DE3100156C2

DE3100156C2 -

Info

Publication number: DE3100156C2
Application number: DE3100156A
Authority: DE
Inventors: Masao Kitajima; Fuminori Arai; Asaji Asaka Saitama Jp Kondo
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1980-01-07
Filing date: 1981-01-07
Publication date: 1988-11-10
Also published as: JPS5697872A; GB2069132A; US4337222A; JPH0133782B2; DE3100156A1; GB2069132B

Description

Die Erfindung betrifft ein Material und ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Hämoglobin-Konzentration durch optische Reflexionsdensitometrie, bei dem eine Hämoglobin enthaltende wäßrige Probe auf die poröse Ausbreitungsschicht eines Materials zur Bestimmung der Hämoglobinkonzentration durch optische Reflexionsdensitometrie, bestehend aus einem wasserundurchlässigen Träger, auf den nacheinander aufgebracht sind eine hydrophile Bindemittelschicht und eine poröse Ausbreitungsschicht, die an der Oberfläche und im Innern der Poren hydrophil und wasserlöslich ist, aufgebracht und die optische Reflexionsdichte des Hämoglobins an der Grenzfläche zwischen der porösen Ausbreitungsschicht und der hydrophilen Bindemittelschicht auf an sich bekannte Weise gemessen wird.

Die quantitative Bestimmung der Hämoglobinkonzentration in wäßriger Lösung, insbesondere der Hämoglobinkonzentration in Blut, ist eine wichtige Testmethode auf dem Gebiet der medizinischen, klinischen oder physiologischen Hämatologie, die ebenso wichtig ist wie die Bestimmung der Anzahl der Erythrocyten und des Hämatokrits. Ein bekanntes Verfahren zur Bestimmung der Hämoglobinkonzentration in wäßrigen Lösungen, beispielsweise in Blut, besteht darin, daß die Absorption eines bestimmten Volumens an hämolytischen oder nicht-hämolytischen Verdünnungen bestimmt und daraus die Hämoglobinkonzentration (Hb-Konzentration) berechnet wird. Dieses übliche Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß es sehr zeitaufwendig ist und ein kompliziertes Naßverfahren darstellt.

Ein weiteres bekanntes Verfahren zur Bestimmung der Hämoglobinkonzentration, als ′′Tallqvist-Verfahren′′ bekannt (T. W. Tallqvist, Z. Klin. Med., Band 40, Seite 137, 1900). wird unter Verwendung eines trockenen, Wasser absorbierenden Blattes Papier, wie z. B. eines Filterpapiers, durchgeführt, das mit der Blutprobe gesättigt wird und bei dem dann die optische Reflexionsdichte bestimmt wird.

In der US-PS 40 57 394 (entsprechend JP 143 885/77) ist ein modifiziertes Tallqvist-Verfahren zur Bestimmung der Hämoglobinkonzentration unter Verwendung eines bogenartigen Materials beschrieben. Das in diesem Falle verwendete Testmaterial besteht aus einem Träger und einer darauf aufgebrachten Absorbensmatrix, die hergestellt wird durch Imprägnieren einer Absorbens-Schicht mit einer opaken, Licht reflektierenden Substanz. In Spalte 4, Zeilen 23 bis 24, dieser Patentschrift ist angegeben, daß dann, wenn das darin beschriebene Testmaterial zur Durchführung eines Bluttests verwendet wird, eine Entlüftungseinrichtung angewendet werden muß, um eingeschlossene feine Luftzellen zu entfernen und korrekte Testergebnisse zu erhalten.

Aus der DE-OS 23 32 760 ist ein mehrschichtiges analytisches Element für die quantitative spektrophotometrische Analyse einer Flüssigkeit, insbesondere von Blut, bekannt, das aus einem für die Flüssigkeit undurchlässigen, für Licht durchlässigen Träger, einer darauf aufgebrachten Reagensschicht, die durch Umsetzung mit einem Bestandteil der zu analysierenden Flüssigkeit eine Farbveränderung innerhalb der Reagensschicht bewirkt, und einer darauf angeordneten porösen Schicht, die für den die Farbbildungsreaktion mit dem Reagens eingehenden Bestandteil der zu analysierenden Flüssigkeit durchlässig ist, besteht. Nach diesem bekannten Verfahren ist nur eine indirekte Bestimmung der Hämoglobinkonzentration über die Messung der Farbdichte möglich, die außerordentlich umständlich ist und zu ungenauen Ergebnissen führt.

Aus der DE-OS 28 82 760 ist ein mehrschichtiges analytisches Element zur Bestimmung der Hämoglobinkonzentration bekannt, das durch Aufbringen einer ein Enzym und ein Farbreaktionsagens enthaltenden Gelatineschicht auf einen Filmträger und anschließendes Aufbringen einer Celluloseacetatschicht mit darin dispergierten feinen Titandioxidteilchen, Aufbringen einer Diatomeenerde und Salicylsäure enthaltenden Celluloseacetatschicht und anschließendes Trocknen hergestellt worden ist. Auch in diesem Falle wird die Blutprobe auf die oberste Oberfläche des mehrschichtigen analytischen Elements bis zur Sättigung aufgebracht und die Reflexionsdichte wird oberhalb der oberen Oberfläche unter Anwendung eines Reflexionsspektrographen gemessen, worauf dann die Bluthämoglobinkonzentration errechnet wird. Auch dieses bekannte Verfahren ist in der Praxis umständlich, zeitraubend und führt zu fehlerhaften Ergebnissen.

