgewählt werden, daß die Schicht unerwünschte Probenkomponenten abfiltriert,

z. B. Proteine mit einem höheren Molekulargewicht als Bilirubin und die beispielsweise die analytische Verschiebungsreaktion beeinträchtigen oder behindern könnten oder die Bestimmung eines Testergebnisses innerhalb des Elementes beeinträchtigen würden. Im Falle der Analyse von Blut haben sich beispielsweise poröse Schichten mit einer Porengröße von 1 bis etwa 5 Mikron als besonders vorteilhaft zur Abscheidung von Blutkörperchen erwiesen, die in typischer Weise eine Größe von etwa 7 bis etwa 30 Mikron haben. Gegebenenfalls kann ein erfindungsgemäßes analytisches Element zwei oder noch mehr Ausbreitschichten aufweisen, wobei eine jede Schicht bezüglich ihrer Ausbreit- und Filtereigenschaft verschieden ist.

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Gegebenenfalls kann es vorteilhaft sein, eine oder mehrere der Schichten eines erfindungsgemäßen analytischen Elementes unter Verwendung von einem oder mehreren oberflächenaktiven Verbindungen, beispielsweise anionischen oder nicht Ionischen oberflächenaktlven Verbindungen herzustellen. Derartige oberflächenaktive Verbindungen können beispielsweise den Beschlchtungsprozeß erleichtern und den Grad und die Geschwindigkeit der Ausbreitung in Ausbreitschichten, die nicht besonders leicht durch Flüssigkeitsproben In Abwesenheit eines Hilfsmittels, beispielsweise einer oberflächenaktiven Verbindung benetzbar sind, steigern. Insbesondere kann es vorteilhaft sein, eine vergleichsweise große Menge einer oberflächenaktiven Verbindung, beispielsweise einer nicht ionogenen oberflächenaktiven Verbindung In der Ausbreitschicht eines erfindungsgemäßen Elementes unterzubringen, um den Transport von Bilirubin, das in einer wäßrigen, protein-haltlgen Flüssigkeitsprobe enthalten ist, In und durch diese Schicht des Elementes zu normalisieren. Unter einer solchen Normallsierung ist gemeint, daß Innerhalb der Ausbreitschicht eine äquivalente Penetration des Lösungsmittelmediums und des Billrubins, wie in den verschiedenen aufgebrachten Proben von wäßrigen Protein enthaltenen Flüssigkeiten enthalten sind, erreicht wird, ungeachtet von verschiedenen Proteinkonzentrationen verschiedener Proben. Des weiteren hat sich gezeigt, daß bei der Bestimmung des Gesamt-Bllirubingehaltes einer Probe, In der das Bilirubin oftmals In gebundener Form vorliegt, z. B. an andere Proteine gebunden, z. B. Serumalbumin, die Verwendung von nicht ionogenen oberflächenaktiven Verbindungen in der Ausbreitschicht zum Zwecke der Normalisierung des Billrubin-Transportes oftmals offensichtlich zu einer Abdissoziation des an Protein gebundenen Billrubins führt.

Erfindungsgemäße analytische Elemente eignen sich nicht nur für die Durchführung von Analysen auf dem Gebiet der klinischen Chemie, sondern vielmehr auch zur Verwendung Im Rahmen der chemischen Forschung und lassen sich des weiteren in vorteilhafter Weise in Laboratorien verwenden, deren Aufgabe es ist, chemische Verfahren zu überwachen und zu steuern. Sie eignen sich in besonders vorteilhafter Weise für die klinische Untersuchung von Körperflüssigkelten, beispielsweise Blut, Blutserum und Urin, da hierbei in der Regel eine große Anzahl von zu wiederholenden Tests erforderlich ist und Testergebnisse oftmals kurz nach Probenahme vorliegen müssen. Im Falle der Analyse von Blut unter Verwendung eines analytischen Elementes nach der Erfindung können die Blutkörperchen zunächst vom Serum abgetrennt werden, beispielsweise durch Zentrifugieren, worauf das Blutserum auf das analytische Element aufgebracht wird. Eine solche Trennung ist jedoch nicht erforderlich, beispielsweise dann nicht, wenn spektrophotometrische Reflexions-Analysenverfahren angewandt werden, um den vorgebildeten, bestimmbaren Liganden quantitativ zu erfassen oder in anderer Welse zu analysieren. So lassen sich Blutproben direkt auf ein erfindungsgemäßes Element aufbringen und die Blutkörperchen lassen sich von der Registrierschicht durch Ver-„Wendung einer Filterschicht fernhalten, die auch aus einer Strahlung-blocklerenden Schicht bestehen kann. Das Vorhandensein der Blutkörperchen Im Element stört die spektrophotometrische Analyse nicht, wenn nach der Reflexionsmethode gearbeitet wird, bei der Licht durch den Schichtträger und die Registrierschicht gelangt und von der Strahlung-blockierenden Schicht oder einer anderen Schicht reflektiert wird, so daß die zur Untersuchung verwendete Strahlung nicht auf die Blutkörperchen auftrifft. Von besonderem Vorteil ist die Verwendbarkeit eines erfindungsgemäßen analytischen Elementes zur Analyse von sowohl Serum als auch Blut.

Die erfindungsgemäßen analytischen Elemente können verschiedene Formen aufweisen. So können sie beispielsweise aus praktisch endlosen Bändern jeder gewünschten Breite, Blättern oder kleineren Chips bestehen.

In typischer Weise weist ein erfindungsgemäßes analytisches Element einen solchen Aufbau auf, daß eine aufgebrachte Flüssigkeltsprobe zunächst in Kontakt mit einer Ausbreitschicht gelangt, sofern eine solche vorhanden ist, bevor die Probe auf die Reagenz-Schicht auftrifft, wobei die Probe zunächst mit einer solchen Ausbreitschicht In Kontakt gelangt, deren Oberfläche am weitesten entfernt von der Reagenz-Schicht Ist. Da eine analytische Genauigkeit der erfindungsgemäßen analytischen Elemente nicht oder praktisch nicht durch Veränderungen im Volumen der aufgebrachten Flüssigkeitsproben beeinträchtigt wird, und zwar insbesondere dann nicht, wenn eine Ausbreltschichl vorhanden ist, kann das Aufbringen der Proben durch Hand oder auf maschinellem Wege erfolgen. In der Regel hat es sich jedoch als zweckmäßig erwiesen, bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens Proben eines in etwa gleichen Probenvolumens zu verwenden.

