DE2532918C3 - Integrales analytisches Element für die Analyse von Flüssigkeiten - Google Patents
Integrales analytisches Element für die Analyse von FlüssigkeitenInfo
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- DE2532918C3 DE2532918C3 DE19752532918 DE2532918A DE2532918C3 DE 2532918 C3 DE2532918 C3 DE 2532918C3 DE 19752532918 DE19752532918 DE 19752532918 DE 2532918 A DE2532918 A DE 2532918A DE 2532918 C3 DE2532918 C3 DE 2532918C3
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
- G01N33/525—Multi-layer analytical elements
Description
Die Erfindung betrifft ein integrales analytisches Element für die Analyse von Flüssigkeiten bestehend
aus einem strahhmgsdurchlässigen Schichtträger, auf den aufgetragen sind:
(a) mindestens eine für die zu analysierende Substanz oder einen Vorläufer derselben permeable Reagensschicht mit einem Stoff A, der mit der zu
analysierenden Substanz bzw. dem Vorläufer derselben unter Bildung eines diffundier- und
erfaßbaren Stoffes B zu reagieren vermag oder die B3dang eines Stoffes B bewirkt, sowie mindestens
eine wehere Schicht, bestehend aus
(b) einer für den Stoff B permeablen Strahhmgs-Sperrschicht und/oder
(c) einer isotrop-porösen Verteilerschicht zum Verteilen (oder Ausbreiten) der zu analysierenden
Substanz oder des Vorläufers derselben über der vom Schichtträger abgewandten Seite der Reagensscmciit
Es ist allgemein bekannt zur chemischen Analyse von
Flüssigkeiten, wie beispielsweise Wasser, Nahrungsmitteln, z. R M3ch und biologischen Flüssigkeiten, analytische Elemente zu verwenden, die ein Reagens für die zu
analysierende Substanz enthalten, das bei Kontakt irät
der Flüssigkeit mit der zu analysierenden Substanz
unter Erzeugung einer farbigen Verbindung reagiert oder eine andere erfaßbare Veränderung auf Grund des
Vorhandenseins der zu analysierenden Substanz herbeiführt Derartige analytische Elemente weisen beispiels-
weise pH-Teststreifen auf und bestehen aus Papier oder einem anderen stark absoi bierenden Träger, das bzw.
der mit einem Stoff imprägniert wird, der zu einer chemischen Reaktion betähigt ist und eine farbige
Verbindung erzeugt oder eine Farbänderung herbeifuhrt Je nach der Auswahl der Reagenzien ist der
erzeugte Farbton oder die herbeigeführte Farbänderung im allgemeinen jedoch nur qualitativ oder im
günstigsten Falle semiquantitativ. Oftmals sind jedoch quantitative Analysen erforderlich. So sind in den
vergangenen Jahren große Anstrengungen unternommen worden, um analytische Elemente zu entwickeln,
die sich für die Durchführung diagnostischer chemischer Analysen eignen und mit denen biologische Flüssigkeiten, z. B. Körperflüssigkeiten, wie Blut, Blutserum, Urin
und dergleichen unter Erzielung quantitativer Ergebnisse schnei! und in einfacher Weise analysiert werden
können.
Die chemische Analyse von Lösungen, insbesondere die automatisierte Analyse von Lösungen hat in den
vergangenen Jahren, insbesondere in klinischen Laboratorien bereits Anwendung gefunden. Die bekannten
Analyseverfahren erfordern jedoch vergleichsweise komplizierte Analysiervorrichtungen. Überdies sind
Analysiergerate für die Analyse von biologischen Flüssigkeiten, wie sie beispielsweise aus den US-PS
27 97 149,30 36 893 und 35 26 480 bekannt sind, oftmals
außerordentlich kostspielig und ihre Bedienung erfordert ein ausgebildetes Personal.
Als eine Alternative für die Analyse von Lösungen J5
sind verschiedene mehrschichtige integrale analytische Elemente für die trockene chemische Analyse bekanntgeworden. Der Ausdruck »integral« bezeichnet dabei
analytische Elemente, die zwei oder mehr diskrete
übereinander angeordnete Schichten aufweisen, die nicht ohne Zerstörung des Elements voneinander
getrennt werden können. Obgleich praktisch trockene Analysenmethoden beträchtliche Vorteile bezüglich
Aufbewahrung des Analysenmaterials, Handhabung und dergleichen im Vergleich zu den nassen Analysenverfahren bieten, hat sich doch gezeigt, daß sich
derartige trockene Verfahren primär nur für die Durchführung von qualitativen und semiquantitativen
Analysen eignen.
Integrale analytisch« Elemente für die Analyse von
Flüssigkeiten sind beispielsweise aus der US-PS 30 92 465 bekannt Kennzeichnend für derartige analytische Elemente sind absorbierende fasrige Träger, die
mit einem oder mehreren Reagenzien imprägniert sind, in typischer Weine mit einem Farbbildner, wobei über
dem Träger eine semipermeable Membran angeordnet ist Bei Kontakt mit der zu analysierenden Flüssigkeit
passiert die zu analysierende Substanz die Membran und gelangt in den fasrigen Träger, wobei die Substanz
zu einer Färbung des Trägers entsprechend der Konzentration der Substanz führt Die Membran
verhindert den Durchtritt von störenden Komponenten und absorbiert derartige störende Komponenten,
beispielsweise rote Blutkörperchen, welche die genaue
Erkennung des erzeugten Farbtons stören würden.
Analytische Elemente auf Basis von absorbierenden
Filterpapieren und anderen fasrigen Medien zur Aufnahme und Verteilung von zu analysierenden
Flüssigkeiten haben sich, insbesondere auf dem Gebiet der klinischen Analyse als nicht besonders geeignet
erwiesen, und zwar vermutlich insbesondere desf?alb
nicht, weil sich mit den bekannten analytischen Elementen keine quantitativen Meßergebnisse großer
Genauigkeit erhalten lassen. Aus der Literatur ist bekannt, daß für diagnostische Zwecke verwendbare
Elemente, die feuchtigkeitsabsorbierend sind, beispielsweise fasrige Filterpapiere, keine gleichmäßigen Testergebnisse liefern. Aus der US-PS 30 50 373 ist es ferner
beispielsweise bekannt, daß Ausfällungen in den Imprägnierlösungen auftreten können, wodurch eine
gleichförmige Verteilung des Reagenzes in dem Trägermaterial verhindert wird. Des weiteren hat sich
gezeigt, daß analytische Elemente aus fasrigen, feuchtigkeitsabsorbierenden Stoffen zu nicht gleichförmigen
Testergebnissen auf Grund eines Effektes neigen, der in der angelsächsischen Literatur als »banding« bekanntgeworden ist Der Ausdruck »banding« bedeutet, daß
verschiedene Abschnitte eines analytischen Elemente verschiedene Testergebnisse ze^n, und zwar auf
Grund einer ungleichmäßigen Wanderang der Komponenten der zu analysierenden Flüssigkeit oder chemischen Reagenzien innerhalb des Elements. Aus den
US-PS 30 61523 und 3104 209 ist es bekannt, daß
Gelatine und gelatineartige Stoffe geeignete Bestandteile von Imprägnierlösungen sein können, und zwar
ganz offensichtlich deshalb, weil sie die hohe Wanderungsgeschwindigkeit einzelner Substanzen zu verhindern vermögen und infolgedessen ia einer Verbesserung der Gleichförmigkeit der Testergebnisse beitragen. Es hat sich jedoch gezeigt, daß Gelatine und
gelatineartige Stoffe in den fasrigen, Reagenzien enthaltenden analytischen Elementen zu einer Verminderung der Aufnahme der zu analysierenden Flüssigkeiten führen, im Vergleich zu den stark absorbierenden,
gelatinefreien Materialien. Die verminderte Absorption kann dabei dazu führen, daß Flüssigkeit auf der
Oberfläche des Elements zurückbleibt und daß das Element gewaschen werden muß, um überschüssige
Flüssigkeiten zu entfernen, bevor die eigentliche analytische Bestimmung durchgeführt werden kann.
Dies hat dazu geführt, daß die Menge an Gelatine, mit der eine feuchtigkeitsabsorbierende Schicht imprägniert werden kann, begrenzt ist Derartige Eigenschaften sind auch kennzeichnend für analytische Elemente,
die Schichten aufweisen, die ganz aus Gelatine oder ähnlichen Stoffen aufgebaut find, wie sie beispielsweise
aus der US-PS 35 26 480 bekannt sind.
Integrale analytische Elemente für automatisierte
analytische Verfahren sind beispielsweise aus den US-PS 33 68 872 und 35 26 480 bekannt. In den
Patentschriften wird dabei auf Maßnahmen zur Vermeidung chromatographischer Effekte verwiesen,
und zwar durch Immobilisierung von Reagenzien oder durch Zusatz eines Mittels zur Verminderung der
Tendenz einer auf das Element aufgebrachten Probe einen Wascheffekt auf das Reagens im Element
auszuüben, z. 3. durch Verwendung einfacher poröser Schichten über einem absorbierenden, ein Reagens
enthaltenden Material, z.B. fasrigem Filterpapier. In
den Patentschriften findet sich jedoch kein Hinweis auf ein Element, das nicht nur eine flüssige Probe aufnimmt,
sondern auch zu einer gleichförmigen Verteilung einer Flüssigkeitsprobe über der gesamten Reagensschicht-Oberfläche führt, die mit der flüssigen Probe in Kontakt
gebracht wird Eine derartige gleichförmige Verteilung der Probe ist jedoch für eine automatisierte Auswertung
der Testergebnisse, gleichgültig, ob es sich dabei um densitometrische, kolorimetrische, fluorimetrische oder
andere Verfahrensweisen handelt extrem wichtig. Dies gilt auch dann, wenn grobe Ungleichförmigkeiten, wie
sie beispielsweise durch chromatographische Effekte ■> herbeigeführt werden, fehlen.
Ein Verfahren zur Herbeiführung einer etwas gleichförmigeren Konzentration einer zu analysierenden Substanz auf den Reagensflächen eines Elements
für die trockene Analyse ist aus der US-PS 33 68 872 in
bekannt Die aus dieser Patentschrift bekannten analytischen Elemente weisen eine Art »Barriere« auf,
um die Einwirkung einer Flüssigkeitsprobe auf einen vorbestimmten Bereich der Oberfläche des Elements zu
beschränken. Dies führt jedoch dazu, daß normalerwei- ι > se auf dem Element nach Aufbringung der Probe
überschüssige Flüssigkeit vorhanden ist was sich sehr nachteilig auswirken kann.
Schichten integraler analytischer Elemente ergibt sich beispielsweise aus den US-PS 27 61813, 26 72 431,
26 72 432, 26 77 647, 29 23 669, 38 14 670 und 38 43 452.
Jedoch finden sich derartige Hinweise im Zusammenhang mit Elementen für die Bestimmung des Vorhandenseins von Mikroorganismen, wobei Elemente für
derartige Zwecke in typischer Weise mindestens eine Schicht mit einer fasrigen Matrix aufweisen und keine
diskreten Schichten erfordern, wobei die Berührungsfläche der Schichten aus einer Mischung der benachbarten
Schichten besteht d. h, daß sich die Schichten an der Berührungsfläche vermischen.
Bis vor kurzem gab es keine Hinweise darauf, wie sich in einem analytischen Element nach Aufbringen einer zu
analysierenden Probe in der Schicht des Elements die zu analysierende Substanz, Substanzreaktionsprodukte
und andere Produkte so gleichförmig verteilen lassen, daß sie in einer benachbarten Schicht für analytische
Reaktionen zur Verfügung stehen. Auf Grund der strukturellen und chemischen Charakteristika von
feuchtigkeitsabsorbierenden und anderen fasrigen Materialien, die zur Herstellung der meisten bekannten
analytischen Elemente verwendet werden, z. B. zur Herstellung von absorbierenden Cellulose-Filterpapieren, Glasfaserpapieren und dergleichen, kann die
Herbeiführung gleichförmiger Konzentrationsverhältnisse in den Elementen, d. h. die gleichförmige
Verteilung der zu analysierenden Substanzen behindert werden. Auch kann die Auswahl der fasrigen Materialien genaue Messungen verhindern, und zwar auf Grund
großer Ungleichförmigkeiten in den Eigenschaften der fasrigen Materialien, z. B. der Struktur und der Textur.
