DE2925365C2 - Testmittel zur Bestimmung von Harnsäure in einer Flüssigkeitsprobe - Google Patents

Testmittel zur Bestimmung von Harnsäure in einer Flüssigkeitsprobe

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Description

Z Testmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekenn- io bracht oder in einer Tablette eingebettei ist.
Die Erfindung betrifft Testmittel zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Harnsäure in Körperflüssigkeiten wie Urin oder Blut.
Die oxidative Kupplung zwischen Phenol und 4-Aminophenazon, auch bekannt als 4-Aminoantipyrin, unter Erhalt eines roten Chinonimin-Farbstoffes ist seit
langem bekannt und wurde von Emerson in J. Org. Chem.8 :417(1943)beschrieben.
Diese Umsetzung hat sich in der klinischen Chemie durch die Anwendung von Trinder (Ann. Clin. Biochem, 6:24 (1969)) zur enzymatischen Bestimmung von Glukose, basierend auf dem Reaktionsschema
Glukose + O1
Glukoseoxidase
·> Gluconsäure + HiO.
2H2O, + Phenol + 4-Aminophenazon —
bewährt
Das chromogene System Phenol (einschließlich substituierte Phenole) + 4-Aminophenazon + Peroxidase. das als Emerson-Trinder-System bezeichnet wird, wird zur Zeit zur quantitativen Bestimmung nicht nur von Glukose sondern auch von Cholesterin und Harnsäure in Serum, Plasma und anderen biologischen Flüssigkeiten verwendet. Die Anwendung dieses Systems zur Bestimmung von Glukose wird in US-PS 38 86 045 bzw. Reissue RE 29 498 beschrieben.
Viele Phenole können in der Emerson-Trinder-Reaktion verwendet werden. Beispiele der am häufigsten in der klinischen Chemie verwendeten sind Phenol, p-Hydroxybenzoat, 2,4-Dichlorphenol. 3,5-DichIor-2-hydroxybenzolsulfonsäurc. Ebenso können auch verschiedene substituierte und unsubstiluierte Naphthole verwendet werden.
Die Bestandteile in den Proben, die man bestimmen kann, schließen Glukose. Choleslerin, Harnsäure oder andere Meiaboliten. die durch eine spezifische Oxidase unter gleichzeitiger Bildung von Wasserstoffperoxid oxidiert werden können, ein. Die Oxidase ist Glukoseoxidase zur Bestimmung von Glukose. Cholesterinoxidase zur Besiimmung von Cholesterin (Cholesterinestcrhydroiye wird auch zugegeben, um verestertes Cholesterin zu hydrolysieren) und Uricase /ur Harnsäurcbestimmung.
Die Menge an gebildetem Farbstoff ist proportional der Konzentration an Wasserstoffperoxid und darum der Konzentration des /u bestimmenden Bestandteils in der Probe. Daher kann man die Konzentration des zu bestimmenden Bestandteils in der Probe durch eine einfache Messung der Absorption der Reaktionslösung bestimmen und durch einen Vergleich einer solchen Messung gegenüber einer bekannten Slandardlösung des Bestandteils.
Der gebildete Farbstoff kann im sichtbaren Bereich, irrt allgemeinen zwischen 500 und 550 Nanometer (je nach dem verwendeten Phenol) gemessen werden, und Peroxidase
ChinoniminfarbstofT + 4 11,0
man benötigt nur ein Colorimeter oder ein im sichtbaren Farbbereich arbeitendes Fotometer.
Das Emerson-Trinder chromogene System hat den wesentlichen Nachteil, daß die oxidative Kupplungsreaküor. durch reduzierende Verbindungen und Bilirubin
ji beeinflußt wird, einem Metaboliten, der im allgemeinen in Serum in Konzentrationen von nicht mehr als 1 mg/dl vorliegt, der aber bei einigen Krankheiten sehr hohe Niveaus (20 oder mehr mg/dl) erreichen kann. Mengen an Bilirubin, die die normalen Mengen übersteigen, haben einen Einfluß auf die enzymatischen Glukose·.
Cholesterin- und Harnsäuretests, weil sie die Farbe der Reaktion verringern. Mit zunehmenden Mengen an Bilirubin nehmen die Störungen zu.
