DE3000380C2

DE3000380C2 - Testmittel und Testvorrichtung für den Nachweis einer oxidierenden Substanz

Info

Publication number: DE3000380C2
Application number: DE3000380A
Authority: DE
Inventors: Giovanni Como Berti; William I. Elkhart Ind. White; Rodric H. Howe Ind. White-Stevens
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1979-02-23
Filing date: 1980-01-07
Publication date: 1982-04-15
Also published as: GB2045428A; DE3000380A1; NO800498L; DK79080A; CA1114725A; ATA99980A; NL8000058A; FI800182A; IL59006A; BE881444A; GB2045428B; LU82180A1; SE8001064L; US4247297A; FR2449889A1; JPS55121149A; FR2449889B1; ZA797017B; AT365342B; AU5573480A

Description

Bei der qualitativen und quantitativen Bestimmung von biologischen Komponenten, wie Glucose und Harnsäure, werden diese Komponenten üblicherweise in eine oxidierende Substanz, wie ein Peroxid, überführt.

Glucoseoxidase wandelt Glucose enzymatisch in Gluconsäure und Wasserstoffperoxid um. Das so gebildete Wasserstoffperoxid kann zu H2O durch eine peroxidativ aktive Substanz in Gegenwart eines Indikatorsystems, das dabei oxidiert wird und eine ansprechbare Nachweisreaktion, wie eine Farbänderung, bildet, reduziert werden. Der chromogene Indikator o-Tolidin ist schon seit geraumer Zeit in Glucosetestsystemen verwendet worden, aber die dabei erhaltenen Ergebnisse werden durch störende Substanzen, wie Ascorbinsäure, welche den oxidierten Indikator reduzieren, verfälscht. Außerdem gilt der Umgang mit o-Tolidin nicht als unbedenklich.

In ähnlicher Weise wird durch Urikase Harnsäure in Allantoin und Wasserstoffperoxid enzymatisch überführt. Das dabei gebildete Wasserstoffperoxid kann durch eine peroxidativ aktive Substanz in Gegenwart eines Indikatorsystems, in den meisten Fällen o-Dianisidin, zu H2O reduziert werden.

Gochman und Schmitz haben in Clin. Chem., 17:1154 (1971), über die Verwendung von 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazonhydrochlorid zusammen mit N,N-Dimethylanilin unter Bildung eines Azo-Farbstoffindikators zur Bestimmung von Harnsäure berichtet. Obwohl dort festgestellt wurde, daß eine Mischung mit Ν,Ν-Dimethylanilin beständiger ist als o-Tolidin, wird durch die Empfindlichkeit gegenüber Ascorbinsäure ein beachtlicher Fehler hinsichtlich der gefundenen Harn

säure- und Glucosekonzentration festgestellt

Der Mechanismus der oxidativen Kupplung heterocyclischer Hydrazone mit Phenolen, aromatischen Aminen und anderen Verbindungen in einer klassischen Azo-Kupplungsreaktion wird von Zollinger in Azo and Diazo Chemistry, Interscience, New York, S. 215 —217, 1961) kurz berichtet Eine Zusammenfassung einer Originalarbeit von Hünig und Mitarbeiter in Deutschland (1957-1968) über die Bildung von Azo-Farbstoffen durch oxidative Kupplung wird von Baer, Cationic Dyes for Synthetic Fibers, Venkataraman (ed.), The Chemistry of Synthetic Dyes, Band 4, Academix Press, N. Y. Seiten 188 bis 193 (1971), beschrieben.

Hunziker beschreibt in der US-PS 39 79 262 die Zugabe eines Puffers aus Zitronensäure oder Maleinsäure zu der von Gochman et al. verwendeten Mischung und offenbart, daß man zusammen mit N.N Dimethylanilin auch andere aromatische Amine verwenden kann, soweit sie nicht sowohl in o- als auch in p-Stellung substituiert sind. Der Puffer ist kritisch und soll einen vorbestimmten pH-Bereich von 3,2 bis 4,7 bei der Harnsäurebestimmung und von 4,7 bis 5,5 bei der Glucose- oder Cholesterinbestimmung einhalten.

