DE69117588T2

DE69117588T2 - Zusammensetzung und Verfahren zur Bestimmung von Ketonkörpern

Info

Publication number: DE69117588T2
Application number: DE69117588T
Authority: DE
Inventors: Thomas A Magers
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1990-06-29
Filing date: 1991-06-15
Publication date: 1996-10-10
Anticipated expiration: 2011-06-16
Also published as: US5190863A; DK0463524T3; US5326697A; JPH04237500A; DE69117588D1; CA2042645A1; AU7926191A; EP0463524A1; ATE135052T1; JP3118029B2; AU628751B2; EP0463524B1; ES2084061T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens oder der Konzentration von insbesondere D-β-Hydroxybutyrat (DHBA), und von Ketokörpern im allgemeinen, in einer Testprobe. Ganz besonders betrifft die vorliegende Erfindung ein neues und verbessertes Assayverfahren fur eine flussige Testprobe, wie Urin, Gesamtblut, Blutplasma oder Blutserum, und zwar bezuglich Ketokörpern, insbesondere D-β-Hydroxybutyrat, wobei man eine stabile und empfindliche Indikator- Reagenszusammensetzung zur Anwendung bringt. Die Indikatorreagenszusammensetzung auf Enzym-Basis liefert eine nachweisbare oder meßbare Reaktion bei Kontakt mit einer Testprobe, die D-β-Hydroxybutyrat enthält. Die Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung ergibt einen genaueren und empfindlicheren Assay fur D-β-Hydroxybutyrat, und somit fur Ketokörper, indem sie den bei ublichen Testproben-Komponenten, wie Glutathion und Ascorbat-Ion, vorkommenden störenden Beeinflussungen des Indikator- Farbstoffes wirkungsvoll widersteht. Demnach ergibt die durch die stabile Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung bewerkstelligte verbesserte Empfindlichkeit ein verbessertes Verfahren eines Assay fur Ketokröper, wie D-β-Hydroxybutyrat, in einer Testprobe, wie einer biologischen Flussigkeit, wie Gesamtblut, Blutserum, Blutplasma oder Urin.
Der menschliche Körper metabolisiert Fette gewöhnlich vollständig zu Kohlendioxid und Wasser. Ist allerdings eine unangemessene Menge an Kohlenhydrat in der Nahrung vorhanden, oder liegt ein Defekt beim Kohlenhydrat- Metabolismus oder der entsprechenden Absorption vor, metabolisiert der Körper dann steigende Mengen von Fettsäuren. Werden große Mengen von Fettsäuren metabolisiert, ist die Verwertung von Fettsäure unvollständig. Daher erscheinen die Zwischenprodukte des Fett-Metabolismus im Blut und werden im Urin ausgeschieden. Diese Zwischenprodukte werden als Ketokörper bezeichnet und schließen Acetoessigsäure, Aceton und β-Hydroxybuttersäure ein. Ausserdem können Streß, körperliche Anstrengung und Diabetes eine beschleunigte Zersetzung von Fetten und Oxidation von Fettsäuren hervorrufen, um die Konzentration an β-Hydroxybuttersäure, Aceton und Acetoessigsäure im Blut und Urin zu erhöhen. Demzufolge kann das Assayverfahren fur in einer biologischen Flussigkeit vorliegende Ketokörper hilfreich bei der Diagnose, Behandlung und Überwachung von Diabetes sein.
Die Konzentration von im Urin und Blut einer gesunden Person vorliegenden Ketokörpern ist sehr niedrig bis vernachlässigbar. Immer wenn erhöh te Fettmengen metabolisiert werden, wenn beispielsweise die Kohlenhydrat Aufnahme eingeschränkt oder die Nahrung fettreich sind, kann sich die Konzentration an Ketokörpern erhohen. Liegt eine Überschußmenge an Ketokörpern in Blut vor, wird dieser Zustand als Ketosis bezeichnet; und liegt ein Überschuß an Ketokörpern im Urin vor, wird dieser Zustand als Ketonune bezeichnet. Ketonune wird auch als Folge der eingeschränkten Kohlenhydrataufnahme beobachtet, die im Zusammenhang mit fiebrigen Erscheinungen, Anorexie, Szörungen des Magen-Darm-Trakts, Fasten, Hungern, zyklischem Erbrechen, perniziösem Erbrechen bei Schwangerschaft, Kachexie, Postanesthesie und als Ergebnis bestimmter neurologischer Störungen auftritt. Im allgemeinen sind alle drei Ketokörper im Urin von an Ketonune erkrankten Personen in den jeweiligen Mengenanteilen von 20% Acetoessigsäure, 2% Aceton und 78% β-Hydroxybuttersäure vorhanden. Aceton und P-Hydroxybuttersäure sind von Acetoessigsäure abgeleitet.
Diabetes mellitus ist die wichtigste Störung, die im Zusammenhang mit Ketosis oder Ketonune steht. Diabetes mellitus ist eine Störung des Glucose-Metabolismus, und bei Insulinmangel-Diabetes, gewöhnlich dem Typ der Jugend-Anfangsphase, ist der Glucose-Metabolismus hinreichend beeinträchtigt, so daß Fettsäuren verwertet werden, um den Energiebedarf des Körpers zu decken. Bleibt Diabetes mellitus unbehandelt oder unangemessen behandelt, werden uberschussige Mengen von Fettsäuren metabolisiert. Als Folge davon reichem sich Ketokörper im Blut an, d.h. Ketosis, und werden im Urin ausgeschieden, d.h. Ketonune. Zudem werden Ketokörper aus dem Körper in Kombination mit normalen basischen Ionen ausgeschieden, wodurch die Kohlendioxid-Vereinigungsenergie des Körpers herabgesetzt und systemische Acidose, d.h. erhöhte Acidität des Bluts, verursacht werden. Fortschreitende diabetische Ketosis, die diabetische Acidose hervorruft, kann zu Koma und gegebenenfalls zum Tod fuhren. Der Begriff Ketoacidose wird häufig angewandt, um damit die vereinigten Zustände von Ketosis und Acidose zu bezeichnen, die mit Diabetes zusammenhängen.
Somit ist der Nachweis von Ketosis oder Ketonune bei einer an Diabetes mellitus erkrankten Person wichtig, und es wird dadurch aufgezeigt, daß eine Änderung der Insulin-Dosierung oder der weiteren Behandlungsmaßnahmen notwendig ist. Während akuter Infektionen, einer chirurgischen Operation, Störungen des Magen-Darm-Trakts oder Stress, und immer wenn die Behandlungsroutine den Verlauf der Krankheit nicht angemessen zu steuern vermag, sollten deshalb Blut oder Urin eines Diabetikers bezuglich des Vorliegens von Ketokörpern uberpruft werden.
Gewöhnlich ist das Vorliegen von Ketokörpern nachgewiesen worden, indem man Urin einem Assayverfahren unterzog. Bei Ketonune werden Acetoessigsäure, Aceton und β-Hydroxybuttersäure im Urin ausgeschieden. Demzufolge ist eine Assayverfahrensmaßnahme, durch die das Vorliegen von einem der drei Ketokörper nachgewiesen oder gemessen wird, zur Diagnose von Ketonune gewöhnlich ausreichend. Obwohl es spezifische Tests zur Bestimmung eines jeden der Ketokörper gibt, gelangen diese spezifischen Tests gewöhnlich nicht zur Anwendung, weil die damit verbundenen Verfahrensmaßnahmen mühsamer, weniger zuverlässig und weniger empfindlich als das allgemeine Assayverfahren fur Ketokörper sind.
Beispielsweise tritt das Nitroprussid-Ion, (Fe(NO)(CN)&sub5;)&supmin;², mit Aceton und Acetoessigsäure in der Gegenwart von Alkali zur Erzeugung einer purpurfarbenen Verbindung in Wechselwirkung. Somit sind Natriumnitroprussid- Assayverfahren spezifisch gegenuber Acetoessigsäure und Aceton und weisen β-Hydroxybut:ersäure nicht nach. Diese Nitroprussid-Wechselwirkung stellt die Grundlage einer Anzahl verschiedener Assayverfahren des Standes der Technik dar, wie dies bei Rothera's Test und Legal's Test der Fall ist. Das gegenwärtig angewandte Reagensstreifenverfahren ist die einfachste Verfahrensweise zur Bestimmung von Ketonune. Der Reagensstreifen wird mit Natriumnitroprussid und alkalischen Puffern imprägniert. Der Streifen wird in frischen Urin getaucht und dann mit der Farbkarte nach exakt 15 Sekunden verglichen. Die Karte weist 6 Farbblöcke auf, wobei Konzentrationen von Ketonen von necativ, Spur (5 mg/dl), wenig (15 mg/dl), mäßig (40 mg/dl), viel (80 mg/dl) cder von (160 mg/dl) aufgezeigt werden, wobei die entsprechende Farbe von ledergelb bis lavendel bis rotbraun reicht. Allerdings wird durch das Nitroprussid-Assayverfahren die Konzentration von (3-Hydroxybutyrat, dem hauptsächlichen Ketokörper, nicht gemessen. Demzufolge kann das Ergebnis aus diesem Assayverahren eine fehltgeleitete Bestimmung der Gesamtmenge an Ketokörpern im Urin darstellen.
Beispielsweise haben Untersuchungen ergeben, daß ein Assayverfahren von Urin fur Acetoacetat durch das Nitroprussid-Verfahren nicht zum erfolgreichen Nachweis von Ketonune bei ca. 50 bis ca. 60% Diabetikern führte, die tatsächlich an Ketonune erkrankt waren. Berücksichtigt man diese Tatsache einer Fehldiagnose zusammen mit der Tatsache, daß ein zur Bestimmung von Ketonen mit Urin durchgeführtes Assayverfahren bereits eine Verzögerung beim Nachweis von Blut-Ketosis darstellt, wird es offensichtlich, daß ein Urin-Assayverfahren für Acetoacetat nicht ausreicht, um die Anfangsphase von Ketosis bei einem Diabetiker zu überwachen und festzuhalten. Nach alldem ist die vorliegende Erfindung darauf gerichtet, ein Assayverfahren anzugeben, bei dem eine biologische Flüssigkeit, wie Blut oder Urin, bezüglich des hauptsächlichen Ketokörpers, nämlich D-β-Hydroxybuttersäure, untersucht wird, um einen empfindlichen und zuverlässigen Assay für die Anfangsphase von Ketosis zu bewerkstelligen.
Obwohl Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens und der Menge von Ketokörpern in Urin verfügbar sind, wobei Fortschritte bei der Selbstüberwachung der Diabetiker beim Glucosegehalt des Bluts erzielt wurden, haben sich Beispiele und Vorfälle unentdeckter Ketosis gehäuft. Es hat sich herausgestellt, daß in dem Maße, wie Diabetiker die Überwachung von Blutglucose in zunehmendem Maße nutzen und anwenden, um den Test von Uringlucose zu ersetzen, der Urintest auf Ketokörper dann vollständig vernachlässigt wird und Ketonune unentdeckt bleibt.
D-β-Hydroxybuttersäure ist im Blut mit ca. der 2- bis 3-fachen Gehaltsmenge an Acetoessigsäure vorhanden. Die Gegenwart von D-β-Hydroxybuttersäure im Blut signalisiert auch das Einsetzen von Ketosis viel früher, als dies durch den Nachweis von Acetoacetat im Urin möglich ist, und sie stellt somit ein viel genaueres Analyt zur Überwachung, Verfolgung und Aufzeichnung des Vorliegens von Ketokörpern dar, was mithin eine unmittelbare Auswirkung auf die Wirksamkeit einer besonderen Insulin-Therapie zur Folge hat. Beispielsweise wird oft eine genügende Menge an Insulin verabreicht, um den Glucosegehalt einer Person herabzusetzen, aber es wird nicht genug Insulin verabreicht, um den Gehalt an Ketokörpern herabzusetzen. Ferner werden, unter bestimmten pathologischen Zustandsbedingungen der Leber, alle Ketokörper zu D-β-Hydroxybuttersäure umgesetzt. Dabei könnte ein Assay für Acetoacetat solche pathologischen Zustände nicht nachweisen.
Demzufolge haben Forscher nach Verfahren gesucht, D-βHydroxybuttersäure im Blut genau nachzuweisen. Der am meisten angewandte kolorimetrische Test für D-β-Hydroxybuttersäure ist die Reduktion des farblosen Farbstoffbildners 2-(4-Indophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchlorid- Hydrat zu einer gefärbten Formazan-Verbindung. Allerdings ist dieser allgemeine Farbstoff in hohem Maße lichtempfindlich sowie gegenüber Ascorbat und Glutathion empfindlich.
Insbesondere wurde im Stand der Technik, wie gemäß JP 58-39813, Datum der Einreichung vom 08.03.1983 (veröffentlicht mit Nr. 59-162899), ein Assayverfaühren für D-β-Hydroxybuttersäure (DHBA) offenbart, worin die DHBA zu Acetoessigsäure durch β-Hydroxybuttersäure-Dehydrogenase in der Gegenwart von Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD) oxidiert wird. In dieser Reaktion wird reduziertes NAD (NAD-H) erzeugt, das seinerseits wiederum mit einem Tetrazolium-Farbstoff in Wechselwirkung tritt, um eine gefärbte Formazan-Verbindung zu erzeugen. Ausmaß und Intensität des Farbübergangs werden dann zur Menge an DHBA in der Testprobe in Korrelation gebracht. Ganz allgemein ist der Reaktionsablauf wie folgt dargestellt:
DHBA + NAD DHBA- Dehydrogenase T Acetoessigsäure + NAD-H (1)
NAD-H + Tetrazolium(farblos) T NAD + Formazan (gefärbt) (2)
In ähnlicher Weise haben Harano et al. in der Veröffentlichung "Development of Paper-Strip Test for 3-Hydroxybutyrate and its Clinical Application", Diabetes Care, 7, S. 481-485, (1984), ein Teststreifen- Assayverfahren für DHBA offenbart, worin die Reaktionsfolge ähnilch der in den Gleichungen (1) und (2) oben dargestellten Folge ist. Ausserdem haben Harano et al. in der Veröffentlichung "Direct Automated Assay Method for Serum or Urine Levels of Ketone Bodies", Clinica Chimica Acta, 157, S. 177- 183 (1985), ein automatisiertes Assayverfahren auf Basis der obigen Reaktionsfolge offenbart.
In EP 84 306 671.3 (veröffentlicht mit Nr. 140 589) wurde ein Assay für DHBA offenbart, worin die anwachsende Menge von reduziertem NAD (NAD- H), erzeugt in Gleichung (1) der obigen Reaktionsfolge, photometrisch ermittelt wurde. Der Assay schloß die Zugabe eines Milchsäure-Dehydrogenase- Inhibitors ein, ein Indikator-Farbstoff war allerdings nicht enthalten. Ferner war das Assayverfaren ein Naß-Assayverfahren, im Gegensatz zu einem trockenen Teststreifen-Assayverfahren.