Eine Erklärung für die nachteilige Störung von reduzierenden Verbindungen (z. B. Ascorbinsäure) ist sehr einfach, weil diese hauptsächlich als Konkurrenten mit dem Chromogen in der Peroxidase-katalysicrten Reaktion mit Wasserstoffperoxid oder als Bleichmittel gegenüber der gebildeten Farbe wirken. Die Störung
so durch reduzierende Substanzen ist jeüjch kein wesentliches Problem, zumindest nicht im Serum, wo Ascorbinsä·, re selten 3 mg/dl übersteigt.
Dagegen is! die Störung durch Bilirubin ein ganz erhebliches Problem bei der Bestimmung von Metaboli-
5i ten im Serum durch das Emerson-Trinder chromogene Syslem und stellt einen beachtlichen negativen Aspekt dieses Systems in der routinemäßigen l.aborpraxis d.ir. wo 1 lyperbihrubin Proben häufig vorkommen
Der Reaktionsmechanismus von Bilirubin ist sehr komplex und noch nicht ganz bekannt. Wiite hat die bisher beste Erklärung gegeben (Clin- Chem. 1\ 1778 (1078), und schreibt die Störung durch Bilirubin einem öder mehreren der folgenden Faktoren zu: einfache Spcktralwirkung, Wirkung als ein alternatives Pefoxida· sesubstral oder Zerstörung der Peroxidasefeaktions-Zwischen-Produkie.
Aufgabe der Erfindung ist es, einen verbesserten Test zum Nachweis von Harnsäure zu zeigen, der eeiren
störende Einflüsse von Bilirubin weitgehend immun ist.
Diese Aufgabe wird durch ein Testmittel gemäß Patentanspruch 1 gelöst.
Es wurde festgestellt, daß Bilirubin den chromogenen Test des Typs, bei dem ein substituiertes oder ί unsubstituiertes Phenol und 4-Aminophenazon verwendet wird, hauptsächlich durch zwei verschiedene Mechanismen erheblich stört: 1. Durch ein Oberlappen des Spektrums des in der Reaktion gebildeten Farbstoffes, wodurch eine positive Störung eintritt, und 2. durch einen chemischen Mechanismus, wie er vorher schon erwähnt wurde, was eine negative Störung bedingt Die positive Störung, die sich aus dem ersten Mchanismus ergibt, kann vermindert werden, indem man die Absorption bei einer Wellenlänge von 520 nm oder darüber abliest. Dies ist jedoch nicht möglich hinsichtlich des zweiten Mechanismus. Dieser spielt eine außerordentlich wichtige Rolle und verursacht ungenaue Ergebnisse in den vorher erwähnten Bestimmungen, wen Bilimbin in einer Probe in unnormalen Konzentrationen vorliegt.
Im Gegensatz zu den Zusammensetzungen des Standes der Technik sind die der vorliegenden Erfindung hochempfindlich gegenüber der Gegenwart von Harnsäure in Körperflüssigkeit, aber im wesentli- r> chen resistent gegenüber Störungen durch Bilirubin.
Bevorzugte Reagentien. die Ferrocyanidionen enthalten, sind Alkalisalze von Ferrocyaniden, wie Natriumoder Kaliumferrocyanid, und auch viele andere Quellen für Ferrocyanidionen, einschließlich anderer Salze oder jo Systeme, die in der Lage sind, Fe(CN)f,-4-Ionen freizumachen.
Die Testmittel können in Lösung „air Bestimmung von Harnsäure verwendet werden Die zur Herstellung einer solchen Lösung verwende' η Lösungsmittel j> können Wasser, physiologische Lösungen, organische Lösungsmittel, wie Methanol oder Mischungen davon sein.
Die Zusammensetzung wird zum Nachweis von Harnsäure verwendet, indem man sie zu einer Probe, wie Urin. Rückenmarksflüssigkeit, Gewebekulturflüssigkeiten und insbesondere Serum. Plasma oder Gesamtblut gibt.