Aufgabe der Erfindung war es daher, eine einfache Methode zur Bestimmung der Hämoglobinkonzentration zu finden, die ohne genaues Abwiegen der Probe auf außerordentlich einfache Weise eine genaue Bestimmung der Hämoglobinkonzentration im Rahmen eines Trockenverfahrens erlaubt.

Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe erfindungsgemäß gelöst werden kann durch ein Material mit dem eingangs genannten Aufbau, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Ausbreitungsschicht aus einem porösen Material besteht, welches das Eindringen der das Hämoglobin enthaltenden wäßrigen Probe in einem begrenzten Volumen pro Flächeneinheit erlaubt und einen solchen mittleren Porendurchmesser hat, daß das Hämoglobin an der Grenzfläche zwischen der porösen Ausbreitungsschicht und der hydrophilen Bindemittelschicht in Form einer gleichmäßigen ebenen Schicht zurückgehalten wird, während die wäßrige Komponente und die wasserlöslichen Inhaltsstoffe der Probe von der Bindemittelschicht absorbiert werden.

Nach einem einen weiteren Gegenstand der Erfindung bildenden Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Konzentration von Hämoglobin in einer wäßrigen Lösung wird eine Hämoglobin enthaltende wäßrige Probe auf die poröse Ausbreitungsschicht eines Materials mit dem vorgenannten Aufbau aufgebracht und die optische Reflexionsdichte des Hämoglobins wird an der Grenzfläche zwischen der porösen Ausbreitungsschicht und der hydrophilen Bindemittelschicht auf an sich bekannte Weise gemessen.

Auf diese Weise erhält man an der Grenzfläche zwischen der porösen Ausbreitungsschicht und der hydrophilen Bindemittelschicht eine dünne, einheitliche Hämoglobinschicht in gleichmäßiger Verteilung, die eine äußerst genaue Bestimmung der optischen Reflexionsdichte des in der Probe enthaltenen Hämoglobins erlaubt. Es ist somit erfindungsgemäß möglich, die Hämoglobinkonzentration ohne genaues Abwiegen der Probe auf außerordentlich einfache Weise äußerst genau zu bestimmen, ohne daß es zu einer Sättigung der optischen Reflexionsdichte und damit zu einer Verfälschung der Meßergebnisse kommt.

Da die erfindungsgemäß vorgesehene hydrophile Bindemittelschicht die wäßrige Komponente und die wasserlöslichen Bestandteile der wäßrigen Probe absorbiert, wird dadurch die Ausbreitung der das Hämoglobin enthaltenden wäßrigen Probe in die Ausbreitungsschicht beschleunigt und die Bildung von feinen Lufteinschlüssen wirksam verhindert.

Erfindungsgemäß kann daher sehr schnell eine gleichmäßige Verteilung des Hämoglobins in Form einer einheitlichen Schicht einer Grenzfläche zwischen der Ausbreitungsschicht und der hydrophilen Bindemittelschicht erhalten werden, die eine genaue quantitative Bestimmung des Hämoglobingehaltes der Probe durch Messung der optischen Reflexionsdichte erlaubt.

Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung hat die poröse Ausbreitungsschicht eine Porosität von 20 bis 80% und sie besteht vorzugsweise aus einem nicht-faserförmigen porösen Material, das insbesondere einen mittleren Porendurchmesser von 2,5 bis 500 µm hat und vorzugsweise eine poröse Membran darstellt.

Die poröse Ausbreitungsschicht kann aber auch aus einem faserförmigen porösen Material bestehen, bei dem es sich vorzugsweise um ein gewirktes oder gewebtes Gewebe oder um eine Papier- oder Glasfaserbahn handelt, wobei dieses faserförmige poröse Material vorzugsweise einen Garntiter von 40 bis 100 und insbesondere eine Dicke von nicht mehr als 3 µm aufweist.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist die poröse Ausbreitungsschicht hydrophil gemacht worden durch Adsorption einer hydrophilen Verbindung, durch Hydrolyse mit einer Säure oder einem Alkali, durch Umsetzung mit einer hydrophilen Verbindung, durch Flammenbehandlung, durch Bestrahlung mit UV-Licht, durch elektrische Entladung, durch Vakuumabscheidung oder durch Besprühen.

Die poröse Ausbreitungsschicht enthält vorzugsweise ein oder mehr Agentien zur Stabilisierung der Farbtönung von Hämoglobin oder zur Modifizierung der Erythrozyten-Membran, die ausgewählt werden aus der Gruppe pH-Puffer, Antikoagulationsmittel, antihämolytisches Mittel, Antioxidationsmittel Oxidationsmittel, Farbstoff, Pigment, anorganisches Salz, Aldehyd, Isocyanat und Wasserstoffperoxid.

Die hydrophile Bindemittelschicht besteht vorzugsweise aus Gelatine, Agarose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyacrylamid oder Polyacrylsäure. Sie enthält vorzugsweise mindestens einen Zusatz zur Stabilisierung der Farbtönung des Hämoglobins, zur Verhinderung des Eindringens, der Diffusion oder der Ausfällung von Hämoglobin oder zur Steuerung der Ausbreitung, wobei dieser Zusatz vorzugsweise ausgewählt wird aus der Gruppe der nicht-ionischen, kationischen oder anionischen oberflächenaktiven Agentien, der Weichmacher, der anorganischen Salze, der organischen Säuresalze, der pH-Puffer, der Pigmente, der Farbstoffe, der festen feinen Faserteilchen, der Oxidationsmittel, der Reduktionsmittel, der Säuren und Alkalien.