Owen offenbarte in US 4,254,222 und 4,351,899 ein Assayverfahren für DHBA auf Basis der obigen Reaktionsfolge der Gleichungen (1) und (2), allerdings ist dabei des weiteren ein Zwischenstufen-Elektronträger enthalten, um den Tetrazolium-Farbstoff wirkungsvoller zu einer Formazan- Verbindung zu reduzieren. Owen offenbarte, daß verbesserte Farbübergänge beobachtet wurden, wenn das NAD-H einen Elektronträger, wie Phenazinmethosulfat, reduzierte und dann das reduzierte Phenazinmethosulfat den Tetrazolium-Farbstoff zu einer Formazan-Verbindung reduzierte. Wie später vollständiger dargelegt wird, hängen Zusammensetzung und Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht von der in Gleichung (2) oben dargestellten Tetrazohum-Reaktion ab. Die vorliegende Erfindung beruht auf sequentiellen Reaktionen auf Enzym-Basis und vermeidet die mit Tetrazolium-Farbstoffen zusammenhängenden Mängel und Nachteile, wie die der Lichtempfindlichkeit und Empfindlichkeit gegenüber Ascorbat-Ion und Glutation, welche oft in Testproben anzutreffen sind.
In EP 226 427 sind ein Verfahren zur gleichzeitigen Durchführung einer Qualitätsprüfung tierischer Milch und einer Gesundheitsprüfung des Tieres sowie ein Indikator dafür beschrieben. EP 348 826 handelt von Isobenzthiazolon-Indikatoren und deren Derivaten, wogegen EP 153 872 auf ein Verfahren zur Bestimmung der reduzierten Form von Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid gerichtet ist. EP 140 589 offenbart eine enzymatische Bestimmung von D-3- Hydroxybuttersäure oder Acetoessigsäure sowie ein Reagens dafür, und GB 2 200 989 offenbart ein Verfahren und ein Mittel zum Nachweis von Thiolen. Alle diese Literaturstellen schweigen sich bezüglich des Gegenstands der vorliegenden Erfindung aus.
Im Gegenstatz zum Stand der Technik wird im Verfahren der vorliegenden Erfindung ein reduktiver Weg auf Basis von Lipoamid-Dehydrogenase (LADH) und eines Thiol-empfindlichen Indikator-Farbstoffs, wie von Ellman's Reagens, eines Derivats von Ellman's Reagens oder, vorzugsweise, eines substituierten Isobenzthiazolons angewandt. Es ist herausgefunden worden, daß, nachdem die DHBA mit DHBA-Dehydrogenase und NAD zur Bildung von NAD-H reagiert hat, LADH dann mit dem NAD-H und D,L-Lipoamid zur Bildung einer Thiol-Verbindung, 6,8-Dimercaptooctaamid, in Wechselwirkung tritt. Das 6,8- Dimercaptooctamid tritt dann mit einem Thiol-reaktiven Indikator-Farbstoff, wie mit Ellman's Reagens, einem Derivat von Ellman's Reagens oder einem geeigneten Isobenzthiazolon, in Wechselwirkung. Bei Wechselwirkung mit der Thiolverbindung erfolgt mit dem Thiol-reaktiven Indikator-Farbstoff ein nachweisbarer oder meßbarer Farbübergang, der zur Menge der DHBA in einer Testprobe in Korrelation gebracht werden kann.
Wie vorher festgestellt, bleibt das Vorliegen von Ketokörpern im Blut oder Urin einer Person oft unentdeckt, weil Diabetiker gegenwärtig die Glucosegehaltsmengen in ihrem Blut selbst überwachen. Der Assay für Ketokörper ist ein Standard-Urin-Assay, seit aber die betroffenen Personen damit begonnen haben, ihr Blut selbst zu testen, vermeiden die betroffenen Personen die Belästigung und loder Ausgaben zu Kauf und Anwendung eines unterschiedlichen Assay-Produkts zur Anwendung an einer weiteren Körperflüssigkeit, um an einem weiteren Analyt einen Test durchzuführen. Ausserdem glauben Diabetiker, in irrtümlicher Weise, oft, daß eine Selbstüberwachung des Gesamtbluts bezüglich der Glucosegehaltsmengen die betroffene Person von der Notwendigkeit einer Überwachung der Gehaltsmengen von Ketonen entbindet. Wird allerdings die Überwachung von Keton ignoriert, kann Ketosis unentdeckt bleiben, und der Patient kann in eine diabetische Ketoacidose schlittern, eine bei Patienten mit Diabetes allgemein verbreitete Krankheit mit einer Mortalitätsrate in einer Höhe von 10%.
Daher führt unüberwachte Diabetes zu zwei wichtigen Konsequenzen. Die erste Konsequenz ist eine Veränderung bei Produktion und Verfügbarkeit von Glucose, und die zweite ist eine beschleunigte Ketogenese, d.h. Ketonbildung. Diese beiden Konsequenzen stehen in engem Zusammenhang, weil der Metabolismus von Kohlenhydraten und Lipiden in der Leber stark gekuppelt ist mit erhöhten Konzentrationen an Acetoacetat und DHBA im Plasma von an diabetischer Ketoacidose erkrankten Personen wegen einer beschleunigten Synthese von Ketonen in der Leber und einer begrenzten Kapazität der äußeren Gewebemengen zur Verwertung dieser Ketone.
Die Aktivierung von Ketogenese erfordert die Mobilisierung langkettiger Fettsäuren aus Lagerbeständen in Adipose-Gewebe sowie eine Änderung beim hepatischen Metabolismus, so daß unvollständige Fettsäuren eher zu Ketokörpern oxidiert als zur Bildung von Triglyceriden zum Transport als Lipoproteine mit sehr niedriger Dichte aus der Leber heraus umgeestert werden. Die Mobilisierung der Fettsäuren wird durch Insulinmangel, wogegen die Oxidation der Fettsäuren durch einen Anstieg beim Glucagon/Insulin- Verhältnis induziert werden.
Die Ketokörper werden dann durch den Körper metabolisiert, wobei das Verhältnis von DHBA zu Acetoacetat extrem variabel ist. Allerdings stellt die DHBA die vorherrschende Komponente dar. Die steigenden Gehaltsmengen von DHBA, widergegeben in einem erhöhten DHBA/Acetoacetat-Verhältnis, korreliert zur Konzentration an verfügbarer freier Fettsäure. Da der Prozentsatz der Oxidation der Fettsäuren in direkter Relation zu ihrem Plasmagehalt steht, kann die Fettsäure-Konzentration das Gleichgewicht zwischen Acetoacetat und 13-Hydroxybutyrat bestimmen. Daher kann eine sinkende Fettsäure-Oxidation dieses Gleichgewicht zugunsten von Acetoacetat verändern und zu einem niedrigeren DHBA/Acetoacetat-Verhältnis führen. Umgekehrt, wird ein sehr hohes DHBA/Acetoacetat-Verhältnis beobachtet, wenn die Fettsäure-Gehaltsmengen steigen.
Insulin übt ebenfalls eine unmittelbare Wirkung auf das DHBA/Acetoacetat-Verhältnis aus. Ein rascher Abfall des Verhältnisses tritt nach Verabreichung von Insulin ein. Dieser Effekt steht nicht in Relation zur Insulindosis und wird sowohl bei an Ketoacidose erkrankten Personen als auch bei Personen beobachtet, die versuchen, ihre Diabetes zu stabilisieren. Das Absinken des DHBA/Acetoacetat-Verhältnisses wird einem verzögerten Absinken bei der Acetoacetat-Konzentration zugeschrieben, einer Konzentration, die über Stunden hinweg unverändert anhalten und über Tage nach dem Beginn einer Behandlung von Ketoacidose fortdauern kann. Tatsächlich können Acetoacetat-Gehaltsmengen während dieser Periode aktuell ansteigen. Weil die Konzentration von Acetoacetat ansteigen kann und zumindest einige Stunden lang während der Behandlung von Ketoacidose unverändert bleibt, kann daher durch ein Assayverfahren für Acetoacetat das Fortschreiten der Behandlung nicht zuverlässig überwacht und verfolgt werden.
Demnach zeigen der empfindliche Anstieg und Abfall der DHBA-Konzentration beim Einsetzen und während der Behandlung von Ketoacidose an, daß DHBA der primäre Analyt für Nachweis und Überwachung von Ketosis sein sollte. Beispielsweise ist, auf Basis millimolarer Mengen, das Ausmaß von Anstieg und Abfall der Blutgehaltsmengen von DHBA größer als jenes von Acetoacetat oder Glucose. Demnach liefert ein Assay für DHBA das empfindlichste Monitor-Instrument von Ketosis und Ketoacidose unter den verschiedenen, für Ketosis symptomatischen Analyten.
Die gegenwärtige Technologie hat die Selbstüberwachung von Glucose von dern eher unexakten und Post facto-Urin-Testverfahren zum empfindlicheren metabolischen Kontrollverfahren von Glucose im Blut verändert. Die Überwachung von Blutglucose ersetzt den Urintest, da die Seibstüberwachung des Bluts es ermöglicht, Glycämie im Nahnormalbereich zu steuern. Als Ergebnis davon, ist die Selbstüberwachung von Keton im Harn vernachlässigt worden. Offensichtlich hat der Erfolg der Selbstüberwachung des Gesamtbluts bezüglich Glucose die betroffenen Personen dazu verleitet, die Verfolgung und Überwachung der Keton-Gehaltsmengen im But oder Urin im Hinblick auf die Signalisierung des Einsetzens von Ketosis zu vernachlässigen. Weil die betroffenen Personen und die damit befaßten Doktoren das Testen auf Ketone im Urin vernachlässigt haben, wäre daher die Entwicklung eines Trockenphasen- Reagensteststreifens für Nachweis und Messung der Ketonkonzentration im Blut für Personen nützlich, die den Verlauf ihrer Krankheit zuhause verfolgen und überwachen.
Es ist dargelegt worden, daß jeder Naßphasen- oder Trockenpasen-Assay, bei denen nur Acetoacetat gemessen wird, als Monitor-Instrument zur Feststellung des Einsetzens von Ketosis unzuverlässiger ist. Wegen der intimen Wechselwirkungsbeziehung zwischen Glucose-Metabolismus und Ketokörper- Metabolismus bei einer an Diabetes mellitus erkrankten Person ist es daher offensichtlich, daß der Diabetiker-Bevölkerungsanteil, der eine Selbstüberwachung beim Glucose-Gehalt im Gesamtblut durchführt, auch einen Test für β-Hydroxybutyrat im Gesamtblut benötigt. Wie vorher festgestellt, hat die Verfügbarkeit von Teststreifen zur Selbstüberwachung der Blutglucose die Möglichkeit erhöht, daß Ketosis unentdeckt bleibt, weil die betroffenen Personen einen Harntest vernachlässigen und die Person dann daran scheitert, das Einsetzen von Ketonune festzustellen und nachzuweisen. Somit würde die Verfügbarkeit eines Trockenphasen-Reagensteststreifens für Ketokörper im Blut dazu beitragen, die Ketoacidose bei Diabetikern zu verhindern. Falls es eine betroffene Person wegen Bevorzugung oder aus ökonomischen Gründen wünscht, das Einsetzen von Ketosis durch einen Urin-Test auf Ketonune zu verfolgen und zu überwachen, sollte ein empfindlicher und zuverlässiger Urin-Assay zum Nachweis von Ketonune DHBA nachweisen und messen. DHBA ist im Urin immer in größerer Konzentration als Acetoacetat vorhanden und stellt daher den empfindlichsten und zuverlässigsten Analyt zum Nachweis von Ketonune und daher von Ketosis dar.
Zum Nachweis des Einsetzens von Ketosis oder Ketonune werden daher für eine betroffene Person genaue und empfindliche Assayverfahren für Gesamtblut, Blutserum, Blutplasma, Urin und weitere Testproben bezüglich der Ketokörper sowohl für den Labor- als auch den Hausgebrauch benötigt. Die Assayverfahren sollten den Nachweis und die Messung der Ketokörper in der Testprobe ermöglichen, so daß eine korrekte Diagnose durchgeführt und eine korrekte medizinische Behandlung eingeschlagen, verfolgt und aufrechterhalten werden können. Ausserdem wäre es vorteilhaft, wenn bei dem Assayverfahren ein Trockenphasen-Teststreifen, entweder in einem Format zum Abwischen, Ablöschen oder zum Eintauchen und Ablesen, zur einfachen und ökonomischen, qualitativen oder quantitativen Bestimmung von Ketokörpern in Blut, Urin oder weiteren Testproben zur Anwendung gelangen würde.
Ferner sollte jedes Assayverfahren für Ketokörper in Blut, Urin oder einer weiteren Testprobe genaue, zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse unter Anwendung einer Indikator-Reagenszusammensetzung liefern, welche einen Farbübergang als Ergebnis einer Wechselwirkung mit einem Ketokörper, wie DHBA, und nicht als Ergebnis einer konkurrierenden chemischen oder physikalischen Wecchselwirkung, wie einer bevorzugten Wechselwirkung zwischen einer Testproben-Komponente, die sich von einem Ketokörper unterscheidet, oder eines Farbübergangs ergibt, der wegen der Instabilität der Indikator- Reagenszusammensetzung auftritt. Darüber hinaus wäre es vorteilhaft, wenn sich das Assayverfahren für Ketokörper zur Verwendung in Trockenphasen- Reagensteststreifen zur raschen, ökonomischen und genauen Bestimmung eines Ketokörper in Blut, Urin oder einer weiteren Testprobe eignen würde. Außerdem sollten Verfahren und Zusammensetzung, die im Assay für Ketokörper eingesetzt werden, die weiteren Testreagens-Trägern nicht gegenteilig beeinflussen oder stören, welche gegenbenenfalls auf einem Reagensteststreifen für Mehrfachbestimmungen vorliegen.
Um zu ermitteln, ob eine Person Ketokörper ausscheidet oder eine erhöhte Menge an Ketokörpern im Blut aufweist, und um den Verlauf einer medizinischen Behandlung zur Ermittlung der Wirksamkeit der Behandlung zu verfolgen und zu überwachen, sind daher einfache, genaue und kostengünstige Nachweisassayverfahren für Ketokörper entwickelt worden. Ferner haben sich bei den verschiedenen Assayverfahren, die zum Nachweis und zur Messung von Ketokörpern im Urin entwickelt worden sind, die Verfahren auf Basis eines Eintauch-und-Ablese-Trockenphasen-Teststreifens als besonders nützlich erwiesen, weil Verfahren mit Trockenphasen-Teststreifen rasch automatisiert werden können und reproduzierbare und genaue Ergebnisse liefern.
