DE3222707A1

DE3222707A1 - Mehrschichtiger analysenfilm zur transaminase-analyse

Info

Publication number: DE3222707A1
Application number: DE19823222707
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Asaki Saitama Amano; Harumi Katsuyama; Oaza Mizonuma
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1981-06-17
Filing date: 1982-06-16
Publication date: 1982-12-30
Also published as: DE3222707C2; US4897347A; JPS57208998A; JPH04640B2

Description

Mehrschichtiger Analysenfilm zur Transaminase-Analyse

Die vorliegende Erfindunc betrifft einen verbesserten mehrschichtigen Analysenf:.lm, der für die hochempfindliche quantitative Analyse der Transaminase-Aktivität geeignet ist.

Verschiedene Transaminasen sind als Enzyme bekannt, die zur Übertragung einer Amino-Gruppe befähigt sind. Von diesen sind es Glutamylpyruvat-Transaminase (GPT) und Glutamyloxaloacetat-Transaminase (GOT), deren Konzentrationen im Blut Hinweise auf Leber-Erkrankungen liefern können, und demzufolge ist die quantitative Analyse der GPT- und GOT-Aktivitäten für die Diagnose von Leber-Erkrankungen von besonderer Bedeutung.

GPT und GOT sind Transaminasen, die jeweils die nachstehenden Reaktionen katalysieren:

GPT
(^-Ketoglutarsäure + L-Alanin -»-

Brenztraubensäure + L-Glutaminsäure (1)

GOT

od-Ketoglutarsäure + L-Asparaginsäure

Oxalessigsäure + L-Glutaminsäure (2)

In der Vergangenheit wurden die Transaminase-Aktivitäten mit Hilfe einer Farbreaktion gemessen, bei der ein Diazo-Farbstoff mit Brenztraubensäure oder Oxalessigsäure, die nach den Gleichungen (1) oder (2) gebildet werden, gekuppelt wird (JP-OS 40191/76). Als eine Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens
wurde ein mehrschichtiger Analysenfilm vorgeschlagen,

bei dem die vorgenannten, nacheinander ablaufenden Reaktionen getrennt in zwei benachbarten Reagensschichten durchgeführt werden sollen. Das Ziel ist, daß das Gleichgewicht der Enzymreaktion der ersten Stufe dadurch erreicht wird, bevor die Kupplungsreaktion der zweiten Stufe beginnt, daß die beiden Reaktionen mit einem geeigneten zeitlichen Abstand durchgeführt v/erden. Der Wirkungsgrad der Reaktion ist jedoch verbesserungsbedürftig, sogar zu Lasten der Reaktionszeit, da die Geschwindigkeit der Kupplungsreaktion größer ist als die Geschwindigkeit der vorangehenden Enzymreaktion. Somit wird diese Methode den derzeitigen Bedürfnissen der Praxis insofern nicht gerecht, als die Reaktionszeit (Dauer der Analyse) soweit wie möglich abgekürzt werden sollte; darüber hinaus ist auch die Empfindlichkeit dieser Nachweismethode weit davon entfernt, den Ansprüchen zu genügen.

Weiterhin wurde eine Methode zur quantitativen Bestimmung der Aktivitäten verschiedener Transaminasen vorgeschlagen, bei der Brenztraubensäure direkt, wie in der vorstehenden Gleichung (1) dargestellt, oder indirekt aus der nach Gleichung (2) gebildeten Oxalessigsäure mittels einer Reaktion entsteht, bei der ein anderes Enzym beteiligt sein kann oder auch nicht, wonach Hy-

drogenperoxid - gebildet aus Brenztraubensäure durch Pyruvatoxidase (POP) entsprechend Gleichung (3) - , eine Farbindikator-Zusammensetzung und eine Peroxidase entsprechend Gleichung (5) einen Farbstoff bilden. Anschließend kann die auftretende Farbintensität kolorimetrisch gemessen werden (vgl. beispielsweise die JP-OS 13068/80)). Das Prinzip dieser Methode wird durch die nachstehenden Gleichungen erläutert:

«!-Ketoglutar säure + L-Asparaginsäure

Oxalessigsäure + L-Glutamin-

säure

Oxalessigsäuredecarboxylase (4)

o{-Ketoglutarsäure _rprp (1)

+ L-Alanin

Brenztraubensäure + L-Glutamin-

säure

POP

FAD + M⁺ (3)

TPP

Wasserstoff-Donator Kuppler

'ι)

+ Acetylphosphat +

POD

(5)

Farbstoff

In diesen Gleichungen bezeichnen:

GOT: Glutamylöxaloacetat-Transaminase; GPT: Glutamylpyruvat-Transaminase; 20 Pi: anorganisches Phosphat; POP: Pyruvatoxidase; FAD: Flavinadenindinucleotid; TPP: Thiaminpyrophosphorsäure;

2+ M : zweiwertiges Metall; POD: Peroxidase-

Das heißt, Brenztraubensäure, die durch die GPT-Enzymreaktion der Gleichung (1) oder durch eine Reaktion,

bei der die durch die GOT-Enzymreaktion der Gleichung (2) gebildete Oxalessigsäure unter Einwirkung der Oxalessigsäuredecarboxylase in Brenztraubensäure überführt wird, entsteht, bildet aufgrund der POP-Enzymreaktion der Gleichung (3) , die in beiden Vorgängen konjugiert abläuft, Hydrogenperoxid.