Die Bindemittelschicht hat vorzugsweise eine Dicke von mindestens 0,1 µm und höchstens 1 mm.

Der wasserdurchlässige Träger ist vorzugsweise transparent.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird zur quantitativen Bestimmung der Konzentration von Hämoglobin in einer wäßrigen Lösung ein Material mit transparentem Träger verwendet und die Bestimmung der Hämoglobinkonzentration wird von der Seite aus vorgenommen, die der Seite, auf die die wäßrige Probe aufgebracht worden ist, gegenüberliegt.

Mit der vorliegenden Erfindung ist es nicht nur möglich, die Hämoglobinkonzentration in wäßrigen Lösungen, insbesondere in Blut, auf technisch einfache, zuverlässige und präzise Art zu bestimmen, sondern es kann damit auch die Hämoglobinkonzentration in Spinalflüssigkeiten ermittelt werden.

In den Zeichnungen stellt

Fig. 1 einen schematischen Schnitt, der eine Ausführungsform eines Materials zur Bestimmung der Hb- Konzentration gemäß der Erfindung zeigt, und

Fig. 2 eine perspektivische Ansicht, die den Ausbreitungszustand einer auf die hydrophile poröse Ausbreitungsschicht des in Fig. 1 gezeigten Blattes zur Bestimmung der Hb-Konzentration aufgetragenen wäßrigen Lösungsprobe, zeigt, dar.

In den in Fig. 1 und 2 bezeichnet die Bezugsziffer 1 den wasserundurchlässigen Träger, 2 den hydrophilen Binder, 3 die hydrophile poröse Ausbreitungsschicht, 4 einen Ausbreitungskreis, der Pfeil A die Richtung der Auftragung der wäßrigen Lösungsprobe und die Ansicht und Bestimmung des Ausbreitungskreises von der Seite der porösen Ausbreitungsschicht, während der Pfeil B die Richtung der Ansicht und Bestimmung des Ausbreitungskreises von der Seite des Trägers im Fall der Anwendung eines transparenten wasserundurchlässigen Trägers zeigen.

Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen der nach einem Standardverfahren bestimmten Hb-Konzentration und der unter Anwendung des Blattes zur Bestimmung der Hb-Konzentration gemäß der Erfindung gemessenen optischen Dichte zeigt.

Im Rahmen der Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen wird die vorliegende Erfindung anhand des in den beiliegenden Zeichnungen gezeigten Blattes zur Bestimmung der Hb-Konzentration beschrieben, welches eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt.

Das Blatt gemäß der Erfindung zur Bestimmung der Hb-Konzentration hat die in der Fig. 1 gezeigte Grundstruktur, worin eine hydrophile Binderschicht 2 und eine hydrophile poröse Ausbreitungsschicht 3 aufeinanderfolgend auf einem wasserundurchlässigen ebenen Träger 1 zur Bildung eines zusammenhängenden Blattes ausgebildet sind.

Bei der Bestimmung der Hb-Konzentration wird ein Tropfen einer wäßrigen Lösungsprobe, wie Blut, beispielsweise Gesamtblut, eine hämolytische Lösung oder verdünntes Blut, auf die hydrophile poröse Ausbreitungsschicht aufgetragen, wie durch den Pfeil A in den Fig. 1 und Fig. 2 gezeigt, wobei die letztere die perspektivische Ansicht eines Blattes zur Bestimmung der Hb-Konzentration gemäß der Erfindung darstellt.

Die Menge der aufgetragenen Blutprobe beträgt günstigerweise etwa 5 µl bis 100 µl, beispielsweise 10 µl.

Die so aufgetragene Blutprobe breitet sich unmittelbar in die hydrophile poröse Ausbreitungsschicht in horizontaler Richtung zur Bildung eines roten Ausbreitungskreises und eines konzentrischen erythorcytenfreien Kreises von geringfügig größerem Durchmesser darum herum innerhalb 1 Sekunde bis zu einigen zehn Sekunden aus.

Die Hb-Konzentration wird durch Messung der Durchlässigkeit oder der optischen Reflexionsdichte des roten Ausbreitungskreises, wie in Fig. 2 gezeigt, von der durch den Pfeil A oder B angezeigten Richtung bestimmt. Die Hb-Konzentration kann unmittelbar durch Umwandlung der optischen Dichte in die Hb-Konzentration unter Anwendung einer vorhergehend hergesellten Umwandlungstabelle oder Eichkurve bestimmt werden.

Als hydrophile poröse Ausbreitungsschicht kann eine faserförmige oder nicht-faserförmige poröse Membrane verwendet werden, die eine hydrophile Oberfläche hat und worin die Oberfläche der inneren Hohlräume oder das Innere hydrophil und wasserunlöslich sind.

Das Ausmaß der Porosität derselben variiert in Abhängigkeit von dem Ausmaß des hydrophilen Charakters, dem Zustand der Poren, der Form und Verteilung der Poren und dgl., so daß keine allgemeine Regel angegeben werden kann. Als Leitlinie liegt jedoch, falls die Ausbreitungsschicht ein nicht-faserförmiges poröses Material darstellt, der mittlere Porendurchmesser im Bereich von etwa 2,5 µm bis etwa 500 µm, vorzugsweise etwa 3 µm bis etwa 100 µm, und, falls es aus einem faserförmigen porösen Material, wie Textilien (breitem Tuch) besteht, werden die Textilien unter Anwendung von zweifach gefalteten Garnen von etwa 40 bis etwa 100, vorzugsweise etwa 60 bis etwa 80, als Garnzahlzählung angewandt. Das geeignete Ausmaß der Porosität liegt im Bereich von etwa 20 bis 80%, vorzugsweise etwa 25 bis 80%. Zusätzlich wird im Fall der Anwendung von Textilien der Größenbereich der Textur oder die Maschenzahl ermittelt, wobei gefunden wird, daß der Durchmesser der offenen Poren der Textur selbst bis zu etwa 1 mm für die hydrophile poröse Ausbreitungsschicht betragen kann.