Wird das Testmittel in Lösung verwendet, so enthält das Reagens die Ferrocyanidionen insbesondere in 4j Konzentrationen von etwa 1,0 Micromol/I bis zu einer gesättigten Lösung. Der günstige Bereich liegt bei etwa 5 μΜοΙ/Ι bis etwa 50 μΜοΙ/Ι. Uricase liegt insbesondere in einer Konzentration von etwa 10 internationalen Einheiten (I. U.)/l bis etwa 200 I. U./I und, falls Peroxidase in den Reagentien enthalten ist, beträgt deren Konzentration insbesondere 10 1. UVI bis clwa 200 I. U./I.
Die En/ymaktivität wird m internationalen Einheilen (I. I') ausgedrückt, wobei I IU. die Menge an ü En/vrniMintät ist. die erforderlich ist. um die Umwandlung von I μ Mol des Substrates pro Minute un'cr genauen pH· und Temperaturbedingungen /ti kai.ilvsieren
D.is rcsimittd kann durch Imprägnieren mit einer f,o Lösung der Zusammensetzung lind Trocknen der imprägnierten Träger hergestellt werden öder auch durch Drucken oder Aufsprühen der Zusammensetzung auf ein Substrat oder eine Matrix. Alternativ kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung auch in einem Träger in Form von Tabletten, enthallend übliche Trägermalerialien eingebettet sein.
Der Ausdruck »Träger« umfaßt Matrices; die unlöslich sind und ihre strukturelle Einheit beibehalten, wenn sie physiologischen oder anderen Flüssigkeiten ausgesetzt werden. Geeignete Matrices schließen Papier, Cellulose, Holz, synthetische Harzvliese, Glasfasern, Gewebe, Vliese, Gelatine, verschiedene organische Polymere, wie Polypropylen, und andere organische Materialien, die filmbildend sind und dem Fachmann bekannt sind, ein. Aus Gründen der Zweckmäßigkeit kann der Träger oder die Untersuchungseinrichung auf einem unlöslichen Träger oder einen der besseren Handhabung dienenden Teil, der z. B. aus Polystyrol hergestellt ist, aufgebracht sein.
Wird das Testmittel zum Nachweis von Harnsäure in Blut verwendet, so wird die Oberfläche der imprägnierten Trägermatrix insbesondere mit einem halbdurchlässigen, transpareten Film aus Äthylcellulose oder einem anderen geeigneten Material bedeckt. Dies kann man bewirken, indem man eine Schicht von Äthylcellulose, gelöst in Benzol, auf die Oberfläche der imprägnierten Trägermanx aufbringt und dann das Lösungsmittel durch Abdampfen entfernt.
Da die Testrnittel häufig längere Zeit vor ihrer Verwendung aufbewahrt werden, ist es wünschenswert, daß die verwendeter. Reagentien so ausgewählt werden, daß sie nicht an der Luft leicht autoxidabel sind. Es ist ratsam, die Testeinrichtung vor der Einwirkung von Licht zu schützen. <md in einigen Fällen kann es wünschenswert s n, sie in versiegelt und feuchtigkeitsundurchlässigen Verpackungen aufzubewahren, die nur zum Zwecke der Entnahme kurz vor deren Verwendung geöffnet werden.
Gewünschtenfalls kann eine Trägermatrix mit einem Hintergrundfarbstoff spezieller Färbung, z. B. gelb, behandelt werden, so daß sich die bei dem Testmittel gebildete Farbe mit der Hintergrundfarbe mischt und unterschiedliche Färbungen ergibt, je nach der Konzentration des in der Probe nachzuweisenden Bestandteils.
Zweckmäßig wird das Testmittel durch einfaches Eintauchen hergestellt. Die Konzentration der verwendeten Reagenzien in der Eintauchlösuiig liegt bei etwa 10 'mMol bis zu einer gesättigten Lösung. Besonders brauchbar für 4-Aminophenazon ist eine Konzentration von etwa 0.2 mMol. Die Peroxidase-Konzentration in der Eintauchlösung liegt zwischen etwa 0.1 mg/dl bis etwa 20 mg/dl. Als Lösungsmittel zur Herstellung der Imprägnierlösung kann man Wasser, physiologische Lösungen, organische Lösungsmittel oder Kombinationen davon verwenden.