Die POD-Enzymreaktion, bei der das so gebildete Hydrogenperoxid Substrat ist, bewirkt die Kupplungsreaktion der Gleichung (5) zwischen einem Wasserstoff-Donator und einem Kuppler, wodurch ein Farbstoff gebildet wird, der dann einer quantitativen kolorimetrischen Bestimmung unterworfen wird.

Nach dieser Methode wird eine chemische Reaktionsfolge, wie sie oben beschrieben ist, in wäßriger Lösung durchgeführt. Zu einer in hohem Maße wirkungsvollen Durchführung dieser komplizierten Reaktionen sind jedoch eine genaue Kontrolle des Gewichts oder Volumens der Bestandteile und die unbequeme Handhabung wäßriger Lösungen nötig, und weiterhin erfordert die analytische Arbeitsweise eine beträchtliche Zeit. Dementsprechend genügt die genannte Methode nicht den Anforderungen der klinischen Praxis, wo es sowohl auf Schnelligkeit als auch auf Genauigkeit ankommt.

Die normale Transaminase-Konzentration im Blut des gesunden Menschen beträgt höchstens 20 I.E./l, und die Menge des Substrates, auf dem die Transaminase-Enzymreaktion während einiger zehn Minuten bei der Messung nach dem Verfahren gemäß dem Stand der Technik abläuft, liegt unter optimalen Bedingungen in der Größenordnung

-4
von 10 mol/1. Bei einer Methode zur kolorimetrischen

Bestimmung derartiger Spurenmengen des Substrats unter Einsatz einer konjugierten Enzymreaktion ist es zur Aufrechterhaltung der Genauigkeit der Ergebnisse und zur Verkürzung des Zeitaufwands für die Durchführung
der Analyse erforderlich, daß

(1) jede Reaktion vollständig abläuft,

(2) der gebildete Farbstoff eine hohe Extinktion
aufweist,

(3) der Farbstoff stabil bleibt, bis er photometrisch gemessen ist, und

(4) bei einer kolorimetrischen Bestimmung mittels
eines Films für die quantitative Analyse der Farbstoff vor der Messung nicht durch Wanderung oder Diffusion verloren geht.

Im Hinblick auf diese Bedingungen wurden seitens der Anmelderin eingehende Untersuchungen durchgeführt. Dabei wurde gefunden, daß die Zufuhr des Sauerstoffs, eines der Substrate von Oxidasen, der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der durch das oben angegebene

Reaktionsschema beschriebenen Reaktionsfolge ist und daß die Geschwindigkeit, mit der Hydrogenperoxid, eines der Substrate der Reaktionsfolge, von einer Schicht des mehrschichtigen Analysenfilms zu einer anderen wandert, um vieles größer ist als die Wanderungsgeschwindigkei-

ten anderer Substrate oder Produkte. Auf diesen Befunden beruht die vorliegende Erfindung.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein mehrschichtiger Analysenfilm, bei dem jeder der für die quantitative Analyse der Transaminase-Aktivität verwendeten und zur Erzeugung von Hydrogenperoxid beitragenden Bestandteile in einer speziellen Schicht vorliegt.

_ ο

Ein mehrschichtiger Analysenfilm gemäß der vorliegenden Erfindung besitzt eine solche Struktur, bei der eine ein Transaminase-Substrat enthaltende poröse Schicht, eine Farbindikator-Schicht zum Hydrogenperoxid-Nachweis und ein transparenter Träger in dieser Reihenfolge integriert laminiert sind. Die poröse Schicht kann weiterhin Brenztraubensäureoxidase (im folgenden als POP bezeichnet) enthalten, aber POP muß nicht immer zusammen mit dem Substrat vorliegen, sondern kann sich auch in einer anderen Schicht (als Enzymschicht bezeichnet) befinden, die in fließfähige Berührung (durch ein Gas oder eine Flüssigkeit) mit der porösen Schicht gelangt und auf die Farbindikator-Schicht laminiert ist. In der vorliegenden Beschreibung bezeichnet der Begriff "fließfähige Berührung" Zonen, die miteinander in einer solchen Weise verbunden sind, daß unter den Bedingungen der praktischen Anwendung ein fließfähiger Stoff, ob gasförmig oder flüssig, von einer Zone in die andere übertreten kann.

Wenn POP in die oberste Schicht oder den oberen Teil des mehrschichtigen Analysenfilms gegeben wird, kann wie oben beschrieben ein Enzym oder eines der Substrate für POP in wirksamerer Weise aus der Luft zugeführt werden, zusätzlich zu dem Sauerstoff, der in einer zu untersuchenden Lösung gelöst ist (vgl. Gleichung (3)). Aufgrunddessen wird für eine POD-Enzymreaktion (vgl. Gleichung (5)), die mit der Reaktion nach Gleichung (3) gekoppelt ist, Hydrogenperoxid, das ein Substrat des POD ist, hinreichend und rasch gebildet.

Das so gebildete Hydrogenperoxid diffundiert sofort zu der Indikatorscliicht und wandert in diese hinein, wo ein farbstoffbildendes Reagens, etwa ein Kuppler., mit ihm unter Bildung eines gefärbten Produkts reagiert.