Soweit aus dem Stand der Technik bekannt ist, Hydrazonindikatoren zur Analyse von H2O2 zu verwenden, wird dort erwähnt, daß die Umsetzung zwischen 3-MethyI-2-benzothiazolinon-hydrazon (MBTH) und Dimethylarülin beständig gegenüber der Einwirkung von reduzierenden Substanzen in der Probe ist. Obwohl dies im Vergleich mit Indikatoren, wie o-Tolidin, stimmen mag, ergibt die Verwendung solcher Hydrazonindikatoren immer noch schlechte Ergebnisse in Gegenwart von Ascorbaien.
Bisher hat man sich vergeblich bemüht, ein Indikatorsystem zu finden, das sowohl frei von einer Beeinflussung durch störende Substanzen ist, als auch in gesundheitlicher Hinsicht unbedenklich verwendet werden kann.
In der US-PS 41 19 405 wird die Verwendung von

4,5-Dihydroxy-2,7-naphthalin-disulfonsäure und 1-Hydroxy-2-naphthalin-suIfonsäure als Hydrazonkuppler beschrieben. Im Unterschied zu den Kupplern gemäß Hunziker sind diese Verbindungen keine Amine. Obwohl diese Kuppler sehr viel besser sind ais die bisher verfügbaren, sind sie immer noch verbesserungsfähig hinsichtlich der Unempfindlichkeit gegenüber Störungen durch Ascorbate.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Testmittel zum Nachweis von oxidierenden Substanzen in Körperflüssigkeiten zu schaffen, das auch geeignet ist als Testmittel für solche oxidierenden Substanzen, die enzymatisch aus anderen klinisch bedeutsamen Körperflüssigkeitskomponenten gebildet werden.

Die Nachweisreaktion soll dabei gegenüber dem Einfluß von störenden reduzierenden Substanzen in der Körperflüssigkeit möglichst unempfindlich sein.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe ausgehend von einem Testmitte!, welches ein Hydrazon und eine Naphthalinsulfonsäure enthält, dadurch gelöst, daß die Naphthalinsulfonsäure 8 Amino-1 -naphthol-SJ-disulfonsäure (Chicago-Säure) ist.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgende Beschreibung anhand der Zeichnungen näher erläutert.

b5 In den Figuren bedeutet

F i g. 1 eine grafische Darstellung der beim erfindungsgemäßen Test in Gegenwart von Ascorbinsäure bei unterschiedlichem pH-Niveaus gemessenen Werte

fur das System MBTH/Chicago-Säure, wobei die optischen Dichten (OD) gegen die Zeit aufgetragen wurden, und

F i g. 2 ist eine grafische Darstellung der in Versuch 3 für verschiedene MBTH-Kuppler in Gegenwart von Ascorbinsäure in Tris-Malonat-Puffer (pH 7) gemessenen Werte mit der Ausnahme, daP die Kurve für Dimethylanilin mit einem Zitronensäure-Puffer (pH 5) aufgenommen wurde.

Ein erfindungsgemäßes Testmittel besteht >m einfcchsten Fall au. einem Hydrazon und 8-Amino-l-naphthol-5,7-disul fonsäure. Darüber hinaus kann auch ein Reagenzsystem vorhanden sein, das auf die Gegenwart eines Bestandteils in der Probe unter Ausbildung wenigstens einer oxidierenden Substanz anspricht. Das Testmittel dient vorzugsweise für die Bestimmung der bei der enzymatischen Umwandlung von Bestandteilen in biologischen Flüssigkeiten gebildeten Peroxide. Das errindungsgemäße Testmittel kann gegebenenfalls in eine Trägermatrix (z. B. in Tablettenform) eingebracht werden, wodurch man eine Testvorrichtung erhält. Das erfindungsgemäße Testmittei ist außerordentlich empfindlich auch gegenüber niedrigen Konzentrationen von nachzuweisenden Bestandteilen in Körperflüssigkeiten und dabei doch sehr resistent gegenüber störenden reduzierenden Substanzen, z. B. Ascorbinsäure, wie sie häufig in Körperflüssigkeiten vorkommen.