So ist es beispielsweise bekannt daß bei der Herstellung von Papieren die zur Herstellung der Papiere
verwendeten Fasern oftmals derart bearbeitet werden, daß kleinere Fasern entstehen, sogenannte »Tendrils«,
welche die Festigkeit des hergestellten Papieres erhöhen. Der Ausdruck »f asrig«, der hier im Zusammenhang mit der Beschreibung von Materialien wie Papier
und dergleichen verwendet wird, bezieht sich auf Materialien, die unter Verwendung vorgebildeter
Fasern oder Faserstränge hergestellt werden, die in dem Endprodukt vorliegen. Beispiele für Fasern, die zur
Herstellung derartiger fasriger Materialien verwendet werden können, werden näher beispielsweise in den
US-PS 38 67 258 beschrieben.
Ein Nachtetl von iniegraien analytischen Elementen
fasriger Struktur besteht somit in der Ungenauigkeit mit
der die Farbanzeige oder Farbveränderung oder ein
anderes Testergebnis erfaßbar ist Versuche, mit derartigen integralen analytischen Elementen zu verbesserten Ergebnissen zu gelangen, sind fehlgeschlagen.
Als Beispiel sei die US-PS 37 23 064 genannt, aus der ein analytisches Element bekannt ist, das Bereiche verschiedener Permeabilität für eine zu analysierende Substanz
oder ein Reaktionsprodukt einer zu analysierenden Substanz aufweist, wobei in den einzelnen Bereichen
Farbanzeigen oder Farbveränderungen nur bei bestimmten verschiedenen Mindestkonzentrationen auftreten. Obgleich der Wunsch nach einem Element mit
kontinuierlichem Ansprechvermögen offensichtlich ist, kann ein analytisches Element des aus der US-PS
37 23 064 bekannten Typs lediglich zu einem ungefähren analytischen Ergebnis führen, wobei das erzielbare
Ergebnis umso ungenauer wird, je größer der Unterschied zwischen den verschiedenen Permeabilitätsbereichen ist Wird die Differenz in der Permeabili-
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um den Abstand zwischen den einzelnen Schwellwerten im Interesse einer erhöhten Ansprechgenauigkeit zu
verkleinern, so steigt die Komplexität des herzustellenden Elements stark an. In der US-PS 37 23 064 Findet
sich kein Hinweis darauf, wie sich die Gleichförmigkeit und Genauigkeit von Testergebnissen verbessern läßt
und im optimalen Falle zeigen Elemente des aus der US-PS 37 23 064 bekannten Typs ein diskontinuierliches
Ansprt ihverhalten, das in jedem Bereich der Permeabilität auf Grund der Ungleichförmigkeiten, die mit der
Verwendung von Filterpapieren und anderen fasrigen Materialien verbunden sind, ungleichförmig ist
Aus der US-PS 37 91933 ist des weiteren ein
Verfahren für die Untersuchung von Enzymsubstraten und Metaboliten, z.B. in Körperflüssigkeiten bekannt
Bei diesem Verfahren wird jedoch kein integrales analytisches Element verwendet Vielmehr werden
mehrere Teilelemente mittels einer Klammer für die Aufnahme einer Testprobe, zum Abfiltrieren oder zur
anderweitigen Entfernung größerer Probenbestandteile, z. B. zum Entfernen von Proteinen und zur
Herbeiführung einer Reaktion unter Erzeugung eines erfaßbaren Meßergebnisses, z. B. zur Erzeugung eines
Farbtones, zusammengefügt Obgleich in der US-PS 37 91933 angegeben ist daß Glasfaserpapier dazu
beitragen kann, eine Reaktionsmischung über einem plastischen Betrachterfenster zu verteilen, unterstützt
ein solches Material doch ganz offensichtlich hauptsächlich die äußere Diffusion der Flüssigkeitsproben in die
Glasfaserschicht unter Vergrößerung des Bereiches des Elements, der ein Testergebnis zeigt so daß das
Ergebnis leichter sichtbar wird. In der Patem.chrift
findet sich kein Hinweis darauf, wie sich im Diffusionsbereich eine gleichmäßige Konzentration der zu
analysierenden Substanz erzeugen läßt was für die Erzielung gleichmäßiger analytischer Ergebnisse außerordentlich wichtig ist
Aus der DE-OS 23 32 760 ist schließlich ein mehrschichtiges analytisches Element für die quantitative spektrophotometrische Analyse einer Flüssigkeit mit
den eingangs beschriebenen Merkmalen bekannt
Beim Auftragen einer zu analysierenden Flüssigkeitsprobe auf ein solches Element erfolgt eine gleichförmige
Verteilung oder Ausbreitung der zu analysierenden Substanz, anderer Probenbestandteile oder eines
Reaktionsproduktes der zu analysierenden Substanz, wobei in Gegenwart der zu analysierenden Substanz ein
analytisches Ergebnis erzielt wird, das auf Grund seiner
Gleichmäßigkeit in automatisch arbeitenden Vorrichtungen quantitativ erfaßt werden kann, beispielsweise
auf spektrophotometrischem oder fluorimetrischem Wege. Das aus der DE-OS 23 32 760 bekannte Element
weist somit Ausbreit- oder Verteiler- sowie Reagens- > schichten auf, die eine reaktionsfähige oder in anderer
Weise reaktive Verbindung erhalten, die auf Grund ihrer Aktivität im Element eine radiometrisch erfaßbare
Veränderung herbeiführt, beispielsweise eine Farbveränderung.
Eine Farberzeugung oder die Herbeiführung eines anderen analytischen Ergebnisses erfordert jedoch
oftmals eine Reihe von Reaktionen, die schwierig zu steuern sind und welche chemischen und/oder anderen
Störungen unterliegen. So können beispielsweise die zu ι ">
analysierende Flüssigkeit oder Nebenprodukte der analytischen Bestimmung innerhalb des Elements
Bestandteile liefern, welche das Testergebnis beeinflussen.
Aufgäbe der Erfindung wäf es dciiiiüiuige ein .«>
integrales analytisches Element für die trockene Analyse von Flüssigkeiten anzugeben, in dem die Stoffe
oder Verbindungen, die das Testergebnis charakterisieren, erfaßbar oder erkennbar sind, ohne daß dabei
Störungen durch solche Bestandteile hervorgerufen r> werden, welche zu unerwünschten Farbveränderungen
oder Farbbeeinflussungen, einer Fluoreszenz und dergleichen führen. Insbesondere sollten die aus der
DE-OS 23 32 760 bekannten analytischen Elemente noch weiter verbessert werden. jn
Gegenstand der Erfindung ist ein integrales analytische - Element für die Analyse von Flüssigkeiten des
eingangs beschriebenen Typs, das dadurch gekennzeichnet ist, daß zwischen Reagensschicht und Schichtträger
eine für den in der Reagensschicht gebildeten η diffundier- und erfaßbaren Stoff B permeable Registrierschicht für die Erfassung des Stoffes B vorhanden
und die Strahlungs-Sperrschicht, sofern vorhanden, zwischen der Reagensschicht und der Registrierschicht
angeordnet ist. au
Unter einem »integralen« analytischen Element ist dabei ein Element mit mindestens drei auf einem
Schichtträger angeordneten Schichten zu verstehen. Ein erfindungsgemäßes Element erfüllt eine Vielzahl von
Funktionen. Zu seiner Verwendung sind keine Experten -r, erforderlich. Es lassen sich quantitative analytische
Ergebnisse ohne einen besonderen Tüpfelprozeß und ohne andere besondere Maßnahmen, beispielsweise
eine Probenbeschränkung, ein Waschen des Elements oder eine Entfernung von überschüssiger Prüfflüssigkeit ,n
erzielen. Des weiteren sind die mit einem erfindungsgemäßen Element erzielbaren Testergebnisse reproduzierbar und frei von Abweichungen, so daß sich die
Ergebnisse auf automatischem Wege erfassen lassen, beispielsweise mittels elektromagnetischer Strahlung.
Ein erfindungsgemäßes analytisches Element eignet sich in besonders vorteilhafter Weise für die diagnostische Analyse von biologischen Flüssigkeiten, ζ. Β. Blut
Blutserum und Urin.
Die Reagensschicht ist dabei mindestens für die zu eo
analysierende Substanz oder eine Vorläuferverbindung derselben permeablen und weist einen Stoff A auf, der
mit der zu analysierenden Substanz oder dem Vorläufer derselben unter Bildung eines diffundier- und erfaßbaren Stoffes B zu reagieren vermag oder die Bildung b5
eines Stoffes B bewirkt Der Stoff B kann dabei beispielsweise aus einem Farbstoff bestehen, der
innerhalb des Elements diffundierbar ist
Die Registrierschicht ist für den zu bestimmenden
Stoff permeabel und soll das Erfassen des zu bestimmenden Stoffes ermöglichen, z. B. auf radiometrischem Wege. Die Registrierschicht enthält keinen
chemisch reaktionsfähigen Stoff, der die Erkennung oder Erfassung des Stoffes B behindern würde.
Der strahlungsdurchlässige Schichtträger ist für elektromagnetische Strahlung durchlässig, die zur
Erfassung eines analytischen Ergebnisses im Element verwendet wird. In vorteilhafter Weise weist der
Schichtträger eine Durchlässigkeit für elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge oder eines Wellenlängenbereiches von etwa 200 nm bis 900 nm auf sowie für
erfaßbare Strahlung, die auf radioaktivem Wege erzeugt wird. In vorteilhafter Weise ist der strahlungsdurchlässige Schichtträger transparent.
Die Strahlungs-Sperrschicht, sofern vorhanden, ist
eine Schicht, die ein oder mehrere Trübungsmittel enthält und die Aufgabe hat, den Eintritt elektromagnetischer Strahlung in die Schicht uder durch die Schicht
zu verhindern. ?.. B. von Strahlung einer solchen Wellenlänge oder eines solchen Wellenlängenbereiches,
die bzw. der für die Anregung und/oder einer Substanz innerhalb der Registrierschicht verwendet wird.
Die isotrop-poröse Verteilerschicht, die sich, sofern
vorhanden, in Fließkontakt mit den anderen Schichten des Elements befindet, beispielsweise der Reagensschicht und der Registrierschicht, hat die Aufgabe, innerhalb der Schicht eine oder mehrere Substanzen
einschließlich der zu analysierenden Substanz oder einer Vorläuferverbindung derselben einer Flüssigkeitsprobe, die auf das Element aufgebracht wird, zu
verteilen oder zu dosieren, so daß eine gleichförmige Konzentration der Substanzen auf der Oberfläche der
Verteilerschicht erzeugt wird, die der Reagensschicht gegenüberliegt
Die isotrop-poröse Verteilerschicht ist eine Schicht, die porös in jeder Richtung ist Der Grad der Porösität
kann dabei verschieden sein, beispielsweise bezüglich der Porengröße und des Prozentsai2es des Porenvolumens. Der Ausdruck »isetrop-porös« ist dabei nicht mit
den Ausdrücken isoporös und ionotrop zu verwechseln, die oftmals im Zusammenhang mit Filtermembranen
zur Kennzeichnung von solchen Membranen, die Poren aufweisen, die sich zwischen den Membranoberflächen
befinden, gebraucht werden. Des weiteren ist eine isotrope Porösität nicht zu verwechseln mit dem
Ausdruck isotrop, der das Gegenteil des Ausdruckes anisotrop ist und der zur Kennzeichnung von
Filtermembranen verwendet wird, die eine dünne »Haut« auf mindestens einer Oberfläche der Membran
aufweisen.