Bei dem mehrschichtigen Analysenfilm gemäß der vorliegenden Erfindung ist es wichtig, daß der aus der Luft eingespeiste Sauerstoff die Reaktionsgeschwindigkeit des gesamten Reaktionssystems bestimmt und das Hydrogenperoxid die größte Beweglichkeit zwischen den Schichten besitzt und demi:ufolge zwischen den Schichten wandert, so daß aus diesea Gründen POP an jeder beliebigen Stelle angeordnet werden kann, so lange es diese Vorgänge zuläßt; im allgemeinen wird POP jedoch in die

das Transaminase-Substrat enthaltende obere poröse Schicht oder in eine dieser in Richtung auf den Träger benachbarte Schicht gegeben. Da diese Schichten uneingeschränkt oder zumindest im wesentlichen mit Luft in Berührung gelangen, läuft die Reaktion der Gleichung

(3) rasch ab.

Das Reaktionsprodukt oder Hydrogenperoxid ist farblos und beginnt dementsprechend seine Wanderung unter solchen Bedingungen, die kolorimetrisch nicht nachweisbar sind, und erreicht sofort die Indikator-Schicht, wo
dann ein nachweisbares gefärbtes Produkt gebildet wird. Für die vorliegende Erfindung ist es sehr wichtig, daß der zwischen den Schichten wandernde Stoff nicht nachweisbar ist.

Bei dem oben beschriebenen Verfahren nach dem Stand der Technik besteht die Möglichkeit, daß ein in Wanderung befindliches gefärbtes Reaktionsprodukt bei der kolorimetrischen Messung miterfaßt wird, sofern nicht die Analyse nach relativ langer Zeit, während der die Wanderung des gefärbten Reaktionsprodukts in die Reaktionsschicht beendet und dieses an einer Nachweisschicht fixiert wird, durchgeführt wird, da das gefärb-

lote Produkt mit relativ niedriger Wanderunsgeschwindigkeit von der Reaktionsschicht zu der Nachweisschicht wandert. Im Gegensatz hierzu besteht eine solche Möglichkeit bei der vorliegenden Erfindung nicht, bei der der wandernde Stoff nicht nachweisbar ist.

Die Fig. 1 bis Fig. 9 zeigen vergrößerte Schnittansichten verschiedener Ausführungsformen des mehrschichtigen Analysenfilms der vorliegenden Erfindung.

Die Fig. 10 zeigt eine graphische Darstellung der Farbdichten, die 10 min nach der Inkubation der Analysenfilme (A), (B) bzw. (C), die gemäß Beispiel 1, Bezugsbeispiel 1 bzw. Beispiel 2 erhalten wurden, gemessen wurden, wobei die Enzym-Aktivitäten (in I.E./l) auf der Abszisse und die optischen Dichten bei 550 nm auf der
Ordinate aufgetragen sind.

Die in den Zeichungen angegebenen Bezugszahlen haben die folgenden Bedeutungen:

1 ist eine poröse, TA- (Transaminase-) Substrat und POP enthaltende Schicht,

11 ist eine poröse, ein TA-Substrat enthaltende

Schicht,
12 ist eine POP-Enzym-Schicht,

2 ist eine Farbindikator-Schicht,

21 ist eine ein Beizmittel enthaltende Farbindikator-Schicht,

22 ist eine ein Beizmittel und TiO₂ enthaltende Farbindikator-Schicht,

3 ist ein Träger,

40 ist eine TiO„ enthaltende lichtblockierende Schicht und
50 ist eine Beizschicht.

Transaminasen, deren Aktivitäten gemäß der vorliegenden Erfindung gemessen werden können, sind solche, die speziell unter der Klassifizierungs-Nr. 2.6.1 der Enzyme Nomenclature, Ausgabe 1972, erschienen bei der Elsevier Co. (1973) unter Zustimmung der International Union of Biochemistry, beschrieben sind, wie

Glutaroxaloacetat-Transaminase (GOT),
Glutarpyruvat-Transaminase (GPT),
L-Aspartat:2-Oxoglutarat-Aminotransferase
(EC 2.6.1.1),

L-Alanin:2-0xoglutarat-Aminotransferase

(EC 2.6.1.2) ,
Älanin-Glyoxylsäure-Transaminase

(EC 2.6.1.44) und
ß-Alanin-Transaminase (EC 2.6.1.18).

Eine indirekte Reaktion, bei der Brenztraubensäure erzeugt wird, kann eine solche sein, bei der eine andere Enzymreaktion wie durch Gleichung (4) dargestellt beteiligt ist, oder eine nicht-enzymatische chemische

Reaktion. Generell kann jeder Vorgang, bei dem eine enzymatische oder chemische Reaktion in Verbindung mit einer Transaminase-Reaktion zur Erzeugung von Hydrogenperoxid als Endprodukt auf dem Wege über Brenztraubensäure benutzt wird, eingesetzt werden. Hiervon sind die analytischen Nachweise der Aktivitäten von GOT und GPT diagnostisch am bedeutsamsten.

Die Substanz, die Substrat für die Transaminase ist, braucht lediglich eine Amino-Gruppe aufzuweisen, und da Fachleuten die Beziehung in einem Substrat-Enzym-Paar
wohlbekannt ist, bedarf es hierzu keiner weiteren Erläuterungen.

Transaminase ist ein Enzym, das die Übertragung der Amino-Gruppe einer Aminosäure auf eine «f-Ketosäure fördert. Das Substrat für Transaminase umfaßt die Aminosäure und die o^-Ketosäure.

Die in dem mehrschichtigen Analysenfilm gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete POP wird gewöhnlich durch einen POP-Aktivator aktiviert, um die Reaktion zu beschleunigen. Zu Beispielen für den POP-Aktivator zählen Coenzyme, anorganische Phosphate, zweiwertige Metallionen und dergleichen.