Bei einem typischen analytischen Untersuchungsverfahren, das manuell oder automatisch durchgeführt werden kann, wird das zur Analyse verwendete analytische Element von einer Vorratsrolle abgezogen, einem Chip-Paket oder einem anderen Vorratsbehälter entnommen und in eine solche Lage gebracht, daß ein freier Tropfen, Kontakt-Spot oder eine Flüssigkeitsprobe In anderer Form, beispielsweise aus einem geeigneten Verteiler, aufgebracht werden kann. Nach Aufbringung der Probe und In wünschenswerter Weise nachdem die Probe von einer Ausbreitschicht aufgenommen worden ist, sofern eine solche vorhanden ist, wird das analytische Element in vorteilhafter Weise konditioniert, ζ. Β. durch Erhitzen, durch Einstellung eines bestimmten Feuchtigkeitsgehaltes oder dergleichen, um die Gewinnung eines Testergebnisses zu beschleunigen oder In anderer Weise zu erleichtern. Wird ein automatisches Verfahren angewandt, so kann es ebenfalls vorteilhaft sein, wenn eine Ausbreitschicht ihre Funktion innerhalb von einigen Sekunden erfüllt, wobei bei Durchführung des Verfahrens eine solche Zeitspanne einkalkuliert werden soll, daß eine Verkeilung ermöglicht wird.

Nachdem das analytische Ergebnis in Form einer bestimmbaren Veränderung vorliegt, erfolgt die Messung desselben, zweckmäßig unter Verwendung einer geeigneten Vorrichtung für die Durchführang einer Reflexions-, Transmissions- oder Fluoreszenz-Spektrophotometrie. ,Mittels einer solchen Vorrichtung wird ein Energiestrahl, beispielsweise ein Lichtstrahl, durch den Schichtträger und die Registrierschicht geführt. Der Energiestrahl, ζ. B. der Lichtstrahl wird dann reflektiert, z. B. von einer Strahlung blockierenden Schicht 1m Element, und zwar auf ein Anzeigegerät oder gelangt durch das Element auf ein Anzeigegerät, sofern eine Transmlssions-Bestimtnungsmethode angewandt wird.

Tn vorteilhafter Welse wird das analytische Ergebnis In einem Bereich des Elementes bestimmt oder angezeigt, der Innerhalb des Bereiches liegt, indem das Ergebnis bewirkt wird. Die Anwendung von reflexlons-spektrophotometrischen Verfahren kann in manchen Fällen besonders vorteilhaft sein, da bei Anwendung dieses Ver-

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fahrens Interferenzen von Rückständen, beispielsweise Blutkörperchen, die auf oder In den Schichten des Elementes verblieben sein können, ausgeschaltet werden. Auch läßt sich In vorteilhafter Weise die Fluoreszenz-Spektrophotometrle einsetzen, wenn der bestimmbare Llgand aus einer Verbindung besteht, die In ihrer freien Form eine erhöhte oder verminderte Fluoreszenz gegenüber ihrer gebundenen Form, d, h. bei Bindung an den Träger des Blllrubin-aktlven Komplexes zeigt. In diesem Fall erfolgt die Bestimmung oder Ermittlung des analytischen Ergebnisses durch Verwendung einer Energie, die die Fluoreszenz der fluoreszierenden Verbindungen anregt und durch Verwendung eines Anzeigegerätes, das auf die fluoreszierende Emission anspricht. Wird Blutserum getestet oder werden Mittel zur Eliminierung unerwünschter Blutrückstände vorgesehen, so lassen sich Transmissionsverfahren anwenden, um die freigesetzten Liganden zu bestimmen und quantitativ zu erfassen, indem man einen Strom von Strahlungsenergie, beispielsweise einen Strahl von U.V.-Licht, sichtbarem Licht oder Infrarot-Strahlung auf eine Oberfläche des Elementes richtet und die Energiemenge mißt, die auf der gegenüberliegenden Oberfläche des analytischen Elementes austritt. Ganz allgemein hat sich die Verwendung von elektromagnetischer Strahlung eines Bereiches von etwa 200 bis etwa 900 nm als vorteilhaft für die Durchführung derartiger Messungen erwiesen, obgleich an sich eine jede Strahlung, für die das Element durchlässig ist und die zur quantitativen Erfassung der bestimmbaren Veränderung, die in der Reagenz-Schicht hervorgerufen wurde, verwendet werden kann.

Im übrigen können die verschiedensten üblichen Eichmethoden angewandt werden, um Basis-werte für die analytischen Verfahren zu schaffen. Beispielsweise kann eine Probe einer Standardlösung benachbart zu der Fläche, auf die ein Tropfen der zu analysierenden Probe aufgebracht wird, aufgebracht werden, um einen Vergleichswert zu erhalten.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen. In diesen Beispielen wurden die im folgenden näher beschriebenen Materialien und Abkürzungen verwendet:

Rinder-Serumalbumln: BSA
menschliches Serumalbumin: HSA 8-Aniltnonaphthalin-l -sulfonat: ANS

fluoreszierende Verbindung, hergestellt in Form des Magnesiumsalzes, einer Verbindung der folgenden Strukturformel:

Mg

H₃C

N(CHj)₂

M^a

ein handelsübliches Spektrofluorometer.

In den folgenden Beispielen werden die Mengen an bestimmbaren Liganden, gewöhnlich eines fluoreszierenden Farbstoffes oder einer fluoreszierenden Verbindung und dem Träger, normalerweise einem Protein, wie HSA oder BSA, die den Billrubin-aktiven Komplex liefern, in Form des Farbstoff/Protein-Verhältnisses (D/P) angegeben. Bei diesen Verhältnissen handelt es sich um molare Verhältnisse. In den Fällen, In denen der in den folgenden Beispielen bestimmbare Ligand aus einer fluoreszlerenden Verbindung besteht, wurde eine willkürliche Fluoreszenz (F), sowohl unmittelbar bevor als auch nach Zusatz von Bilirubin (B) zum Komplex gemessen. Die Differenz der F-Werte (d. h. AF) wurde dann ausgedrückt ds Prozentsatz durch willkürliche Zuordnung des F-Wertes für den Komplex von 100 vor Zugabe der BiIirubinenthaltenden Probe zum Komplex (d. h. bei einer O-Konzentration von B). In einem Diagramm wurde dann eine Reihe von AF-Werten eines bestimmten Komplexes mit einem konstanten D/P-Verhältnis in Abhängigkeit von einer Reihe von flüssigen Testproben mit verschiedenen B-Konzentrationen aufgetragen. Auf diese Weise wurde eine Eichkurve für den Komplex erhalten. Im Falle einer Flüssigkeitsprobe mit einer unbestimmten Konzentration an B wurde dann unter Verwendung des geeichten Komplexes der entsprechenden AF-Wert ermittelt, worauf der entsprechende AF-Wert mittels der zunächst hergestellten Eichkurve für den Komplex ausgewertet wurde.