Als derartige hydrophile poröse Ausbreitungsschichten können nicht-faserförmige poröse Membranen, wie ein Membranfilter gemäß der japanischen Patent-Veröffentlichung 2999/73, entsprechend den US-Patentschriften 35 53 067 und 35 94 263, der japanischen Patentanmeldung 53 888/74, entsprechend der US-Patentschrift 39 22 158 und 131 786/77, entsprechend der US-Patentschrift 40 50 898 und dgl. oder solche, welche durch Ausbildung eines Membranfilters mit hydrophilem Charakter hergestellt wurden oder poröse Pulvermembranen, sowie hydrophile Textilien entsprechend der japanischen Patentanmeldung 72 047/79, entsprechend der US-Patentanmeldung Serial-No. 157 737 vom 9. Juni 1980, aus Glasfasern oder Papieren aufgebaute Bahnen oder Bögen und dgl. verwendet werden. Beispiele für verwendbare Tücher können gewebt oder gestrickt sein und geeignete Beispiele für verwendbare Tücher umfassen aus Naturfasern aufgebaute Tücher, aus Mischgarnen oder Naturfasern und synthetischen Polymeren aufgebaute Tücher und aus synthetischen Polymeren aufgebaute Tücher. Hiervon werden die hydrophilen Textilien mit den nachfolgend aufgeführten Eigenschaften besonders bevorzugt. Falls Membranfilter verwendet werden, können solche mit einer Porengröße von etwa 3 µm bis etwa 500 µm verwendet werden, wobei eine Porengröße von etwa 3 µm bis etwa 100 µm besonders bevorzugt wird. Die Stärke der porösen Ausbreitungsschicht ist nicht besonders begrenzt, sofern sie nicht weniger als 10 µm beträgt, jedoch wird im Hinblick auf die Menge der aufzutragenden Probe, die Bestimmungsgenauigkeit, die leichte Handhabung und dgl. bevorzugt, daß sie im Bereich von etwa 30 µm bis etwa 3 mm, stärker bevorzugt etwa 50 µm bis etwa 1 mm und am stärksten bevorzugt etwa 100 µm bis etwa 500 µm, beträgt.

Die erfindungsgemäß verwendete hydrophile poröse Ausbreitungsschicht kann eine einheitliche aus einem einzigen Material aufgebaute Struktur haben oder kann durch Kombination von zwei oder mehr Materialien mit unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften gebildet sein, um verbesserte Eigenschaften zu erhalten, wie nachfolgend geschildert wird.

Als Verfahren zur integralen Ausbildung einer hydrophilen porösen Ausbreitungsschicht auf der Binderschicht, wie es nachfolgend beschrieben wird, kann man integral eine vorhergehend hergestellte poröse Membrane oder Textilie auf die Binderschicht aufschichten oder eine Lösung oder Dispersion, welche zur Bildung einer hydrophilen porösen Ausbreitungsschicht auf der Binderschicht fähig ist, aufziehen, so daß dadurch integral die poröse Ausbreitungsschicht gebildet wird.

Die hydrophile poröse Ausbreitungsschicht hat solche Eigenschaften, daß die Oberfläche, worauf die Probe aufzutragen ist und die Oberfläche der Hohlräume in der hydrophilen porösen Ausbreitungsschicht oder dem Innern derselben einen hohen hydrophilen Charakter besitzen, so daß, falls ein Tropfen der Probe hierauf aufgetragen wird, die Probe praktisch isotrop innerhalb der Ebene der Probeauftragung ausgebreitet wird.

Um diese Eigenschaften zu erhalten, muß das verwendete poröse Material einer Behandlung unterworfen werden, um es hydrophil zu machen. Als derartige Behandlung kann eine Adsorption einer hydrophilen Verbindung, wie eines kationischen, anionischen oder nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels oder Weichmachers oder eines Kolloids, beispielsweise Gelatine, Hydrolyse mit einer Säure oder einem Alkali, Umsetzung mit einer hydrophilen Verbindung, Koronabehandlung, Flammbehandlung, Ultraviolettlichtbestrahlung, elektrische Entladung, Vakuumabscheidung, Aufsprühen und dgl., angewandt werden.

Die Zugabe von Mitteln zur Stabilisierung der Tönung des Hämoglobins, wie pH-Puffer, Antikoaguliermittel, antihämolytische Mittel, Antioxidantien, Oxidationsmitteln und dgl. und Membranmodifiziermittel für die Erythrocyten, wie Farbstoffe, Pigmente, anorganische Salze, Aldehyde, Isocyanate, Wasserstoffperoxid und dgl., zu der hydrophilen porösen Ausbreitungsschicht dient zur Verbesserung der Genauigkeit oder zur Verbesserung der Verfahren, wie dem Ablesen.