Einige Teststreifen, die in Assayverfahren für Ketokörper verwendet werden, weisen eine Einzeltestfläche auf, die aus einer kleinen Quadratunterlage einer geeigneten Trägermatrix besteht, die mit einer Indikator- Reagenszusammensetzung imprägniert ist, welche einen Indikator-Farbstoff, wie einen Tetrazolium-Farbstoff, NAD und DHBA-Dehydrogenase enthält. Weitere Teststreifen sind Reagensstreifen zur Mehrfachbestimmung, die 1 Testfläche für das oben beschriebene Assayverfahren von Ketokörpern und ferner einige zusätzliche Testflächen auf demselben Streifen enthalten, um den gleichzeitigen Assay weiterer Bestandteile der Testprobe zu ermöglichen. Für beide Typen kolorimetrischer Teststreifen wird das Assayverfahren für Ketokörper einfach dadurch durchgeführt, daß man den kolorimetrischen Teststreifen mit einer Blut- oder Urin- oder einer weiteren Testprobe in Kontakt bringt, dann die auf der Testfläche des Teststreifens entstandene Farbe mit einer standardisierten Farbkarte vergleicht, die auf der Flasche für die kolorimetrischen Teststreifen vorgesehen ist, oder indem man die Farbänderune mit einem Fotometer bestimmt. Tests von Ketokörpern sind gewöhnlich auf Reagensstreifen für Mehrfachbestimmungen enthalten, um Urinproben bei routinemäßig durchgeführten körperlichen Untersuchungen zu überprüfen. Allerdings sind Testverfahren für Ketokörper gewöhnlich nicht auf Reagensstreifen enthalten, die dazu verwendet werden, um Blutproben einem Assayverfahren zu unterziehen.
Das Teststreifenverfahren ist das einfachste und genaueste Direktassayverfahren für Ketokörper in einer biologischen Flüssigkeit. Bei den Testvorrichtungen des Standes der Technik wird die Testfläche mit einem Tetrazolium-Indikator-Farbstoff, NAD sowie mit DHBA-Dehydrogenase imprägniert. Die Testfläche verändert die Farbe, wenn in der Testprobe vorhandene Ketokörper mit der DHBA-Dehydrogenase, NAD und dem Tetrazolium-Farbstoff in der Testunterlage reagieren. Gemäß dem oben beschriebenen Verfahren des Standes der Technik kann eine Person dann die Konzentration eines Ketokörpers in einer Testprobe aus dem Farbübergang des Tetrazolium-Farbstoffs ermitteln.
Wie weiter unten vollständiger zu erörtern sein wird, haben Forscher herausgefunden, daß Tetrazolium-Farbstoffe oft lichtempfindlich und störenden Wechselwirkungen mit üblichen Testproben-Komponenten, wie mit Gulutathion und Ascorbat, ausgesetzt sind, welche die Empfindlichkeit und Genauigkeit des Assay wesentlich herabsetzen. Daher wäre es äußerst vorteilhaft, ein einfaches, genaues und zuverlässiges Verfahren zur Verfügung zu haben, um Blut, Urin oder weitere biologische Flüssigkeiten bezüglich Ketokörpern einem Assayverfahren zu unterziehen. Gegenwärtige Teststreifen für Ketokörper sind für ein mit Blut durchzuführendes Assayverfahren im allgemeinen nicht erhältlich und verfügbar und weisen die Nachteile einer Instabilität des Indikator-Farbstoffs sowie einer durch Komponenten aus der Testprobe hervorgerufenen Störanfälligkeit auf. In überraschender und unerwartetenr Weise wird durch die Zusammensetzung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine stabile Indikator-Reagenszusammensetzung bereitgestellt, die sich beim Assay von Blut, Urin oder weiteren biologischen Flüssigkeiten für Ketokörper verwenden läßt. Durch Bereitstellung eines genaueren Verfahrens zur Ermittlung der Konzentration von Ketokörpern in einer Testprobe, in einem einfach anzuwendenden Format wie einem Eintach-und-ablese-, Abwisch- oder Ablösch-Teststreifen, kann das Assayverfahren von Laborpersonal durchgeführt werden, um sofortige und verläßliche Testergebnisse zu liefern. Ausserdem kann das Teststreifenverfahren von der Einzelperson zuhause durchgeführt werden, um den Gehalt an Ketokörpern in Blut oder Urin und/oder den Erfolg der an der Einzelperson durchgeführten medizinischen Behandlung genauer zu überwachen und zu verfolgen.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht den schnellen, genauen und vertrausenswürdigen Assay für Ketokörper, unter Anwendung eines Teststreifens, der eine Testunterlage einschließt, die eine geeignete Trägermatrix umfaßt, die gemäß der vorliegenden Erfindung mit einer Indikator- Reagenszusammensetzung imprägniert ist. Die Indikator- Reagenszusammensetzung umfaßt einen mit Thiol reaktionsfähigen bzw. darauf reagierenden Indikator-Farbstoff, wie Ellman's Reagens, ein Derivat von Ellman's Reagens oder ein substituiertes Isobenzthiazolon, D-β-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase (DHBA-Dehydrogenase), Lipoamid-Dehydrogenase (LADH), D,L-Lipoamid und Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD). Die Indikator- Reagenszusammensetzung ist empfindlich auf niedrige Konzentrationen des Ketokörpers D-β-Hydroxybuttersäure (DHBA) und spezifisch gegenüber DHBA, und es wird durch ihre Verwendung das Problem der Instabilität des Indikator- Farbstoffs und der Indikator-Reagenszusammensetzung im wesentlichen beseitigt, welches zu ungenauen und unempfindlichen Assayverfahren führt. Demnach steigern die verbesserte Stabilität und Selektivität der Indikator- Reagenszusammensetzung die Empfindlichkeit des Assay für DHBA, wodurch ein genauerer und vertrauenswürdiger Assay für Ketokörper bereitgestellt ist.
Vor der erfolgreichen Entwicklung der vorliegenden Erfindung war kein bekanntes Verfahren zur Durchführung eines Assay mit Blut, Urin oder anderen Testproben für Ketokörper bekannt, bei dem eine Indikator- Reagenszusammensetzung enthalten war, die einen mit Thiol reaktionsfähigen Indikator-Farbstoff, DHBA-Dehydrogenase, LADH, D,L-Lipoamid und NAD aufweist, um eine stabile und selektive Indikator-Reagenszusammensetzung bereitzustellen. Demzufolge steigern die verbesserte Stabilität und Selektivität der Indikator-Reagenszusammensetzung die Empfindlichkeit des Assayverfahrens, so daß genaue und zuverlässige Assayverfahren für Ketokörper durchgeführt werden. Obwohl ein Trockenphasen-Teststreifen, enthaltend einen Tetrazolium-Indikator-Farbstoff, NAD und DHBA-Dehydrogenase, bereits früher verwendet worden ist, zeigten Trockenphasen-Teststreifen, in die diese Verbindungen eingebracht waren, eine Instabilität gegenüber Lichteinwirkung sowie eine Tendenz zur Wechselwirkung mit verschiedenen üblichen Test-Komponenten. Demnach wurden durch diese Instabilität und Nicht- Selektivität die Genauigkeit und Empfindlichkeit des Teststreifens bezüglich der Ketokörper in der Testprobe herabgesetzt.
Im allgemeinen sind Trockenphasen-Teststreifen vorteilhafter als die Assayverfahren in Naßphase, weil das Teststreifen-Format leichter zu handhaben ist, wobei weder die kontinuierliche Zubereitung der Reagentien noch die zusätzliche Bereitstellung einer Vorrichtung erforderlich sind. Ausserdem ist die Reagensstabilität größer im Teststreifen, wodurch sich eine verbesserte Genauigkeit, Empfindlichkeit und Wirtschaftlichkeit des Assayverfahrens ergeben. Obwohl Trockenphasen-Teststreifen zur Bestimmung von Ketokörpern stabiler und empfindlicher als Naßphasen-Assayverfahren sind, bedürfen gegenwärtig im Gebrauch befindliche Teststreifen für Ketokörper noch immer einer Verbesserung auf den Gebieten der Stabilität, Selektivität und Empfindichkeit. Daher würde es einen beachtlichen Fortschritt für den Stand der Technik bei Diagnose-Assayverfahren bedeuten, falls Teststreifen stabiler während Aufbewahrung und Lagerung und noch selektiver und empfindlicher gegenüber Ketokörpern hergestellt werden könnten. Dies stellte die Zielrichtung der angestrebten Verbesserungen dar, worauf die Untersuchungen gerichtet waren, die zu der Zusammensetzung, Vorrichtung und dem Verfahren der vorliegenden Erfindung führten.
Einige Versuchsansätze zum Erreichen der oben genannten Ziele einer erhöhten Stabilität und Empfindlichkeit sind im früher disutierten Stand der Technik zu finden. Im Gegensatz zum Stand der Technik und im Gegensatz zu gegenwärtig im Handel erhältlichen Teststreifen werden durch die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung dem Teststreifen eröhte Stabilität und verbesserte Selektivität verliehen, und somit wird eine erhöhte Empfindlichkeit des Teststreifens bei Nachweis und Messung von Ketokörpern in einer Testprobe erreicht. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gelangt eine stabile Indikator-Reagenszusammensetzung zur Anwendung, die einem Abbau des Indikator-Farbstoffs wirkungsvoll widersteht und in spezifischer Weise mit dem Ketokörper DHBA in Wechselwirkung tritt, der in der Testprobe vorhanden ist. In überraschender und unerwarteter Weise werden durch das Verfahren und die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine Farbbildung oder weitere nachweisbare Reaktionen im wesentlichen eliminiert, welche einer Indikator-Farbstoff-Wechselwirkung mit Testproben- Komponenten zuzuordnen sein könnten, die sich von DHBA unterscheiden. Daher werden gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung neue und unerwartete Ergebnisse beim Trockenphasen-Teststreifen-Assay von Blut, Urin oder weiteren Testproben für Ketokörper erhalten, und zwar durch die Verwendung einer stabilen, selektiven und empfindlichen Indikator-Reagenszusammensetzung.
Kurz gesagt, ist die vorliegende Erfindung auf eine neue und verbesserte Zusammensetzung, Testvorrichtung und ein Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens oder der Konzentration einer bestimmten Komponente in einer Testprobe gerichtet. Die Vorrichtung schließt eine Test-Unterlage aus einer geeigneten Trägerrnatrix ein, in die eine Indikator-Reagenszusammensetzung eingebracht ist, die dazu befähigt ist, mit einer bestimmten Testproben- Komponente wechselzuwirken, um eine nachweisbare Reaktion zu erzeugen. Für den Hausgebrauch erzeugt die Indikator-Reagenszusammensetzung eine visuell nachweisbare Reaktion. Für den Laborgebrauch erzeugt die Indikator- Reagenszusammensetzung eine Reaktion, die visuell oder mittels eines Gerätes nachweisbar ist. Die Trägermatrix der Test-Unterlage weist ein saugfähiges Material, wie Filterpapier, ein nicht-saugfähiges Material, wie einen Streifen, eine Schicht oder Membran eines polymerisierten Materials, oder Kombinationen davon auf. Es wird eine Indikator-Reagenszusammensetzung homogen in die Trägermatrix eingebracht, und die Trägermatrix enthält dann die Indikator-Reagenszusammensetzung homogen verteilt über die Trägermatrix, wobei die Durchdringbarkeit der Trägermatrix für die bestimmte Komponente der Testprobe aufrechterhalten bleibt.
Insbesondere ist die vorliegende Erfindung auf ein Assayverfahren von Blut, Urin oder weiteren Testproben für Ketokörper gerichtet, wobei eine neue und verbesserte Indikator-Reagenszusammensetzung verwendet wird. Es ist dargelegt worden, daß eine Indikator-Reagenszusammensetzung aus:
(a) einem Thiol-empfindlichen Indikator-Farbstoff, wie Ellman's Reagens, einem Derivat von Ellman's Reagens oder einem substituierten Isobenzthiazolon, das die allgemeine Strukturformel aufweist:
worin mindestens einer der Substituenten R&sub1; und R&sub2; aus der Gruppe aus Nitro-, Arylazo-, substituierten Arylazo-, Benzylidenamino- und substituierten Benzylidenamino-Resten so ausgewählt ist, daß, wenn nur einer der Substituenten R&sub1; und R&sub2; entsprechend substituiert ist, einer der Substituenten R&sub1; und R&sub2; Wasserstoff sein kann, und worin der Substituent R&sub3; aus der Gruppe aus Alkyl-, Carboxyalkyl, Hydroxyalkyl-, Aminoalkyl-, Haloalkyl-, Aryl-, Carboxyaryl-, Hydroxyaryl-, Aminoaryl-, Heteroaryl-, Carboxyheteroaryl-, Hydroxyheteroaryl-, Aminoheteroaryl-, Hydroxy-, Alkoxy-, Amino- Resten und aus substituierten Derivaten davon ausgewählt ist,
(b) D-β-Hydroxybuttersäure-Dehydrogenase (DHBA-Dehydrogenase),
(c) Lipoamid-Dehydrogenase (LADH),
(d) D,L-Lipoamid und aus
(e) Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD) verbesserte Stabilität und erhöhte Selektivität und Empfindlichkeit gegenüber dem Ketokörper DHBA in einer Testprobe zeigt.
Gemäß einem wichtigen Merkmal der vorliegenden Erfindung wird eine genauere und verläßlichere qualitative oder quantitative Bestimmung von Ketokörpern in einer Testprobe erhalten, weil die Indikator- Reagenszusammensetzung eine verbesserte Stabilität des Indikator-Farbstoffs vor dem Kontakt zwischen der Indikator-Reagenszusammensetzung und einer Ketokörper enthaltenden Testprobe sowie verbesserte Selektivität aufweist, weil die Indikator-Reagenszusammensetzung nicht mit üblichen störenden Komponenten wechselwirkt, die in Testproben oft vorzufinden sind. Durch die Anwendung der Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung in klinischen Testverfahren ist der qualitative oder quantitative Assay für einen Ketokörper, wie D-β-Hydroxybuttersäure (DHBA), in Blut, Urin oder weiteren biologischen oder nicht-biologischen Testproben empfindlicher und genauer
Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues verbessertes Verfahren sowie eine Testvorrichtung zur Ermittlung der Relativkonzentration einer bestimmten chemischen Verbindung in einer flüssigen Testprobe anzugeben und zur Verfügung zu stellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein einfaches, zuverlässiges, genaues und reproduzierbares Assayverfahren mit Urin, Gesamtblut, Blutplasma, Blutserum und weiteren Testproben für Ketokörper anzugeben.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Assayverfahren mit Gesamtblut, Blutplasma, Blutserum, Urin oder weiteren flüssigen Testproben für Ketokörper anzugeben, wobei eine stabile und spezifische Indikator-Reagenszusammensetzung zur Anwendung gelangt, die erhöhte Empfindlichkeit und Genauigkeit im Assayverfahren für den Ketokörper DHBA liefert.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein empfindliches Assayverfahren von biologischen Testproben für den Ketokörper DHBA in einem Konzentrationsbereich von 0 bis ca. 60 mMol/l (Millimol DHBA pro Liter Testprobe) anzugeben und zur Verfügung zu stellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Assayverfahren mit Gesamtblut, Blutserum, Blutplasma, Urin oder weiteren flüssigen Tstproben für DHBA anzugeben, das genügend empfindlich ist, um DHBA in Konzentrationen bis herab auf ca. 0,1 mMol/l quantitativ nachzuweisen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Assayverfahren mit Gesamtblut, Blutserum, Blutplasma, Urin oder weiteren biologischen Testflüssigkeiten für Ketokörper anzugeben, wobei man eine Indikator- Reagenszusammensetzung aus einem Thiol-reaktiven Indikator-Farbstoff, DHBA- Dehydrogenase, LADH, D,L-Lipoamid und aus NAD verwendet, wobei die Indikator-Reagenszusammensetzung stabil bei Lagerung und Lichteinwirkung ist und selektiv im wesentlichen nur mit der DHBA wechselwirkt, die in der biologischen Testflüssigkeit vorhanden ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Assayverfahren mit Gesamtblut, Blutserum, Blutplasma, Urin oder weiteren biologischen Testproben anzugeben, wobei man eine stabile Indikator- Reagenszusammensetzung verwendet, die in wirksamer Weise die Aktivität des Indikator-Farbstoffs vor einem Kontakt mit der Testprobe aufrechterhält und bei Kontakt mit der Testprobe selektiv mit einem Ketokörper in der Testprobe wechselwirkt, um einen nachweisbaren und meßbaren Farbübergang zu ergeben, um das Vorliegen oder die Konzentration des Ketokörpers in der Testprobe festzuhalten.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine neue und verbesserte Testvorrichtung zur Wechselwirkung mit dem in einer Testprobe vorliegenden Ketokörper DHBA bereitzustellen, um eine sichtbare Änderung, wie eine Farbänderung der Testvorrichtung zu erzeugen, wobei die Farbänderung ein Maß für die Konzentration von DHBA in der Testprobe ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und Testvorrichtung bereitzustellen, die gegenüber niedrigen Konzentrationen eines Ketokörpers empfindlich sind, ausgezeichnete Beständigkeit gegenüber Ascorbat- und Glutathion-Störungen zeigen, ausgezeichnete Lagerstabilität aufweisen und ungenaue Assay-Ergebnisse für einen Ketokörper im wesentlichen eliminieren.