Beispiel 1

Bilirubin: B
_;Thioflavln S: TF

!fluoreszierender Farbstoff, der sich von sulfoniertem, rnethyllertem Benzothläzol ableitet, in der Literatur oftmals :als Vasoflavin bezeichnet wird und folgender Strukturformel entspricht;

Bestimmung von Bilirubin in der Lösung unter Verwendung eines ANS-Albumlnkomplexes.

Im Falle dieses Beispiels erfolgt die Bestimmung von Bilirubin in der Lösung unter Verwendung eines ANS-Albuminkomplexes als Bilirubin-aktiver Komplex.

Im Falle dieses Beispiels wie auch im Falle der nachfolgenden Beispiele lieferten sowohl BSA wie auch HSA praktisch die gleichen Ergebnisse, obgleich ganz allgemein festgestellt wurde, daß im Falle der Verwendung von HSA ein etwas stärker fluoreszierender Komplex mit ANS als im Falle von BSA erzeugt wurde. Im Falle dieses Beispieles wurde eine Fluoreszenz des ANS-Albuminkümplexes durch Anregung des Komplexes bei einem Anregungsmaximum von 386 Nanometem erreicht. Die Fluoreszenz-Emission des Komplexes wurde sowohl bei dem Anregungsmaximum von 386 Nanometer wie auch bei der primären Fluoreszenz-Emissions-Wellenlänge von 475 Nanometem des Komplexes ermittelt. Die fluoreszierende Verbindung ANS ist bekanntlich stark fluoreszierend, wenn sie an Albumin gebunden 1st, jedoch nicht fluoreszierend in freier Form in Lösung. Wie dieses Beispiel zeigt ist die ANS-Bindung an Albumin tatsächlich empfindlich gegenüber Billrubln-Konzentrationen in Lösung. Dies bedeutet, daß ANS von dem Bilirubin-aktlven ANS-Albumlnkomplex in einer Menge verdrängt wurde, die in Beziehung zur Bilirubin-Konzentration der Lösung stand. Durch Ermittlung der Veränderung der AF-Werte In der beschriebenen

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Methode unter Verwendung eines Spektrofluorometers wird somit eine extrem effektive Bestimmung von Billrubin in der Lösung ermöglicht.

Teil 1

In diesem Teil des Beispieles 1 wurde der Einfluß von verschiedenen Blllrubin-Konzentrationen auf einen ANS-AJbuminkomplex wie folgt ermittelt:

Eine Reihe von Lösungen mit verschiedenen Mengen an ANS wurde mit einer Reihe von Lösungen titriert, die jeweils fünf Mlkromole HSA pro Liter enthielten, wobei die relative Fluoreszenz F unter Verwendung des Spektrofluorometers gemessen wurde. Eine offensichtlich maximale relative Fluoreszenz wurde bei ungefähr 15 Mikromolen ANS pro Liter bei 5 Mikromolen HSA pro Liter erzielt, woraus sich ergibt, daß ungefähr 3 Mole ANS pro Mol HSA gebunden werden.

Daraufhin wurde jeweils eine Probe der beschriebenen Bilirubin-aktlven Komplexe mit verschiedenen ANS/KSA-Verhältnissen auf ihre Verwendbarkeit für die Bilirubin-Bestimmung getestet. Es zeigte sich in jedem Falle, daß, wenn beispielsweise 0,066 mg pro Deziliter Bilirubin zu den beschriebenen Lösungen mit den beschriebenen ANS/HSA-Bilirubln-sktiven Komplexen zugegeben wurden, eine drastische Verminderung der Fluoreszenz auftrat, woraus sich die Verdrängung von ANS durch Bilirubin und das Freisetzen von ANS in Lösung ergibt.

Um zu veranschaulichen, daß steigende Mengen an Bilirubin, die den ANS/HSA-BIlirubin-aktiven Komplex zugegeben wurden, zu einer entsprechenden größeren Abnahme an Fluoreszenz führten, die festgestellt werden konnten und infolgedessen zur quantitativen Bestimmung von Bilirubln-Konzentrationen in verschiedenen biologischen Flüssigkeitsproben genutzt werden konnten, wurde eine Lösung hergestellt, die als Bllirubin-aktiven Komplex eine Mischung von 25 Mikromolen ANS pro Liter und 15 Mikromolen HSA pro Liter enthielt. Diese Lösung aus 25 Mikromolen ANS und 15 Mikromolen HSA pro Liter wurde dann in eine Reihe von Testlösungen aufgeteilt. Die Fluoreszenz dieser einzelnen Testlösungen wurde beobachtet, wenn Bilirubin enthaltende Testproben den Lösungen zugesetzt wurden. Die verwendeten Bilirubin enthaltenden Testproben enthielten verschiedene Konzentrationen an Bilirubin, beginnend mit einer Mlnimum-Billrubin-Konzentratlon von etwa 0,03 mg pro Deziliter bis zu einer maximalen Bilirubin-Konzentration von 0,33 mg pro Deziliter. Es zeigte sich, daß ein stärkerer Abfall der Fluoreszenz gemessen wurde, in Abhängigkeit von der erhöhten Blllrubin-Kor,-zentration in der Flüssigkeit. Es zeigte sich, daß Billrubin ANS von dem Albumin verdrängte und daß der Grad der Verdrängung, der durch die Fluoreszenzveränderung ermittelt werden konnte, praktisch in linearer Beziehung zu der Billrubinmenge stand, die dem ANS/HSA-Komplex zugesetzt wurde.

Teil 2

Die Bestimmung von Bilirubin in Lösung unter Verwendung von ANS/HSA-Komplexen, die in Teil 1 beschrieben wurde, wurde modifiziert, in dem das D/P-Verhältnls von ANS zu HSA oder BSA in der Lösungsmischung von ANS und HSA verändert wurde, um das optimale Verhältnis für die Bilirubin-Bestimmung zu ermitteln. Des weiteren wurden die absoluten Mengen an sowohl ANS als auch HSA oder BSA, die den Lösungen zugesetzt wurden, die für die Bilirubin-Bestimmung verwendet wurden, verändert, um diesen Parameter soweit wie möglich optimal zu gestalten. Als Ergebnis dieser weiteren Versuche wurde festgestellt, daß die Lösungs-Bestimmungsmethode nach der Erfindung bei Verwendung von ANS oder HSA oder BSA zur Erzeugung des Bllirubin-aktiven Komplexes bei Verwendung eines weiten Bereiches von verschiedenen ANS/HSA- oder BSA-Verhältnissen durchgeführt werden kann sowie unter Verwendung sehr verschiedener absoluter Mengen an ANS und HSA oder BSA. So wurde beispielsweise gefunden, daß das ANS/HSA- oder BSA-Verhältnis von 1:1 bis zu 100:1 verändert werden kann und daß sich bei derartigen Verhältnissen vorteilhafte Bllirubin-Bestimmungen durchführen lassen. Bei Verwendung eines ANS/BSA-Verhältnlsses von 1 :1 und einer absoluten Konzentration von sowohl ANS wie auch BSA von 5 Mikromolen pro Liter ergab sich beispielsweise, daß eine Lösung eines solchen Bilirubin-aktlven Komplexes zur Bestimmung eines Bilirubln-Konzentrationsbereiches von 0 mg Bilirubin pro Deziliter bis 0,4 mg Bilirubin pro Deziliter eingesetzt werden konnte. Des weiteren hat sich gezeigt, daß bei wesentlicher Erhöhung der absoluten Konzentration an ANS und BSA bei der Bereitung der Lösung des Bilirub'.n-aktiven Komplexes der dynamische Bereich, innerhalb dessen, eine Lösung eines derartigen Komplexes zur Bilirubin-Bestimmung eingesetzt werden konnte, stark ei ,öht werden konnte. So zeigte sich beispielsweise, daß eine Lösung eines Bilirubin-aktiven Komplexes aus 1500 Mikromolen ANS und 500 Mikromolen BSA pro Liter dazu verwendet werden konnte, um in Flüssigkeitsproben Billrubinkonzentrationen von 0 bis etwa 50 mg Billrubin pro Deziliter Testprobe quantitativ zu bestimmen.