Um einheitlich Gesamtblut auszubreiten, ist eine hydrophile poröse Ausbreitungsschicht mit besonders guten Ausbreitungseigenschaften notwendig. Eine hydrophile poröse Ausbreitungsschicht in Form einer Doppelschicht, die aus einer oberen aus Textilien oder einem Netz mit ausgezeichneten Ausbreitungseigenschaften bestehenden Schicht und einer unteren porösen Schicht mit kleinen Poren, wie einem Membranfilter mit erteiltem hydrophilem Charakter besteht, zeigt eine ausgezeichnete Eignung zur einheitlichen und feinen Ausbreitung einer derartigen Blutprobe.

In dem Material zur Bestimmung der Hb-Konzentration gemäß der Erfindung dringen die wäßrige Komponente und die wasserlöslichen Bestandteile einer wäßrigen Lösungsprobe, die sich einheitlich innerhalb der hydrophilen porösen Ausbreitungsschicht ausbreitet, in einem einheitlich ausgebreiteten Zustand in die darunterliegende hydrophile Binderschicht ein und infolgedessen wird die poröse Ausbreitungsschicht niemals mit der wäßrigen Lösungsprobe gesättigt. Ein Grund hierfür liegt darin, daß die hydrophile poröse Ausbreitungsschicht eine Wirkung zur einheitlichen Ausbreitung einer wäßrigen Lösungsprobe besitzt, welche mindestens etwa 10 Vol.-% Hohlraum nach der einheitlichen Ausbreitung der Probe hinterläßt. Deshalb ergibt das Material gemäß der vorliegenden Erfindung nicht die nachteilige Erscheinung der Ausbildung feiner Luftzellen nach der Sättigung der porösen Ausbreitungsschicht mit der wäßrigen Lösungsprobe und deshalb ist es nicht notwendig, besondere Luftdurchdringungsmaßnahmen in der hydrophilen porösen Ausbreitungsschicht und/oder der hydrophilen Binderschicht auszubilden.

Als für die hydrophile Binderschicht einzusetzender hydrophiler Binder kann eine große Vielzahl von Materialien, wie natürliche hydrophile hochmolekulare Materialien, z. B. Gelatine, Agarose, Dextran und dgl., und hydrophile synthetische hochmolekulare Materialien, z. B. Polyvinylalkohol, Polyacrylamid, Polyacrylsäure und dgl., verwendet werden. Hiervon wird Gelatine für photographische Zwecke am stärksten auf Grund ihrer ausgezeichneten Quelleigenschaften in Wasser, Gelbildungseignung, Haftungseigenschaften, Wasserabsorptionseigenschaften und dgl. und ihrer guten Herstellbarkeit bevorzugt.

Verschiedene Zusätze können zu der hydrophilen Binderschicht zum Zweck der Stabilisierung der Tönung des Hämoglobins oder der Verhinderung des Eindringens, der Diffussion oder des Ausfällens von Hämoglobin sowie zur Steuerung der Ausbreitung zugesetzt werden. Als Beispiele derartiger Zusätze seien aufgeführt Materialien von niedrigen oder hohem Molekulargewicht, wie nicht-ionische, kationische oder anionische oberflächenaktive Mittel, Weichmacher, anorganische Salze, organische Säuresalze, pH-Puffer, Pigmente, Farbstoffe, feste feine Faserteilchen, Oxidationsmittel, Reduktionsmittel, Säuren, Alkalien und dgl.

Zum Zweck der Erleichterung des Ablesens des Durchmessers des roten Ausbreitungskreises kann ein pH-Indikator zugegeben werden, der Farbe annimmt oder verliert in Abhängigkeit von dem pH-Wert des Blutserums oder ein Farbreaktionsmittel, welches mit Bestandteilen des Blutserums, wie Albumin unter Annahme von Farbe reagiert, wie Bromcresolgrün.

Die hydrophile Bindungsschicht kann in einigen Fällen aus zwei oder mehr Unterschichten zum Zweck der Verbesserung der Haftung und zur erleichterten Ablesung und Verhinderung der Kräuselung gebildet sein.

Die Stärke der Binderschicht liegt im Bereich von etwa 0,1 µm bis 1 mm, vorzugsweise 1 µm bis 100 µm, besonders bevorzugt 5 µm bis 50 µm.

Als wasserundurchlässiger ebener Träger kann ein plattenartiges transparentes oder halbtransparentes Material, wie Glas, ein synthetischer Harzfilm, beispielsweise aus Polyester, z. B. Polyäthylenterephthalat, Bisphenol A-Polycarbonat und dgl., Celluloseester, z. B. Cellulosediacetat, Cellulosetriacetat, Celluloseacetatpropionat und dgl., Polymethylmethacrylat oder dgl. verwendet werden. Die Stärke des Trägers liegt im Bereich von etwa 10 µm bis etwa 3 mm, vorzugsweise etwa 20 µm bis etwa 1 mm, am stärksten bevorzugt von etwa 50 µm bis etwa 500 µm.

Steife plattenartige Träger, wie Glas oder Kunststoffplatten, können verwendet werden, jedoch sind in zahlreichen Fällen flexible Folien hinsichtlich der Herstellung und der leichten Handhabung vorteilhaft. Es ist natürlich möglich, falls gewünscht oder notwendig, in Kombination andere transparente oder opake Träger entsprechend dem Verwendungszweck und den Lagerungsbedingungen zu verwenden.