Zu einem Reagenzsystem, das auf die Gegenwart des Bestandteils in der Probe unter Ausbildung wenigstens einer oxidierenden Substanz anspricht, gehört Glucoseoxidase bei der Bestimmung von Glucose oder Urikase bei der Hanstoffbestimmung sowie eine peroxidativ aktive Substanz. Typische peroxidativ aktive Substanzen sind Peroxidase oder Hämoglobin, die man anwendet, wenn Wasserstoffperoxid die oxidierende Substanz ist.

Die vorliegenden Testmittel sind hoch empfindlich gegenüber niedrigen Niveaus an Bestandteilen in Körperflüssigkeiten, die nachgewiesen werden sollen und außerordentlich beständig gegenüber der Wirkung von kompetitiven reduzierenden Substanzen, insbesondere von Ascorbinsäure in Urin. Da in Abhängigkeit von der Konzentration der nachzuweisenden oxidierenden Substanz eine charakteristische Farbänderung stattfindet, ist ein quantitativer Nachweis für Komponenten in Körperflüssigkeiten, wie Glucose und Harnsäure, möglich.

Die Testmittel können sowohl in flüssiger als auch in fester Form verwendet werden, und auch ii. Testvorrichtungen, die eine Zusammensetzung des Testmittels enthalten, und die nachfolgend noch beschrieben werden.

Geeignete Hydrazone in den Testmitteln sind Kondensationsprodukte eines Hydrazins mit einem Aldehyd oder Keton und enthalten die Gruppieiung

C NMI.

Viele Hydrazone sind in der Lage, mit Hydrnxynaphthalinsulfonaten unter Bildung eines gefärbten Stoffes oxidativ zu kuppeln. Geeignet sind u. a.

3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon,

1 -Methyl-2-chinolinon-hydrazon,

N-Methyl-pyridon-4-hydrazon,

N-Met hyl-pyridon-2-hydrazon,

l-Methyl-chinolinon-4-hydrazon,

N-Mel:hyl-thiazolinon-2-hydrazon,

N-Methyl-oxazolinon-2-hydrazon,

N-Methyl-benzoxazoIinon-2-hydrazon und
!,S-DimethylbenzirnidazoIinon^-hydrazon.
Bevorzugt verwendet man ein 3-(Ci — C₄-AIkyI)-2-benzothiazolinon-hydrazon-chromogen, wie 3-Methyl-2- -> benzothiazolinon-hydrazon (MBTH). Solche Hydrazone sind starke Reduktionsmittel.

Der hier verwendete Ausdruck »Hydrazon« schließt auch deren Säureadditionssalze ein. Man kann alle üblichen Säureadditionssalze verwenden, z. B. solche,

ίο die mit Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure und dergleichen gebildet werden. Diese Säureadditionssalze können allein verwendet werden, oder sie können zusammen mit dem entsprechenden Hydrazon verwendet werden.

li Die Molverhältnisse von Hydrazon/Kuppler liegen im Rereich von 17:1 bis etwa 1:17, wobei annähernd äquimolare Verhältnisse für die optimale Kombination hinsichtlich der Nachweisempfindlichkeit und der Störungsbeständigkeit bevorzugt werden.

2u Das Testmittel kann auch noch Stabilisierungsmittel. Carboxymethylcellulose und Polyöxyäthylenäthe- von Fettalkoholen enthalten.

Die erfindungsgemäßen Testmittel werden vorzugsweise in einem neutralen oder schwach alkalischen pH-Bereich angewendet. Die Aufrechterhaltung eir;es neutralen oder alkalischen pH verbessert die Reaktivität hinsichtlich der Geschwindigkeit und der Störungsbeständigkeit.