Schließlich ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine stabile Indikator-Reagenszusammensetzung bereitzustellen, die dazu befähigt ist, einen Farbübergang bei Kontakt mit DHBA einzugehen, wobei die Indikator-Reagens zusammensetzung einen Thiol -reaktiven Indikator-Farbstoff wie Ellman's Reagens, ein Derivat von Ellman's Reagens oder ein Isobenzthiazolon der allgemeinen Strukturformel:
worin mindestens einer der Substituenten R&sub1; und R&sub2; aus der Gruppe aus Nitro-, Arylazo-, substituierten Arylazo-, Benzylidenamino- und substituierten Benzylidenamino-Resten so ausgewählt ist, daß, wenn nur einer der Substituenten R&sub1; und R&sub2; so substituiert ist, einer der Substituenten R&sub1; und R&sub2; Wasserstoff sein kann, und worin der Substituent R&sub3; aus der Gruppe aus Alkyl-, Carboxyalkyl-, Hydroxyalkyl-, Aminoalkyl-, Haloalkyl-, Aryl-, Carboxyaryl-, Hydroxyaryl-, Aminoaryl-, Heteroaryl-, Carboxyheteroaryl-, Hydroxyheteroaryl-, Aminoheteroaryl-, Hydroxy-, Alkoxy-, Amino-Resten und aus substituierten Derivaten davon ausgewählt ist, D-β-Hydroxybuttersäure- Dehydrogenase (DHBA-Dehydrogenase), Lipoamid-Dehydrogenase (LADH), D,L- Lipoamid und Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD) enthält.
Die obigen und weitere Gegenstände, Vorteile und neuen Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung der vorliegenden Erfindung zusammen mit den Zeichnungen ersichtlich, in denen:
Fig. 1 eine Auftragung des Prozentsatzes der Reflektion gegen die Zeit für Trockenphasen-Teststreifen ist, die entweder den Tetrazolium- Farbstoff INT oder den Isobenzthiazolon-Farbstoff IBTZ-I als den Indikator- Farbstoff enthielten und 60 Minuten lang der kombinierten Belichtung mit Tageslicht und ultravioletter Strahlung ausgesetzt waren,
Fig. 2 eine Auftragung der Kubelka-Munk-Funktion (K/S) gegen die Konzentration von DHBA auf Basis der Reflektionswerte ist, die bei 440 nm "Nanometer) und nach 1045 Sekunden gemessen wurden, nachdem ein Trockenphasen-Teststreifen, enthaltend eine Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung unter Einschluß von IBTZ-I, mit einer standardisierten Lösung von DHBA in Kontakt gebracht war,
Fig. 3 eine Auftragung der Kubelka-Munk-Funktion (K/S) gegen die Konzentration von DHBA auf Basis der Reflektionswerte ist, die bei 440 nm und nach 600 Sekunden gemessen wurden, nachdem ein Teststreifen, enthaltend eine Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung unter Einschluß von IBTZ-I, mit einer standardisierten Lösung von DHBA in Kontakt gebracht war,
Fig. 4 eine Serie von Auftragungen der Kubelka-Munk-Funktion (K/S) gegen die Zeit ist, welche den Farbübergang eines Teststreifens im Zeitablauf für Assayverfahren an standardisierten Lösungen zeigt, welche 0, 1,0, 2,5 und 5,0 mM (millimolar) DHBA enthalten, worin der Indikator- Farbstoff in der Indikator-Reagenszusammensetzung IBTZ-I war,
Fig. 5 eine Dosis-Reaktion-Auftragung der Kubelka-Munk-Funktion (K/S) gegen die Konzentration von DHBA über den Bereich von 0 bis 5 mM ist, worin die K/S-Werte aus der Reflektion des Teststreifens bei 440 nm nach 8 Minuten Inkubationsdauer ermittelt wurden,
Fig. 6 eine Serie von Auftragungen der Kubelka-Munk-Funktion (K/S) gegen die Zeit ist, welche den Farbübergang eines Teststreifens im Zeitablauf für Assayverfahren an standardisierten Lösungen zeigt, die 0, 0,1, 2,5 und 5,0 mM DHBA enthalten, worin der Indikator-Farbstoff in der Indikator-Reagenszusammensetzung IBTZ-I war,
Fig. 7 eine Dosis-Reaktion-Auftragung der Kubelka-Munk-Funktion (K/S) gegen die Konzentration von DHBA über den Bereich von 0 bis 5 mM ist, worin die K/S-Werte aus der Reflektion des Teststreifens bei 440-nm nach 8 Minuten Inkubationsdauer bestimmt wurden,
Fig. 8 und 10 eine Serie von Auftragungen der Kubelka-Munk- Funktion (K/S) gegen die Zeit darstellen, welche den Farbübergang eines Teststreifens im Zeitablauf für Assayverfahren an standardisierten Lösungen zeigen, die 0, 1,0, 2,5 und 5,0 mM DHBA enthalten, worin der Indikator- Farbstoff in der Indikator-Reagenszusammensetzung IBTZ-VII war,
Fig. 9 und 11 Dosis-Reaktion-Auftragungen der Kubelka-Munk- Funktion (K/S) gegen die Konzentration von DHBA über den Bereich von 0 bis 5 mM darstellen, worin die K/S-Werte aus der Reflektion des Teststreifens bei 580 nm nach 4 Minuten Inkubationsdauer ermittelt wurden,
Fig. 12 eine Serie von Auftragungen der Kubelka-Munk-Funktion (K/S) gegen die Zeit darstellt, welche den Farbübergang eines Teststreifens im Zeitablauf für Assayverfahren an standardisierten Lösungen zeigen, die 0, 1,0, 2,5 und 5,0 mM DHBA enthalten, worin der Indikator-Farbstoff in der Indikator-Reagenszusammensetzung IBTZ-VIII war,
Fig. 13 eine Serie von Auftragungen der Kubelka-Munk-Funktion (K/S) gegen die Zeit darstellt, welche den Farbübergang eines Teststreifens im Zeitablauf für Assayverfahren an standardisierten Lösungen zeigen, die 0, 1,0, 2,5 und 5,0 mM DHBA enthalten, worin der Indikator-Farbstoff in der Indikator-Reagenszusammensetzung IBTZ-IX war, und worin
Fig. 14 eine Dosis-Reaktion-Auftragung der Kubelka-Munk-Funktion (K/S) gegen die Konzentration von DHBA über den Bereich von 0 bis 5 mM darstellt, worin die K/S-Werte aus der Reflektion des Teststreifens bei 540 nm nach 9 Minuten Inkubationsdauer ermittelt wurden.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden der qualitative oder quantitative Assay für einen Ketokörper, und zwar für D-β-Hydroxybuttersäure (DHBA), in Gesamtblut, Blutserum, Blutplasma, Urin oder weiteren Testproben durchgeführt, indem eine stabile und selektive Indikator- Reagenszusammensetzung aus einem Thiol-reaktiven Indikator-Farbstoff, D-β- Hydroxybutyrat-Dehydrogenase (DHBA-Dehydrogenase), Lipoamid-Dehydrogenase (LADH), D,L-Lipoamid und aus Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD) zur Anwendung gelangt. Die Verwendung der stabilen Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung gewährleistet, daß der Indikator-Farbstoff seine Wirksamkeit vor Kontakt zwischen der Indikator- Reagenszusammensetzung und der Testprobe beibehält. Der Indikator-Farbstoff geht, nach Kontakt mit einer DHBA enthaltenden Testprobe, rasch einen Farbübergang oder eine sonstige nachweisbare Umwandlung in Reaktion auf eine Wechselwirkung mit der reduzierten Form von D,L-Lipoamid (d.h. 6,8- Dimercaptooctamid) ein, welche durch die Wechselwirkung der DHBA- Dehydrogenase, NAD und von LADH, welche in der Indikator- Reagenszusammensetzung vorliegen, mit der in der Testprobe vorhandenen DHBA erzeugt wird.
Die Assayverfahren gemäß des Standes der Technik für DHBA beruhten, entweder in Naß- oder Trockenphase, auf einer Tetrazolium-Verbindung als dern Indikator-Farbstoff bei der Oxidations-Reduktionsreaktion zum Nachweis von DHBA. Die Assayverfahren des Standes der Technik beruhten ganz allgemein auf dem folgenden Reaktionsablauf, worin ein farbloser Tetrazolium- Farbstoffbildner in eine gefärbte Formazan-Verbindung überführt wurde:
DHBA + NAD DHBA-Dehydrogenase T Acetoessigsäure + NAD-H (1)
NAD-H + Tetrazolium (farblos) T NAD + Formazan (gefärbt) (2)
Allerdings ist dieser Tetrazolium-Farbstoff relativ instabil, und das Assayverfahren ist störenden Verbindungen ausgesetzt, die oft in biologischen Testproben vorliegen, wie dem Ascorbat-Ion und Glutathion. Diesbezüglich werden durch die Zusammensetzung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Chemie auf Basis von Tetrazoliumbeseitigt bzw. umgangen, und es wird eine Chemie auf Basis von Lipoamid-Dehydrogenase angewandt und verwertet, um einen auf ein Thiol-reagierenden Indikator-Farbstoff von einer ersten Farbe in eine zweite Farbe zu überführen. Vorzugsweise sind die erste Farbstufe farblos und die zweite Farbstufe tief oder intensiv gefärbt; oder es sind, in umgekehrter Weise, die erste Farbstufe tief gefärbt und die zweite Farbstufe farblos. Derartige Farbübergänge sind differenzierter und besser auf lösbar und ergeben daher empfindlichere und genauere Assayverfahren. Ferner ist herausgefunden worden, daß die in der vorliegenden Erfindung angewandte Chemie auf Basis von Lipoamid-Dehydrogenase eine stabile Indikator-Reagenszusammensetzung ergibt, die selektiv für DHBA und keiner Störung durch normalerweise in biologischen Systemen aufgefundene Verbindungen ausgesetzt ist.
Insbesondere wird in der vorliegenden Erfindung ein gekoppeltes Enzym- System angewandt, worin die Enzyme DHBA-Dehydrogenase und LADH nacheinander mit ihren besonderen Substraten wechselwirken, um eine nachweisbare und meßbare Veränderung zu ergeben, die zur Menge von DHBA in der Testprobe korreliert werden kann. Demnach reagieren die DHBA-Dehydrogenase und die LADH nacheinander, wie im folgenden Reaktionsschema gezeigt, in einem Assayverfahren für das Vorliegen oder die Konzentration von DHBA in einer Testprobe:
DHBA + NAD DHBA- Dehydrogenase T Acetoessigsäure + NAD-H (1)
NAD-H + D,L-Lipoamid LADH T 6,8-Dimercaptooctamid + NAD (3)
6,8-Dimercaptooctamid + Thiol-reaktiver Indikator-Farbstoff (farblos) T reduzierten Farbstoff (gefärbt) + D,L-Lipoamid (4)
Wie nachfolgend vollständiger dargelegt wird, werden durch die Zusammensetzung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung die mit einem für DHBA auf Basis von Tetrazoliumdurchgeführten Assayverfahren zusammenhängenden Nachteile und Probleme eliminiert. Demzufolge werden die Genauigkeit und Empfindlichkeit des DHBA-Assay erhöht. Die verbesserte-Genauigkeit und erhöhte Empfindlichkeit bezüglich DHBA, welche durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung geleistet werden, sind besonders nützlich bei Blut- Assayverfahren für DHBA.
Ein im Handel vertreibbarer Assay für DHBA muß stabil, empfindlich und beständig gegenüber störenden Verbindungen, wie Ascorbinsäure, sein. Die Stabilitäts- und Empfindlichkeitserfordernisse für einen verwertbaren DHBA- Assay sind bezüglich der Empfindlichkeit mit mindestens 0,5 mMol/l DHBA in der Testprobe definiert worden. Ausserdem sind, wie vorher bereits diskutiert, Ascorbinsäure und Glutathion übliche Störfaktoren bei Assayverfahren auf Basis von Redox-Indikator-Farbstoffen. Insbesondere sind Störungen durch Ascorbinsäure bei Assayverfahren für DHBA im Stand der Technik wohlbekannt und sollten beseitigt werden. Die Ascorbat-Beständigkeit wird diesbezüglich als ein zu vernachlässigender Störfaktor beim Farbübergang des Indikator-Farbstoffs definiert, wenn eine Testprobe im Ausmaß von annähernd 50 mg (Milligramm Ascorbinsäure pro Deziliter (dl) Probe enthält.