Falls eine geringe Menge, beispielsweise 10 µl, einer nicht-verdünnten oder verdünnten Probe, beispielsweise Gesamtblut, verdünntes Gesamtblut und dgl., auf die hydrophile poröse Ausbreitungsschicht aufgetragen wird, wird die Probe rasch innerhalb der hydrophilen porösen Ausbreitungsschicht einheitlich in flacher Weise ausgebreitet, d. h. in der Weise, daß ein praktisch begrenztes Volumen der Probe je Einheitsfläche einverleibt wird. Hierbei absorbiert eine hydrophile Binderschicht, die unter der porösen Ausbreitungsschicht liegt, Feuchtigkeit und darin gelöste diffundierbare Substanzen von niedrigem Molekulargewicht und verhindert infolgedessen die Ausbildung von feinen Luftzellen während der Ausbreitung der Probe, wodurch die Ausbreitung nicht einheitlich würde, so daß dies zur raschen und einheitlichen Ausbreitung der Probe innerhalb der hydrophilen porösen Ausbreitungsschicht dient.

Außerdem ermöglicht die hydrophile Binderschicht kein Eindringen von Proteinen, wie Albumin, Globulin, und hämolytischen Hämoglobin sowie festen Bestandteilen, wie Erythrocyten, Leukocyten, Thrombocyten und dgl., auf Grund ihrer semipermeablen Eigenschaften. Deshalb ist die zu messende Hämoglobinkonzentration einheitlich an der Grenzfläche zwischen der hydrophilen Binderschicht und der porösen Ausbreitungsschicht in flacher Weise ausgebreitet. Somit ist die Oberfläche, an der die optische Reflexionsdichte zu messen ist, flach, was zu einer hohen Genauigkeit bei der Bestimmung führt.

Eine weitere wichtige Funktion der hydrophilen Binderschicht besteht in der Stabilisierung des Hämoglobins. Bekanntlich wird Hämoglobin leicht oxidiert, wenn es getrocknet wird oder in Kontakt mit Luft steht, so daß sich eine Änderung seiner Tönung oder eine Änderung seiner Absorptionswellenlänge einstellt. Um deshalb genau die Menge des Hämoglobins in der Lösung zu messen, ist es notwendig, das Absorptionsspektrum des Hämoglobins selbst zu stabilisieren. Zu diesem Zweck wird die Messung ausgeführt, indem Hämoglobin beispielsweise in Cyanmetohämoglobin überführt wird.

Das Material gemäß der Erfindung zur Bestimmung der Hb-Konzentration erlaubt auch die Messung der optischen Dichte von der Seite der Probeauftragung in gleicher Weise mit dem vorstehend angegebenen bekannten Verfahren. In diesen Fällen jedoch sind die Änderungen im Ausmaß der Trocknung der Blattoberfläche, der Oxidation oder der Denaturierung des Hämoglobins und dgl., so ernsthaft, daß sich ungenaue Werte ergeben.

Falls andererseits die optische Dichte nach der Auftragung der Blutprobe von der Seite entgegengesetzt zur Seite der Probeauftragung oder von der Seite des hydrophilen Binders durch den transparenten Träger gemessen wird, sind die Denaturierung des Hämoglobins an der Bestimmungsfläche und der Einfluß zur Trocknung weit niedriger als auf der Oberfläche der Probeauftragung; dadurch wird eine Messung einer äußerst stabilen Grenzfläche von hoher Genauigkeit erhalten.

Ein weiterer Vorteil des Verfahrens der Messung der optischen Dichte durch den transparenten Träger des Blattes besteht darin, daß der meßbare Hb-Konzentrationsbereich erweitert wird. Wird nämlich die optische Dichte von der Seite der Probeauftragung ähnlich zu dem Fall der Anwendung des in der US-PS 40 57 394 bzw. JP 143 885/77 beschriebenen Materials gemessen, liegt ein hoher Anteil der Erythrocyten auf der Oberfläche der Probeauftragung und infolgedessen wird die optische Oberflächenreflexionsdichte so hoch, daß bei einem Blut mit einem hohem Hämoglobingehalt die optische Oberflächenreaktionsdichte die Sättigung erreicht, so daß eine quantitative Messung unmöglich wird. Falls hingegen von der Seite entgegengesetzt zur Seite der Probeauftragung durch den transparenten Träger und eine hydrophile Bindungsschicht gemessen wird, aggregieren die Erythrocyten nicht unter Bildung einer Schicht auf der gemessenen Fläche und lediglich die Menge der auf die hydrophile Binderschicht diffundierten Probe wird gemessen. Infolgedessen findet eine Sättigung der optischen Reflexionsdichte lediglich unter extremen Umständen statt.

Die gemäß der Erfindung verwendete poröse hydrophile Ausbreitungsschicht umfaßt ein hydrophiles poröses Material, das so aufgebaut ist, daß eine Probe einheitlich mit einem praktisch begrenzten oder definiertem Volumen je Flächeneinheit ausgebreitet wird, ohne daß es durch die Menge oder die Viskosität der Flüssigkeitsprobe oder Blutprobe, d. h. die Mengen an Hämatocyten oder Proteinen in dem Blut, beeinflußt wird. Infolgedessen kann die Hb-Konzentration unmittelbar durch Auftragung eines Tropfens einer wäßrigen Lösungsprobe auf das Blatt und direkte Messung der Hb-Dichte nach Beendigung der Ausbreitung unter Anwendung beispielsweise von Rotlicht erhalten werden.