Bei der Anwendung eines Testmittels in Lösung wird die 8-Amino-1-naphihol-5,7-disulfonsäure (Chicago-Säure) vorzugsweise in Konzentrationen von etwa 10 'Molar (M) bis etwa 10"³M angewendet. In gleicher Weise wird das Hydrazon vorzugsweise in Konzentrationen von etwa 10-'¹M bis 10-³M angewendet. Werden ein oder mehrere Stabilisierungsmitte! verwendet, so liegen sie vorzugsweise in einer Gesamtkonzentration von etwa 0,5 mg/dl bis etwa 5,0 g/dl vor. Ist Peroxidase eines der Reagenzien in dem auf den Bestandteil ansprechenden System, so beträgt die Konzentration an Peroxidase vorzugsweise etwa 10 ng/I bis etwa 500 μg/l. Das zur Herstellung der Lösung verwendete Lösungsmittel kann Wasser, eine physiologische Lösung, ein organisches Lösungsmittel, wie Methanol, oder eine Mischung davon sein.

Testvorrichtungen, in die ein Testmittel nach der Erfindung eingebracht ist, kann man herstellen, indem man einen Träger, wie eine Matrix oder eine Tablette mit dem Testmittel zusammenbringt. Erfolgt das Zusammenbringen durch Imprägnieren mit einer Lösung des Testmittels, so wird der Träger imprägniert und dann getrocknet. Außer durch eine Imprägnierung kann eine Testvorrichtung auch auf andere Weise hergestellt werden, z. B. durch Drucken oder Aufsprühen der Zusammensetzung auf ein Subsnat oder eine Matrix.

Vorzugsweise wird die Testvorrichtung durch ein Mehrfacheintauchverfahren hergestellt. Die Konzentration der verwendeten Reagenzien in den Imprägnierlösungen betragen etwa 10-³M bis zur Sättigung der

bo Lösung. Am geeignetsten sind für das Hydrazon und den Kuppler jeweils eine Konzentration von etwa 0,02 M.

Die Peroxidasekonzentration liegt zwischen etwa 0,015 mg/ml bis etwa 2 mg/ml der Lösung.

Vorzugsweise liegt die Trägermatrix einer Testvorrichtung in Streifenform vor. Der Ausdruck »Trägermatrix« bedeutet hier flüssigkeitsaufnehmende als auch nicht flüssigkeitsaufnehmende Matrices, die in Wasser oder physiologischen Flüssigkeiten unlöslich sind und

ihre strukturelle Einheit beibehalten. Geeignete feuchtigkeitsaufnehmende Matrices sind z. B. Papier, Cellulose, Holz, synthetische Faservliese, Glasfasern, gewebte und nicht gewebte Stoffe und dergleichen. Keine feuchtigkeitsaufnehmenden Matrices sind organoplasti- "> sehe Stoffe, wie Polypropylen und dergleichen. Verwendet man eine feuchtigkeitsaufnehmende Matrix, so ist die Matrix vorzugsweise durch geeignete Mittel, z. B. durch ein doppelseitiges Klebeband an einem unlöslichen Träger befestigt, z. B. an einen organoplastischen Streifen aus beispielsweise Polystyrol, um dadurch leichter gehandhabt zu werden.

Alternativ kann ein erfindungsgemäßes Testmittel auch in einem Träger in Form einer gepreßten oder geformten Tablette, die übliche Trägerstoffe enthält, ι5 enthalten sein.

Die Testvorrichtung wird vorzugsweise angewendet, indem man sie kurz in eine Testprobe eintaucht oder auf andere Weise mit einer Testprobe in Berührung bringt, worauf sich dann eine nachweisbare Färbung einstellt, 2» sofern oxidierbare Komponenten in der Probe vorhan- Chicago-Säure den sind. Die Testvorrichtung kann in gleicher Weise Violett-Säure zur Untersuchung von Proben von Plasma, Serum oder anderen Körperflüssigkeiteri verwendet werden. Diäthylanilin

Durch die nachfolgenden Vergleichsversuche wird die Erfindung näher erläutert.