Gegenwärtige handelsübliche Assayverfahren für einen Ketokörper, wie DHBA, vermögen Konzentrationen bis herab zu ca. 0,5 mMol/l in Urin und ca. 0,05 mMol/l in Blut nachzuweisen. Urin oder Blut einer gesunden Person sind im wesentlichen frei von Ketokörpern. Der Nachweis einer niedrigen Konzentration von Ketokörpern in biologischen Flüssigkeiten ist deshalb klinisch wichtig, weil Ketokörper in der Flüssigkeit einen erkrankten oder gestörten Zustand zu signalisieren vermögen, der weiterverfolgt werden sollte. Demnach, und wie später vollständiger zu diskutieren sein wird, stellen Verfahren und Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ein genaues Assayverfahren für eine niedrige Konzentration von Ketokörpern in biologischen Flüssigkeiten dar und ergeben daher ein zuverlässiges Signal für das Einsetzen von Ketosis. Die im Verfahren und der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung angewandte Zusammensetzung ist stabil, widersteht Störungen durch Ascorbat und Glutathion und geht einen Farbwechsel nur in Reaktion auf die Konzentration an DHBA in der Testprobe ein, wodurch ein empfindlicher und zuverlässiger Assay für Ketokörper bereitgestellt wird.
Ferner wird es ersichtlich, daß Verfahren und Vorrichtung der vorliegenden Erfindung angewandt werden können, um das Vorhandensein oder die quantitative Konzentration von Ketokörpern in Gesamtblut, Blutplasma, Blutserum und Urin sowie allgemeiner die Ketokörper-Konzentration vieler weiterer biologischer Flüssigkeiten zu ermitteln. Im allgemeinen können jede wässrige Testprobe oder Testprobe, die in einem wässrigen Lösungsmittel löslich ist, dem Assayverfahren unterzogen werden. Gemäß einem weiteren wichtigen Merkmal der vorliegenden Erfindung können Verfahren und Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in Assayverfahren mit Trockenphasen- Teststreifen angewandt werden, um Vorliegen und Konzentration von Ketokörpern in Blut, Urin oder weiteren Testproben zu ermitteln.
Verfahren und Test, bei denen die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung angewandt wird, liefern einen genaueren, vertrauenswürdigeren und klinisch signifikanteren Assay für DHBA, weil der mit einem Thiol reaktionsfähige Indikator-Farbstoff einen Farbübergang nur in Reaktion auf die Menge an DHBA in der Testprobe und nicht in Reaktion auf Ascorbinsäure oder Glutathion eingeht, welche oft in einer Testprobe vorhanden sind. Ferner wird eine technische Verfahrensweise zur Durchführung schneller, genauer, reproduzierbarer und vertrauenswürdiger Assayverfahren für Ketokörper bereitgestellt, welche zuhause oder im Labor durchführbar sind, um im wesentlichen sofortige Assay-Ergebnisse zu liefern.
Im Verfahren der vorliegenden Erfindung wird die Befähigung von LADH genutzt, in der Gegenwart von reduziertem NAD (NAD-H) D,L-Lipoamid zu 6,8- Dimercaptooctamid zu reduzieren. Gemäß einem wichtigen Merkmal der vorliegenden Erfindung wechselwirkt das Enzym LADH mit D,L-Lipoamid, in Abfolge, nachdem das Enzym DHBA-Dehydrogenase zuerst mit DHBA und NAD zur Erzeugung von reduziertem NAD, d.h. NAD-H, wechselgewirkt hat. Die LADH wechselwirkt mit D,L-Lipoamid und NAD-H (Gleichung 3) zur Erzeugung von 6,8- Dimercaptooctamid. Das 6,8-Dimercaptooctamid beinhaltet zwei Thiol- Einheiten, welche mit dem Thiol-reaktiven Indikator-Farbstoff in Wechselwirkung zu treten vermögen, um eine reduzierte Form des Indikator- Farbstoffs zu ergeben. Gewöhnlich unterscheidet sich die Farbe der reduzierten Form des Indikator-Farbstoffs von derjenigen der oxidierten Form des Indikator-Farbstoffs, und Ausmaß und Intensität des Farbübergangs sind zur Konzentration von DHBA in der Testprobe direkt proportional. In diesem Zusammenhang sollte festgestellt sein, daß andere nachweisbare Änderungen, wie eine Trübung, ebenfalls dazu herangezogen werden können, um Vorliegen und Konzentration von DHBA in einer Testprobe nachzuweisen. Demnach enthält die Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung ein Paar gekuppelter Enzyme, NAD, D,L-Lipoamid und einen Thiol-reaktiven Indikator- Farbstoff, worin der Indikator-Farbstoff einen Farbübergang nach Umwandlung in seine reduzierte Form durch ein Thiol eingeht, welche durch die auf in der Testprobe vorhandene DHBA einwirkende Mediation von Enzymen, NAD und D,L-Lipoamid gebildet werden.
Die Indikator-Reagenszuammensetzung der vorliegenden Erfindung, die zum Nachweis von DHBA und daher zum Nachweis von Ketokörpern befähigt ist, schließt das Enzym D-β-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase (DHBA-Dehydrogenase) ein. Dieses Enzym ist zur Überführung von DHBA in Acetoacetat befähigt und ist im allgemeinen in der Indikator-Reagenszusammensetzung in einer Menge von 50 bis ca. 5000, vorzugsweise von ca. 90 bis ca. 500, Einheiten enthalten, worin eine Einheit als diejenige Enzymmenge definiert ist, die dazu benötigt wird, um 1 Mikromol DHBA zu Acetoacetat pro Minute bei pH 8 und 37ºC umzusetzen. Innerhalb dieser Bereiche ist genügend DHBA-Dehydrogenase in der Indikator-Reagenszusammensetzung für einen relativ raschen Umsatz von DHBA zu Acetoacetat vorhanden. DHBA-Dehydrogenase ist ein übliches, im Handel erhältliches Enzym, das aus vielen Quellen verfügbar ist, wie von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.
Zusätzlich zu der DHBA-Dehydrogenase ist Nicotinamid-Adenin- Dinucleotid (NAD) in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ebenfalls enthalten. Wie in Gleichung 1 dargestellt, werden die DHBA in der Testprobe enzymatisch zu Acetoacetat durch die DHBA-Dehydrogenase oxidiert und das NAD zu NAD-H reduziert. Die reduzierte Form von NAD wird dann in der nächsten Reaktionsstufe verwertet, d.h. der Reduktion von D,L-Lipoamid durch LADH (Gleichung 3). Das NAD ist in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in einer Menge von ca. 10 mM (millimolar oder Millimol pro Liter Indikator-Reagenszusammensetzung) bis ca. 500, vorzugsweise von ca. 40 bis ca. 100, mM vorhanden. Im allgemeinen ist die in der Zusammensetzung enthaltene Menge an NAD lediglich insofern eingeschränkt, als eine genügende Menge vorhanden sein sollte, um die vollständige Umwandlung von DHBA zu Acetoacetat durch DHBA-Dehydrogenase zu ermöglichen. NAD ist ein übliches, aus verschiedenen Quellen im Handel erhätliches Enzym, wie von TCI American, Portland, OR, oder von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.
Sowohl im Stand der Technik wie auch beim Verfahren der vorliegenden Erfindung wird die Umwandlung von DHBA in Acetoacetat durch DHBA- Dehydrogenase und NAD angewandt und genutzt (Gleichung 1). Allerdings wird im Stand der Technik dann das in Gleichung 1 gebildete NAD-H angewandt und genutzt, um mit einem Tetrazolium-Farbstoff, entweder direkt oder über eine Zwischenstufe mit einem Elektronträger, zur Bildung eines gefärbten Formazans wechselzuwirken (Gleichung 2). Bei der vorliegenden Erfindung werden jedoch die instabilen Tetrazolium-Farbstoffe weggelassen und umgangen, und es wird die Überführung von DL-Lipoamid zu 6,8-Dimercaptooctamid durch das in Gleichung 1 erzeugte NAD-H und das Enzym LADH angewandt und genutzt (Gleichung 3).
D,L-Lipoamid ist eine Verbindung der folgenden Strukturformel (1):
D,L-Lipoamid, auch bekannt als D,L-6,8-Thioctamid, ist eine im Handel aus einer Quelle wie von TCI American, Portland, OR, oder von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, erhältliche Verbindung. D,L-Lipoamid ist in der Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung in einer Konzentration von ca. 10 mM (millimolar) bis ca. 200, vorzugsweise in Konzentrationen von ca. 50 bis ca. 150, mM vorhanden. Im allgemeinen ist die in der Zusammensetzung enthaltende Menge an D,L-Lipoamid lediglich insofern eingeschränkt, als eine genügende Menge vorhanden sein sollte, um die vollständige Rückumwandlung des in Gleichung 1 gebildeten reduzierten NAD (NAD-H) in NAD zu ermöglichen. Es sollte ebenfalls selbstverständlich sein, daß substituiete Derivate von D,L-Lipoamid in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ebenso verwendet werden können.
Die Disulfid-Bindung in D,L-Lipoamid oder in deren substituierten Derivaten läßt sich durch Lipoamid-Dehydrogenase (LADH) in der Gegenwart von reduziertem NAD (NAD-H) reduzieren, um das Dithiol 6,8-Dimercaptooctamid zu erzeugen, das als Strukturformel (II) dargestellt ist. Diese Reaktion, die ganz allgemein in obiger Gleichung 3 und insbesondere in der unten angegebenen Gleichung 3a dargestellt ist, ist im Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Nachweis des Vorhandenseins oder der Konzentration von DHBA in einer Testprobe wichtig:
Es ist ersichtlich, daß das in Gleichung 1 erzeugte NAD-H mit D,L- Lipoamid (1) in der Gegenwart von LADH reagieren kann, um NAD erneut und die Dithiolverbindung (II) zu erzeugen. Demnach stellen D,L-Lipoamid und LADH wesentliche Bestandteile in der Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung dar. Die LADH reduziert die Dislfid-Bindung des D,L- Lipoamids (1), um die Dithiol-Verbindung (II) zu erzeugen, die dann mit dem Thiol-reaktiven Indikator-Farbstoff wechselwirken kann. Deshalb enthält die Indikator-Reagenszusammensetzung, zusätzlich zum D,L-Lipoamid, auch das Enzym Lipoamid-Dehydrogenase, um die Reduktion von D,L-Lipoamid oder einem Derivat von D,L-Lipoamid zu einer Dithiol-Verbindung enzymatisch zu katalysieren.
Das LADH-Enzym ist in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in einer Menge von ca. 100 bis ca. 2000, vorzugsweise von ca. 250 bis ca. 1000, Einheiten vorhanden, worin eine Einheit als diejenige Enzymmenge definiert ist, die 1 µmol (Mikromol) D,L-Lipoamid zu D,L-Dihydrolipoamid pro Minute bei pH 6,5 und 25ºC reduziert. LADH ist eine im Handel von einer Quelle wie Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, erhältliche Verbindung.
Es sollte festgestellt sein, daß zusätzlich zu D,L-Lipoamid und dem LADH-Disulfid-Reduktasesystem weitere Disulfid-Reduktasesysteme ebenso in Verfahren und Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. In jedem System reduziert ein Enzym, d.h. die Disulfid-Reduktase, wie LADH, eine Disulfid-Bindung im Substratmolekül, d.h. dem Disulfid- Substrat, wie dem D,L-Lipoamid, um Thiol-Reste zu ergeben, die dann dazu verfügbar sind, mit dem Thiol-reaktiven Indikator-Farbstoff wechselzuwirken. Tabelle 1 veranschaulicht nicht einschränkende Beispiele von Disulfid- Systemen, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Es sollte allerdings ebenso in Betracht gezogen sein, daß jedes Reduktasesystern, das einen Thiolrest erzeugt, in Zusammensetzung und Verfahren der vorliegenden Erfindung angewandt und genutzt werden kann. Wie oben erörtert, ist das bevorzugte Disulfid-Substrat D,L-Lipoamid und die entsprechenden Derivate, welche durch Lipoamid-Dehydrogenase (LADH) reduziert werden können. Tabelle I Disulfid-Reduktasesysteme Disulfid-Substrat: L-Cystin oxidiertes Glutathion Lipoamid Proteindisulfid oxidiertes Thioredoxin COAS-Sglutathion Asparagusat Disulfid-Reduktase Cystin-Reduktase Glutathion-Reduktase Lipoamid-Dehydrogenase Proteindisulfid-Reduktase Thioredoxin-Reduktase COAS-Sglutathion-Reduktase Asparagusat-Reduktase
Zusätzlich zum Enzym LADH, zum Enzym DHBA-Dehydrogenase, zum NAD und dem D,L-Lipoamid enthält die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung einen mit Thiol reaktionsfähigen Indikator-Farbstoff. Der in der Indikator- Reagenszusammensetzung enthaltene Indikator-Farbstoff ist lediglich insofern eingeschränkt, als der Indikator-Farbstoff dazu befähigt sein sollte, eine nachweisbare Reaktion, vorzugsweise eine chromogene Reaktion, in der Gegenwart eines Thiols einzugehen. Demzufolge ist der Indikator-Farbstoff vorzugsweise ein Redox-Indikator, der einen Farbübergang oder eine andere nachweisbare Reaktion bei Überführung aus einem oxidierten Zustand in seinen reduzierten Zustand durch Thiol eingeht bzw. ergibt, das in den enzymatischen Wechselwirkungen mit DHBA und D,L-Lipoamid erzeugt wird. Der Indikator-Farbstoff sollte genügend stabil sein, und zwar so sehr, daß ein Thiol vorliegen kann, bevor ein Farbübergang eintritt. Zum Erreichen des vollen Vorteils der vorliegenden Erfindung geht der Indikator-Farbstoff eine Farbumwandlung über verschiedene nachweisbare und meßbare Gradabstufungen und Intensitäten der Farbe ein, und zwar so, daß Ausmaß und Intenstität des Farbübergangs zur Konzentration von DHBA in einer Testprobe korreliert werden können.
Ein besonderer Thiol-empfindlicher Indikator-Farbstoff, der in der vorliegenden Erfindung einsetzbar ist, ist Ellman's Reagens 5,5'-Dithio(2- nitrabenzoesäure), eine Disulfidverbindung, die die Strukturformel (III) aufweist:
In der Gegenwart eines Thiols erzeugt Ellman's Reagens die gelbe Farbe von p-Nitrophenol bei 405 nm (Nanometer). Deshalb geht Ellman's Reagens einen Farbübergang von farblos zu gelb bei Wechselwirkung mit dem in Gleichung 3 erzeugten 6,8-Dimercaptooctamid ein.
Diese Wechselwirkung ist ganz allgemein als Gleichung 4 und insbesondere als Gleichung 4a dargestellt:
Ellman's Reagens ist ein stabiler Indikator-Farbstoff und sein Farbübergang ist hinreichend unterscheidbar, um eine Korrelation von Intensität und Ausmaß des Farbübergangs zur Konzentration von in der Testprobe vorhandener DHBA zu ermöglichen. Allerdings sind, obwohl der Farbübergang von farblos nach gelb eine visuell wahrnehmbare Unterscheidbarkeit zwischen den Farbabstufungen schwierig gestalten kann, die entsprechenden Farbabstufungsunterschiede von farblos nach gelb durch Farbmeßgeräte, wie ein Kobrimeter oder ein Spektrophotorneter, leicht zu unterscheiden.