Die Reagensschicht weist vorzugsweise eine praktisch gleichförmige Permeabilität gegenüber mindestens einer Substanz, die innerhalb der Verteilerschicht
verteilt wird und gegenüber dem diffundier- und erfaßbaren Stoff B, der in der Reagensschicht erzeugt
wird, auf. Die Registrierschicht weist vorzugsweise eine praktisch gleichförmige Permeabilität gegenüber dem
erfaßbaren Stoff B auf.
Eine gleichförmige Permeabilität einer Schicht liegt dann vor, wenn eine homogene Flüssigkeit gleichförmig
auf eine Oberfläche der Schicht aufgebracht wird und wenn gleiche Messungen der Konzentration der
Flüssigkeit in der Schicht jedoch in verschiedenen Bereichen einer Oberfläche der Schicht zu praktisch den
gleichen Ergebnissen führen. Auf Grund einer gleichförmigen Permeabilität können unerwünschte Konzentra-
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tionsgradienten vermieden werden, beispielsweise innerhalb einer Reagensschicht.
Eine gleichförmige Permeabilität ist bekanntlich nicht charakteristisch für fasrige Materialien, beispielsweise
Filterpapier. Es ist anzunehmen, daß Faktoren, wie ■·> beispielsweise unterschiedliche Verflechtungsgrade innerhalb des fasrigen Materials, Unterschiede in der
Fasergröße, im Faserabstand und dergleichen, die Ausbildung von Veränderungen in den Flüssigkeitskonzentrationen in dem faserigen Material und hiermit in in
Kontakt stehenden Materialien beeinflussen können. Dies führt naturgemäß zu unerwünschten Effekten bei
Testen, die mit verschiedenen Konzentrationsbereichen durchgeführt werden. Dies bedeutet, daß eine gleichförmige Permebialität von Reagensschicht, Registrier- i>
schicht und anderen Schichten innerhalb eines analytischen Elements für die Erleichterung der Erfassung
analytischer Ergebnisse wichtig ist Die Wirksamkeit der Et fassung analytischer Ergebnisse kann des
weiteren beispielsweise durch irreguläre Konzentrations- und andere Diskontinuitäten des Aufzeichnungsmaterials beeinträchtigt werden.
Die einzelnen Schichten eines erfindungsgemäßen integralen analytischen Elements sollen sich in einem
»Fließkontakt« miteinander befinden. Dies bedeutet, r> daß eine Flüssigkeit oder ein Gas ein solches Element
passieren kann. Ein integrales analytisches Element nach der Erfindung ermöglicht es somit, daß die
Komponenten einer Flüssigkeit zwischen den im Fließkontakt miteinander stehenden Schichten befor- jo
dert werden können. Im Falle der Analyse von Stickstoff enthaltenden Verbindungen beispielsweise, können
Ammoniak oder andere Stickstoff enthaltende Gase durch die Schichten befördert werden. Obgleich die sich
im Fließkontakt miteinander befindlichen erwähnten r. Schichten einander benachbart sind, können sie
gegebenenfalls durch Zwischenschichten voneinander getrennt sein. Auch diese Schichten befinden sich dann
mit den anderen Schichten in Fließkontakt und behindern den Durchtritt von Flüssigkeiten oder Gasen durch
die einzelnen Schichten nicht.
Unter »diffundierbar« sind hier Substanzen oder Verbindungen zu verstehen, die in dem analytischen
Element zu diffundieren vermögen, wenn die Substanz bzw. Verbindung im Element in einer Flüssigkeit -r,
vorliegt, z. B. dem Lösungsmittel- oder Dispersionsmedium der Flüssigkeitsprobe, die auf das Element
aufgebracht worden ist »Permeabel« bedeutet, daß eine Schicht wirksam von einer Substanz oder einem Stoff
durchsetzt werden kann, die bzw. der gelöst oder -,0 dispergiert in einer Flüssigkeitsprobe vorliegt
Wird einem erfindungsgemäßen analytischen Element eine Flüssigkeitsprobe zugeführt, so läuft, falls die
zu analysierende Substanz zugegen ist, innerhalb der Reagensschicht eine chemische Reaktion ab, und zwar
unter Erzeugung eines diffundierbaren, vorzugsweise radiometrisch erfaßbaren Stoffes B, der aus der
Reagensschicht in die Registrierschicht diffundiert, in
der er erfaßt werden kann. Die Registrierschicht ist vorzugsweise strahlungsdurchlässig. In vorteilhafter
Weise ist zwischen Reagensschicht und Registrierschicht eine Strahhmgs-Sperrschicht angeordnet Auch
kann in vorteilhafter Weise eine Verteilerschicht vorhanden sein, in welchem Falle eine auf das Element
aufgebrachte Probe durch die Verteilerschicht gelangt, bevor sie auf die Reagensschicht auftrifft, wobei die zu
analysierende Substanz oder der Vorläufer derseiben in
dieser Schicht verteilt wird, unter Erzeugung einer
gleichförmigen Konzentration der Substanz oder deren
Vorläufer an der Oberfläche der Verteilerschicht, die der Reagenssci'iicht gegenüberliegt Es hat sich gezeigt,
daß eine solche gleichförmige Konzentration über einen breiten Bereich von Probevolumina, die auf das Element
aufgebracht werden, erzielt werden kann. Auf Grund des Strömungs- oder Flüssigkeitskontaktes zwischen
der Verteilerschicht einerseits und der Reagensschicht andererseits sowie auf Grund der vorteilhaften gleichförmigen Permeabilität der Reagensschicht für Substanzen, die in der Verteilerschicht verteilt werden oder der
gleichförmigen Permeabilität der Reagensschicht gegenüber Produkten, die auf Grund einer Reaktion
derartiger Substanzen erzeugt worden sind, erfolgt eine gleichförmige Zufuhr oder Dosierung von Bestandteilen aus der Verteilerschicht in die Reagensschicht,
welche letztere durchdringen, ohne daß dabei Konzenirationsveränderungen der Substanzen auftreten. Bei
Vorhandensein einer aktiven, z. B. chemisch reaktiven Substanz in gleichförmiger Konzentration wird im
Element eine" gleichförmige, quantitativ erfaßbare Veränderung hervorgerufen, die in der Erzeugung oder
einer Zerstörung eines Farbtones oder Fluoreszenz bestehen und quantitativ durch radiometrische Verfahren erfaßt werden kann, gegebenenfalls durch automatische arbeitende radiometrische Abtastvorrichtungen,
z.B. photometrische oder fluorimetrische Vorrichtungen.
In der Zeichnung sind in den F i g. 1 bis 4 Beispiele
für vorteilhafte integrale analytische Elemente nach der Erfindung schematisch vergrößert im Schnitt dargestellt
Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung eines integralen analytischen Elements nach der Erfindung
besteht das Element aus einem strahlungsdurchlässigen Schichtträger, einer Reagensschicht, einer Strahlungs-Sperrschicht und einer strahlungsdurchlässigen Registrierschicht Gegebenenfalls kann die Registrierschicht
ein Beizmittel für den erfaßbaren Stoff B enthalten. Die Reagensschicht weist des weiteren vorzugsweise eine
gleichförmige oder praktisch gleichförmige Permeabilität gegenüber der zu analysierenden Substanz bzw.
deren Vorläufer und gegenüber dem diffundier- und erfaßbaren Stoff B auf. Die Registrierschicht ist von
einer solchen Permeabilität bezüglich des erfaßbaren Stoffes. Die Strahlungs-Sperrschicht weist vorzugsweise eine ebenfalls gleichförmige Permeabilität gegenüber
dem erfaßbaren Stoff B auf. In vorteilhafter Weise kann die Strahlungs-Sperrschicht ein Trübungsmittel enthalten, z. B. ein Pigment ein Polymer in geeigneter Form,
z. B. ein sog. »Blushed-Polymer« oder beides.
Gemäß einer weiteren besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung besteht ein integrales
analytisches Element nach der Erfindung aus einem Schichtträger, einer Reagensschicht einer Registrierschicht, einer Verteilerschicht und gegebenenfalls einer
Strahlungs-Sperrschicht wobei die Verteilerschicht derart im Element angeordnet ist daß sich die
Reagensschicht zwischen Registrierschicht und der Verteüerschicht befindet
Die Reagensschichten der erfindungsgemäßen Elemente sind in vorteilhafter Weise gleichförmig permeabel und gegebenenfalls in vorteilhafter Weise porös
gegenüber Substanzen, die innerhalb der Verteilerschicht verteilt werden und gegenüber Reaktionsprodukten hiervon oder Produkten, die das Ergebnis einer
Reaktion solcher Substanzen sind. Der Ausdruck »Permeabilität« schließt hier die Permeabilität ein, die
sich aus einer Porosität, der Fähigkeit zu quellen oder
anderen Charakteristika ergibt
Die Reagensschichten können eine Matrix oder einen Träger aufweisen, in der bzw. in dem der
reaktionsfähige Stoff gelöst oder dispergiert vorliegt. Zur Herstellung der Schichten können die verschiedensten Träger- oder Bindemittel verwendet werden. Diese
können beispielsweise aus hydrophilen Stoffen bestehen, und zwar natürlich vorkommenden Stoffen, z. B.
Gelatine, Gelatinederivaten, hydrophilen Cellulosederivaten, Polysacchariden, z. B. Dextran, Gummiarabicum
und Agarose wie auch aus synthetischen Stoffen, z. B. wasserlöslichen Polyvinylverbindungen, z. B. Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon und Acrylamidpolymeren. Auch können in vorteilhafter Weise organophile
Träger verwendet werden, z. B. Celluloseester, wobei
der im Einzelfalle verwendete Träger von dem Verwendungszweck des im Einzelfalle herzustellenden
Elements abhängt Um die Permeabilität der Reagensschicht zu fördern, ist es oftmals vorteilhaft, falls die
Reagensschicht nicht porös ist, einen Träger oder eine Matrix zu vf. "wenden, der bzw. die in dem Lösungsmittel
oder Dispersionsmittel der zu analysierenden Flüssigkeit quellbar ist Außerdem kann es erforderlich sein,
das Träger- oder Bindemittel derart auszuwählen, daß eine Verträglichkeit mit den benachbarten Schichten
gewährleistet ist, z. B. beim Auftragen der Schichten,
während der Herstellung des Materials und dergleichen. Ist beispielsweise die Ausbildung diskreter Schichten
erwünscht und ist beabsichtigt wäßrige Flüssigkeiten zu analysieren, so kann es vorteilhaft sein, ein wasserlösliches oder im wesentlichen wasserlösliches Bindemittel
für die Reagensschicht auszuwählen und ein organolösliches oder organodispergierbares oder im wesentlichen
organolösliches oder im wesentlichen organodispergierbares Bindemittel für die benachbarte Schicht,
beispielsweise die Verteilerschicht Auf diese Weise kann eine wechselseitige Lösungsmitteleinwirkung auf
ein Minimum vermindert werden und eine klar abgegrenzte Schichtenstruktur erzeugt werden.
Die Auswahl des Stoffes A richtet sich nach der zu
analysierenden Substanz. Gegebenenfalls kann dieser Stoff A auch mit einem Vorläufer der zu analysierenden
Substanz reagieren, z. B. im Falle von Elementen, die für
die Bestimmung von Cholesterin bestimmt sind, das im Serum in veresterter Form vorliegt und im Falle von
Triglyzeriden, die oftmals auf Basis der Glyzerinkomponente der Triglyzeride analysiert werden. Der Stoff A
kann ein chemisch reaktionsfähiger Stoff sein, kann katalytisch aktiv sein, beispielsweise im Falle der
Bildung eines Enzym-Substratkomplexes oder kann zu einer anderen Form einer chemischen oder physikalischen Reaktion oder Aktion befähigt sein unter
Erzeugung eines diffundierbaren Stoffes, der radiometrisch erfaßbar ist
Die Verteilung des Stoffes A kann durch Lösen oder Dispergieren des Stoffes in dem Träger erreicht werden.