Versuch 1

In diesem Beispiel wird die relative Beständigkeit gegen Ascorbat von verschiedenen MBTH-Kupplersy-Sternen und von o-Tolidin gezeigt.

Eine erste Imprägnierlösung mit folgenden Bestandteilen wurde hergestellt:

200 mg Peroxidase in 4,3 ml Glucoseoxidase (1000 ml)

+ 19,3 ml destilliertes Wasser

Blätter von Ealon-Dikeman 204 Filterpapier wurden bis zur Sättigung mit der obigen Lösung imprägniert und bei 8O⁰C getrocknet.

Ein erster Anteil der getrockneten Filterpapiere wurde mit 0,02 M o-Tolidin in CHCb gesättigt und bei 50°C getrocknet. Der Rest oder ein zweiter Anteil des vorher erhaltenen getrockneten Filterpapiers wurde dann bis zur Sättigung mit einer Lösung von 50 ml Methanol, worin 250 mg MBTH-Hydrochlorid-Monohydrat gelöst waren, imprägniert und bei 60⁰C getrocknet.

In einer dritten imprägnierung wurden Filterpapierblätter des zweiten Anteils jeweils bis zur Sättigung mit der angegebenen Lösung einer der nachfolgenden potentiellen Kuppler imprägniert:

200 mg in 50 ml Methanol
350 mg in 40 ml Methanol
+ 10 ml Wasser
186 mg in 50 ml Methanol

Destilliertes Wasser 40 ml

Äthanol 40 ml

Gantrez AN 139,5 Gew.-%/Volumen

(W/V) in destilliertem Wasser 52 ml

Trismalonat- Puff er

[2,8 M Tris(hydroxymethyl)-

aminomethan; 1,4 M Malonsäure;

1,4 M Natriummalonat] 32 ml

Polyvinylpyrrolidon. 10% W/V in

destilliertem Wasser 28 ml

Tabelle 1

Relative Störungen durch Ascorbat

35 Die so imprägnierten Papiere wurden bei 60°C getrocknet.

Die zuvor hergestellten Materialien wurden jeweils mit ascorbatfreien 100 mg/dl wäßrigen Glucoselösungen und mit 100 mg/dl wäßrigen Glucoselösungen, enthaltend 50 mg/dl Ascorbat, geprüft und alle Farbänderungen wurden mit Hilfe eines Aufzeichnungsbeugungsspectrofotometers aufgezeichnet. Die Beugungsverte bei spezifischen Wellenlängen wurden mittels der Kubelka-Monk-Gleichung auf äquivalente Extiktionswerte (K) umgerechnet

Ein Verhältnis der K-Werte wurde angewendet, bei denen K für die Gegenwart von 50 mg/dl Ascorbat dividiert durch K für die Daten, gemessen 1 Minute in Abwesenheit von Ascorbat, verwendet wurde. Ein Wert von 1 würde bedeuten, daß keine Störung durch Ascorbat eintritt Ein Wert von 0 würde bedeuten, daß eine vollständige Störung durch Ascorbat vorliegt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt

Indicator

λ K (Glucose + 50 mg/dl

beobachtet Ascorbat

(Nanometer) K (Kein Ascorbat)

o-Tolidin	620	0,01
MBTH-Chicago-Säure	560	0,40
MBTH - Violeü-Säure	540	0,08
MBTH-Diäthylanilin (DEA)	600	0,12

Diese Werte zeigen deutlich, daß MBTH/Chicago-Säure eine Ascorbatbeständigkeit hat, die der von o-Tolidin erheblich überlegen ist, und die auch erheblich besser ist als bekannte Formulierungen auf Basis von MBTH-/Diäthylanflin.