Zu bemerken ist, daß In Teil 1 und Teil 2 dieses Beispiels sämtliche Lösungen in 0,05 molaren Natrlumphosphat-Pufferlösungen mit einem pH-Wert von 7,4 ± 0,05 hergestellt wurden. Zu bemerken ist des weiteren, daß sowohl im Falle des Teiles 1 wie auch im Falle des Teiles 2 dieses Beispieles gefunden wurde, daß die Bestimmungen gleich gut bei Temperaturen von etwa 37° C wie auch 20° C ± 2° C durchgeführt werden konnten.

Im Falle des Teiles 1 wie auch im Falle des Teiles 2 dieses Beispieles wie auch in den folgenden Beispielen wurden sämtliche Testproben mit Bilirubin, sofern nichts anderes angegeben wurde, dadurch hergestellt, daß die angegebenen Mengen an kristallinem Bilirubin zu 0,05 molaren Natriumphosphat-Pufferlösi'ngen nach der Methode J. Jacobsen und W. Wennberg, veröffentlicht in der Zeitschrift »Clinical Chemistry«, Band 20, Seite 783

(1974) zugesetzt wurden.

Beispiel 2

Bestimmung von Bilirubin In Lösung unter Verwendung von Vasoflavln-Albuminkomplexen.

Dies Beispiel beschreibt die Bestimmung von Bilirubin in Lösung nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode, mit der Ausnahme jedoch, daß der Bllirubin-aktlve Komplex durch einen Vasoflavln-Albumlnkomplex ersetzt wurde.

Die Vasoflavln-Albumlnkomplexe enthaltenden Lösungen wurden wie von Bethell in der Zeitschrift »Analytical Chemistry«, Band 32, Teil 4, Seite 560, 1960, beschrieben, hergestellt. Demzufolge wurden die Vasoflavin-Albumlnlösungen in einem Amlnpuffer eines pH-Wertes von etwa 9 wie von Betheil beschrieben, hergestellt. Außerdem wurde In diesem Beispiel die Fluoreszenz bei einer Anregungs-Wellenlänge von 390 Nanometern und einer Emissions-Maximum-Wellenlänge von

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430 Nanometern bestimmt. Bei der in diesem Beispiel verwendeten Amin-Pufferlösung handelt es sich um eine Älhyle-ndlamin-Citrat-Pufferlösung. Die Bestimmungen in diesem Beispiel wurden bei einer Temperatur von etwa 20 bis 22° C durchgeführt. Unter den angegebenen Testbedingungen zeigte sich, dall ein Vasoflavin-Albuminkomplex mit einem Vasoflavln-Albuminverhältnis von etwa 3 zu etwa 1 ein wirksamer Billrubin-aktiver Komplex für die Bilirubin-Bestimmung war. Es zeigte sich wiederum, wie bereits in Beispiel 1 beschrieben, daß sich der Bestimmungsbereich des Bilirubins wesentlich vergrößern ließ, wenn größere absolute Mengen an Vasoflavln und Albumin zur Herstellung der den Billrubln-aktiven Komplex enthaltenden Lösungen verwendet wurden. So zeigte sich diesbezüglich, daß sich Billrubin in Konzentrationen von 0 bis etwa 20 mg Bilirubin pro Deziliter Flüssigkeit unter Verwendung von Lösungen mit einem Bilirubin-aktiven Komplex mit etwa 0,4 Mikromolen Vasoflavin pro Liter und 500 Mikromolen HSA pro Liter bestimmen ließ.

Beispiel 3

Colorimetrische Bilirubin-Bestimmung in Lösung Unter Verwendung eines Bromphenolblau-Albuminkomplexes.

Dies Beispiel beschreibt eine weitere Möglichkeit der Bestimmung von Bilirubin In Lösung nach der Erfindung. Das Verfahren dieses Beispiels ähnelt den in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Verfahren, mit der Ausnahme jedoch, daß im Falle dieses Beispieles anstatt einer fluorimetrlschen Bestimmungsmethode eine colorimetrische Bestimmungsmethode angewandt wurde, wobei ein Bromphenolblau-Indlkatorfarbstoff als bestimmbarer Llgand Im Blllrubln-aktlven Komplex verwendet wurde.

Es wurde gefunden, daß Bromphenolblau an verschiedene Träger gebunden werden kann, die sich zur Bildung von Bllirubin-aktlven Komplexen verwenden lassen und daß sich Bromphenolblau leicht von solchen Trägern, wie beispielsweise Albumin, durch Bilirubin verdrängen läßt.

Es wurde gefunden, daß Bromphenolblau eine Bindungskonstante erster Ordnung K_A(M') von 2 χ ΙΟ⁶ aufweist, d. h. eine geeignete Bindungskonstante im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens, d. h. eine Bindungskonstante gegenüber dem Träger, die größer als 10⁵ Ist und geringer als die des Bilirubins, da Bilirubin beispielsweise eine Bindungskonstante gegenüber Albumin von 10⁸ aufweist. Bromphenolblau weist des weiteren einen relativ hohen Extinktionskoeffizienten von ungefähr 78 000 bei einer Wellenlänge bei oder nahe 590 Nanometern auf.

Im Falle dieses Beispieles wurde eine Reihe von Lösungen von HSA und Bromphenolblau In einer 0,05 molaren wäßrigen Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,4, gemessen bei 25° C, hergestellt.