Obgleich eine gleichförmige Verteilung des Stoffes A vorteilhaft sein kann, ist sie doch nicht unbedingt
erforderlich, wenn es sich bei dem Stoff A beispielsweise um ein Enzym handelt Reagenzien oder andere
reaktionsfähige oder aktive Stoffe und Verbindungen,
die in der zu analysierenden Flüssigkeit löslich sind, können in vorteilhafter Weise in der Reagensschicht
immobilisiert werden, und zwar insbesondere dann, wenn die Reagensschicht porös ist
Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung enthält die Reagensschicht als Stoff A ein Enzym,
z. B. eine Oxidase, z. B. Glucoseoxidase oder Cholest»-
rinoxidase, wenn das Element für die Analyse einer Substanz bestimmt ist, die ein Substrat für ein solches
Enzym darstellt Beispielsweise kann in der Reagensschicht ein oxidatives Enzym gemeinsam mit Peroxidase
oder einem peroxidasen Stoff und einer Verbindung oder einer Mischung von Verbindungen vorliegen, der
bzw. die bei Oxidation in Gegenwart der Peroxidase (oder einer anderen Substanz mit peroxidativer
Aktivität) und dem Wasserstoffperoxid, das be:
Reaktion einer Oxidase und ihrem Substrat erzeugt wird, einen Farbstoff liefert oder einen anderen
erfaßbaren Stoff. Der erfaßbare Stoff soll diffundierbar sein, so daß er in die permeable Registrierschicht
diffundieren kann. Eine solche Diffusionsfähigkeit kann im Falle von erfaßbaren Stoffen, die nicht von Natur aus
diffundierbar sind, durch bekannte Maßnahmen erreicht
werden, beispielsweise durch Zuführung chemischer Reste, welche die gewünschte Löslichkeit bewirken. In
den Fällen, in denen wäßrige Flüssigkeiten zu analysieren sind, können beispielsweise löslich machende Reste, wie Hydroxyl-, Carboxyl- und Sulfonsäurereste zum Lösiichmachen herangezogen werden.
Der erfaßbare Stoff B kann beispielsweise eine oxidierbare Verbindung sein, die einen Farbstoff zu
bilden vermag. So kann das analytische Element beispielsweise einen Stoff B liefern, der in oxidiertem
Zustand mit sich selbst oder mit seiner reduzierten Form unter Bildung eines Farbstoffes kuppeln kann. Zu
derartigen zu einer »Autokupplungsreaktion« befähigten Stoffen gehören eine Vielzahl von hydroxylierten
Verbindungen, beispielsweise o-Aminopheno!e, 4-AIkoxynaphthole, 4-Amino-5-pyrazo!one, Polyhydroxyverbindungen wie Kresole, Pyrogallol, Guajacol, Orcinol,
Brenzkatechin, Phloroglucinol, ρ,ρ-Dihydroxydiphenyl, Gallussäure, Dihydroxybenzoesäuren, z. B. 23-Dihydroxybenzoesäureti und Salicylsäure.
Verbindungen dieses Typs sind bekannt und werden beispielsweise in dem Buch von Mees und James, »The
Theory of the Photographic Process«, 1966. insbesondere Kapitel 17, näher beschrieben.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung kann der erfaßbare Stoff B durch
Oxidation eines Leucofarbstoffes zu dem entsnrechenden Farbstoff erzeugt werden. Typische Leucoiarbstoffe sind beispielsweise Leucomalachitgrün und Leucophenolphthalein. Weitere Leucofarbstoffe, die verwendbar sind, sind beispielsweise die als oxichromogene
Verbindungen bezeichneten Leucofarbstoffe des aus der US-PS 38 80 658 bekannten Typs. Aus dieser
Patentschrift geht auch hervor, daß derartige Verbindungen mit bestimmten Substituenten diffundierbar sein
können. In besonders vorteilhafter Weise können die nicht stabilisierten oxichromogenen Verbindungen des
aus der US-PS 38 80 658 bekannten Typs verwendet werden.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird der analytisch erfaßbare Stoff B
durch einen Farbstoff liefernde Verbindungen, z. B. eine
Kupplerverbindung und eine oxidierbare Verbindung, die zu einer oxidativen Kondensation mit einer
Kupplerverbindung befähigt ist z. B. mit einem Kuppler mit phenolischen Resten oder aktivierten Methylenresten, erzeugt Beispiele für derartige oxidierbare
Verbindungen sind Benzidin und seine Homologen, p-Phenyldiamine, p-Aminophenole und 4-Aminoantipyrin. Derartige Kuppler und autokuppelnde Verbindungen sind aus der Literatur bekannt beispielsweise aus
dem bereits zitierten Buch von Mees und James und aus dem Buch von Kosar »Light-Sensitive Systems«, 1965,
Seiten 215 bis 249.
In vorteilhafter Weise verwendbare, Farbstoffe erzeugende Verbindungen sind 4-Methoxy-l-naphthol,
eine selbstkuppelnde Substanz sowie ferner die Kombination von 4-Aminoantipyrin (HCl) als oxidierbare Verbindung und 1,7-Dihydroxynaphthaün als Kuppler.
Zur Erleichterung der Erfassung oder Bestimmung einer jeden Änderung, die in einem der erfindungsgemäßen Elemente hervorgerufen wird, z. B. der Erfassung
einer Farbveränderung, einer Veränderung der optischen Dichte oder der Fluoreszenz, weisen die Elemente
erfindungsgemäß eine Registrierschicht auf, die der Aufnahme eines jeden Reaktionsproduktes oder anderen Stoffes dient, das in der Reaktionsschicht erzeugt
wurde. Gegebenenfalls kann die Registrierschicht von der oder den Reagensschichten durch eine Strahlungs-Sperrschicht getrennt sein, z.B. eine reflektierende
und/oder opake Schicht, um die Erfassung oder Ermittlung der analytischen Ergebnisse nach den
verschiedensten radiometrischen Methoden zu erleichtern. Die Registrierschicht, die in vorteilhafter Weise in
den zu analysierenden Flüssigkeiten quellbar ist, kann ein oder mehrere hydrophile Kolloide enthalten,
beispielsweise solche, die zur Herstellung der Reagensschicht oder Reagensschichten verwendet werden. In
vorteilhafter Weise soll die Registrierschicht des weiteren strahlungsdurchlässig sein, um die Erfassung
der Ergebnisse zu erleichtern. Handelt es sich bei dem erfaßbaren Stoff B, der im Element erzeugt wird, um
einen Farbstoff, so kann die Registrierschicht zusätzlich ein Beizmittel für den Farbstoff enthalten, wie es
üblicherweise in der Farbphotographie zum Beizen von J5
Bildfarbstoffen verwendet wird. Beispiele für geeignete Beizmittel sind Vinylpyridinverbindungen, z. B. des aus
der US-PS 24 84 430 bekannten Typs, Polymere mit quatemären Ammoniumresten, beispielsweise des aus
den US-PS 36 25 694,37 58 445,37 09 690,34 88 706 und
35 57 006 bekannten Typs. Ein Beispiel für ein geeignetes Beizmittel ist beispielsweise N,N-Dimethyl-N-benzyl-3-maleimidopropylammoniumchlorid.
Eine gegebenenfalls vorhandene Strahlungs-Sperrschicht dient dazu, den Durchtritt von elektromagnet!- 4 >
scher Strahlung zu verhindern, z. B. der elektromagnetischen Strahlung der Wellenlänge oder der Wellenlängen, die zur Erfassung oder Ermittlung des zu
analysierenden Stoffes bestimmt sind. Bei Verwendung einer solchen Schicht können störende Farbkomponen- >
<> ten und andere störende Verbindungen von der Registrierschicht ferngehalten werden. Derartige
Schichten enthalten ein Trübungsmittel, das z.B. auf Grund seiner Absorptionsfähigkeit oder Reflexionsvermögens einen Strahlungsinhibierenden Effekt in der v,
Schicht ausübt Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung kann die Strahlungs-Sperrschicht ein
Bindemittel oder Träger mit einem Trübungsmittel enthalten oder hieraus bestehen. Geeignete Trübungsmittel sind beispielsweise Pigmente wie Ruß und andere w>
anorganische Pigmente, z. B. Metalloxide und Metallsalze, wie Titaniumdioxid, Zinkoxid und Bariumsulfat. Als
Trübungsmittel können des weiteren sog. »blushed« Polymere verwendet werden, die im allgemeinen von
Natur aus reflektiv sind, wobei gilt, daß Schichten aus μ
derartigen Polymeren, die zur Herstellung von Verteilerschichten oder Ausbreitschichten verwendet werden können, auch zur Erzeugung der Strahlungs-Sperr
schichten verwendet werden können. Zu beachten ist dabei, daß, wird eine mikroporöse Schicht aus einem
derartigen Polymeren als Strahlungs-Sperrschicht verwendet, eine solche Schicht auch als Filterscbicht dienen
kann.
Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung können derartige aus »blushed« Polymeren
aufgebaute Schichten auch ein reflektierendes anorganisches Pigment enthalten, z. B. eines dsr bekannten stark
reflektierenden Pigmente, um die Verteilung oder Ausbreitung und/oder das Reflexionsvermögen zu
erhöhen. Die Konzentration des Pigmentes in einer Schicht gemeinsam mit einem »blushed« Polymer kann
sehr verschieden sein. In vorteilhafter Weise werden Konzentrationen von etwa 5 Gew-% bis etwa 1000
Gew.-% Pigment, bezogen auf das Gewicht des Polymeren verwendet, wobei sich Pigmentkonzentrationen von etwa 100 Gew.-% bis etwa 600 Gew.-%,
bezogen auf das Gewicht des Polymeren, als ganz besonders vorteilhaft erwiesen haben.
Der Mechanismus der Verteilung oder Ausbreitung einer Flüssigkeitsprobe durch eine Verteilerschicht ist
noch nicht restlos geklärt Es wird angenommen, daß die
Verteilung durch verschiedene Kräfte hervorgerufen wird, z. B. einen hydrostatischen Druck einer Flüssigkeitsprobe, einer Kapillarwirkung innerhalb der Verteilerschicht, der Oberflächenspannung der Probe, einer
Dochtwirkung von Schichten im Fließkontakt mit der Verteilerschicht und dergleichen. Das Ausmaß der
Verteilung oder Ausbreitung hängt dabei teilweise von dem Volumen der zu verteilenden Flüssigkeit ab. Die
gleichförmige Konzentration, die bei Verwendung einer solchen Verteilerschicht erreicht wird, ist jedoch
praktisch unabhängig von dem Volumen der Flüssigkeitsprobe und tritt bei verschiedenen Ausbreitungsgraden auf. Demzufolge ist es bei Verwendung erfindungsgemäßer Elemente nicht erforderlich, die Mengen der
aufzubringenden Flüssigkeitsproben genau zu dosieren. Zur Erzielung vorteilhafter Verweilzeiten hat es sich
jedoch als vorteilhaft erwiesen, im Einzelfalle spezielle Volumina von Flüssigkeitsproben zu verwenden. Da die
erfindungsgemäßen Elemente zu quantitativen Ergebnissen bei Verwendung sehr geringer Probenvolumina
führen, die vollständig von einem geeigneten Bereich der Verteilerschicht aufgenommen werden können (z. B.
einem Quadratzentimeter) besteht keine Notwendigkeit dazu, überschüssige Feuchtigkeit von dem Element nach
der Aufbringung der Flüssigkeitsprobe zu entfernen. Da des weiteren die Verteilung in der Verteilerschicht
erfolgt, und die verteilte Substanz der Reagensschicht zugeführt wird, und zwar ohne einen ins Gewicht
fallenden lateralen hydrostatischen Druck, tritt kein sog. »Ringing«-Problem auf, das oftmals bei analytischen
Elementen des Standes der Technik zu beobachten ist
Die Verteilerschicht braucht lediglich eine gleichförmige Konzentration der zu verteilenden Substanz pro
Flächeneinheit an der Oberfläche, die der Reagensschicht gegenüberliegt, zu erzeugen. Ob eine Schicht als
Verteilerschicht geeignet ist, läßt sich leicht feststellen, z. B. durch Abtasten einer Oberfläche der Reagensschicht oder einer anderen mit dieser Schicht in
Verbindung stehenden Schicht unter Bestimmung der Konzentration der verteilten Substanz oder eines
Reaktionsproduktes der Substanz.