Der POP-Aktivator wird im allgemeinen in einer Menge

-9 -5
von 10 bis 10 mol pro POP-Einheit eingesetzt.

Zu den typischen Coenzymen gehören Flavinadenindinucleotid, Thiaminpyrophosphat etc.; typische anorganisehe Phosphate sind primäres und sekundäres Natriumphosphat, primäres und sekundäres Kaliumphosphat etc., und zu den typischen zweiwertigen Metallionen zählen

2+ 2+ 2+ ^+ 3+
Mg ,Mn ,Ca , Co'" , Al und dergleichen.

Die in der vorliegenden Erfindung verwendete poröse Schicht kann faseric' oder nicht-faserförmig sein. Als poröses faserförmiges Material können Papier wie Filterpapier, synthetisches Gewebe, Vlies und Polyethylen-Pulpe, sowie.Textilstoffe wie natürliche oder synthetische Gewebe, insbesondere solche mit Leinenbindung, verwendet werden. Spaziellc Beispiele für solche Materialien sind im einzalnen in der JP-OS 164356/80 (entsprechend der US-PS 4 292 272) beschrieben. Darüber hinaus können Membrarfilter oder Perlen, etwa aus Glas, Polymerisaten, Keramik-Materialien, oder Gemische aus diesen als poröses, nicht-faseriges Material verwendet

werden. Spezielle Beispiele für solche Materialien sind in der JP-Patentveröffentlxchung 21677/78 (entsprechend der US-PS 3 992 158) beschrieben.

Die Porengröße der porösen Schicht liegt im Bereich von 0,05 bis 300 μπι, vorzugsweise 0,1 bis 100 μπι.

Der Grad der Porosität der porösen Schicht liegt im allgemeinen innerhalb des Bereichs von 25 bis 85 %, vorzugsweise von 40 bis 85 %.

Die poröse Schicht besitzt im allgemeinen eine Dicke im Bereich von 50 bis 500 μπι, vorzugsweise von 100 bis 400 μπι.

Die poröse Schicht kann auch als Spreitungsschicht mit definierter Flächengröße wirken, so daß eine Menge einer Flüssigkeitsprobe, die in der porösen Schicht gehalten wird, durch die definierte Fläche bestimmt wird und die so bestimmte Menge der Flüssigkeitsprobe auf eine darunter liegende Schicht in gleicher Menge und Fläche wie in der porösen Schicht übertragen wird.

Solche porösen Materialien werden mit einer Lösung getränkt, die ein Transaminase-Substrat oder ein Gemisch aus einem Transaminase-Substrat und POP enthält, wodurch eine poröse Schicht erhalten wird. Sofern die poröse Schicht nur ein Transaminase-Substrat enthält, kann das POP zur Bildung einer POP-Enzymschicht (einer
Enzymschicht), die der porösen Schicht benachbart ist, aufgetragen werden. Die POP-Enzymschicht besitzt im allgemeinen eine Dicke von 1 bis 100 μια, vorzugsweise von 5 bis .50 μπ\.

Die Farbindikator-Schicht zum Hydrogenperoxid-Nachweis
besitzt im allgemeinen eine Dicke von 1 bis 100 μπι, vorzugsweise von 5 bis 50 μΐη, und besteht aus einer

Zusammensetzung, die durch Dispersion eines Kupplers und eines Wasserstoff-Donators in einem bekannten hydrophilen Bindemittel wie Gelatine, Polyvinylalcohol, Polyvinylpyrrolidon, Agarose, Natrium-polyvinylbenzolsulfonat und dergleichen hergestellt wurde.

Sobald der Analyt festgelegt ist, wird dementsprechend die Imprägnierungsrate bestimmt; sie liegt aber im allgemeinen innerhalb der nachstehend angegebenen Bereiche:

Allgemeiner Bevorzugter

Bereich Bereich

Substrat(g/m²) 0,5 - 500 1 - 150

Kuppler (g/m²) 0,01- 5 0,1- 3 Wasserstoff-Donator

(g/m²) 0,01 - 5 0,1-3

POP (I.E./m²) 500 - 100 000 1 000 - 50 000 Oxalessigsäuredecarb-

oxylase (I.E./m²) 500 - 100 000 1 000 - 50 000

Coenzym (mg/m²) 0,01 - 10 000 0,1 - 5 000

Vorzugsweise wird ein einen kationischen Farbstoff bildendes System als Farbindikator-System für den Hydrogenperoxid-Nachweis verwendet, und besonders bevorzugt benutzt werden 4-Aminoantipyrin oder ein N,N-disubstituiertes p-Phenylendiamin als Wasserstoff-Donator und eine Kombination eines Ν,Ν-disubstituierten Anilin-Derivats und eines anionischen Polymerisats als Kuppler.

Ein solches System besitzt viele Vorteile, und zwar ist der Wirkungsgrad der Umwandlung in das gefärbte Reaktionsprodukt hoch, der gebildete kationische Farbstoff

besitzt eine hohe Extinktion, das gefärbte Reaktionsprodukt (der Farbstoff) kann in wirksamer Weise fixiert werden, und infolgedessen ist die analytische Nachweisempfindlichkeit bemerkenswert hoch.

Als Träger werden zweckmäßigerweise bekannte wasserundurchlässige transparente Film-Materialien wie Polyethylenterephthalat, Celluloseester (Cellulosediacetat, Cellulosetriacetat, Gelluloseacetat-propionat und dergleichen) , Polycarbonat, Polymethylmethacrylat oder
eine Glasplatte mit einer Dicke von etwa 50 μΐη bis etwa 2 mm verwendet.