Das Testmittel wird insbesondere angewendet, indem man es kurz in die zu untersuchende Probe eintaucht, oder indem man die zu untersuchende Probe in anderer Weise auf die Trägermatnx aufbringt, wodurch sich eine nachweisbare Farbänderung ergibt, wenn Harnsäure vorhanden ist.
Wird Gesamtblut getestet, dann wird günstig so verfahren, daß ein Bluttropfen auf die Oberfläche des Tclmittels gebracht wird.
Beispiel I
und Vergleichsverbueh !
Bestimmung von Harnsäure in Serum
mit Uricase und Peroxidase/S^Dichlor-
2'hydroxybenzoesulfonsäure/4-Aminophena2:on
Testmittel wurden gemäß dem Stand der Technik und gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt und hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit gegenüber störenden
Einflüssen durch Bilirubin bei der Bestimmung von Harnsäure verglichen.
Testlösungen gemäß dem Stand der Technik wurden wie folgt hergestellt:
Phosphatpuffer
Uricase
Peroxidase
4-Aminophenazon
3,5-DLhlor-2-hydroxy-
benzolsulfonsäure
15OmMoVI,
pH 7,0
60 I. UJl
140I.U7I
0,24 mMol/I
2,0 mMol/I
Die Testmittel, welche die Zusammensetzung gemäß der Erfindung hatten, wurden genau wie die obigen hergestellt, jedoch wurden zusätzlich 20 μΜοΙ/Ι Kaliumferrocyanid [K4Fe(CN)6] zugegeben.
Ein 2,0 ml aliquoter Teil der Testlösung des Standes der Technik wurde in eine erste Gruppe von Reagensgläsern pipetiert und ein 2,0 ml Aliquot der Lösung mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung wurde in jedes einer zweiten Gruppe der Reagensgläser pipetiert. Eine Parallelserie der Proben wurde neben den Reagensgläsern in jeder Gruppe durc'· geführt.
Serumproben wurden entnommen, zusammengegeben und auf ihren Gehalt an Harnsäure und Bilirubin geprüft. Harnsäure wurde zu den zusammengegebenen Seren in einer Konzentration von 6,0 mg/dl gegeben und die Lösung wurde in aliquote Anteile aufgeteilt. Dann wurden Mengen an Bilirubin zugegeben, um auf diese Weise Proben für die zu untersuchenden Harnsäurelösungen zu erhalten, wobei Bilirubin-Konzentrationen von 0,7,1.4,2,2 3,6,5,0,6,5.8,8.12,1,16.7 und 23.4 mg/dl eingestellt wurden. Als Standardlösung wurden andere Harnsäurelösungen-aliquote verwendet. die kein Bilirubin enthielten.
In jede Gruppe der Reagensgläser wurde eine parallele Serie von 0.05 ml aliquoten Proben, enthaltend verschiedene Bilirubin-Konzentrationen injiziert und man ließ die Reaktion in den Reagensgläsern 15 Minuten bei Raumtemperatur ablaufen. Die Absorptionsablfsungen wurden bei 520 nm gegen die entsprechenden Blindproben, die erhalten wurden durch Fortlassen von Uricase aus den Reagensformulierungen, gemessen.
Die erzielten Ergebnisse bei der Bestimmung von Harnsäure unter Verwendung von Testreagentien des Stande·; der Technik und genäß der vorliegenden Erfindung bei verschiedenen Bilirubin-Konzentrationen werden in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle
Gefundene Harnsäure (% Gewinnung) ohne K4Fe(CN),,
Bilirubin (mg/dl) mit K4Fe(CN)6 100,0 ±1,2
0.7 100.0 ±1.2 97.2
l.J 100.0 °3.5
2.2 99.2 83,6
3.6 98.0 78,5
5.Ü 97,0 71,5
6,5 95,9 59,0
8,8 93,4 43,5
12,1 91,0 21,0
15,7 90,0
23,4 89,0
Eine merkliche chemische Störung (etwa 6°/o) wird in
dem Harnsäure-Test in Abwesenheit von Ferrocyanid festgestellt und zwar selbst bei Bilirubinmengen von so niedrig wie 2 mg/dl, und in erheblich größerem Maße
ι (mehr als 20%) bei Bilirubinmengen von 5 mg/dl.