Der folgende Test ist lediglich ein Beispiel und die hierzu verwendeten Verbindungen und Testparameter
besagen nicht, daß nicht auch andere Stoffe und Verbindungen bzw. Parameter für entsprechende
Auf einen transparenten photographischen FiImschichtträger, beispielsweise einen Schichtträger aus
Polyäthylenterephthalat mit einer Haftschicht, wird eine transparente Gelatineschicht in einer Stärke von etwa
200 mg/dm2 aufgebracht Der Härtegrad der Gelatine kann verschieden sein. Für Testzwecke hat es sich als
besonders vorteilhaft erwiesen, wenn eine Gelatineschicht verwendet wird, die derart gehärtet ist, daß die
Schicht um etwa 300% quillt, wenn die Schicht \a
5 Minuten lang in Wasser von 22° C getaucht wird. Im
trockenen Zustand hat die Gelatineschicht eine Dicke von etwa 30 Mikron. Auf die Gelatineschicht wird nun
beispielsweise durch Verwendung einer Lösung oder Dispersion, die Schicht aufgetragen, deren Eignung als
Verteilerschicht ermittelt werden solL Die Verteilerschichten können eine verschiedene Trockendicke
aufweisen, wobei sich eine Dicke von etwa 100 bis 200 Mikron für Testzwecke als besonders geeignet erwiesen
hat Nach dem Trocknen der Schicht kann eine Probe der Testlösung oder Dispersion auf die Oberfläche der
zu testenden Verteilerschicht aufgebracht werden, vorzugsweise in geringer Menge, so daß nicht alle Teile
der Schicht mit dem Prüfling befeuchtet werden, jedoch mit einer ausreichenden Menge, so daß ein Bereich
befeuchtet wird, der aus einem runden Flecken eines Durchmessers von etwa 8 bis 10 mm besteht
Die Auswahl der Testlösung oder Testdispersion hängt vom Typ des Prüflings oder der zu analysierenden
Substanz ab, die auf die Schicht aufgebracht wird.
Im Falle von Stoffen mit vergleichsweise geringem Molekulargewicht, haben sich wäßrige Farbstofflösungen als geeignet erwiesen, z. B. eine 0,0005 gew.-%sge
Lösung von Solatine Pink.*) Im Falle von Stoffen mit
vergleichsweise hohem Molekulargewicht, z. B. im Falle J5
von Proteinen, haben sich beispielsweise wäßrige Dispersionen von Rinder-Albumin, gefärbt mit Solatine
Pink als geeignet erwiesen. Nach Aufbringen der Flüssigkeitsprobe auf die zu untersuchende Schicht und
nachdem die Flüssigkeit von der Oberfläche der Schicht w verschwunden und von der Schicht aufgenommen
worden ist, wird das Testelement umgedreht und die untere Seite der Verteilerschicht wird durch den
transparenten Schichtträger und die Gelatineschicht hindurch betrachtet. Ist vor Verdunstung eines größeren 4 ϊ
Teils des Lösungsmittels oder des Dispersionsmediums, der gefärbte Fleck von einer praktisch gleichförmigen
Farbdichte, wenn er von einem Densitometer mit einer öffnung von etwa 5 bis 100 Micron abgetastet wird,
dann erfolgt eine gleichförmige Verteilung auf der >o
Unterseite der Testschicht und/oder in der Gelatineschicht Unter einer praktisch gleichförmigen Dichte ist
dabei eine Dichte quer über den Flecken gemeint mit Ausnahme der Peripherie des Reckens mit Maximum-
und Minimumwerten von nicht mehr als etwa ±10% ϊ5
von der mittleren Dichte. Auf Grund von Kanteneffekten können nicht charakteristische Dichtegradienten an
der Fleckenperipherie auftreten, welche jedoch keinen Effekt auf die Bedeutung des analytischen Ergebnisses
zu haben brauchen. Die Peripheriebezirke können m>
zwischen einzelnen Flecken verschieden sein, sie machen jedoch in der Regel nicht mehr als etwa 20%
des gesamten Fleckens aus und können viel geringer sein.
*) Color-Index Nr. 25 380.
von verschiedenen Komponenten hergestellt werden. Gemäß einer besonderen Ausgestaltung der Erfindung
kann ein teilchenförmiges Material zur Erzeugung solcher Schichten verwendet werden, wobei die
isotrope Porösität durch die Zwischenräume zwischen den Teilchen hervorgerufen wird. Zur Erzeugung der
Schichten können die verschiedensten teilchenförmigen Materialien verwendet werden, die gegenüber den
Bestandteilen der zu analysierenden Flüssigkeit inert sind. Geeignet sind beispielsweise Pigmente, wie
beispielsweise Titandioxid, Bariumsulfat, Zinkoxid und
Bleioxid. Andere geeignete Partikel sind Diatomeenerde und mikrokristalline kolloidale Stoffe, die sich von
natürlichen oder synthetischen Polymeren ableiten.
Geeignete mikrokristalline Stoffe sind beispielsweise solche, die in einem Aufsatz von O. A. Battista und
Mitarbeitern unter der Bezeichnung »Colloidal Macromolecular Phenomena, Part II, Novel Microcrystals of
Polymers« in der Zeitschrift »Journal of Applied Polymer Science«, Band II, Seiten 481 bis 498 (1967)
beschrieben werden. Derartige mikrokristalline Stoffe sind des weiteren im Handel erhältlich. Sphärische
Teilchen gleichförmiger Größe, z.B. Kügelchen aus Glas oder Harzen können ebenfalls verwendet werden.
Sie können besonders vorteilhaft dann sein, wenn gleichförmige Poren vorteilhaft sind, beispielsweise zum
Zwecke einer selektiven Filtration. Haften die einzelnen Teilchen nicht, was beispielsweise dann der Fall ist
wenn Glasteilchen oder Glaskügelchen verwendet werden, so können diese Teilchen so vorbehandelt
werden, daß Teilchen erhalten werden, die haften, und zwar miteinander an Kontaktpunkten, wodurch die
Bildung einer isotrop-porösen Schicht erleichtert wird. So können beispielsweise nicht haftende Teilchen mit
einer dünnen Haftschicht überzogen werden, und zu diesem Zweck beispielsweise mit einer Lösung eines
hydrophilen Kolloides, beispielsweise Gelatine oder Polyvinylalkohol behandelt werden. Durch Trocknung
der Kolloidbeschichtung wird eine haftende Schicht erhalten, wobei Zwischenräume zwischen den einzelnen
Partikeln verbleiben.
Als Alternative oder zusätzlich zu solchen teilchenförmigen Stoffen kann die Verteilerschicht auch unter
Verwendung von isotropen porösen Polymeren hergestellt werden. Derartige Polymere lassen sich nach
Methoden herstellen, wie sie zur Herstellung von sog. »blushed« Polymeren angewandt werden. Blushed-Polymerschichten lassen sich auf einem Substrat durch
Lösen eines Polymeren in einer Mischung von zwei Flüssigkeiten, von denen eine einen vergleichsweisen
niedrigen Siedepunkt hat und ein gutes Lösungsmittel für das Polymer ist und die andere einen vergleichsweise
höheren Siedepunkt hat und ein Nicht-Lösungsmittel oder mindestens ein schlechtes Lösungsmittel für das
Polymer ist herstellen. Eine solche Polymerlösung wird dann auf den Schichtträger aufgetragen und unter
bestimmten Bedingungen getrocknet. Das niedrigsiedende Lösungsmittel verdampft dabei leichter, so daß
sich die aufgetragene Schicht an der Flüssigkeit anreichert, die ein schlechtes Lösungsmittel oder kein
Lösungsmittel für das Polymer ist. In dem Maße, in dem die Verdampfung fortschreitet, bildet das Polymer eine
isotropporöse Schicht. Zur Herstellung derartiger Schichten können die verschiedensten Polymeren
verwendet werden, und zwar einzeln oder in Kombination miteinander. Typische geeignete Polymere zur
Herstellung von isotrop-porösen blushed-Polymerschichten sind Polycarbonate, Polyamide, Polyurethane
und Celluloseester, ζ. Β. Celluloseacetat
Bei der Herstellung integraler analytischer Elemente nach der Erfindung können die einzelnen Schichten
separat vorgebildet werden und dann zu dem Element laminiert werden. In diesem Falle werden die Schichten
in typischer Weise aus Lösungen oder Dispersionen auf eine Oberfläche aufgetragen, von welcher die getrockneten
Schichten leicht auf physikalischem Wege wieder abgestreift werden können. Ein vorteilhaftes Verfahren
zur Herstellung erfindungsgemäßer Elemente, das ι ο
einzelne Abstreif- und Laminierungsstufen verhindert, besteht darin, auf einen Schichtträger zunächst eine und
dann die anderen Schichten successive aufzutragen. Ein solches Auftragen verschiedener Schichten auf einen
Schichtträger kann durch Hand erfolgen oder durch Beschichtung unter Verwendung eines Beschichtungsmessers
oder einer Beschichtungsvorrichtung, wobei übliche bekannte Beschichtungsmethoden angewandt
werden können, beispielsweise eine Tauchbeschichtung
oder eine Benbeschichtung. Erfolgt die Beschichtung eines Schichtträger mit einer Beschichtungsvorrichtung,
so kann es vorteilhaft sein, einander benachbarte Schichten gleichzeitig aufzutragen, beispielsweise unter
Verwendung bekannter Beschichtungsverfahren, wie sie zur Herstellung lichtempfindlicher photographischer
Aufzeichnungsmaterialien üblich sind. Falls es wichtig oder wünschenswert ist, daß diskrete einander benachbarte
Schichten erzeugt werden und sich eine Schichtentrennung durch Einstellung oder Überwachung
des spezifischen Gewichtes der Beschichtungs- jo massen nicht erreichen läßt oder nicht zufriedenstellt,
wie es im Falle von porösen Verteilerschichten möglich ist, so kann die geeignete Ausv^hl von Komponenten
für eine jede Schicht, einschließlich des Lösungsmittelsoder Dispersionsmediums eine V "änderung von Korn- js
ponenten zwischen den einzelnen Schichten und Lösungsmitteleffekte auf ein Minimum herabdrücken
oder gar ausschalten, wodurch die Bildung gut ausgebildeter, diskreter Schichten gefördert wird.
Zwischenschichten-Adhäsionsprobleme lassen sich ohne nachteilige Effekte dadurch beseitigen, daß
Oberflächenbehandlungen vorgenommen werden, einschließlich der Aufbringung extrem dünner Haftschichtenmaterialien,
wie sie beispielsweise von der Herstellung photographischer Aufzeichnungsmaterialien bekannt
sind.