Unter Anwendung einer Ultrafiltrationsmethode wie von U. Kragh-Hansen und Mitarbeitern In der Zeltschrift Blochem. et Biophys. Acta, Band 365, Seite 36 (1974), beschrieben und unter Verwendung eines Amlcon Ultraflo Membrane Cone CF-25 (mit einer Molekulargewichtsgrenze von 25 000 Daltons) wurde ermittelt, daß geeignete Billrubln-äktlve Komplexe aus Bromphenolblau und HSA In den bsschrlebenen wäßrigen Natriumphosphat-Pufferlösungen ausgehend von absoluten HSA-Konzentratlonen von etwa 0,20 bis etwa 100 Mikromolen pro Liter und Konzentrationen ah Bromphenolblau von 0 bis 12 Mikromolen pro Liter hergestellt werden konnten.

Das molare Bindungsverhältnis von Farbstoff zu HSA der den Biilrubln-aktiven Komplex enthaltenden Lösungen lag bei etwa 0,5 bis etwa 3,4, was dem ungefähren maximalen molaren Bindungsverhältnis von Bromphenolblau zu HSA entsprach.

Die beschriebene Reihe von Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen an Bromphenolblau/HSA-Bilirubin-aktlven Komplexen wurde dann dadurch getestet, daß einer jeden dieser Lösungen eine Standard-Testlösung mit etwa 0,0244 mg Bilirubin pro Deziliter zugesetzt wurde, worauf die erhaltenen Lösungen einer Ultrafiltration, wie oben angegeben, unterworfen wurden, um das durch das Bilirubin freigesetzte Bromphenolblau zu entfernen.

Als Ergebnis wurde ein klar abgegrenzter Abfall von etwa 3396 der Bromphenolblaubindung an HSA durch spektrometrische Überwachung des 590 Nanometer-Absorptionsmaxlmums für Bromphenolblau festgestellt, das aus den Lösungen als Folge der Verdrängung vom Albuminträger durch Bilirubin freigesetzt wurde. Daraufhin wurde eine Standard-Testlösung mit einer hohen Bilirublnkonzentratlon von ungefähr 10 mg Bilirubin pro Deziliter zu den oben beschriebenen Lösungen mit dem Bromphenolblau/HSA-Blllrubin-aktlven Komplexen zugesetzt, worauf wiederum eine Ultrafiltration durchgeführt wurde. Es zeigte sich, daß in diesem Falle eine beträchtlich höhere Menge an Bromphenolblau in jeder der beschriebenen Testlösungen vom Albuminträger durch diese große Menge an Bilirubin verdrängt wurde.

Die Ergebnisse dieses Beispieles zeigen, daß sich Bilirubin auf colorlmetrischem Wege unter Verwendung von Farbstoffen wie Bromphenolblau mit einem Extinktionskoeffizienten von größer als etwa 75 000 und der gewünschten BindungsaffinltSt gegenüber einem übliehen Träger für sowohl den Farbstoff als Bilirubin bestimmen läßt.

Beispiel 4

Analytisches Element für die Bilirubin-Bestimmung.

In diesen und den folgenden Beispielen werden verschiedene Konfigurationen von Integralen, mehrschichtigen analytischen Elementen nach der Erfindung beschrieben, die sich wirksam für eine »trockene« Bestimmung für Bilirubin eignen.

Im Falle dieses Beispiels wurde ein mehrschichtiges Element mit einem Celluloseacetatschlchtträger hergestellt, auf den aufgetragen wurden: eine Polyvlnylalkohol(PVA)-Registrierschlcht in einer Schichtstärke von etwa 1,7 g/m² PVA für die Aufnahme von Irelgesetzten, bestimmbaren Liganden von anderen Schichten; eine polymere Haftschicht oder Zwischenschicht, die auf die Polyvinylalkohol-Registrlerschlcht aufgetragen wurde und eine Ausbreit-Reagenz-Schicht aus einem sog. blushed-Polymeren mit einem Blllrubln-aktiven Komplex. Der Blltrubin-aktive Komplex bestand aus einer 1 :1 molaren Mischung der fluoreszierenden Verbindung ANS zu HSA, Celluloseacetat, einer nicht-ionogenen oberflächenaktiven Verbindung aus Octylphenoxypolyäthoxyäthanol sowie Titandioxidteilchen. In dieser Reagenz-Schicht lag der Bllirubln-aktive Komplex in einer Konzentration von etwa 5,4 g Komplex pro Quadratmeter vor. Die Konzentration an Celluloseacetat betrug etwa 6,4 g pro m², die Konzentration an oberflächenaktiver Verbindung etwa 1,4 g/m² und die Konzentration an Titandloxidteilchen etwa 49,5 g/m². Sämtliche angegebenen Beschichtungstärken beziehen sich auf das Trockengewicht der auf den Träger aufgebrachten Stoffe, ausschließlich des Gewichtes von verwendeten flüssigen

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Beschlchtungslösungsmltteln. Die Reagenz-Schicht wurde aus einer Lösungsmlttel-Nlchtlösungsmlttel-Mischung, bestehend aus Aceton, Dlchloräthan und Xylol erzeugt.

Des weiteren wurde eine Reihe von Testlösungen mit verschiedenen Bilirubinkonzentrationen von 0 bis 50 mg Bilirubin pro Deziliter und etwa 7 g Albumin pro Deziliter hergestellt. Von diesen Lösungen wurden jeweils 10 Mikroliter Tropfen auf einzelne Stellen des beschriebenen mehrschichtigen Elementes aufgetragen. Ein Spektrofluorometer wurde dazu verwendet, um die Fluoreszenz sowohl unmittelbar bevor als auch 5 Minuten nach Aufbringung der Bilirubin enthaltenden Proben zu messen. Auf diese Weise wurde eine Eichkurve für Bilirubin hergestellt. Es ielgte sich, daß das in Form eine Bandes vorliegende analytische Element sich zur quantitativen Bestimmung von Bilirubin in Flüssigkeitsproben eignete.

Unter Vervendung eines mehrschichtigen analytischen Elementes des beschriebenen Typs läßt sich eine Billrubinbestimmung in etwa 5 bis 7 Minuten durchführen. Das Vorhandensein von Bilirubin in den Bilirubin-■Probenlösungen, die zum Eichen des analytischen Elementes verwendet wurden, störte das Ansprechvermögen ,des analytischen Elementes auf Bilirubin offensichtlich nicht. Das Spektrofluorometer wurde im Falle dieses Beispieles für die Fluoreszenzmessungen in einer Weise wie In den Beispielen 1 und 2 beschrieben verwendet, d. h. bei einer Anregungs-Wellenlänge von 396 Nanometem wurde sowohl diese Anregungs-Wellenlänge wie auch das Emlssions-Wellenlängenmaxlmum von ANS bei 475 Nanometern überprüft. Im Falle dieses Beispieles wurde ein Celluloseacetat-Schlchtträger ausgewählt, da dieser keine oder höchstens eine sehr geringe Fluoreszenz aufweist, welche die in diesem Beispiele durchgeführten Messungen stören könnte. Infolgedessen konnten die fluorimetrischen Messungen direkt durch den Träger des analytischen Elementes erfolgen. Wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, zeigen die Ergebnisse der Fluoreszenzmessungen eindeutig eine praktisch lineare Verminderung der Fluoreszenz, die durch den Bilirublnaktiven Komplex in der Reagenz-Schicht des Elementes bewirkt wurde, wenn die Bilirubin enthaltenden Testproben auf das Element aufgetragen wurden. Verwendet wurden dabei 10 Mikroiiter Testproben.