Außerdem können auch transparente Träger wie oben beschrieben, in denen ein Pigment wie Ruß, Titanoxid;oder Kupferphthalocyanin dispergiert ist, oder nicht durchscheinende Träger wie Abziehpapier verwendet werden. In diesem Fall wird nach Beendigung der Analyse und vor der anschließenden kolorimetrischen Messung der Träger entfernt.

Neben der oben beschriebenen Grundstruktur (vgl. die
Fig. 1 und 2) kann der mehrschichtige Analysenfilm gemäß der vorliegenden Erfindung auch andere verschiedenartige Strukturen besitzen oder funktionelle Hilfsschichten enthalten, etwa eine farbmaskierende Schicht, lichtblockierende Schicht, lichtreflektierende Schicht, Haftschicht und/oder Beizschicht (Dicke jeweils 1 bis 50 μΐη, vorzugsweise 1 bis 30 μπι) , die in üblicher Weise hergestellt werden können. Repräsentative Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung mit solchen Hilfsschichten sind in den Fig. 3 bis 9 dargestellt.

Die Schichtdicke der strahlungsblockierenden oder lichtabsorbierenden Schicht liegt im allgemeinen im Bereich von 1 bis 50 μΐη, vorzugsweise von 2 bis 10 μΐη.

Der mehrschichtige Analysenfilm gemäß der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise dadurch hergestellt werden, daß eine Schicht' in innige Berührung mit einer anderen Schicht gebracht wird, falls erforderlich oder erwünscht nach Befeuchten der Oberflächen der Schichten mit Wasser oder einer wäßrigen Lösung eines oberflächenaktiven Mittels, und die Schichten zwischen Druckwalzen hindurchgeschickt werden, wodurch ein Laminat gebildet wird.

Die analytische Arbeitsweise kann im allgemeinen folgendermaßen durchgeführt werden: Eine Eichkurve für den mehrschichtigen Analysenfilm gemäß der vorliegenden Erfindung wird in der Weise hergestellt, daß handelsübliche Eichlösungen, die Transaminase in Konzentrationen von 0 bis 8 00 I.E./l enthalten, auf den Film aufgetropft und dieser etwa 30 s bis etwa 20 min bei 37⁰C inkubiert wird und anschließend die in der Farbindikator-Schicht erzeugte Färbungsdichte spektralphotometrisch durch den transparenten Träger hindurch bestimmt wird. Eine Flüssigkeitsprobe mit unbekanntem Transaminase-Gehalt wird dann auf getrennte, jedoch identische Filmproben aufgetropft, und der Transaminase-Gehalt wird jeweils mit Hilfe der vorher hergestellten Eichkurve bestimmt.

Im allgemeinen beträgt die Gesamt-Analysendauer etwa 3 bis etwa 30 min.

Der auf diese Weise hergestellte mehrschichtige Analysenfilm besitzt die folgenden Vorteile:

(1) Die Zeitdauer für die gesamte Analyse wird verkürzt, da die Sauerstoff-Zufuhr (d.h. die Einwirkung der Luft), die der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Reaktion ist, mit einem

hohen Wirkungsgrad erfolgt.

(2) Eine bemerkenswert hohe Empfindlichkeit wird
erreicht, da Hydrogenperoxid, das eine kolorimetrisch nicht nachweisbare chemische Species ist, als primärer wandernder Stoff dient, d.h.

der Vorgang findet vom Beginn bis zur Oxidase-

Reaktion in einer oberen Schicht statt, wo die Entfernungen der Diffusion und Wanderung kurz sind, und die Farbbildungsreaktion findet in einer dem transparenten Träger benachbarten

Indikator-Schicht statt, wodurch ein hoher Wir

kungsgrad des Nachweises gegeben ist.

(3) Eine hohe Genauigkeit wird erzielt, da das Produkt der Transaminase-Reaktion mit hohem Wirkungsgrad in einen nachweisbaren Farbstoff

überführt wird.

(4) Als Folge der angeführten Vorteile wird der
Bereich, in dem die Transaminase-Aktivität gemessen werden kann, ausgeweitet.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele
näher erläutert. In diesen Beispielen wurden, sofern nichts anderes angegeben ist, die Schichten 30 min bei 15⁰C und 30 min bei 40⁰C getrocknet.

- 18 Beispiel 1

Auf einen farblosen transparenten Polyethylenterephthalat- (PET-) Film (einen photographischen Träger) wurde eine Farbstoff-Fixierschicht der folgenden Zusammensetzung aufgebracht, wodurch eine Schicht von 10 μπι Dicke im trockenen Zustand erhalten wurde.

Zusammensetzung der Beschichtungsflüssigkeit für die Farbstoff-Fixierschicht:

Gelatine 5,0 g

Kaliumpolystyrol-4-sulfonat 2,5 g

(Molekulargewicht 340 000)

Oberflächenaktives Mittel 10 G® 0,50 g (ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, hergestellt von Olin Chemicals Co.,

p-Octylphenoxypolyethoxyethanol) Bis(vinylsulfonylmethyl)ether 0,20 g Glycerin 1 g

Wasser 100 ml

Auf diese Farbstoff-Fixierschicht wurde eine Beschichtungsf lüssigkeit der folgenden Zusammensetzung aufgetragen, wodurch eine Farbindikator-Schicht von 15 μπι Dicke im trockenen Zastand erhalten wurde.