Versuch 2

Bei diesen Versuchen wurden die MBTH/Chicago-Säure-Testvorrichtungen wie in Beispiel 1 hergestellt und jeweils mit Proben von ascorbatfreiem Urin und Urin, enthaltend 50 mg/dl Ascorbat, erprobt wobei beide Urinproben 100 mg/dl Glucose enthielten. Die bei den erprobten Testmaterialien beobachteten Extinktionswerte wurden auf äquivalente Extinktions-(K)-Werte umgerechnet, und das Verhältnis der K-Werte wurde wie in Beispiel 1 berechnet Das Verhältnis der Aktivität in Gegenwart von Ascorbat verglichen zu der Aktivität von ascorbatfreien Untersuchungen war 0,89.

Vergleicht man diese Ergebnisse mit den in Tabelle 1 von Beispiel 1 erhaltenen, so wird ersichtlich, daß das MBTH/Chicago-Säure-Testmaterial bei der Verwendung zum Prüfen von Urin zweimal so ascorbatbeständig war.

Versuch 3

In der nachfolgend beschriebenen Weise wurden Lösungen aus erfindungsgemäßen Zusammensetzungen hergestellt und verglichen mit solchen des Standes der Technik hinsichtlich der Wirkung von pH- und Pufferveränderungen bei Lösungen mit und ohne Ascorbat.

In diesen Versuchen wurde wie in den zuvor beschriebenen die Umsetzung eines Hydrazons mit verschiedenen Kupplern als Ansprechung auf ein oxidierbares Mittel verglichen. In den vorhergehenden Versuch enthielten die Zusammensetzungen Oxidase, die mit der nachzuweisenden Substanz unter Bildung eines Oxidans, H2O2 reagierte. Peroxidase wurde in solche Zusammensetzungen zusammen mit den anderen Komponenten gegeben und die Umsetzung fand dann statt, wenn man die die nachzuweisende Substanz enthaltende Probe damit in Berührung brachte. Im Gegensatz zu diesen vorhergehenden Untersuchungen wurden die Zusammensetzungen im vorliegenden

Tabelle 2
Tris-malonat-Puffer (ph 7)

Versuch so hergestellt, daß sie H2O2 anstelle der auf die nachzuweisende Substanz ansprechende Oxidase enthielten, und die Peroxidase wurde erst zugegeben im Laufe der Untersuchung.

Testlösungen von pH 5,0 wurden in 0,311 M Zitratpuffer hergestellt. Testlösungen von pH 7,0 wurden in 0,093 M Tris[Tris(hydroxymethyl)aminomethan] in Kombination mit 0,093 M Malonat hergestellt. In jedem Puffersystem wurden Testlösungen in Konzentrationen von 100 μΜ MBTH, 100 μΜ Kuppler und 333 μΜ H2O2 hergestellt. Die für jeden der Kuppler bereiteten Testlösungen wurden in zwei Teile geteilt. Zu einem Teil einer jeder dieser Testlösungen wurden 56,8 μΜ (1 mg/dl) Ascorbinsäure gegeben. Diese Lösungen wurden in 3 ml Standard-Glas- oder -Quarzküvetten gegeben. In allen Fällen ließ man die Umsetzung ablaufen durch Einspritzen von Peroxidase in einer Konzentration von 125 Nanogram (ng)/ml. Wie in den vorhergehenden Versuchen ergab sich durch die Bildung eines chromogenen gekuppelten Hydrazon/ Kupplers eine Veränderung der optischen Dichte. Die Änderungen der optischen Dichte (ΔΟΌ) wurden mit einem Standard-Aufzeichnungs-Extinktions-Spektrofotometer aufgezeichnet und die Ergebnisse werden in Tabellen 2 und 3 gezeigt.