Beispiel 5

Im Falle dieses Beispieles wurde ein weiteres analytisches Element wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme jedoch, daß der Bllirubin-aktive Komplex direkt In die Polyvinylalkoholschlcht eingearbeitet wurde, so daß diese Schicht nicht mehr die Funktion einer Registrierschicht hatte, sondern vielmehr die Funktion einer Reagenz-Schicht. Des weiteren wurde die Konzentration an Blllrubin-akllven Komplex derart verändert, daß die Gesamtmenge an Albumin in der Polyvinylalkoholschlcht bei etwa 2,7 g/m² lag und die Konzentration an ANS bei etwa 0,027 g/m². Im Falle des Elementes dieses Beispieles wurde kein Bllirubin-aktlver Komplex in die Celluloseacetat-Titandioxid-Deckschicht des Elementes eingeführt, so daß diese Schicht allein die Funktion einer Ausbreitschicht hatte.

Im Falle des analytischen Elementes dieses Beispieles wurde die oberflächenaktive Verbindung in der Ausbreitschicht zur Normalisierung des Transportes verschiedener Bilirubin enthaltender Lösungen verwendet sowie zur Erhöhung der Abdlssoziation von Albumin, das an das Bilirubin der Testproben gebunden war. Des weiteren war die Porengröße der Polyvlnylalkohol-Reagenz-Schlcht derart, daß die Reagenz-Schicht mit Polyvinylalkohol und dem Billrubin-aktiven Komplex praktisch undurchlässig für Albumin war. Das Element wurde wiederum wie Im Beispiel beschrieben geeicht, und zwar unter Verwendung einer Reihe von Standard-Testlösungen mit verschiedenen Konzentrationen an Bilirubin von 0 bis 50 mg Bilirubin pro Deziliter, worauf das in Form eines Bandes vorliegende geeichte Material zur Bestimmung einer Reihe von BUirubin-Konzentratlonen und Verwendung von Serumproben mit unbekannten Billrubingehalt verwendet wurde.

Wie in Beispiel 4 beschrieben, erfolgte die Billrubin-Bestimmung unter Verwendung eines Spektrofluorometers. Die Ergebnisse der Versuche zeigten, daß keine Störangen aufgrund des Vorhandenseins von Albumin in den verschiedenen Bilirubin enthaltenden Proben des Serums auftraten. Sowohl im Falle des analytischen Elementes des Beispieles 4 wie auch im Falle des analytischen Elementes des Beispieles 5 konnten Bllirubin-Konzentrationen bis zu etwa 10 mg pro Deziliter ermittelt werden. Innerhalb eines Bereiches von 0 bis 10 mg Bilirubin pro Deziliter ließen sich sowohl im Falle des analytischen Elementes des Beispieles 4 wie auch im Falle des analytischen Elementes des Beispieles 5 ausgezeichnete quantitative Ergebnisse erzielen.

Beispiel 6

Im Falle dieses Beispieles wurde der strukturelle Aufbau der in den Beispielen 4 und 5 beschriebenen analytischen Elemente weiter verändert, um einen größeren Bllirubln-Konzentrationsberelch bestimmen zu können.

Das analytische Element dieses Beispieles bestand aus einem Celluloseacetatträger. auf den aufgetragen wurden: eine Gelatine-Registrierschicht aus einer wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert von 7,0, die in einer Schichtstärke von 5,7 g Gelatine pro m² Schichtträger vorlag; auf die Gelatine-Registrierschicht wurde eine Reagenz-Schicht aus einer 0,05 molaren Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 aufgetragen, mit pro m² Schlchtträgerfläche, 2,3 g Schweinshautgelatine, 0,27 g BSA und 0,27 g der fluoreszierenden Verbindung ANS; auf die Reagenz-Schicht wurde eine blush-Polymer-Ausbreitschicht mit 0,34 g/m² Bariumsulfatteilchen, ungefähr 3,2 g pro m² einer oberflächenaktiven Verblndung auf Basis Octylphenoxypolyäthoxyäthanol und ungefähr 6,4 g/m² Celluloseacetat aufgetragen.

Das hergestellte mehrschichtige analytische Element wurde dann wie In den Beispielen 4 und 5 beschrieben getestet, in dem eine Reihe von Proben mit verschiedenen Billrubingehalten von 0 bis 50 mg Bilirubin pro Deziliter auf das Material aufgetüpfelt wurden, um eine Elchkurve des analytischen Elementes herzustellen.

In Fig. 4 ist diese Eichkurve dargestellt. Aus der Kurve ergibt sich, daß bei Verwendung dieses mehrschichtigen Elementes eine Bilirubln-Bestlmmung sowohl bei sehr geringen Bllirubln-Konzentrationen, d. h. von etwa 0,1 bis etwa 1 mg Bilirubin pro Deziliter ermöglicht, wie auch von vergleichsweise hohen Bllirubln-Konzentrationen, d. h. von Konzentrationen von 1 bis etwa 20 mg pro Deziliter.

Das Element wurde dann wiederum mittels einer Reihe von Testproben mit unbekannten Bllirubingehalt getestet. Es wurde festgestellt, daß gute quantitative Bestimmungen des Bilirublngehaltes dieser Proben mög-Hch waren.

Das analytische Element dieses Beispieles zeigte keine oder praktisch keine Störungen auf Grund des Vorhandenseins von Albumin In den verschiedenen Bilirubin

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enthaltenden aufgetüpfelten Proben, d. h. bei Verwendung des analytischen Elementes ließen sich reproduzierbare Ergebnisse erhalten.