Zusammensetzung der Beschichtungsflüssigkeit für die Farbindikator-Schicht:

Ν,Ν-Bis(ß-hydroxyethyl)-m-

toluidin

4-Aminoantipyrin-hydrochlorid Gelatine
POD (EC 1.11.1.7)

Oberflächenaktives Mittel 10 G Bis(vinylsulfonylmethyl)ether VJa s se r

O	,20	g
O	,24	g
15		g
500		I.E.
0	,50	g
0	,38	g
100		ml

- in -

Auf diese Schicht wurde dann eine Beschichtungsflüssigkeit der folgenden Zusammensetzung aufgetragen, wodurch eine lichtblockierende Schicht von 7 μπι Dicke im trokkenen Zustand erhalten wurde.

Zusammensetzung der Beschichtungsflüssigkeit für die lichtblockierende Schicht:

Feinteiliges TiO„-Pulver 19,5 g Gelatine 6,8 g

Natriumdioctylsulfosuccxnat 1,0 g Wasser 87 ml

Auf diese lichtblockierende Schicht wurde dann eine Beschichtungsflüssigkeit der folgenden Zusammensetzung aufgetragen, wodurch eine Pyruvatoxidase-Schicht (POP-Schicht) von 10 μΐη Dicke im trockenen Zustand erhalten wurde.

Zusammensetzung der Beschichtungsflüssigkeit für die POP-Schicht:
Gelatine

POP (EC 1.2.3.3) 5

20 FAD

TPP

Oberflächenaktives Mittel 10 G^ Wasser

5 Sodann wurde eine Lösung eines GPT-Substrates der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

Natrium-oC-ketoglutarat 3,8 g

L-Alanin 35,6 g

Dinatriumhydrogenphosphat.12H„O 10,9 g Natriumdihydrogenphosphat 3g

Polyacrylamid 2 g

Oberflächenaktives Mittel 10 G^ 2 g Wasser 400 ml

10	,1	g
000		I.E.
4		mg
92	,50	mg
47		mg
0	g
100	ml

Ein Filterpapier für die Elektrophorese mit glatter Oberfläche (Dicke 400 \im) wurde in die erhaltene GPT-Substratlösung getaucht und zwischen Silicongummi-Walzen, die im Abstand von 500 μΐη zueinander angeordnet
waren, hindurchgeschickt, um eine gleichmäßige Imprägnierung mit der Lösung zu erreichen. Dann wurde das Filterpapier auf der Oberfläche einer ebenen Glasplatte von selbst trocknen gelassen.

Das mit der GPT-Substratlösung imprägnierte Filterpapier wurde als eine eine TA-Substrat-Zusammensetzung enthaltende poröse Schicht verwendet. Die poröse Schicht wurde auf den vorher mit einer wäßrigen Lösung des oberflächenaktiven Mittels 10 G^ (2 Vol.-%) befeuchteten, mit mehreren Schichten überzogenen PET-FiIm aufgepreßt und dann getrocknet, so daß sie mit diesem fest verbunden war. Auf diese Weise wurde ein mehrschichtiger Analysenfilm für die quantitative Analyse von GPT (A) hergestellt.

Bezugsbeispiel 1

In dem mehrschichtigen Analysenfilm (A) wurde an Stelle der POP-Schicht eine Beschichtungsflüssigkeit der folgenden Zusammensetzung unter Zusatz der POP hergestellt und aufgetragen, wodurch eine Farbstoff-Bildungsreagensschicht von 18 μίτι Dicke im trockenen Zustand erhalten wurde. In diesem Falle betrug die POP-Menge das 1,5-fache der in Beispiel 1 verwendeten Menge, und aus diesem Grunde wurden auch die Mengen der Pyruvatoxidase-Aktivatoren FAD, TPP und MgCl₂ in dem gleichen Verhältnis erhöht. Die POD-Menge war jedoch die gleiche wie in Beispiel 1, da die schließlich zu messende Färbung aufgrund der Enzymreaktion der POD mit H₃O₃ entsteht, das durch die POP-Enzymroaktion gebildet wird.

0,20	g
0,24	g
15	g
7 500	I.E.
8 000	I.E.
6,2	mg
138	mg
^ ⁷⁰'⁷	mg
£J 0,50	g
0,38	g
100	ml

Zusammensetzung der BeE;chichtungsflüssigkext für die POP-Farbstoff-Bildungsreagensschicht:
N,N-Bis (ß-hydroxye'thyl) -m-

toluidin

4-Aminoantipyrin-hydrochlorid

Gelatine

POD (EC 1.11.1.7)
POP (EC 1.2.3.3)
FAD
TPP

MgCl₂

Oberflächenaktives Mittel 10 G

Bis (vinylsulfonylirethyl) ether

Wasser

Auf den erhaltenen, mit mehreren Schichten überzogenen Film wurde die oben beschriebene, die TA-Substrat-Zusammensetzung enthaltende poröse Schicht, d.h. das mit der GPT-Zusammensetzung imprägnierte Filterpapier, im feuchten Zustand aufgepreßt, wodurch ein mehrschichti-

ger Analysenfilm für die quantitative Analyse von GPT (B) hergestellt wurde.

Die so erhaltenen Analysenfilme (A) und (B) wurden zu Proben von 0,5 cm² zerschnitten. Im Handel erhältliche Kontroll-Sera, denen verschiedene Mengen GPT-Enzym zugesetzt worden waren, wurden auf die TA-Substrat-Schicht der Proben aufgetropft.