M BTH-K. iippler

Chicago-Säure

Chromotrop-Säure

N,N-Dimethylanilin

1-Hydroxy-l-naphthalin-sulfbnsäure

l-Hydroxy-3-naphthalin-sulfonsäure

l-llydroxy-5-naphthalin-sulfonsäure

Tabelle 3
Zitronensäure-Puffer (pH 5)

Wellenlänge	Reaktionsgrad
	KA OD/Min.)
	Kein Ascorbat
565 nm	0,867
572 nm	0,600
-	keine Reaktion
495 nm	0,373
490 nm	0,545
495	0,493

Ascorbat

0,360

0,223

keine Reaktion

0,159

0,77

0,0815

MBTH-Kuppler

Wellenlänge

Reaktionsgrad (A OD/Min.)

kein Ascorbal

Ascorbat

Chicago-Säure 565 nm

Chromotrop-Säure 572 nm

Ν,Ν-Dimethylanilin 570 nm

l-Hydroxy-2-naphthalin-sulfonsäure 495 nm

1 -Hy droxy-3-naphthalin-sulfonsäure

l-Hydroxy-5-naphthalin-sulfonsäure 495 nm

Die gefundenen Ergebnisse zeigen, daß das Trismalonat-Puffersystem bei pH 7 für Chicagosäure wesentlich besser war als das mit Dimethylanilin und den Hydroxynaphthalmsulfonaten. Chicago-Säure ist sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Ascorbat reaktiver. Die Aktivität bei einem pH von etwa 7,0, ausgedrückt als Farbentwicklung (4OD) pro Minute betrug etwa das Drei- bis Vierfache in 0.196

0,162

0,189

0,0891

0,0992

0,0822

0,0282 0,0065 0,0000 0,0037 0,0000 0,0000

Zitronensaure bei pH 5,0 ohne Ascorbat und ein noch größerer Unterschied ist in Gegenwart von Ascorbat festzustellen. Die Ergebnisse, die in Gegenwart von 56,8 μΜοΙ/1 (1,0 mg/dl) Ascorbinsäure nach verschiedenen Zeiten gemessen wurden, und die jeweiligen Extinktionen (optische Dichten) sind grafisch in Fi g. 1 für MBTH/Chicago-Säure in Tris-malonat-(pH 7-) und Zitronensäure-(pH 5-)Systemen wiedergegeben. Ein

Vergleich der mit den verschiedenen Kupplern in Gegenwart von 56,8 μΜοΙ/1 (1,0 mg/dl) Ascorbinsäure erhaltenen Ergebnisse wird grafisch in F i g. 2 für das Tris-malonat-(pH 7-)System mit einer bemerkenswerten Ausnahme gezeigt. Da der bekannte Kuppler, Dimethylanilin, nicht einmal unter diesen Parametern

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reagieren würde, wurde dessen Kurve aus dem Zitronensäure-(pH 5-)Daten abgeleitet.

Chicago-Säure ist somit besonders, und zwar optimal hinsichtlich des bevorzugten physiologischen pH-Bereiches, insbesondere bei Enzymuntersuchungen geeignet.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Testmittel für den Nachweis einer oxidierenden Substanz, enthaltend ein Hydrazon und eine Naphthalinsulfonsäure, dadurch gekennzeichnet, daß die Naphthalinsulfonsäure 8-Amino-1 -naphthol-5,7-disulfonsäure ist

2. Testmittel zum Nachweis eines Bestandteils in einer Probe, enthaltend ein Reagenzsystem, das auf die Gegenwart des Bestandteils in der Probe anspricht unter Bildung einer oxidierenden Substanz und ein Reagenzsystem aus einem Hydrazon und einer Naphthalinsulfonsäure zum Nachweis der oxidierenden Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß die Naphthalinsulfonsäure 8-Amino-1-naphthol-5,7-disulfonsäure ist

3. Testmittel gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrazon 3-MethyI-2-benzothiazolin-hydrazon ist

4. Testvorrichtung zum Nachweis einer oxidierenden Substanz, welche eine Trägermatrix und ein Testmittel, enthaltend ein Hydrazon und eine Naphthalinsulfonsäure, umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Testmittel gemäß Anspruch 1 bis 3 enthält.

5. Testvorrichtung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägermatrix feuchtigkeitsaufnehmend ist.

6. Testvorrichtung gemäß Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form einer Tablette vorliegt.