Zusätzlich zu Ellman's Reagens können auch Derivate von Ellman's Reagens als ein Indikator-Farbstoff im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Durch Änderung von z.B. dem Hydroxyl-Rest der Carboxylsäuregruppen ergeben sich weitere einsetzbare Derivate von Ellman's Reagens. Deshalb schließen weitere Beispiele von Derivaten von Ellman's Reagens, die sich als geeignet in der Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung erwiesen haben, ohne darauf eingeschränkt zu sein, verschiedene Stellungsisomere der in Strukturformel (IV) dargestellten Verbindung ein:
worin R der Rest eines Alkohols oder Amins ist, um eine Ester- oder Amid-Bindung zu ergeben. Beispiele von Alkohol- und Amin-Resten, die sich als geeignet erwiesen haben, schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, ein:
Wasserlösliche Deriväte von Ellman's Reagens sind besonders bevorzugt, allerdings sind wasserunlösliche Derivate ebenfalls in Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignet. Ein besonders bevorzugtes wasserlösliches Derivat von Ellman's Reagens ist 3-N-(3- Dimethylaminopropyl)carboxamido-4-nitrophenyldisulfid, dargestellt als Strukturformel (V)
Diese Verbindung ist wie Ellman's Reagens farblos in der oxidierten Form und zeigt eine gelbe Farbe in der Gegenwart von Lipoamid, NADH und von Lipoamid-Dehydrogenase. Weitere üblich angewandte Indikator-Farbstoffe zum Nachweis von Thiolen schließen die 2,2'- und 4,4'-Dipyridyldisulfide wie 2,2'-Dithiobis(5-nitropyridin) ein, das eine Absorption bei 340 nm in der reduzierten Form zeigt.
Der Thiol-reaktive Indikator-Farbstoffliegt gewöhnlich in der Indikator-Reagenszusammensetzung in einer Konzentration von ca. 10 bis ca. 200, vorzugsweise von ca. 25 bis ca. 150, mM vor. Es sollte klar sein, daß die Menge des Indikator-Farbstoffs in der Indikator-Reagenszusammensetzung weniger als ca. 10 oder mehr als ca. 200 mM betragen kann, und zwar in Abhängigkeit von der Intensität des Farbübergangs, den ein besonderer Indikator- Farbstoff bei Reduktion ergibt. Im allgemeinen ist die Menge des in der Indikator-Reagens zusammensetzung enthaltenen Indikator-Farbstoffs lediglich insofern eingeschränkt, als der Indikator-Farbstoff einen nachweisbaren Farbübergang für einen qualitativen Assay oder für einen quantitativen Assay einen meßbaren Farbübergang im Verhältnis zur Menge der in der Testprobe vorhandenen DHBA ergeben muß.
Zusätzlich zu Ellman's Reagens, den Derivaten von Ellman's Reagens und den Dipyridyldisulfiden schließen weitere geeignete Indikator-Farbstoffe, die in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung einsetzbar sind, Isobenzthiazolon-Verbindungen mit der als allgemeine Strukturformel (VI) dargestellten Struktur ein:
worin mindestens einer der Substituenten R&sub1; und R&sub2; aus der Gruppe aus Nitro-, Arylazo-, substituierten Arylazo-, Benzylidenamino- und substituierten Benzylidenamino-Resten ausgewählt ist, und zwar so, daß, wenn nur einer der Reste R&sub1; und R&sub2; so substituiert ist, einer der Reste R&sub1; und R&sub2; Wasserstoff sein kann, und worin der Substituent R&sub3; aus der Gruppe aus Alkyl-, Carboxyalkyl-, Hydroxyalkyl-, Aminoalkyl-, Haloalkyl-, Aryl-, Carboxyaryl-, Hydroxyaryl-, Aminoaryl-, Heteroaryl-, Carboxyheteroaryl-, Hydroxyheteroaryl-, Aminoheteroaryl-, Hyydroxy-, Alkoxy-, Amino-Resten und aus substituierten Derivaten davon ausgewählt ist.
1 bevorzugtes Isobenzthiazolon der Strukturformel (VI) schließt eine Verbindung mit R&sub1; als Nitrogruppe und R&sub2; als Wasserstoffatom ein. Weitere bevorzugte Verbindungen schließen, ohne allerdings darauf eingeschränkt zu sein, Verbindungen mit R&sub2; als Wasserstoffatom und R&sub1; als Phenylazo-, 4- Hydroxyphenylazo-, 4-Nitro-2-methylphenylazo-, 2-Hydroxy-1-naphthylazo-, 2- Hydroxy-5-methylphenylazo-, 2-Hydroxy-4-methyl-5-nitrophenylazo-, 4- Hydroxy-1-naphthylazo-, 4-Hydroxy-3-methyl-1-naphthylazo-, 4-Hydroxy-5-aza- 1-naphthylazo-, 2-Amino-1-naphthylazo-, 1-Hydroxy-2-naphthylazo-, 1- Hydroxy-2-(N-dimethylaminopropylcarbamoyl)-4-naphthylazo-, 3-N,N- Dimethylaminopropylcarboxyamido-1-hydroxy-4-naphthylazo-, 1-Hydroxy-4methoxy-2-naphthylazo-, 2-Hydroxy-3-carboxy-1-naphthylazo-, 1-Hydroxy-3,6- disulfonat-2-naphthylazo-, 2,3-Dihydroxy-1-naphthylazo- und als 2-Hydroxy- 3,5-dimethyl-1-phenylazo-Gruppe ein. Eine weitere besonders geeignete Verbindung der allgemeinen Strukturformel (VI) schließt Verbindungen mit Benzylidenamino- und 2,4-Dinitrobenzylidenamino-Resten als Substituenten R, und mit R&sub2; als Wasserstoffatom ein. Weitere geeignete Indikator-Farbstoffe schließen, ohne allerdings darauf eingeschränkt zu sein, Verbindungen mit R, als Wasserstoffatom und mit R&sub2; als 2-Hydroxy-1-naphthylazo- oder als 4- Hydroxy-1-phenylazo-Substituent ein.
Zum Erreichen des vollen Vorteils der vorliegenden Erfindung schließt ein Isobenzthiazolon der allgemeinen Strukturformel (VI) eine Verbindung mit einem Substituenten R&sub3; ein, der aus der Gruppe aus Alkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Hydroxy-, Alkoxy-, Phenyl- und Aminoresten ausgewählt ist. Diese Reste können ihrerseits mit funktionellen Gruppen, wie mit Aminoalkyl-, Aminoaryl-, Carboxyalkyl-, Carboxyaryl-, Hydroxyalkyl-, Hydroxyaryl- und Haloalkyl-Gruppen, substituiert sein, die ausgewählt sind, um geeignete chemische, d.h. Reaktivität vermittelnde, oder physikalische, d.h. Löslichkeit verleihende, Eigenschaften zu ergeben.
Im allgemeinen ist eine Verbindung mit der Strukturformel (VI) dazu befähigt, das Vorhandensein oder die Konzentration von Thiolen, insbesondere in wässrigen Medien, nachzuweisen und einer Messung zugänglich zu machen. Somit beruht das Verfahren der vorliegenden Erfindung darauf, das Vorhandensein und die Konzentration eines Thiols durch Ausmaß und Intensität des Farbübergangs eines Thiol-reaktiven Farbstoffs nachzuweisen und zu messen und dann die Thiol-Konzentration zur Konzentration von in der Testprobe vorhandener DHBA in Korrelation zu bringen.
Die Indikator-Farbstoffe der allgemeinen Strukturformel (VI) ergeben, bei Wechselwirkung mit einem Thiol, eine Farbe längerer Wellenlänge und eine entsprechende Extinktion als die mit Ellman's Reagens und Derivaten von Ellman's Reagens entwickelte Farbe. Demzufolge zeigen diese höher gefärbten reduzierten Farbstoffe einen einfacher unterscheidbaren und aufgelösten Farbübergang, und der Farbübergang kann leichter und genauer in der Gegenwart von üblichen störenden Substanzen nachgewiesen werden, die in Gesamtblut, Plasma, Serum, Urin oder weiteren biologischen Proben vorhanden sein können.
Deshalb geht ein Indikator-Farbstoff der allgemeinen Strukturformel (VI) einen Farbübergang ein, wenn der Indikator-Farbstoff mit dem in Gleichung 3 des Schema erzeugten 6,8-Dimercaptooctamid zum Nachweis von DHBA in Wechselwirkung tritt. Diese Wechselwirkung ist ganz allgemein als Gleichung 4 und insbesondere als Gleichung 4b dargestellt: (farblos) (gefärbt)
Bei Kontakt mit dem 6,8-Dimercaptooctamid (II) geht der Indikator- Farbstoff (VI) eine Thiol-mediierte Reduktion ein, um das gefärbte Reduktionsprodukt (VII) zu bilden. Ausmaß und Intensität des Farbübergangs sind zur in der Testprobe erzeugten Menge von 6,8-Dimercaptoocctamid und, ihrerseits, die erzeugte Menge von 6,8-Dimercaptooctamid zur in der Testprobe vorhandenen Menge von DHBA proportional.
Deshalb ist, gemäß Verfahren und Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, ein geeigneter Indikator-Farbstoff eine Verbindung, die mit Thiol reaktionsfähig bzw. zur Wechselwirkung damit befähigt ist, einen ausreichenden Farbübergang bei Wechselwirkung mit einem Thiol eingeht und ergibt und geeignete physikalische Eigenschaften, wie ausreichende Löslichkeit in wässrigen Medien, zeigt. Ein geeigneter mit Thiol zur Wechselwirkung befähigter Indikator-Farbstoff weist ein charakteristisches UV-nachweisbares Spektrum auf, das sich nach Wechselwirkung mit einem Thiol ändert. Vorzugsweise ist die Anderung im UV-empfindlichen Spektrum genügend groß, so daß der Farbübergang entweder visuell oder mit einem Gerät nachgewiesen werden kann. Derartige Thiol-reaktive Indikator-Farbstoffe eignen sich zum Nachweis eines durch die Reduktion von Disulfiden erzeugten Thiols. Insbesondere sind die Thiol-reaktiven Indikator-Farbstoffe dazu befähigt, 6,8- Dimercaptooctamid nachzuweisen, das durch die Reaktion von LADH und NADH mit D,L-Lipoamid erzeugt ist. Weil NADH durch die Oxidation eines Substrats durch dessen besondere Dehydrogenase erzeugt wird, ist eine Kombination dieser Verbindungen dazu befähigt, die in einer Testprobe vorhandene Menge derartiger Substrate indirekt nachzuweisen. Ein typisches NADH-erzeugendes System schließt DHBA-Dehydrogenase und ihr Substrat DHBA ein.
Deshalb wird die Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung, enthaltend einen Thiol-reaktiven Indikator-Farbstoff, DHBA- Dehydrogenase, NAD, D,L-Lipoamid und LADH, in einem verbesserten Verfahren angewandt und dazu genutzt, das Vorhandensein oder die Konzentration von DHBA und somit von Ketokörpern, in flüssigen Testproben zu ermitteln. Es ist belegt worden, daß die Indikator-Reagenszusammensetzung mit DHBA wechselwirkt, um einen entweder visuell oder mit einem Gerät unterscheidbaren und meßbaren Farbübergang zu erzeugen. Ferner kann, zusätzlich zu den oben beschriebenen wesentlichen Bestandteilen, die Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung auch eine ausreichende Menge verschiedener gegebenenfalls vorhandener Bestandteile enthalten, wie einen Puffer.
Beispielsweise weisen Testproben oft einen pH-Wert ausserhalb des für den Assay von Interesse gewünschten pH-Bereichs auf, und deshalb wird ein Puffer der Indikator-Reagenszusammensetzung zugefügt. Demzufolge ist dargelegt worden, daß ein jeder von verschiedenen bekannten Typen von Puffern, falls benötigt, in der Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthalten sein kann. Der Puffer ist besonders wichtig in einem im Handel akzeptablen Trockenphasen-Teststreifen, um die Indikator- Reagenszusammensetzung bei einem ausreichenden pH-Wert zu halten, um die Stabilität der Indikator-Reagenszusammensetzung aufrechtzuerhalten und den erwünschten Farbübergang beim Thiol-reaktiven Indikator-Farbstoff beim Assayverfahren zu erzeugen.
Der Puffer ist in der Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfidung gewöhnlich in einer Konzentration von ca. 100 bis ca. 600 mM enthalten, obwohl in besonderen Situationen die Konzentration des Puffers oberhalb oder unterhalb dieses Bereichs liegen kann. Es ist herausgefunden worden, daß für optimale Assay-Ergebnisse der pH-Wert der Indikator- Reagenszusammensetzung im allgemeinen bei einem leicht alkalischen bis zum neutralen pH-Wert gehalten werden sollte. Deshalb ergibt ein pH-Wert von ca. 7 bis ca. 8,5, vorzugsweise von ca. 7 bis ca. 8, eine stabilere Indikator-Reagenszusammensetzung und einen leichter unterscheidbaren Farbübergang im Assay für DHBA.
Somit wird die Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung auf einen geeigneten pH-Wert gepuffert, und zwar mit einem Puffer wie Acetat, BICINE, Phthalat, Borat, Trichloracetat, Sulfosalicylat, Phosphat, Tartrat, Zitrat, Succinat, Maleinsäure, 2,2-Bis(hydroxymethyl)- 2,2',2"-nitrilotriethanol, 3,3-Dimethylglutarsäure, 3-N- Morpholinopropansulfonsäure (MOPS), Malonsäure, 1,3- Bis(tris(hydroxymethyl)methylamino)propan (Bis-TRIS), Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS), Tris(hydroxymethyl)aminomethan- Maleinsäure (TRIS-Maleat), Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Malonsäure (TRIS- Malonat), 3-N-(Trishydroxymethyl)methylamino-2-hydroxypropansulfonsäure (TAPSO), 2-((Tris(hydroxymethyl)methyl)amino)ethansulfonsäure (TES), 1,4- Piperazinbis(ethansulfonsäure) (PIPES), 4-Morpholinoethansulfonsäure (MES), N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES) und wie mit weiteren geeigneten, im Stand der Technik wohlbekannten Puffern oder mit Kombinationen davon.
Zusätzlich zu den wesentlichen Bestandteilen können weitere gegebenenfalls vorhandene Bestandteile, zusätzlich zum Puffer, welche die Natur der Funktion der wesentlichen Bestandteile nicht materiell verändern und das Assayverfahren für DHBA nicht stören, ebenfalls in der Indikator- Reagenszusammensetzung enthalten sein. Beispielsweise kann die Indikator- Reagenszusammensetzung gegebenenfalls eine Verbindung enthalten, um die Benetzung der Test-Unterlage der Test-Vorrichtung mit der Testprobe zu verbessern und den reduzierten Indikator-Farbstoff zu stabilisieren. Diese Verbindung ist gewöhnlich ein anionisches oder nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel. Ein anionisches oberflächenaktives Mittel, wie ein Sulfat oder Sulfonat mit langer Kohlenstoffkette, wie Natriumdodecylsulfat, Natriumdioctylsulfosuccinat und Natriumdodecylbenzosulfonat, ist das bevorzugte oberflächenaktive Mittel. Nicht-ionische oberflächenaktive Mittel, wie ein Octooxynol, ein Nonoxynol oder ein ethoxylierter Fettalkohol, können ebenfalls in der Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthalten sein. Das oberflächenaktive Mittel ist in der Indikator- Reagenszusammensetzung in einer Konzentration von 0 bis ca. 200, vorzugsweise von ca. 50 bis ca. 200, mM enthalten.