Im Falle der Reagensschichten kann eine Beschichtungslösung oder Beschichtungsdispersion mit dem
Träger oder dem Bindemittel und einem hierin verteilten Stoff A hergestellt, auf einem Schichtträger in w
der beschriebenen Weise aufgetragen und unter Erzeugung einer dimensionsstabilen Schicht aufgetrocknet
v/erden. Die Dicke der Reagensschicht sowie ihr Permeabilitätsgrad können sehr verschieden sein
und hängen von dem Verwendungszweck des Materials ab. Trockendichten von etwa 10 Mikron bis etwa 100
Mikron haben sich als vorteilhaft erwiesen, obgleich auch dünnere und dickere Schichten verwendet werden
können. Werden beispielsweise vergleichsweise große Mengen an Stoff A in der Schicht untergebracht, z. B. wi
polymere Stoffe, wie beispielsweise Enzyme, so kann es
vorteilhaft sein, vergleichsweise dickere Reagensschichten zu erzeugen.
Die Strahlungs-Sperrschichten und Registrierschichten können nach Methoden hergestellt werden, wie sie b>
zur Herstellung der Reagensschichten angewandt werden, jedoch unter Verwendung geeigneter Ausgangsstoffe.
Die Schichtstärken dieser Schichten können den Schichtstärken der Reagensschichten entsprechen.
Die Registrierschichten sind abgesehen von ihrer Permeabilität und Strahlungsdurchlässigkeit in vorteilhafter
Weise frei von solchen Charakteristika, welche zu einer Fleckenbildung oder anderen Störungen bei der
Feststellung eines analytischen Ergebnisses durch das integrale Element nach der Erfindung führen würden.
So kann beispielsweise eine jede Veränderung der Farbe oder Textur in der Registrierschich;, wie sie
beispielsweise im Falle fasriger Materialien auftritt, beispielsweise bei einigen Papieren, sich nachteilig
auswirken, auf Grund der nicht gleichförmigen Reflexion oder Durchlässigkeit der zur Analyse verwendeten
Energie. Obgleich fasrige Materialien, wie Filterpapiere und andere Papiere im allgemeinen insgesamt permeabel
sind, können derartige Materialien in typischer Weise doch stark verschiedene Permeabilitätsgrade
aufweisen und nicht gleichförmig permeabel sein, beispielsweise auf Grund struktureller Unterschiede,
wie beispielsweise unterschiedlicher Faserdimensionen und Faserabstände. Demzufolge sind derartige Stoffe
nicht vorzugsweise verwendbare Stoffe zur Bereitung der Registrierschichten und anderer Schichten von
erfindungsgemäßen Elementen.
Die Verteiler- oder Ausbreitschichten können auch durch Beschichtung unter Verwendung von Lösungen
oder Dispersionen erzeugt werden. Wie bereits dargelegt, sind die Verteilerschicht und die anderen
Schichten eines Elements nach der Erfindung übereinander angeordnet, und zwar derart, daß sich die
Verteilerschicht in einem Strömungs- oder Flüssigkeitskontakt mit einer Reagensschicht befindet Die zum
Aufbau der Verteilerschichten verwendeten Stoffe und Materialien können, wie bereits dargelegt sehr verschieden
sein, wobei zum Aufbau der Schichten mindestens zum überwiegenden Teile Stoffe verwendet werden, die
gegenüber den zu analysierenden Flüssigkeiten resistent sind, d.h. die in diesen Flüssigkeiten unlöslich oder
praktisch unlöslich sind und bei Kontakt mit diesen Flüssigkeiten mindestens nicht stark quellen. Quellungen
von etwa 10 bis 40%, bezogen auf die Trockendicke der Schichten sind dabei normal. Die Dicke der
Verteilerschichten kann sehr verschieden sein und hängt im einzelnen von dem aufzubringenden Probenvolumen
ab, das aus Zweckmäßigkeitsgründen und Gründen der Sauberkeit der Verteilerschicht absorbiert werden
sollte, sowie von dem Leerstellenvolumen der Schicht, das auch die Menge des Prüflings, der von der Schicht
absorbiert werdtn kann, beeinflußt Als besonders vorteilhaft haben sich Verteilerschichten einer Schichtstärke
von etwa 50 bis etwa 300 Mikron erwiesen. Jedoch können auch Verteilerschichten größerer oder
kleinerer Schichtstärke verwendet werden.
Bei der Herstellung einer isotropen porösen Verteilerschicht kann es vorteilhaft sein ein Leerstellenoder
Porenvolumen von mindestens etwa 25%, bezogen auf das Volumen der Gesamtschicht zu haben. In
vorteilhafter Weise soll das Porenvolumen bei etwa 50 bis 95% liegen. Durch Veränderungen im Porenvolumen
der porösen Verteilerschichten lassen sich die Elementchäräktefistika in vorteilhafter Weise modifizieren,
beispielsweise die Gesamtpermeabilität der Verteilerschicht oder die Zeit, die erforderlich ist, um
eine Probe zu verteilen. Das Porenvolumen einer Schicht läßt sich leicht steuern, beispielsweise durch
Auswahl von geeigneten teilchenförmigen Stoffen geeigneter Größe oder durch Variation der Lösungsmittel
oder Trockenbedingungen, wenn isotrope poröse
Blushed-polymere zur Herstellung der Verteilerschicht
verwendet werden. Das Porenvolumen einer solchen Schicht läßt sich leicht mit ausreichender Genauigkeit
nach verschiedenen bekannten Methoden ermitteln, beispielsweise nach statistischen Methoden, wie sie z. B.
von Chalkley in der Zeitschrift »Journal of the National Cancer Institute«, 4,47 (1943) beschrieben werden und
durch direktes Wiegen und Bestimmung des Verhältnisses von tatsächlichem Gewicht der Schicht zum
Gewicht der Feststoffe, deren Volumen gleich ist dem
Volumen der Schicht Die Porengröße sollte in jedem Falle so bemessen sein, daß eine Verteilung oder
Ausbreitung der Komponenten der zu analysierenden Probe oder anderer Substanzen, die in wünschenswerter
Weise einer Reagensschicht zugeführt werden sollen, ii
möglich ist
Geeignete Schichtträger für die Herstellung integraler
analytischer Elemente nach der Erfindung sind übliche Schichtträger aus polymeren Stoffen, z. B.
Celluloseacetat, Polyäthylenterephthalat, Polycarbonaten
und Polyvinyiverbindungen, beispielsweise Polystyrol.
Besonders vorteilhafte Schichtträger sird solche, die
strahlungsdurchlässig sind und elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge oder eines Weilenlängenbereiches
zwischen etwa 200 nm und etwa 900 nm wie auch radioaktive Strahlung durchlassen.
Im Falle fluorimetrischer Bestimmungen durch den Schichtträger hindurch hat es sich als zweckmäßig
erwiesen, wenn der Schichtträger für einen etwas breiteren Wellenlängebereich durchlässig ist als im Falle jo
nicht fluoreszierender Messungen oder alternativ wenn der Schichtträger durchlässig ist bei den Absorptionbund
Emissionsspektren der fluoreszierenden Stoffe, die für die Bestimmung verwendet werden. Es kann des
weiteren vorteilhaft sein, Schichtträger zu verwenden, die nur eine oder vergleichsweise sehr enge Wellenlängenbanden
durchlassen und die gegenüber benachbarten Wellenlängenbanden opak oder undurchlässig sind.
Dies läßt sich beispielsweise dadurch erreichen, daß in den Schichtträger ein oder mehrere färbende Komponenten
eingearbeitet oder aufgetragen werden, die geeignete Absorptionscharakteristika aufweisen.
Die Reagensschicht, die Strahlungs-Sperrschicht (sofern eine solche vorhanden ist) und die Registrierschicht
befinden sich im Element zwischen Schichtträger und der Verteilerschicht {sofern eine solche
vorhanden ist), die gewöhnlich die äußerste Schicht des Elements ist
Die einzelnen Komponenten, aus denen jede einzelne Schicht eines integralem analytischen Elements nach der -,o
Erfindung aufgebaut sind und der Aufbau der Schichten hängen von dem Verwendungszweck des Elements ab.
Wie bereits dargelegt, kann die Porengröße der Verteilerschicht derart ausgewählt werden, daß die
Schicht unerwünschte Probenkomponenten ausfiltrie- v>
ren kann, d. h. solche Komponenten, die beispielsweise die analytische Reaktion stören würden oder welche die
Ermittlung des Testergebnisses innerhalb des Elements beeinträchtigen würden.
Für die Analyse von Blut beispielsweise haben sich «)
poröse Schichten mit einer Porengröße von etwa 1 bis etwa 5 Mikron als besonders vorteilhaft erwiesen, um
Blutzellen abzi'fil trie fen, welche in typischer Weise eine
Größe von etWU 7 bis etwa 30 Mikron aufweisen.
Gegebenenfalls katin ein erfindungsgemäßes Element «,->
mehrere VerMilersßhichten aufweisen, wobei jede
dieser Schichten veis Mieden bezüglich der Fähigkeit
der Verteilung und Filtration der Proben ist. Ist eine Hemmung oder Behinderung des Transportes von
Substanzen innerhalb des Elements, zuzüglich zn der Behinderung, die durch die Verteilerschicht bewirkt
wird, notwendig, so kann eine Filter- oder Dialysierschicht an geeigneter Stelle des Elements untergebracht
werden. Bei der Analyse von Blutglucose beispielsweise kann eine Dialysierschicht, z. B. eine semipermeable
Cellulosemembran die Passage von Proteinen oder anderen potentiellen störenden Substanzen in die
Reagensschicht verhindern.
In vorteilhafter Weise können in eine oder mehrere der Schichten eines erfindungsgemäßen Elements eine
oder mehrere oberflächenaktive Stoffe, z. B. anionische und/oder nicht ionische oberflächenaktive Verbindungen
eingearbeitet werden. Derartige Verbindungen können die Beschichtungsfähigkeil der Beschichtungsmassen
verbessern und das Ausmaß und die Geschwindigkeit der Verteilung der zu analysierenden Flüssigkeiten
in den Verteilerschichten fördern, welche von flüssigen Proben in Abwesenheit eines oberflächenaktiven
Stoffes nicht leicht benetzbar sind. Des weiteren können beispielsweise in der Verteilerschicht gegebenenfalls
für die Durchführung bestimmter Analysen reaktionsfähige oder aktive Substanzen bzw. Verbindungen
vorhanden sein. So können beispielsweise Proteine oder andere Stoffe von höherem Molekulargewicht
in vorteilhafter Weise in mehrere leicht verteilbare oder ausbreitbare Komponenten von
geringerem Molekulargewicht geteilt oder gespalten werden, die sich leichter für analytische Reaktionen
eignen, in dem beispielsweise in der Verteilerschicht geeignete reaktionsfähige oder aktive Stoffe oder
Substanzen untergebracht werden, z. B. ein Enzym, beispielsweise eine Protease oder Esterase.
Es kann des weiteren vorteilhaft sein, in Schichten des
Elements Stoffe oder Substanzen unterzubringen, die durch chemische Reaktion oder in anderer Weise Stoffe
oder Substanzen nicht aktiv machen können, welche sich für die Durchführung der Analyse nachteilig
auswirken würden. So läßt sich beispielsweise Ascorbatcxidase in einem Element unterbringen, um Ascorbationen
zu entfernen, die die Analyse von Glucose stören können.