Einer der charakteristischen Gesichtspunkte des Materials zur Bestimmung der Hb-Konzentration gemäß der Erfindung liegt darin, daß die Hb-Konzentration ohne genaues Abwiegen der Probe bestimmt werden kann. Tatsächlich hat Blut eine hohe Viskosität und unterliegt Änderungen, wie Hämolyse auf Grund von Änderungen der Temperatur, Kontakt mit Luft, mechanischer Vibration und dgl., so daß das Abwiegen einer Blutprobe selbst schwierig ist. Durch das Material zur Bestimmung der Hb- Konzentration gemäß der Erfindung wird die Notwendigkeit des genauen Abwiegens einer wäßrigen Lösungsprobe vermieden und zusätzlich wird die Bestimmung der Hb-Konzentration unter Anwendung einer Probe, die eine gewisse Hämolyse erlitten hat, in der gleichen Weise wie mit der frischen Probe ermöglicht.

Das Material zur Bestimmung der Hb-Konzentration gemäß der Erfindung kann in Form kleiner Stücke, wie als Streifen oder als für eine Messung geeignetes Schnitzel verwendet werden, oder kann in Bogenform verwendet werden, so daß man die Hb-Konzentration einer Mehrzahl von Proben bestimmen kann. Ferner kann es in Rollenform verwendet werden, was für eine kontinuierliche Messung günstig ist.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 1

Eine Gelatineschicht wurde auf eine 185 µm dicke transparente Polyäthylenterephthalatfolie (PET-Film), die mit einer Grundierung für Gelatine zu einer Trockenstärke von 15 µm grundiert war, aufgezogen und getrocknet. Ein Mikrofilter (poröse Ausbreitungsschicht, bestehend aus Cellulosetriacetat mit einer mittleren Porengröße von 5 µm, das mit 0,5 Gew.-% eines Alkylphenoxypolyäthoxyäthanols (oberflächenaktives Mittel) imprägniert war, wurde auf die Gelatineschicht unter Quellung mit Wasser zur Herstellung eines Blattes zur Bestimmung der Hb-Konzentration (mehrschichtiger Film) preßgeschichtet.

Frisches mit ACD konserviertes Blut (konserviertes Blut, welches als Konservierungsmittel Natriumcitrat, Zitronensäure und Dextrose enthält) für die Transfusion wurde zentrifugiert, um dieses in die Hämocytenkomponente und die Blutserumkomponente aufzutrennen, welche dann miteinander in verschiedenen Verhältnissen zur Herstellung einer Reihe von bekannten Proben mit einem Hämatocrit- Gehalt von 0 bis 70% vermischt wurden. Die verdünnten hämolytischen Lösungen wurden für die jeweiligen Proben hergestellt und die Hb-Konzentration jeder Lösung wurde durch Bestimmung der Absorption der Lösung ermittelt. Die Hb-Konzentration betrug somit 0 bis 24,7 mg/dl.

Getrennt wurden 10 µl jeder Blutprobe mit der entsprechenden Hb-Konzentration auf die hydrophile poröse Ausbreitungsschicht des entsprechend dem vorstehenden Verfahren hergestellten Blattes zur Bestimmung der Hb- Konzentration aufgetragen. Die Blutproben wurden in kreisförmiger Form mit praktisch begrenzter Fläche unabhängig von der Hb-Konzentration ausgebreitet.

Eine Minute nach der Auftragung wurde die optische Reflexionsdichte für Rotlicht des porösen Probeausbreitungsanteiles von der Seite des transparenten PET-Filmes unter Anwendung eines optischen Reflexionsdensitometers bestimmt. Die Beziehung zwischen der Hb-Konzentration der jeweiligen Blutproben und der optischen Reflexionsdichte sind in Fig. 3 gezeigt, woraus sich ergibt, daß sie eine gute Korrelation miteinander zeigen.

Beispiel 2

Blätter zur Bestimmung der Hb-Konzentration wurden unter Anwendung einer hydrophilen porösen Ausbreitungsschicht in Form eines Tuches (10% Baumwolle, gebildet unter Anwendung von zweifach gefalteten Garnen mit einer Garnzahlzählung von 80) hergestellt, welche durch Imprägnierung derselben mit Wasser mit einem Gehalt von 0,2% Polyoxyäthylennonylphenoxyäther (nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel) erhalten worden waren, anstelle des in Beispiel 1 eingesetzten Mikrofilters hergestellt.

Die Beziehung zwischen der Hb-Konzentration und der optischen Reflexionsdichte wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 unter Anwendung der in dieser Weise hergestellten Blätter zur Bestimmung der Hb-Konzentration untersucht. Zu Vergleichszwecken wurden optische Dichtewerte, welche durch Messung von der Seite der Probeauftragung (Seite der porösen Ausbreitungsschicht) erhalten worden waren, mit den durch Messung von der Seite des transparenten PET-Filmes erhaltenen Werten verglichen. Wie aus Tabelle I ersichtlich ist, waren die von der Seite des transparenten PET-Trägers erhaltenen Werte bemerkenswert besser als diejenigen von der Seite der porösen Ausbreitungsschicht.

Tabelle I

Beispiel 3

Photographische Gelatine mit einem Gehalt von 0,1% des nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels HS 210 wurde auf eine 185 µm dickte transparente PET-Folie, die für Gelatine grundiert war, zu einer Trockenstärke von 40 µm aufgezogen und getrocknet. Dann wurde ein Mikrofilter (poröse Ausbreitungsschicht, aus Cellulosetriacetat aufgebaut) mit einer mittleren Porengröße von 3 µm imprägniert mit 0,5% eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels, hierauf unter Quellung mit Feuchtigkeit pressgeschichtet. 10 µl-Anteile von Blutproben mit unterschiedlichen Hb-Konzentrationen, hergestellt in der gleichen Weise wie in Beispiel 1, wurden auf die Folie aufgetragen, während auf die Folie ein Nylontuch mit einer Feinheit von 37 µm gepreßt wurde.