Die beschriebenen Ergebnisse wurden unter Verwendung eines Spektrofluorometers und durch Überwachung des Aruegungsmaximums von ANS bei 680 Nanometern und des Emissionsmaximums von ANS, gebunden an Albumin bei 475 Nanometerri erhalten.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (25)

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Patentansprüche:

L Verfahren zur Bestimmung von Bilirubin in einer wäßrigen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) die zu untersuchende Probe mit einem Reagenz in Kontakt bringt, das einen Bilirubin-aktiven Komplex aufweist, der aus einem diffusionsfähigen, durch Bilirubin verdrängbaren und bestimmbaren Liganden und einem Träger, der durch Bilirubin zu binden vermag, besteht, wobei der Träger eine Bindungskonstante erster Ordnung für Bilirubin von über 10⁷ und für den bestimmbaren Liganden von über 10⁵, jedoch unter der Bindungskonstanten für Bilirubin, aufweist, so daß das Bilirubin den bestimmbaren Liganden aus dem Komplex verdrängen kann und daß man

(b) den durch Bilirubin verdrängten bestimmbaren Liganden selektiv bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Probe und das Reagenz In einem flüssigen Medium mit einem pH-Wert von 6,8 bis 9,5 bei einer Temperatur von 15 bis 60° C in Kontakt bringt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz in einer zu Beginn des Verfahrens trockenen Reagenzzone enthalten ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzzone eine polymere Matrix umfaßt, und daß man die zu analysierende Flüssigkeitsprobe mit der das Reagenz enthaltenden Matrix bei einem pH-Wert von 6,8 bis 9,5 sowie einer Temperatur von 15 bis 60° C in Kontakt bringt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als bestimmbaren Liganden eine kolorimetrisch bestimmbare Substanz oder Verbindung mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von Ober etwa 75 000 auswählt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Liganden eine fluorlmetrisch bestimmbare Verbindung auswählt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger des Bilirubln-aktlven Kornplexes aus einem Protein besteht.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein aus Albumin, einem Albumin-Abbau-Produkt oder einem Albuminderivat besteht. 50

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei Verwendung von Blutserum als Probe das Blutserum zwecks Verminderung des Albumingehaltes einer Vorbehandlung unterwirft.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als bestimmbaren Liganden Bromphenolblau oder Chlorphenolrot verwendet.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als bestimmbaren Liganden ein 8-Anllino-1-naphthallnsulfonatsalz, ein 6-p-Toluldlno-2-naphthallnsulfonatsalz, ein 5-Dlmethylamlno-l-naphthallnsulfonatsalz oder ein sulfoniertes methyllertes Benzothlazolderlvat verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als bestimmbaren Liganden ein 8-Anilino-1-naphthallnsulfonatmagnesiumsalz oder das Sulfonylchlorldderivat eines ö-p-ToluldIno-2-naphthallnsulfonatsalzes verwendet.

13. Analytisches Element für die Bestimmung von Bilirubin In einer wäßrigen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß es eine trockene Reagenzzone (6) umfaßt, die einen Bilirubin-aktiven Komplex enthält, der aus einem diffuslonsfählgsn, durch Bilirubin verdrängbaren und bestimmbaren Liganden und einem Träger, der auch Bilirubin zu binden vermag, besieht, wobei der Träger eine Bindungskonstante erster Ordnung für Bilirubin von über 10⁷ und für den bestimmbaren Liganden von über IQ⁵, jedoch unter der Bindungskonstanten für Bilirubin aufweist, so daß das Bilirubin den bestimmbaren Liganden aus dem Komplex verdrängen kann.

14. Analytisches Element nach Anspruch 13, gekennzeichnet durch eine trockene Ausbreitzone (7), die sich in Kontakt mit der Reagenzzone (6) befindet und aus einer porösen Polymermasse oder einem teilchenförmigen Material aufgebaut ist.

15. Analytisches Element nach Anspruch 13 oder 14, gekennzeichnet durch eine trockene Registrierzone (8), die sich in Kontakt mit der Reagenzzone (6) befindet und den diffusionsfähigen Liganden nach ^Verdrängung desselben durch Bilirubin aufzunehmen vermag.

16. Analytisches Element nach Anspruch 15, gekennzeichnet, durch einen strahlungsdurchlässigen Schichtträger (9), auf dem die Registrier-Schicht (8) die Reagenz-Schicht (6) und gegebenenfalls die Ausbreit-S-Jilcht (7) aufgetragen sind.

17. Analytisches Element nach Ansprüchen 13 bis

16, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenz-Schicht (6) aus einer Isotropporösen Schicht mit dem Bilirubin-aktiven Komplex und einer porösen polymeren Masse oder einer teilchenförmigen Masse besteht.

18. Analytisches Element nach Ansprüchen 13 bis

17, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenz-Schicht (6) für Verbindungen mit einem Molekulargewicht gleich oder größer als das des Albumins Impermeabel ist.

19. Analytisches Element nach Ansprüchen 15 bis

18, dadurch gekennzeichnet, daß der bestimmbare Llgand eine kolorimetrisch bestimmbare Verbindung mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von über 75 000 Ist und daß das Element eine Strahlung blokkierende Schicht zwischen der Reagenz-Schicht (6) und der Registrier-Schicht (8) aufweist.

20. Analytisches Element nach Ansprüchen 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der bestimmbare Ligand eine fluorlmetrisch bestimmbare Verbindung 1st.

21. Analytisches Element nach Ansprüchen 13 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger des Bilirubin-aktiven Komplexes ein Protein ist.

22. Analytisches Element nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein aus Albumin, einem Albumln-Abbau-Produkt oder einem Albuminderivat besteht.

23. Analytisches Element nach Ansprüchen 13 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß der bestimmbare Ligand Bromphenolblau oder Chlorphenolrot Ist.

24. Analytisches Element nach Ansprüchen 13 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß der bestimmbare Ligand aus einem 8-Anlllno-l-naphthallnsulfonatsalz, einem 6-p-ToluldIno-2-naphthalinsulfonatsalz, einem 5-Dimethylam'.no-l-naphthalinsulfonsalz oder einem sulfonierten methyllerten Benzothiazolderivat besteht.

25. Analytisches Element nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß der bestimmbare Ligand

aus einem 8-Anillno-l-naphthalinsulfonatmagnesiumsalz oder dem Sulfonylchloridderivat eines 6-p-ToIuldlon-2-naphthalinosulfonatsalzes besteht.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Bilirubin in einer wäßrigen Probe sowie ein analytisches Element für die Durchführung des Verfahrens.

Eine Zusammenfassung bekannter Bllirubln-Bsstlmmungsmsihoden findet sich beispielsweise in dem Buch von R. J. Henry, D. C. Cannon und J. W. Winkelman »Clinical Chemistry-Principles and Technics«, Verlag Harper and Row Publishers, 2. Auflage, 1974, Seiten 1042 bis 1079, oder in dem Buch von N. W. Tietz, »Fundamentals of Clinical Chemistry«, herausgegeben von W. B. Saunders Co. (1970), Selten 743 bis 762.