Wird Ferrocyanid verwendet, so wird die chemische
Störung durch Bilirubin erheblich vermindert (statistisch unbedeutend bei 2 mg/dl Bilirubin, 3% bei 5 mg/dl und etwa 10% bei Mengen an Bilirubin von so hoch wie 15
in bis 20 mg/dl).
Beispiel 2
und Vergleichsversuch 2
Testmittel zur Bestimmung von Harnsäure in Urin
mit Uricase und PeroXidasee^Dichlor-2-hydroxybenzolsuIfonsäure/4-Aminophenazon
Testmittel mit den bekannten Zusammensetzungen und denen der vorliegenden Erfindung wurden hergestellt und miteinander verglic^n hinsichtlich ihrer Beständigkeit gegen störende Pirn'O^e von Bilirubin bei der Prüfung der Gegenwart von Harnsäure in Urin.
Eine Imprägnierlösung des Standes der Technik wurde mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
Phosphatpuffer 15OmMoI.
pH 7.0
Uricase 150 1. U.
Peroxidase 860 I. U.
d Aminophcnuzon 0.2* mMol
3.5- Dichlor-2-hydroxy-
benzolsulfonsäure 2 mMol
H,O bis zu 1000 ml
»j Die Imprägnierlösungen, welche eine Zusammensetzung gemäß der Erfindung erhielten, wurden in gleicher Weise hergestellt, jedoch wurden dazu 20 μΜοΙ an Kaliumferrocyanid [K4Fe(CN)0] zugegeben.
Blätter von Whatman Nr. 17 Filterpapier wurden bis
4» zur Sättigung mit den Imprägnierlösungen imprägnien und bei 600C getrocknet. Diese Blätter enthielten die trockenen Rückstände der Imprägnierlösungen und wurden zu 2,5 mm χ 2.5 mm Stücken geschnitten. Diese Stücke wurden auf doppelseitiges Klebepapier aufge-
•i > bracht und an einem Plastikstreifen befestigt.
Urinproben wurden entnommen, gesammelt und auf ihren Gehalt an Harnsäure und Bilirubin untersucht. Der gesammelte Urin wurde dann mit 10 Volumenteilen destilliertem Wasser verdünnt. Harnsäure wurde zu
so dem verdünnten, zusammengegebenen Urin gegeben bis zu einer Konzentration von 6 mg/dl Harnsäure. Dann wurde zu der verdünnten Urinlösung Bilirubin bis zu einer Konzentration von 10 mg/dl gegeben ur.J das Ganze stellte die zu untersuchende Lösung dar. Diese
' 5 T jsilösung wurde in adiquote Teile geteilt.
Testmittel gemäß der Erfindung wurden kurz in ein Aliquot der Harnsäuretestlösung eingetaucht und Testmittel des Standes der Technik wurden kurz in einen anderen Aliquot eingetaucht. Die Testmittel wurden visuell auf Farbänderungen nach etwa 10 Minuten untersucht.
Die erfindungsgemäß hergestellten Untersuehungseinrichtungen zeigten eine ausgeprägte Farbänderung, was die Gegenwart von Harnsäure anzeigte, während die Testmittel des Standes der Technik keine Farbänderungen zeigten fnd somit einen falschen negativen Wert für Harnsäure ansahen.

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Testmittel zur Bestimmung von Harnsäure in einer Flüssigkeitsprobe, enthaltend Uricase, eine peroxidativ aktive Substanz, ein Phenol oder Naphthol und 4-Amiaophenazon, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich Ferrocyanidionen enthält.
zeichnet,daß es ein Ferrocyanidionensalz enthält.
3. Testmittel gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Ferrocyanidionensalz Natriumferrocyanid oder KaJiumferrocyanid ist
4. Testmittel gemäß Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es auf einem Träger aufge-
DE2925365A 1979-04-13 1979-06-22 Testmittel zur Bestimmung von Harnsäure in einer Flüssigkeitsprobe Expired DE2925365C2 (de)

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