Etwa 1 Minute nach der Auftragung der Blutproben wurde die optische Reflexionsdichte des ausgebreiteten Blutes unter Anwendung eines optischen Reflexionsdensitometers von der Seite des transparenten PET-Filmes gemessen. Wie aus Tabelle II ersichtlich, wurde die gute Korrelation mit den nach dem Standardverfahren erhaltenen Ergebnissen bestätigt.

Tabelle II

Claims

1. Material zur quantitativen Bestimmung der Hämoglobin- Konzentration durch optische Reflexionsdensitometrie, bestehend aus einem wasserundurchlässigen Träger, auf den nacheinander aufgebracht sind eine hydrophile Bindemittelschicht und eine poröse Ausbreitungsschicht, die an der Oberfläche und im Innern der Poren hydrophil und wasserunlöslich ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausbreitungsschicht aus einem porösen Material besteht, welches das Eindringen der das Hämoglobin enthaltenden wäßrigen Probe in einem begrenzten Volumen pro Flächeneinheit erlaubt und einen solchen mittleren Porendurchmesser, hat, daß das Hämoglobin an der Grenzfläche zwischen der porösen Ausbreitungsschicht und der hydrophilen Bindemittelschicht in Form einer gleichmäßigen ebenen Schicht zurückgehalten wird, während die wäßrige Komponente und die wasserlöslichen Inhaltsstoffe der Probe von der Bindemittelschicht absorbiert werden.

2. Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Ausbreitungsschicht eine Porosität von 20 bis 80% aufweist.

3. Material nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Ausbreitungsschicht aus einem nichtfaserförmigen porösen Material besteht.

4. Material nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-faserförmige poröse Material einen mittleren Porendurchmesser von 2,5 bis 500 µm hat.

5. Material nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-faserförmige Material eine poröse Membran ist.

6. Material nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Ausbreitungsschicht aus einem faserförmigen porösen Material besteht.

7. Material nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das faserförmige poröse Material besteht aus einem gewirkten oder gewebten Gewebe oder Papier- oder Glasfaserbahnen.

8. Material nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das faserförmige poröse Material einen Garntiter von 40 bis 100 aufweist.

9. Material nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Ausbreitungsschicht eine Dicke von nicht weniger als 10 µm aufweist.

10. Material nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Ausbreitungsschicht eine Dicke von nicht mehr als 3 mm aufweist.

11. Material nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Ausbreitungsschicht hydrophil gemacht worden ist durch Adsorption einer hydrophilen Verbindung, durch Hydrolyse mit einer Säure oder einem Alkali, durch Umsetzung mit einer hydrophilen Verbindung, durch Flammenbehandlung, durch Bestrahlen mit UV-Licht, durch elektrische Entladung, durch Vakuumabscheidung oder durch Besprühen.

12. Material nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Ausbreitungsschicht enthält ein oder mehr Agentien zur Stabilisierung der Farbtönung von Hämoglobin oder zur Modifizierung der Erythrocyten-Membran, ausgewählt aus der Gruppe pH-Puffer, Antikoagulationsmittel, antihämolytisches Mittel, Antioxidationsmittel, Oxidationsmittel, Farbstoff, Pigment, anorganisches Salz, Aldehyd, Isocyanat und Wasserstoffperoxid.

13. Material nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrophile Bindemittelschicht besteht aus Gelatine, Agarose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyacrylamid oder Polyacrylsäure.

14. Material nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrophile Bindemittelschicht mindestens einen Zusatz zur Stabilisierung der Farbtönung des Hämoglobins, zur Verhinderung des Eindringens, der Diffusion oder der Ausfällung von Hämoglobin oder zur Steuerung der Ausbreitung enthält.

15. Material nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Zusatz ausgewählt wird aus der Gruppe der nicht-ionischen, kationischen und anionischen oberflächenaktiven Agentien, der Weichmacher, der anorganischen Salze, der organischen Säuresalze, der pH-Puffer, der Pigmente, der Farbstoffe, der festen feinen Faserteilchen, der Oxidationsmittel, der Reduktionsmittel, der Säuren oder Alkalien.

16. Material nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindemittelschicht eine Dicke von mindestens 0,1 µm aufweist.

17. Material nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindemittelschicht eine Dicke von höchstens 1 mm aufweist.

18. Material nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der wasserundurchlässige Träger transparent ist.

19. Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Konzentration von Hämoglobin in einer wäßrigen Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß eine Hämoglobin enthaltende wäßrige Probe auf die poröse Ausbreitungsschicht eines Materials zur Bestimmung der Hämoglobinkonzentration durch optische Reflexionsdensitometrie nach einem der Ansprüche 1 bis 18 aufgebracht wird und die optische Reflexionsdichte des Hämoglobins an der Grenzfläche zwischen der porösen Ausbreitungsschicht und der hydrophilen Bindemittelschicht auf an sich bekannte Weise gemessen wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß ein Material mit transparentem Träger verwendet wird und daß die Bestimmung der Hämoglobinkonzentration von der Seite aus vorgenommen wird, die der Seite, auf die die wäßrige Probe aufgebracht worden ist, gegenüberliegt.