Ein weit verbreitetes analytisches Verfahren für die Bestimmung von Bilirubin ist die sog. Diazo-Methode. Die Diazo-Methode beruht auf einer Kupplungsreaktion von Bilirubin mit einem Diazoniumsalz, z. B. Diazosulfanilsäure, unter Erzeugung eines Pigmentes mit einem . Extinktionskoeffizienten, der größer ist als der Extinktionskoeffizient des Bilirubins (das eine gelbe Färbung aufweist). In typischer Weise besteht das Dlazo-Bestlmmungsverfahren für Bilirubin aus zwei kinetischen Phasen: die erste Phase besteht in einer sog. »direkten Reaktion«, in der sehr rasch ein Farbton erzeugt wird, worauf sich als zweite Phast eine »indirekte Reaktion« anschließt, in der ein Farbton nur nach Zusatz von Methanol entwickelt wird.

Wie sich aus den zitierten Literaturstellen ergibt, insbesondere der Literaturstelle »Clinical Chemistry-Principles and Technics«, 1st bis heute unklar geblieben, was diese beiden kinetischen Phasen tatsächlich anzeigen. Einige Forscher betrachten die direkte Reaktion als ein Maß von ungebundenen oder freien Bilirubin, während die Indirekte Reaktion als Maß von Albumin-gebundenen Billrubin betrachtet wird. Andere Forscher wiederum meinen die direkte Reaktion mißt konjugiertes Bilirubin, wohingegen die indirekte Reaktion die unkonjuglerte Form des Bilirubins mißt.

Weiterhin ergibt sich aus dem Buch »Clinical Chemistry-Principles and Technics«, daß im Hinblick auf die zahlreichen Varianten des Dlazoverfahrens und der Komplexität der Dlazoreaktion selbst die erhaltenen analytischen Ergebnisse oftmals variieren. Hinzu kommt, daß die Dlazo-Bestimmungsmethode, da sie die Verwendung verschiedener Reagenzien erfordert, die kurz vor Durchführung der Bestimmung miteinander vermischt werden müssen, Im allgemeinen recht zeltaufwendig 1st und ungenau sein kann, da auch andere Komponenten Im menschlichen Serum und anderen biologischen Flüssigkelten auf eine Dlazotierung ansprechen.

Abgesehen von der beschriebenen Dia^o-Bestlmmungsmethode und Varianten hiervon für die Bestimmung von Bilirubin sind eine Anzahl von weiteren BlH-rubin-Bestlmmungsmethoden bekanntgeworden. Unter anderem sind verschiedene direkte spektrophotometrlsche Bestimmungsverfahren für Bilirubin bekannt, die die molare Absorptlvltät des Billrubins ausnutzen. Das heißt, Bilirubin 1st ein gelbes Pigment mit einer molaren Absorptlvltät von etwa 5 χ 10⁴, gemessen bei 435 Nanometern. Obgleich jedoch die molare Absorptivität des Bilirubins hoch genug 1st, um In verschiedenen direkten spektrophotometrlschen Lösungs-Bestlmmungsverfahren ausgenutzt werden zu können, 1st sie dennoch nicht ausreichend hoch genug, um eine quantitative Bestimmung von Bilirubin unter »trockenen« analytischen Testelementen zu gestatten. Dies bedeutet, daß die bis heute bekanntgewordenen direkten spektrophotometrlschen Bestimmungsmethoden für Bilirubin im allgemeinen • 5 beschränkt sind auf Lösungs-Bestlmmungsverfahren, und zwar Insbesondere In den Fällen, in denen es auf genaue, quantitative Analysenergebnisse ankommt. Wie sich jedoch aus den oben zitierten Literaturstellen ergibt, leiden direkte spektrophotometrlsche Bestlmmungsverfahren für Billrubin darunter, daß spektrale Störungen aufgrund des Vorhandenseins von Hämoglobin auftreten, das Absorptionsspitzen bei 414, 540 und 576 Nanometer aufweist. Hinzu kommt, daß auch andere Stoffe, die in Bilirubin enthaltenden biologischen Flüssigkeiten, wie dem menschlichen Serum enthalten sind, zu spektralen Störungen bei Durchführung von direkten spektrophotometrischen Meßverfahren führen können. So können beispielsweise Karotinolde die Bilirubin-Bestlmmung stören, da ß-Karotin, d. h. eine der hauptsächlichen Karotinoid-komponenten, eine Absorptionsspitze bei etwa 450 nm aufweist, die in einem Bereich des Spektrums liegt, der sehr nahe der Absorptionsspitze des Bilirubins ist.

Außer den erwähnten Störungen, die bei der direkten spektrophotometrlschen Bestimmungsmethode für Bilirubin auftreten können, hat sich gezeigt, daß derartige Methoden auch aufgrund des Vorhandenseins von anderen Proteinen Im menschlichen Serum, beispielsweise Albumin gestört werden können, an die Bilirubin gebunden werden kann, wobei durch die Bindung eine Verschiebung der Absorptionsintensität und der Absorptionsspitze des Bilirubins eintreten kann. Auf Grund dieser Probleme war man Infolgedessen auf das Dlazo-Bestimmungsverfahren oder auf verschiedene Modlflkationen der direkten spektrophotometrlschen Bestimmung für Bilirubin angewiesen. Aus der US-PS 35 69 721 beispielsweise 1st ein direktes spektrophotometrisches Verfahren für die Bestimmung von Bilirubin bekannt, bei dem die spektrale Störung des Hämogiobins weltestgehend ausgeschaltet wird. Indem man die zu untersuchende Flüssigkeitsprobe bei einer Wellenlänge mißt, bei der Billrubin eine maximale Absorption zeigt und bei einer zweiten Wellenlänge, bei der Hämoglobin allein eine Absorptionsspitze hat. Man muß dann die Absorptionsspitze für die Billrubinkonzentration um einen Betrag korrigieren, der äquivalent ist der Menge des Hämoglobins, die In der Flüssigkeitsprobe bestimmt wurde.

Ein weiteres Verfahren, das für die Bestimmung von Bilirubin angewandt wurde, beruht auf der Verwendung eines Reagenzes für Billrubin mit einer organischen Säure oder einem Salz hiervon, z. B. Trichloressigsäure oder einer organischen Sulfonsäure, gemeinsam mit Ferrlionen. Bei diesem Bestimmungsverfahsen wird Blllrübin durch die organische Säure oder ihr Salz In Gegenwart des Ferrllons zu einem Reaktionsprodukt oxidiert, beispielsweise Blllverdin und/oder Cholecyanin, d. h. einem Reaktionsprodukt, das einen charakterltlschen blauen oder blaugrünen Farbton aufweist, dessen Intensitat von der Menge an ursprünglich vorhandenem Bilirubin abhängt. Derartige Bilirubln-Bestlmmungsverfahren sind beispielsweise aus den US-PS 33 48 920 und 36 07 093 sowie der BE-PS 8 16 927 bekannt. Dieses Verfahren leidet jedoch ebenfalls unter vielen der Nachtelle, die für die Dlazo-Bestlmmungsmethode und die direkte sptektrophotometrlsche Bestimmungsmethode typisch sind.
Beispielsweise Ist es bei Durchführung dieser Bestlm-