Die Indikator-Reagenszusammensetzung kann auch ein polymeres Material einschließen, das die Stabilität und Einheitlichkeit des Farbübergangs der Test-Vorrichtung verbessert. Geeignete polymere Materialien schließen, ohne allerdings darauf eingeschränkt zu sein, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Gummi arabicum, Gelatine, Algin, Karragheenan, Kasein, Albumin, Methylcellulose und ähnliche natürliche und synthetische Polymermaterialien ein. Das bevorzugte Polymermaterial ist ein Polyvinylpyrrolidon mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 40000 und von GAF Corp., New York, NY, im Handel erhältlich. Das Polymermaterial ist im allgemeinen in der Indikator- Reagenszusammensetzung in einer Menge von ca. 0 bis 5, vorzugsweise von ca. 1 bis ca. 4, % vorhanden, bezogen auf das Gesamtgewicht der Indikator- Reagenszusammensetzung.
Zur Verbesserung von Auflösung und Unterscheidbarkeit der Farbe des Farbübergangs in einem chromogenen Assay für DHBA können inerte Hintergrund-Farbstoffe in der Indikator-Reagenszusammensetzung enthalten sein. Geeignete Hintergrund-Farbstoffe schließen, ohne allerdings darauf eingeschränkt zu sein, Ethyl-Orange (4-(4- Dethylaminophenylazo)benzolsulfonsäure, Orange G (4-(2-Hydroxy-(7,9- natriumdisulfonat)-1-naphthylazo)benzol, disperses Orange 11, 13 oder 25, Calcomin-Orange, Methyl-Orange und Orange II (4-(2-Hydroxy-1- naphthylazo)benzolsulfonsäure) oder Kombinationen davon ein. Ein Hintergrund-Farbstoff ist in der Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung in einer Konzentration von 0 bis ca. 2, vorzugsweise von ca. 0,1 bis ca. 1, mM enthalten.
Das Trägermittel für die in der Indikator-Reagenszusammensetzung enthaltenen Bestandteile schließt Wasser ein. Allerdings können, wegen der eingeschränkten Wasserlöslichkeit bestimmter, in der Indikator- Reagenszusammensetzung enthaltener Bestandteile, organische Lösungsmittel wie Methanol, Ethanol, Isopropylalkohol, Ethylenglycol, Propylenglycol, Aceton, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Acetonitril, Ethylacetat und ähnliche Lösungsmittel im Trägermittel eingeschlossen sein. Die Auswahl eines geeigneten organischen Lösungsmittels oder von Lösungsmitteln, zusätzlich zum Wasser, zur Aufnahme im Trägermittel der Indikator- Reagenszusammensetzung liegt innerhalb der Befähigung und des Fachwissens der auf dem einschlägigen Fachgebiet tätigen Fachleute, welche damit befaßt sind, diagnostische Assayverfahren zu entwerfen und zu entwicklen.
Die Menge an in der Indikator-Reagenszusammenstzung vorhandenem organischen Lösungsmittel liegt im allgemeinen im Bereich von 0 bis ca. 90, vorzugsweise von 10 bis ca. 70, %, bezogen auf das Gewicht des Trägermittels. Ein Trägerlösungsmittell aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol oder Ethanol, ist besondes bevorzugt, weil eine mit der Indikator-Reagenszusammensetzung imprägnierte Trägermatrix innerhalb weniger Minuten getrocknet werden kann.
Wie vorher bereits beschrieben, ergibt die Indikator-Reagenszusammensetzung einen Farbübergang bei Kontakt mit einer Testprobe, um das Vorliegen von DHBA zu belegen. Ferner werden Intensität und Ausmaß des Farbübergangs dazu genutzt, die Konzentration von DHBA quantitativ zu bestimmen. Gemäß einem wichtigen Merkmal der vorliegenden Erfindung ist belegt worden, daß eine Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung einen genügend aufgelösten und differenzierten Farbübergang liefert, und zwar so, daß die Menge an in einer Testprobe vorhandener DHBA gemessen und genau bestimmt wird, ohne den Einsatz von Farbmeßgeräten, wie von Spektrophotometern oder Kolorimetern. Falls gewünscht, können jedoch derartige Farbmeßgeräte herangezogen werden, um den Unterschied bei Farbausmaß und -Intensität zwischen der Testprobe und einer Lösung zu messen, die eine bekannte Konzentration von DHBA aufweist.
Demgemäß werden bei einem Assayverfahren für DHBA, bei dem eine Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangt, die Genauigkeit und Zuverlässigkeit des Assayverfahrens verbessert, und es erhöht sich desgleichen das Vertrauen des Arztes in das Assayverfahren. Weil eine Reihe von Assayverfahren für Ketokörper zuhause vom untrainierten Patienten durchgeführt wird, im Gegensatz zu trainierten Ärzten oder Technikern im Labor, ist es zudem zwingend geboten, genaue und verläßliche quantitative Assayverfahren für den Ketokörper-Gehalt in einer biologischen Flüssigkeit zur Verfügung zu stellen.
Wie oben bereits erörtert, beruhten alle bisherigen Versuche zur Entwicklung eines genauen Routine-Tests für DHBA auf Tetrazolium-Farbstoffen, mit denen instabile chemische Bedingungen einhergehen. Im Gegensatz dazu, gelangen in der vorliegenden Erfindung die hochstabilen DHBA-Dehydrogenase und LADH-Enzyme sowie ein Thol-empfindlicher Indikator-Farbstoff in einem Test für DHBA in einem trockenen Reagens-Teststreifen-Format zur Anwendung. Zum Beweis der erhöhten Stabilität der in der Indikator- Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendeten Thiolreaktiven Indikator-Farbstoffe wurde Licht in einer Belastungsstudie herangezogen, wobei die Stabilität des Tetrazolium-Farbstoffs Jodnitrotetrazoliumchlorid (INT) mit der Stabilität der Isobenzthiazolon-Verbindung der allgemeinen Strukturformel (VI) verglichen wurde, worin R&sub1; eine Nitrogruppe, R&sub2; Wasserstoff und R&sub3; die 3-(Dimethylamino)propyl-Gruppe sind, wobei die Verbindung entsprechend der Nomenklatur N-3-(Dimethylaminopropyl)-5- nitroisobenzthiazol-3-on heißt und mit IBTZ-I bezeichnet ist.
Fig. 1 belegt die erhöhte Stabilität der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Thiol-reaktiven Indikator-Farbstoffe gegenüber den im Stand der Technik eingesetzten Tetrazolium-Farbstoffen. Fig. 1 zeigt, daß der Prozentsatz der Reflektion für IBTZ-I im wesentlichen unbeeinflußt während einer Bestrahlungsdauer von 60 Minuten mit kombiniertem Tageslicht und ultravioletter Strahlung bleibt. Für IBTZ-I erniedrigte sich der bei 460 nm ermittelte Prozentsatz der Reflektion lediglich von ca. 68 auf ca. 62%, wohingegen für INT, für eine Belichtungszeit von 60 Minuten, der bei 520 nm gemessene Prozentsatz der Reflektion im wesentlichen von ca. 68 auf ca. 20% absank. In dieser Vergleichsuntersuchung war jeder Farbstoff in äquimolarer Menge in die jeweiligen Filme aus vernetzter Gelatine eingebracht. Jeder einen Farbstoff enthaltende Film wurde einer kombinierten Belichtung mit Tageslicht und ultravioletter Strahlung ausgesetzt, und der Prozentsatz der Reflektion wurde bei der entsprechenden Wellenlänge am Anfang der Belichtung und dann nach 5, 10, 15, 30, 45 bzw. 60 Minuten Belichtung gemessen. Fig. 1 zeigt, daß der INT enthaltende Gelatine-Film einen kontinuierlichen Abfall beim Prozentsatz der Reflektion im Zeitablauf ergibt, wodurch die Instabilität von INT gegenüber IBTZ-I belegt ist. Es sollte festgestellt sein, daß im allgemeinen die Reflektionsmessung oder der entsprechende Wert umso niedriger ausfallen, je größer die Farbentwicklung und somit die Menge des durch Licht beeinflußten Indikators sind. Die Änderung des Prozentsatzes der Reflektion über die Dauer der Belichtung ist deshalb ein Maß für die Stabilität der Indikator-Reagenszusammensetzung und infolge dessen ein Maß der Stabilität des Teststreifens.
Zusätzlich zur gesteigerten Stabilität gegenüber Tetrazolium- Farbstoffen sind die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Thiolreaktiven Farbstoffe selektiver und werden von üblichen Komponenten nicht beeinflußt, die in biologischen Proben vorzufinden sind, wie von Ascorbinsäure oder Glutathion, wodurch falsche oder ungenaue Assay-Ergebnisse anfallen würden. Im Gegensatz dazu, würden die Tetrazolium-Farbstoffe durch diese allgemein vorkommenden Testproben-Komponenten signifikant beeinflußt. Beispielsweise wurden Teststreifen, enthaltend entweder INT oder IBTZ-I, welche in eine Matrix aus vernetzter Gelatine eingebracht waren, mit Lösungen einem Belastungstest unterzogen, die eine Konzentration von Ascorbinsäure im Bereich von 0 mg/dl (Milligramm pro Deziliter) bis 50 mg/dl enthielten. Es wurde festgestellt, daß ein den Tetrazolium-Farbstoff INT enthaltender Teststreifen eine positive Reaktion, sowohl visuell als auch mit einem Gerät, auf steigende Konzentrationen von Ascorbinsäure ergab. Im Gegensatz dazu wurden Teststreifen, in die der Isobenzthiazolon-Farbstoff IBTZ-I eingebraacht war, nicht in signifikanter Weise beeinflußt. Ausserdem wurden Teststreifen, die entweder INT oder IBTZ-I enthielten, einem Belastungstest mit Lösungen unterzogen, die 0 bis 50 mg/dl Glutathion enthielten. Die INT enthaltenden Teststreifen zeigten eine geringfügige Empfindlcihkeit gegenüber Glutathion, wohingegen Teststreifen, die IBTZ-I enthielten, von dem in Glutathion vorliegenden Thiol-Rest unbeeinflußt blieben.
Zusätzlich zum Beweis der verbesserten Stabilität des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Indikator-Farbstoffs wurde die Indikator- Reagenszusammensetzung, enthaltend einen Thiol-reaktiven Indikator- Farbstoff, DHBA-Dehydrogenase, D,L-Lipoamid, LADH und NAD, in einem Trokkenphasen-Teststreifen-Assay für DHBA dazu herangezogen, um die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erzielten neuen und unerwarteten Ergebnisse zu belegen. Der Trockenphasen-Teststreifen-Assay unter Verwendung der Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung, wird gemäß im Stand der Technik wohlbekannter Verfahrensweisen durchgeführt. Im allgemeinen wird der Assay für DHBA durchgeführt, indem man Gesamtblut, Serum, Plasma, Urin oder eine weitere Testprobe mit einer Analyt-Nachweisvorrichtung in Kontkat bringt, die die Indikator-Reagenszusammensetzung einschließt. Die Analyt-Nachweisvorrichtung kann in die Testprobe getaucht werden, oder es kann die Testprobe auf die Analyt-Nachweisvorrichtung getropft werden. Im Falle von Gesamtblut kann das hochgefärbte zelluläre Material von der Analyt-Nachweisvorrichtung gewischt oder abgelöscht werden, bevor die Nachweisvorrichtung bezüglich des Reaktionsergebnisses überprüft und untersucht wird. Die entstandene Farbänderung der Analyt- Nachweisvorrichtung zeigt das Vorhandensein von DHBA an, und es kann, falls entsprechend konstruiert, der entstandene Farbübergang mit einer standardisierten Farbkarte verglichen werden, um eine quantitative Messung der Konzentration von DHBA im Blut, Urin oder einer weiteren Testprobe zu ergeben.
In typischer Weise ist die Analyt-Nachweisvorrichtung ein mit einem Reagens imprägnierter Teststreifen, der entweder als ein Teststreifen mit einer Einzelunterlage (zum Assay von lediglich einem einzelnen Analyt) oder als ein Teststreifen mit Mehrfachunterlage (zum Assay für mehrere Analyte gleichzeitig) konstruiert ist. Für beide Typen eines mit Reagens imprägnierten Teststreifens umaßt der Teststreifen einen Trägerstreifen oder Griff, die normalerweise aus einem hydrophoben Kunststoff gefertigt sind, sowie eine für das Reagens vorgesehene Testunterlage aus einer saugfähigen oder nicht-saugfähigen Trägermatrix, in die die Indikator- Reagenszusammensetzung eingebracht ist. Im allgemeinen ist die Trägermatrix ein Absorbens-Material, das es ermöglicht, daß sich die Testprobe, infolge von Kapillarkräften, durch die Trägermatrix bewegt, um in Kontakt mit der Indikator-Reagenszusammensetzung zu gelangen und einen nachweisbaren oder meßbaren Farbübergang zu erzeugen. Im Assay einer Gesamtblut-Probe ist die Trägermatrix im allgemeinen nicht permeabel für das zelluläre Material. Daher lassen sich die hochgefärbten Zellen von der Testunterlage abwischen oder ablöschen und stören oder maskieren den Assay für DHBA nicht. Sollte im weiteren die Trägerrnatrix für das zelluläre Material permeabel bzw. durchlässig sein, wissen die entsprechenden Durchschnittsfachleute Bescheid über technische Verfahrensweisen und Vorrichtungen, um das zelluläre Material von der Testprobe abzutrennen, um die durch das zelluläre Material hervorgerufenen störenden Beeinflussungen zu eliminieren.