Test-Verfahren:

Die vorbezeichneten Filmproben wurden zur Verhinderung der Verdampfung von Wasser in Kunststoff-Diapositiv-

Rähmchen montiert und bei 37°C inkubiert. Die Inkubation wurde 20 min lang durchgeführt, und während dieser Zeit wurde die optische Dichte in zeitlichen Abständen von 30 s mit Hilfe eines Spektralphotometers gemessen.

Die Änderung der Farbdichte mit der Zeit wurde aufgetragen; die Ergebnisse sind in Fig. 10 dargestellt.

Wie aus Fig. 10 hervorgeht, ist der GPT-Analysenf ilm gemäß dem Stand der Technik (B), obwohl er die 1,5-fache Menge POP enthält, dem GPT-Analysenfilm gemäß der vorliegenden Erfindung (A) hinsichtlich der Farbdichte unterlegen, und auch der Analysenbereich des Films (B) ist enger als derjenige des Films (A).

Bezugsbeispiel 2

Mit Hilfe der folgenden Arbeitsweise wurde ein GPT-Analysenfilm (B') ähnlich wie in Bezugsbeispiel 1 hergestellt.

(1) Die Mengen an FAD, TPP und MgCl₂ (POP-Aktivatoren) waren die gleichen wie in Beispiel 1.

(2) 3 400 I.E. POP wurden der Farbstoff-Bildungsreagensschicht zugesetzt, da diese Menge im

Verhältnis zu derjenigen des POP-Aktivators stand.

(3) Die übrigen Bedingungen waren die gleichen wie in Bezugsbeispiel 1.

Auf diese Weise wurden die gleichen POP-Mengen in sämtlichen Beispielen für den Analysenfilm (A) gemäß der vorliegenden Erfindung und die Analysenfilme zu Vergleichszwecken (B) ur.d (B') verwendet.

Bei den Analysenfilmen zu Vergleichszwecken (B) und (B') wurde die Geschwindigkeit des Auftretens der Färbung beobachtet.

Proben - jeweils 20 μ.1 einer wäßrigen 10 M Pyruvat-Lösung - wurden auf die Analysenfilme (B) und (B') aufgetropft, und Geschwindigkeit des Auftretens der Färbung wurde unter Verwendung eines Reflexions-Spektralphotometers in ähnlicher Weise wie in Bezugsbeispiel 1 gemessen. Die Farbdichte cos Analysenfilms (B') betrug
nur 80 % derjenigen des Aralysenfilms (B).

Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Untersuchung des Kontroll-Serums, das 140 I.E./l GPT enthielt, erhalten.

Aus den Ergebnissen des Beispiels 1 und der Bezugsbeispiele 1 und 2 geht hervor, daß der Analysenfilm (A) gemäß der vorliegenden Erfindung selbst dann, wenn die eingesetzte POP-Menge nur 2/3 derjenigen des Analysenfilms (B) beträgt, eine wesentlich höhere Farbdichte als letzterer liefert und einen breiteren Bereich für
die quantitative Analyse umfaßt, und damit werden die vorgenannten Vorteile der vorliegenden Erfindung noch weiter vergrößert, wenn die gleiche Menge an POP-Aktivator wie in dem Vergleichsfilm eingesetzt wird.

Beispiel 2

An Stelle der POP-Substratschicht des in Beispiel 1 beschriebenen GPT-Analysenfilms (A) wurde eine ausschließlich aus Gelatine bestehende Zwischenschicht aufgetragen, wodurch eine Membran von 5 μιη Dicke im trockenen Zustand erhalten wurde.

Dann wurde ein Filterpapier für die Elektrophorese mit glatter Oberfläche (Dicke 400 um) in Stücke von 0,5 cm² zerschnitten und im feuchten Zustand in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 auf den mit mehreren Schichten überzogenen Film gepreßt (laminiert).

POP und dessen Coenzyme wurden der GPT-Substrat-Zusammensetzung des Beispiels 1 zugesetzt, wodurch eine GPT-Substrat-POP-Lösung der folgenden Zusammensetzung hergestellt wurde.
Zusammensetzung der GPT-Substrat-POP-Lösung:

Natrium-ot-ketoglutarat 3,8 g

L-Alanin 35,6 g

Dinatriumhydrogenphosphat.l2H₂0 10,9 g Natriumdihydrogenphosphat. 2H₂O 3 g

POP (EC 1.2.3.3) 40 000 I.E.

FAD 33 mg

TPP 740 mg

MgCl₂ 370 mg

Gelatine 2 g

Oberflächenaktives Mittel 10 G^ 5 g

Wasser 400 ml

Die auf 0⁰C gekühlte GPT-Substrat-POP-Lösung (20 μΐ) wurde auf das an dem oben beschriebenen, mehrere Schichten umfassenden Film haftende Filterpapier aufgebracht und dann oiner raschen Gefriertrocknung im Vakuum unterworfen, wodurch ein Analysenfilm für die GPT-Analyse (C) erhalten wurde.

Die Prüfung der Leistungsfähigkeit des Analysenfilms (C) wurde ähnlich wio in Beispiel 1 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in (!or Fig. 10 dargestellt.