Eine Analyse kann des weiteren gegebenenfalls eine mehrstufige Reaktion erfordern, die am besten in einem
Element mit mehreren Reaktionsschichten durchgeführt werden kann, wobei jede dieser Reaktionsschichten
derart aufgebaut ist, daß in ihr eine spezielle Reaktionsstufe ablaufen kann. Bei der Bestimmung
eines Enzyms, das bekannt ist als Serum-Glutamin-Oxalessigtransaminase
(serum glutamic-oxalacetic transaminase) beispielsweise, können verschiedene
aufeinanderfolgende Reaktionen ablaufen. Dies Enzym katalysiert bei einem pH-Wert von etwa 7,4 die
Umwandlung von «-Ketoglutarat- und Aspartationen zu dem entsprechenden Oxalacetat und Giutamat. Das
Oxalacetat läßt sich messen nach Kupplung mit dem Diazoniumsalz des Farbstoffes, bekannt als »Fast
Ponceau L«. Ζ.·τ Erleichterung des ersten Gleichgewichts,
das von der Kupplung erreicht werden soll, ist es wünschenswert, die Reagenzien voneinander zu trennen
und jedes der Reagenzien in einer besonderen separaten Schicht unterzubringen, um zu erreichen, daß
das erste Gleichgewicht eingestellt werden kann ohne Behinderung der einstellung des Gleichgewichtes durch
einen frühen Beginn der zweiten Reaktionsstufe. Dies bedeutet, daß die Glutarat- und Aspartationen in einer
ersten Reagensschicht untergebracht werden kann, die
über einer zweiten Reagensschicht angeordnet wird, die
das Salz des Farbstoffes »Fast Ponceau L« enthält.
Erfindungsgemäße integrale analytische Elemente können zur Durchführung der verschiedensten chemischen
Analysen verwendet werden, und zwar nicht nur auf dem Gebiet der klinischen Chemie, sondern
vielmehr auch zur Durchführung von Analysen auf dem Gebiet der chemischen Forschung und in Kontrollaboratorien,
die chemische Prozesse überwachen. Die erfindungsgemäßen Elemente eignen sich insbesondere
für den klinischen Test von Körperflüssigkeiten, z. B. Blut, Blutserum und Urin, da auf diesem Gebiet eine
große Anzahl von zu wiederholenden Testen durchzuführen ist und die Testergebnisse in der Regel in einer
sehr kurzen Zeitspanne nach der Probenahme vorliegen müssen. Auf dem Gebiet der Blutanalyse beispielsweise
kann ein mehrschichtiges erfindungsgemäßes Element derart ausgestaltet sein, daß mit dem Element eine
quantitative Analyse von mehreren oder vielen Blutkomponenten möglich ist, die routinemäßig ermittelt
werden müssen. So kann ein erfindungsgemäßes Element beispielsweise so ausgestaltet sein, daß die
Analyse von solchen Blutkomponenten wie Aluminium, Bilirubin, Harnstoff-Stickstoff, Serum-Glutamin-Oxalessigsäure-Transaminase,
Chlorid, Glucose, Harnsäure und alkalischen Phosphatasen sowie anderen Komponenten
durch geeignete Auswahl der Testreagenzien oder anderer reagierender Stoffe möglich ist. Bei der
Analyse von Blut beispielsweise können bei Verwendung eines analytischen Elements nach der Erfindung
zunächst die Blutzellen vom Serum getrennt werden, beispielsweise durch Zentrifugen, worauf das Serum auf
das Element aufgebracht wird. Jedoch kann eine solche Trennung auch unterbleiben, und zwar insbesondere
dann, wenn spektrophotometrische Reflexionsanalysen angewandt werden, um das im Element erzeugte
Reaktionsprodukt zu ermitteln, da auf das Element auch Blut aufgebracht werden kann, in welchem Falle die
Blutzellen durch die Wirkung der Filterschicht abgefiltert werden. Die Gegenwart dieser Zellen stört dabei
nicht die spektrophotometrische Analyse, wenn diese nach der Reflexionsmethode durchgeführt wird, wobei
Licht durch den Schichtträger und die Registrierschicht gelangt und von der Strahlungs-Sperrschicht oder einer
anderen reflektierenden Schicht reflektiert wird, so daß die Zellen den Strahlengang nicht behindern. Ein
wesentlicher Vorteil eines integralen analytischen Elements nach der Erfindung besteht darin, daß es
sowohl zur Analyse von Serum als auch Blut verwendet werden kann.
Die erfindungsgemäßen Elemente können je nach ihrem Verwendungszweck einen verschiedenen Aufbau
und verschiedene Form aufweisen, d.h. sie können beispielsweise in Streifen- oder Bandform jeder
gewünschten Breite vorliegen, in Form von Blättern oder kleineren Abschnitten. Des weiteren können die
Elemente gegebenenfalls zur Durchführung von einem oder mehreren Testen eines Typs oder einem oder
mehreren Testen verschiedener Typen ausgestaltet sein. Im letzteren Falle kann es vorteilhaft sein, einen
Schichtträger mit einem oder mehreren Streifen oder Kanälen von gegebenenfalls verschiedenen Beschichtungsmassen
zu beschichten, und ein sog. Mehrfachelement oder zusammengesetztes Element herzustellen,
das für die Durchführung verschiedener Teste geeignet
Das in F i g. 1 dargestellte analytische Element besteht aus einem strahlungsdurchlässigen Schichtträger
10, auf dem angeordnet sind: eine Registrierschich 12, eine Strahlungssperrschicht 14, welche sowohl ah
Filterschicht dienen kann, als auch als Schicht, die einer weißen Hintergrund für analytische Zwecke bildet
beispielsweise für reflexions-spektrophotometrisch« Messungen und eine Reagensschicht 16. Die Ermittlung
des analytischen Ergebnisses kann durch den Schicht träger hindurch erfolgen, welcher für die zur Feststel
lung des analytischen Ergebnisses verwendete Strah lungswellenlänge durchlässig ist. Die Registrierschicht
12 kann aus einer hydrophilen Kolloidschicht bestehen z. B. einer Gelatineschicht. Die Reagensschicht 16 kam
aus einer Lösung oder Dispersion von einem odei mehreren Testreagenzien in einem Bindemittel, ζ. Β
Gelatine bestehen, wahrend die Schicht 14 aus einen sog. »Blushed«-Po!ymer mit isotroper Porosität und/
oder einer solchen Porengröße, wie sie zum Abfilterr einer Komponente benötigt wird, aufgebaut sein kann
Die einzelnen Schichten befinden sich dabei irr Strömungs- oder Flüssigkeitskontakt
Das in F i g. 2 dargestellte analytische Elemenl besteht aus einem strahlungsdurchlässigen Schichtträger
20, mit einer hierauf aufgetragenen Registrier schicht 22 im Flüssigkeitskontakt mit einer Reagens
schicht 24 und einer Verteilerschicht 26, die auch die Funktion einer Filterschicht ausüben kann und aucl·
einen geeigneten reflektierenden Hintergrund haber kann, so daß spektrophotometrische Reflexionsmessun
gen durch den Schichtträger 20 durchgeführt werder können. Alternativ kann die Schicht 26 auch deran
beschaffen sein, daß sie nicht reflektiert, in welchen
Falle die Ermittlung des analytischen Ergebnisses naclder Transmissionsmethode erfolgen kann. Die Schicht
26 kann beispielsweise aus einem isotrop-poröser »Blushed«-Polymer aufgebaut sein, welches auf die
Schicht 24 aufgetragen sein kann oder auf diese Schichi 24 auflaminiert worden sein kann.
Das in F i g. 3 dargestellte Element besteht aus ei π err Schichtträger 30, einer Registrierschicht 32, einei
Strahlungs-Sperrschicht 34, z. B. aus einer Dispersior eines Pigmentes, z. B. Titandioxid in einem hydrophiler
Kolloid, wie beispielsweise Gelatine, einer Reagens schicht 36 und einer Verteilerschicht 38, z. B. aus einerr
isotrop-porösen »Blushed«-Polymer, welche die Funk tion der Verteilung und Ausbreitung und ferner die
Funktion einer Filterschicht haben kann. Die verschie denen Schichten befinden sich wiederum im Strömungsbzw. Flüssigkeitskontakt
Das in F i g. 4 dargestellte Element besteht aus einerr Schichtträger 40, einer Registrierschicht 42, einei
Strahlungs-Sperrschicht und Fdterschicht 44 einei Reagensschicht (A) 46, einer weiteren Reagensschichi
(B) 48 und einer Verteiler-Filterschicht 50. Die Schichi
44 kann beispielsweise aus einer Dispersion vor Titandioxid in Celluloseacetat (in Form eines »Blushed«-Polymeren)
bestehen und die Schicht 50 kanr beispielsweise aufgebaut sein aus einer Dispersion vor
Diatomeenerde in Celluloseacetat (»Bhishede-Polymer]
oder aus Glaskügelchen oder Glasteilchen, die aneinan
der durch Beschichtung mit einem hydrophilen Kolloid beispielsweise Gelatine anhaften.
Bei der Verwendung der Elemente wird auf diese eine Probe der zu analysierenden Flüssigkeit aufgebracht Ir
typischer Weise sind die Elemente derart aufgebaut, dai
die aufgebrachte Probe zunächst mit einer Verteiler /-U-Iöi- Aiie-Ki-oWei-'Viii-Vi* in ITrtTitalrt trt*\antrt hpvnr t\\f
Probe auf eine nicht-verteilende Reagensschicht gelangt,
wobei die Probe zunächst auf die Seite dei
Verteilerschicht gelangt, die von der Reagensschicht
weiter entfernt ist Dn die analytische Genauigkeit der Elemente nicht oder praktisch nicht durch Veränderungen
des Volumens der aufgebrachten Proben verändert wird, und zwar insbesondere dann nicht, wenn eine
Verteilerschicht vorhanden ist, kann das Aufbringen der zu analysierenden Proben durch Hand oder auch auf
maschinellem Wege erfolgen. Aus Gründen der Einfachheit und Bequemlichkeit der Erkennung analytischer
Ergebnisse jedoch, hat es sich in der Regel als vorteilhaft erwiesen, wenn die zu analysierenden
Proben das gleiche oder etwa das gleiche Volumen haben. Wie bereits dargelegt, besteht ein weiterer
Vorteil der Verteilerschicht darin, daß sie das Auftreten des »Ringing-Effektes« weitestgehend vermindert,
wenn lösliche reaktionsfähige oder aktive Stoffe oder Substanzen in einer Reagensschicht verwendet werden.
In typischer Weise erfolgt eine manuelle oder maschinelle Analyse unter Verwendung eines Analyseelements
in der Weise, daß das Element zunächst aus einem Vorratsbehälter entnommen oder von einer
Vorratsrolle abgezogen wird, worauf das Element in eine solche Lage gebracht wird, daß es einen freien
Tropfen der zu analysierenden Flüssigkeit aufnehmen kann oder einen Kontaktflecken oder irgendeine andere
Form einer Flüssigkeitsprobe, beispielsweise von einem Dosiergerät Nach dem Aufbringen der zu analysierenden
Probe sowie zweckmäßig nachdem die Probe von einer Verteilerschicht aufgenommen worden ist, falls
eine solche vorhanden ist, kann das Element konditioniert werden, beispielsweise durch Erwärmen oder
Aufheizen, Feuchtmachen und dergleichen, was den durchzuführenden Test beschleunigen oder erleichtern
kann. Bei einer automatisierten Verfahrensweise kann es gegebenenfalls wünschenswert sein, daß die Verteilerschicht
ihre Funktion innerhalb weniger Sekunden ausübt daß jedoch eine ausreichende Zeitspanne für die
Dosierung zur Verfügung steht im Gegensatz zu der sofortigen, ungleichförmigen Diffusion, wie sie bei der
Verwendung von absorbierenden fasrigen Papieren auftritt Dies kann in vorteilhafter Weise erreicht
werden durch geeignete Auswahl oder Abstimmung von verschiedenen Parametern, beispielsweise der
Schichtdicke, des Porenvolumens in porösen Schichten und dergleichen.
Nachdem das analytische Ergebnis in Form einer erfaßbaren Veränderung vorliegt, wird es gemessen, in
vorteilhafter Weise dadurch, daß das Element durch eine Meßzone geführt wird, in welcher die Messung mit
einer geeigneten Vorrichtung für Reflexionsmessungen, Transmissions- oder Fluoreszenz-Spektrophotometrie
durchgeführt wird. Mittels einer solchen Vorrichtung wird ein Energiestrahl, z. B. ein Lichtstrahl durch den
Schichtträger und die Registrierschicht gerichtet Der Lichtstrahl wird dann von der Strahlungs-Sperrschicht
in dem Element zurückreflektiert oder gelangt durch das Element zu einem Detektor, im Falle der
Transmissionsmethode.