- 25 -Beispiel 3

In dem in Beispiel 2 beschriebenen Analysenfilm für die GPT-Analyse (C) wurde an Stelle der lichtblockierenden Schicht ein Membranfilter (Fuji Microfilter® FM-500
(mittlere Porengröße 5 lim) , hergestellt von der Fuji Photo Film Co.)/ das in Kreisform mit 9 mm Durchmesser zugeschnitten worden war, mittels des Naßpreßverfahrens ähnlich wie in Beispiel 2 laminiert.

Sodann wurden 10 μΐ der Lösung der in Beispiel 2 beschriebenen GPT-POP-Zusammensetzung darauf getropft, und das Verbundmaterial wurde der Gefriertrockung unterworfen, wodurch ein Analysenfilm für die GPT-Analyse (D) erhalten wurde.

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 wurden 10 μΐ eines im Handel erhältlichen Kontroll-Serums mit einer GPT-Aktivität von 105 I.E./'l auf den Analysenfilm auf getropft, und dieser wurde 10 min bei 37°C inkubiert. Die GPT-Aktivität wurde aufgrund der Geschwindigkeit der Farbentwicklung mit der Zeit überwacht. Die Farbentwicklung nahm mehr als 20 min lang linear zu, und die Geschwindigkeit betrug etwa das Dreifache derjenigen des Analysenfilms für die GPT-Analyse (C).

Beispiel 4

Ein Filterpapier für die Elektrophorese (Dicke 500 μΐη)
wurde an Stelle des Membranfilters von Beispiel 3 eingesetzt und mit der nachstehenden GOT-Substrat-Enzym-Lösung imprägniert und nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 getrocknet. Es wurde dann auf den mehrere Schichten umfassenden Film wie in Beispiel 3 naß aufgepreßt und mit diesem haftend verbunden.

GOT-Substrat-Enzym-LÖsung:

L-Asparagxnsaure	FAD	2°	50	g
Natrium-oC-ketoglutarat	TPP	2°	3,0	g
Dinatriumhydrogenphosphat.12H	MgCl₀	40	10,9	g
Natriumdihydrogenphosphat. 2H	Triton^* X-IOO (ein ober-		3	g
POP (EC 1.2.3.3)		50	000	I.E
Oxalessigsauredecarboxylase
(EC 4.1.1.3)		000	I.E
	33	mg
	740	mg
1	g
5	g

flächenaktives Mittel,
hergestellt von der Rohm und
Haas, Co., Ltd.; p-Octylphen-

oxypolyethoxyethanol)
Wasser 400 ml

Der erhaltene Analysenfilm für die GOT-Analyse wurde zu Filmproben von 0,8 cm² zerschnitten und dann in ein für einen trocken arbeitenden Analysenfilm vorgesehenes Kunststoff-Diapositiv-Rähmchen eingesetzt und 2 min bei 37°C vorgeheizt.

Proben - jeweils 30 μΐ - von GOT-Lösungen in physiologischer Kochsalz-Lösung mit Konzentrationen von 53,

104, 210 bzw. 401 I.E./l wurden auf die Filmproben aufgetropft, die öffnung, auf* der sich die Probe befand wurde mit Klebeband verschlossen und nach 10 min Inkubation bei 37⁰C wurde die Farbdichte mit Hilfe eines Reflexions-Spektralphotometers gemessen. Die Ergebnisse 0 sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1

GOT-Aktivität (I.E./l)

53 104 210 401

Färbungsdichte

0,75 1,14 1,42 1,68

Die GOT-Aktivität wurde Drittels des Analysenfilms für die GOT-Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung mit einer hohen Empfindlichkeit über den breiten Konzentrationsbereich hinweg gemessen.

Claims

VON KREISLER SCHÖNWALD EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTING WERNER

Fuji Photo Film Co. , Ltd. Kanagawa, Japan

PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler 11973

Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selting, Köln Dr. H.-K. Werner, Köln

DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF

D-5000 KÖLN 1

14. Juni 1982

W/GF 1017

P a

entansprüche

1Λ Mehrschichtiger Analysenfilm zur Transaminase-Analyse, enthaltend als Bestandteile für die Transaminase-Analyse ein Transaminase-Substrat, eine Pyruvatoxidase, einen Aktivator für die Pyruvat-Oxidase und einen Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens

(1) eine das Transaminase-Substrat enthaltende poröse Schicht,

(2) eine Farbindikator-Schicht zum Hydrogenperoxid-Nachweis und

(3) ein transparenter Träger

in dieser Reihenfolge laminiert sind und die Pyruvatoxidase und der Aktivator für die Pyruvatoxidase in der porösen Schicht oder in einer Enzymschicht, die sowohl mit der porösen Schicht als auch mit der Indikator-Schicht in Berührung steht, enthalten sind.
2. Mehrschichtiger Analysenfilm zur Transaminase-Analyse nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Schicht oder die Enzymschicht Oxalessigsäure und eine Decarboxylase enthält.
3. Mehrschichtiger Analysenfilm zur Transaminase-Analyse nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Schicht eine poröse Spreitungsschicht ist.
4. Mehrschichtiger Analysenfilm zur Transaminase-Analyse • nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Schicht eine poröse Spreitungsschicht mit definierter Flächengröße ist.
5. Mehrschichtiger Analysenfilm zur Transaminase-Analyse nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Aktivator für die Pyruvatoxidase ein Coenzym, eine anorganische Phosphorsäure-Quelle und ein zweiwertiges Metall enthält.
6. Mehrschichtiger Analysenfilm zur Transaminase-Analyse nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Coenzym Flavinadenindinucleotid und Thiaminpyrophosphat ist.