In vorteilhafter Weise wird das analytische Ergebnis in einem Bezirk oder Bereich des Elements erfaßt der
vollständig innerhalb des Bereiches liegt in dem das analytische Ergebnis erzeugt wird Die Anwendung der
Reflexions-Spektrophotometrie kann in vielen Fällen besonders vorteilhaft sein, da dieses Verfahren in vielen
Fällen Störungen von Rückständen, z.B. Blutzellen vermeidet, welche auf oder in Schichten des Elements
zurückgeblieben sein können. In vorteilhafter Weise können jedoch auch übliche Methoden der Fluoreszenz-Spektrofotometrie
angewandt werden, wenn die zu erfassenden Substanzen oder Stoffe aus fluoreszierenden
Substanzen oder Stoffen bestehen. In diesem Falle wird zur Erfassung der analytischen Ergebnisse eine
-> Energie verwendet, die die fluoreszierenden Substanzen
oder Stoffe anregt sowie ein Detektor, der die Fluoreszenz-Emission abtastet Die Erfassung der
analytischen Ergebnisse erfolgt dabei unter Verwendung von Energie, welche die fluoreszierende Substanz
in oder Verbindung anregt und unter Verwendung eines
Detektors, der die fluoreszierende Emission der fluoreszierenden Substanz oder Verbindung abtastet.
Wird des weiteren beispielsweise Blutserum analysiert oder werden Maßnahmen getroffen zur Eliminierung
π unerwünschter Blutrückstände, so können Transmissionsmethoden
angewandt werden, zur Ermittlung und quantitativen Erfassung der anzeigenden Reaktionsprodukte,
in dem ein Energiestrahl, beispielsweise aus UV-Licht, sichtbarem Licht oder von Infrarotstrahlung
auf eine Oberfläche des Elements gerichtet wird, worauf der Ausgangswert des Strahles aus der entgegengesetzten
Seite des Elements gemessen wird. Ganz allgemein hat sich die Verwendung von elektromagnetischer
Strahlung eines Strahlungsbereiches von 200 bis etwa
r. 900 nm für derartige Messungen als vorteilhaft erwiesen,
obgleich jede Strahlung verwendet werden kann, dergegenüber das Element permeabel ist und die dazu
befähigt ist, das in der Reagensschicht erzeugte Produkt quantitativ zu erfassen.
in Verschiedene Eichmethoden können angewandt werden, um die Analysenergebnisse zu überwachen.
Beispielsweise läßt sich eine Probe einer Standardlösung der zu analysierenden Substanz oder Verbindung
benachbart zu der Probe aufbringen, die zu analysieren
r. ist.
Die folgenden Beispiele für die Herstellung von analytischen Elementen sollen die Erfindung näher
veranschaulichen.
4n Beispiel 1
Auf einen dicken (180 Mikron) Schichtträger a>'s
Polyäthylenterephthalat mit einer Gelatinehaftschicht wurden nacheinander folgende Schichten aufgetragen:
1. eine Registrier-(Empfangs-)schicht mit pro Qua-4'
dratmeter 2,15 g Gelatine, 2,15 g eines Beizmittels,
und zwar eines Copolymeren aus Styrol und N.N-Dimethyl-N-S-maleimidopropylammoniumchlorid;
2. eine poröse reflektierende Strahlungs-Sperrschicht '" mit pro Quadratmeter 151 g Gelatine und 11,4 g
Titandioxid;
3. eine Reagensschicht (analytische Schicht) mit pro Quadratmeter 174 g Gelatine, 1.5 g l-Naphthol-2-sulfonsäure,
Kalhimsalz, 073 g Dinatriumphosphat-
" puffer, 0,45 g Monokaöumphosphatpuffer, 038 g
4-Aminoantipyrin (HCT), 1,6 g Glycerin als Weichmacher,
0,09 g Peroxklase (14014 U/m2) und 0374 g Glucoseoxidase (40440 U/irf);
4. eine Verteilerschicht mit pro Quadratmeter 97 g b0 Celluloseacetat und 65,5 Titandioxid.
Das hergestellte Element wurde für die Analyse von Glucoselösungen verwendet, deren Konzentrationen
zwischen 0 und 800 mg Glucose pro Deziliter Lösung hi lagen.
Auf Abschnitte des hergestellten Elements wurden dann Tropfen aufgebracht, und zwar jeweils 10 μΐ einer
der wäßrigen Glucoselösungen. Nach einer Stunde
wurde die Dichte der erzeugten Färbungen durch Reflexion gemessen, und zwar unter Verwendung eines
handelsüblichen Densitometers vom Typ Macbeth (Model TD-504). Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind
in der später folgenden Tabelle zusammengestellt
Die auf die Oberfläche der Testelemente aufgebrachten Glucoselösungen verteilten sich in der Schicht (4)
und wurden Ast Schicht (3) zugeführt, in welcher die Glucose mit Sauerstoff und Wasser in Gegenwart der
Glucoseoxidase reagierte unter Bildung von Gluconsäure und Wasserstoffperoxid. Diese Verbindungen in
Gegenwart von Peroxidase reagierten mit dem 4-Aminoantipyrin, das oxidiert wurde. Das Oxidationsprodukt des 4-Aminoantipyrins reagierte dann durch
Kupplung mit dem Kaliumsalz der l-Naphthol-2-sulfonsäure unter Erzeugung eines Farbstoffes, der aus der
Reagensschicht (3) durch die Strahlungs-Sperrschicht (2) in die Registrierschicht (1) diffundierte, in welcher er
durch die Messung mit dem Densitometer erfaßt wurde. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt
Es wurde ein weiteres erfindungsgemäßes analytisches Element wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt,
mit der Ausnahme jedoch, daß die Registrierschicht (I) lediglich aus Gelatine als einziger Komponente,
bestand, bei einer Beschichtungsstärke von 4,30 g pro
Quadratmeter. Das Element wurde dann wie in Beispiel
1 beschrieben zur Analyse von Glucoselösungen verwendet Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind
ebenfalls in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
Element gemäß | Glucose-Gehalt | Dichte gemes |
Beispiel Nr. | des Prüflings | sen durch |
(mg/Deziliter) | Reflexion von weißem Licht |
|
I | 0 | 0,28 |
100 | 0,36 | |
150 | 0,37 | |
200 | 0,40 | |
300 | 0,47 | |
400 | η «2 | |
600 | α« | |
800 | 0,53 | |
2 | 0 | 0,23 |
100 | 0,36 | |
150 | 0,42 | |
200 | 0,47 | |
300 | 0,54 | |
400 | 0,55 | |
600 | 0,56 | |
800 | 0,60 |
Claims (12)
1. Integrales analytisches Element für die Analyse
von Flüssigkeiten, bestehend aus einem strahhingsdurchlissigen Schichtträger, auf den aufgetragen
sind:
(a) mindestens eine für die zu analysierende Substanz oder einen Vorläufer derselben
permeable Reagensschicht mit einem Stoff A, der mit der zu analysierenden Substanz bzw.
dem Vorläufer unter Bildung eines diffundier- und erfaßbaren Stoffes B zu reagieren vermag
oder die Bildung eines Stoffes B bewirkt, sowie ,,.
mindestens eine weitere Schicht, bestehend aus
(b) einer für den Stoff B permeablen Strahhmgs-Sperrschicht und/oder
(c) einer isotrop-porösen Verteilerschicbt zum
Verteilen (oder Ausbreiten) der zu analysieren- ^ den Substanz oder des Vorläufers derselben *
fiber der vom Schichtträger abgewandten Sehe der Reagensschicht,
dadurch gekennzeichnet, daß zwischen Reagensschicht (16; 24; 36; 46; 48) und Schichtträger
(10; 20; 30; 40) eine für den in der Reagensschicht (16;
24; 36; 46; 48) gebildeten diffundier- und erfaßbaren Stoff B permeable Registrierschicht (12; 22; 32; 42)
für die Erfassung des Stoffes B vorhanden und die Strahhmgs-Sperrschicht (14; 34; M), sofern vornanden, zwischen der Reagensschicht (16; 36; 46; 48)
und der Re^^strierschicht (12; 32; 42) angeordnet ist.
2. Analytisches Element na*"h Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die Strahhmgs-Sperrschicht
(14;34;44) ein Trübungsmittel enthält
3. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die Reagensschicht (16; 24; 36; 46; 48) und die Registrierschicht (12; 32; 42)
wasser-queübarsind.
4. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht (16; 24; 36;
46; 48) aus einer hydrophilen Kolloidschicht besteht,
in der der Stoff A verteilt vorliegt, daß die
Strahhmgs-Sperrschicht (14; 34; 44) aus einer hydrophilen KoDoidschicht besteht, in der ein
Pigment verteilt vorliegt und daß die Registrierschicht (12; 32; 42) aus einer hydrophilen Kolktidschicht besteht.
5. Analytisches Element nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die so
Regiieschicht (12; 32; 42) ein Beizmittel für den Stoff B enthält
& Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verteilerschicht (26; 38; SO)
aus einem sog. »BhisheoVPoh/mer besteht oder ein
solches enthalt
7. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahhmgs-Sperrschicht
(14; 34; 44) ein aus einem wasser-resistenten »Bhtthedc-Porymer oder einem Pigment bestehen- u>
des Trübungsmittel entfaüt,
8. Analytisches Element nach Anspruch 6, dadurch
gekennzeichnet, daß die Verteilerschicht (24; 38; 50)
eine oberflächenaktive Verbindung enthält
9. Analytisches Element nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet daß die Verteilenchicht (26; 38; SO)
zusätzlich ein anorganisches Pigment enthält
10. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus einem
strahlungsdurchlässigen Schichtträger, auf den aufgetragen sind:
eine wasser-resistente, isotrop-poröse Verteilerschicht (26; 38; 50) aus einem »Blushed«-Poiymer,
bestehend aus Celluloseacetat oder einem Polyamid und einem hierin dispergieren anorganischen
Pigment sowie einer oberflächenaktiven Verbindung,
eine wasser-queubare Reagensschicht (16; 24; 36;
46; 48) aus Gelatine, Polyvinylalkohol, Porrolidon, einem Acrylamid, Agarose und/oder einem
Poryucchand mit einem hierin verteilten Stoff A,
eine Strahhmgs-Sperrschicht (14; 34; 44) aus Gelatine, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon,
einem Acrylamid, Agarose und/oder einem Poh/saccharid mit einem hierin verteilten Pigment, bestehend aus Ruß oder Kohlenstoff, Titandioxid und
Bariumsulfat und
eine wasser-queUbare strahlungsdurchlässige Regl·
strierachicht (12; 32; 42) aus einem hydrophilen KoSoid, bestehend aus Gelatine, Folyvinyiaikohoi,
Polyvinylpyrrolidon, einem Acrylamid, Agarose und/oder einem Polysaccharid und einem Beizel
für den Stoff A.
11. Analytisches Element nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht
(16; 24; 36; 46; 48) Glucoseoxidase, Peroxidase und einen Indikator aus einer in Gegenwart von
Wasserspoxid und Peroxidase oxidierbaren Stoff zur Erzeugung eines Farbstoffes enthält
12. Analytisches Element nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator aus
4-Ammoantipyrin · HQ und dem Na-SaIz der
Naphthot-2-sulfonsaure und das Beizmittel in der
Registrierschicht (12; 32; 42) aus einem Copolymeren nut wiederkehrenden Einheiten aus Styrol und
NJ^-rJnnethvl-N-benzyl-3-rnaleiinidopropylMmno-
nd besteht
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