Die Trägermatrix kann jede Substanz sein, die zur Aufnahme der chemischen Reagentien befähigt ist, die zur Durchführung des Assayverfahrens von Interesse erforderlich sind, solange die Trägermatrix im wesentlichen inert gegenüber den chemischen Reagentien und porös oder absorbierend gegenüber den löslichen Komponenten der flüssigen Testprobe ist. Der Begriff titrägermatrixyt betrifft entweder saugfähige oder nicht-saugfähige Matrizes, die in Wasser oder weiteren biologischen Flüssigkeiten unlöslich sind und ihre strukturelle Integrität beibehalten, wenn sie Wasser und weiteren biologischen Flüssigkeiten ausgesetzt sind. Geeignete saugfähige Matrizes schließen Filterpapier, Schwamm-Materialien, Zellulose, Holz, Gewebe und Vliesstoffe und dgl. ein. Nicht-saugfähige Matrizes schließen Glasfaser, Polymerfilme und vorgeformte oder mikroporöse Membranen ein. Weitere geeignete Trägermatrizes schließen hydrophile anorganische Pulver, wie Kieselgel, Alurniniurnoxid, Diatomeenerde und dgl., tonartige Substanzen, Tuch, hydrophile natürliche Polymermaterialien, insbesondere Cellulosematerial, wie Cellulose-Perlen, und besonders faserhaltige Papiere wie Filterpapier oder Chromatographiepapier, synthetische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere, wie vernetzte Gelatine, Celluloseacetat, Polyvinylchlorid, Polyacrylamid, Cellulose, Polyvinylalkohol, Polysulfone, Polyester, Polyacrylate, Polyurethane, vernetztes Dextran, Agarose und weitere derartige vernetzte und nicht-vernetzte wasserunlösliche hydrophile Polymere ein. Hydrophobe und nicht-absorptive Substanzen sind zur Verwendung als Trägermatrix für die vorliegende Erfindung nicht geeignet. Die Trägermatrix kann aus verschiedenen chemischen Zusammensetzungen oder einer Mischung chemischer Zusammensetzungen hergestellt sein. Die Matrix kann auch bezüglich Glätte und Rauhigkeit im Zusammenhang mit Härte und Weichheit variabel beschaffen sein. Allerdings weist die Trägermatrix, in jedem Fall, ein hydrophiles oder absorptives Material auf. Die Trägermatrix ist am vorteilhaftesten aus saugfähigem Filterpapier oder nicht-saugfähigen Polymerfilmen aufgebaut. Der Griff ist gewöhnlich aus einem hydrophoben Material wie Celluloseacetat, Polyethylenterephthalat, Polycarbonat oder Polystyrol gebildet.
Bezüglich des Teststreifens zur Durchführung eines Assayverfahrens für DHBA in einer Testprobe kann die Trägermatrix jedes saugfähige oder nicht- saugfähige Material sein, das die Durchlässigkeit für die löslichen Komponenten der Testprobe zuläßt, um die Test-Unterlage des Teststreifens zu sättigen, die mit der Indikator-Reagenszusammensetzung imprägniert wird. Eine bevorzugte Trägermatrix ist eine hydrophile, saugfähige Matrix, enthaltend Cellulosematerialien, wie Papier und vorzugsweise Filterpapier. Zum Erreichen des vollen Vorteils der vorliegenden erfindung beim Assayverfahren für DHBA in einer Testprobe ist die Trägermatrix eine hydrophile, nicht saugfähige Matrix, enthaltend Polymerfilme, wie Filme aus Polyurethan oder aus vernetzter Gelatine. Derartige Polymerfilme besitzen alle Eigenschaften, die für eine Trägermatrix für die vorliegende Erfindung erforderlich sind, einschließlich derjenigen zur Suspendierung und Aufnahme von sowohl den wesentlichen Bestandteilen als auch jedem gegebenenfalls vorhandenen Bestandteil, welche in der Indikator-Reagenszusammensetzung enthalten sind, sowie zur Durchlässigkeit, die die Trägermatrix für die löslichen Komponenten der Testprobe aufweisen soll.
Zum Erzielen des vollen Vorteils der vorliegenden Erfindung wird eine geeignete Trägermatrix mit der Indikator-Reagenszusammensetzung imprägniert, und das Ganze wird in einem Trockenphasen-Teststreifen für den Assay von DHBA in einer Testprobe herangezogen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung liefert einen wirtschaftlichen, genauen und zuverlässigen Assay, der zuhause oder im Labor durchgeführt werden kann, und zwar im Hinblick auf das Vorhandensein oder die Konzentration von DHBA und somit von Ketokörpern in einer Testprobe. Zudem ermöglicht das Verfahren der vorliegenden Erfindung Nachweis, Unterscheidung und Messung einer niedrigen Konzentration von DHBA in der Testprobe, wodurch sich das Assayverfahren noch besser zur klinischen Anwendung eignet.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Durchführung eines Trockenphasen-Teststreifen-Assay für DHBA wird zuerst eine methanolische Lösung hergestellt, die ca. 10 bis ca. 200 mM Thiol-reaktiven Indikator- Farbstoff, wie Ellman's Reagens, ein Derivat von Ellman's Reagens, ein geeignetes 2,2'- oder 4,4'-Dipyridyldisulfid oder ein Isobenzthiazolon der allgemeinen Strukturformel (VI) und ca. 10 bis ca. 200 mM D,L-Lipoamid sowie jeden weiteren gewünschten, gegebenenfalls vorhandenen Bestandteil oder entsprechende Lösungsmittel enthält. Eine nicht-saugfähige Matrix, wie ein Polyurethan-Film, oder eine saugfähige Matrix, wie Filterpapier, werden dann mit der methanolischen Lösung bis zur Sättigung getränkt oder imprägniert, indem man Platten oder vorgeschnittene Streifen oder Unterlagen aus dem Polyurethan-Film oder aus dem Filterpapier in die methanolische Lösung eintaucht oder diese damit besprüht.
Dann werden, nach Entfernung des Methanol-Lösungsmittels durch Trocknen in einem Ofen mit Zwangsluftführung bei einer Temperatur von ca. 40 bis ca. 100ºC ca. 2 bis ca. 5 Minuten lang der Polyurethan-Film oder das Filterpapier mit einer wässrigen Lösung, die ca. 50 bis ca. 5000 Einheiten DHBA-Dehydrogenase, ca. 100 bis ca. 2000 Einheiten LADH, ca. 10 bis ca. 500 mM NAD und jeden weiteren gewünschten, gegebenenfalls vorhandenen Bestandteil, oberflächenaktive Mittel oder Lösungsmittel sowie Hintergrund- Farbstoffe enthält, entweder durch Eintauchen oder Besprühen bis zur Sättigung getränkt und imprägniert. Nach einer zweiten Trocknung im Ofen bei ca. 40 bis ca. 100ºC über ca. 2 bis 5 Minuten werden die 2-fach-getränkten oder 2-fach-imprägnierten Polyurethan-Filme oder Filterpapiere, falls nötig, auf eine geeignete Größe zurechtgeschnitten, wie auf eine Unterlage, die Abmessungen von ca. 0,2 Inch (0,5 cm) auf ca. 0,5 Inch (1,3 cm) bis von ca. 0,5 Inch (1,3 cm) auf ca. 1 Inch (2,5 cm) aufweisen.
Es sollte klar sein, daß es im Rahmen der experimentellen technischen Fertigkeiten des Durchschnittsfachmanns liegt, Test-Vorrichtungen herzustellen, um eine gute Ausgewogenheit zwischen der Größe der Reagens- Unterlage, der Stärke der Indikator-Reagenszusammensetzungslösungen, der Menge der Testprobe und dem Verfahren der Einbringung der Testprobe in den Teststreifen, wie eher durch Pipettieren als durch Tauchen, festzulegen, um ein quantitatives Assayverfahren für DHBA zu entwerfen, bei dem das Verfahren und die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung angewandt sind.
Der getrocknete, zweifach imprägnierte Polyurethan-Film oder das entsprechende Filterpapier werden dann auf einem opaken oder durchsichtigen hydrophoben Griff aus Kunststoff mit doppelseitigem Klebeband befestigt. Der entstandene Teststreifen wird dann mit einer frischen, unzentrifugierten Blut- oder Urin-Probe eine genügende Zeit lang in Kontakt gebracht, um die Test-Unterlage mit der Probe bis zur Sättigung zu tränken. Nach einer vorbestimmten Wartezeit, wie von ca. 0,5 bis ca. 10 Minuten, wird der Teststreifen, entweder visuell oder mit einem Gerät, bezüglich eines Reaktionsergebnisses überprüft und untersucht. Falls nötig, wird das in der Testprobe vorhandene zelluläre Material vom Teststreifen abgewischt oder abgelöscht, bevor der Teststreifen bezüglich des Ergebnisses untersucht wird. Falls vorhanden, offenbart der Farbübergang auf der Test-Unterlage das Vorhandensein oder die Konzentration von DHBA in der Testprobe.
In vielen Fällen liefert die bloße visuelle Betrachtung des Teststreifens die gewünschte Information. Ist eine genauere Information erforderlich, kann eine Farbkarte, die Farbstellen aufweist, die verschiedenen bekannten Konzentrationen von DHBA entsprechen, für die im Teststreifen verwendete besondere Indikator-Reagenszusammensetzung hergestellt werden. Die nach Kontakt mit der Testprobe entstandene Farbe des Teststreifens kann dann mit den Farbstellen auf der Karte verglichen werden, um die Konzentration von DHBA in der Testprobe zu bestimmen. Ist eine noch genauere Bestimmung erforderlich, können ein Spektrophotometer oder Kolorimeter angewandt werden, um das Ausmaß des Farbübergangs präziser zu bestimmen. Zudem kann der Trockenphasen-Teststreifen-Assay quantifiziert werden, indem man, im Gegensatz zu visuellen Techniken, spektrophotometrische oder kolorimetrische Techniken anwendet, um das Ausmaß des Farbübergangs zuverlässiger und genauer zu ermitteln und somit die Konzentration von DHBA in der Testprobe, besonders bei niedrigen Konzentrationen, wie unterhalb 0,5 mMol/l, genauer zu messen.
Gemäß 1 Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung, werden die folgenden Trockenphasen-Teststreifen zur Durchführung eines Trockenphasen- Assayverfahrens für DHBA hergestellt. Ein Streifen, eine Unterlage oder eine Platte einer Trägermatrix, wie eines mikroporösen Polymerfilms oder einer Membran, wie aus einem Polyurethan-Film, enthaltend Talkum als Füllstoff, wurden zuerst in eine methanolische Lösung getaucht, die enthält: Indikator-Reagens zusammensetzung Formulierung Nr. 1 Erste Eintauch-Lösung Bestandteil Konzentration Ellman's Reagens (Indikator-Farbstoff) D,L-Lipoamid (Enzym-Substrat) Methanol
Überschüssige Indikator-Reagenszusammensetzung wurde von der Oberfläche des Polyurethan-Films mit einem Kratzstab entfernt. Ein mikroporöser Polyurethan-Film wurde in diesem Beispiel herangezogen, weil der Polyurethan-Film eine ausreichende Benetzbarkeit und genügende Haftung an die hydrophobe Kunststoffunterlage zeigt.
Der einfach-getränkte oder imprägnierte Polyurethan-Film wurde dann in einem Ofen mit Zwangsluftführung bei einer Tempratur von ca. 45 bis ca. 60ºC ca. 2 Minuten lang getrocknet. Nach Trocknung wurde der einfachgetränkte oder imprägnierte Polyurethan-Film dann in eine wässrige Lösung getraucht, die enthält: Zweite Eintauch-Lösung: Bestandteil Konzentration DHBA-Dehydrogenase (Enzym für DHBA) LADH (Enzym für D,L-Lipoamid) BICINE (Puffer, pH = 8) Wasser Einheiten
Der zweifach-getränkte oder imprägnierte Polyurethan-Film wurde dann in einem Ofen bei einer Tempratur von ca. 40 bis ca. 60ºC ca. 5 Minuten lang getrocknet. Der getrocknete und zweifach-getränkte oder imprägnierte Polyurethan-Film wurde dann auf der Rückseite mit einem doppelseitigen Klebeband versehen und zu einem Streifen von 0,4 Inch (1 cm) Breite geschnitten. Dieser Streifen aus Polyurethan-Film in den eine Indikator- Reagenszusammenstzung der vorliegenden Erfindung eingebracht war, wurde dann mit dem doppelseitigen Klebeband auf einer Unterlage aus Polystyrol- Kunststoff befestigt. Die Unterlage aus Kunststoff, die den getränkten oder imprägnierten Polyurethan-Film aufweist, wird dann in Streifen von 0,2 Inch (0,5 cm) geschnitten. Demnach enthält die Unterlage aus Kunststoff eine Trägerunterlage, die Abmessungen von ca. 0,2 Inch (0,5 cm) auf ca. 0,4 Inch (1 cm) eines getränkten oder imprägnierten Polyurethan-Films aufweist, um eine Test-Unterlage zu ergeben, die eine Trägermatrix aus Polyurethan-Film aufweist, in die eine Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung eingebracht ist.
Ausserdem sollte klar sein, daß die Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung ausreichende Stabilität aufweist, so daß die Trägermatrix gesättigt oder imprägniert werden kann, indem die Trägermatrix in eine einzelne wässrige oder wässrig-alkoholische Lösung getaucht wird, die alle wesentlichen und gegebenenfalls vorhandenen Bestandteile der Indikator-Reagenszusammensetzung enthält. Allerdings ist die zweistufige Verfahrensweise unter Durchführung von zwei Eintauchvorgängen bevorzugt, weil bestimmte Bestandteile der Indikator-Reagenszusammensetzung relativ niedrige Wasserlöslichkeiten aufweisen und bestimmte Enzym-Zubereitungen gelegentlich hineichend unrein sind, um die Solubilisierung einer ausreichenden Menge der Bestandteile der Indikator-Reagenszusammensetzung auszuschließen.
Zum Beweis der neuen und unerwarteten Ergebnisse, die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erzielt werden, wurden Trockenphasen- Teststreifen, enthaltend eine Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung (Formulierung Nr. 1), dazu herangezogen, ein Assayverfahren mit standardisierten Lösungen durchzuführen, die DHBA enthielten. Es wurden jeweils einzelne Teststreifen in eine Reihe standardisierter Lösungen getaucht, die 0 bis 16 mM DHBA enthielten. Annähernd 15 Minuten nach Kontakt mit einer standardisierten DHBA-Lösung wurde die Reflektion der Test-Unterlage des Teststreifens bei 440 nm (Nanometer) an einem SERALYZER Reflektionsphotometer der Diagnostics Division von Miles, Inc., Elkhart, IN, gemessen. Die Reflektion R, wie ermittelt aus der Reflektionsskala von bis 1, wurde in die Kubelka-Munk-Funktion eingesetzt:
K/S (1-R²/2R),
worin K der Absorptionskoeffizient, S der Streukoeffizient und R der Reflexionswert sind. Die bei 440 nm ermittelten Reflexionswerte wurden zur Berechnung der K/S-Werte eingesetzt. Die K/S-Werte sind proportional zur Farbe des Teststreifens, und somit gilt, daß, je größer die K/S-Werte sind. Ausmaß und Intensität des Farbübergangs des Teststreifens umso größer sind. Das in Fig. 2 dargestellte Diagramm zeigt die im wesentlichen linear verlaufende Reaktionswechselwirkung des Farbübergangs der Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung mit steigender Menge von DHBA in einer standardisierten Testprobe. In Fig. 2 wurden die K/S-Werte aus den Messungen der Reflektionswerte berechnet, die bei 440 nm 1045 Sekunden nach Kontakt der Test-Unterlage mit der standardisierten Testprobe drchgeführt wurden. Es wurde festgestellt, daß ausser für die standardisierte Lösung, die 8 mM DHBA enthielt, die K/S-Werte linear mit der steigenden Konzentration von DHBA über den Bereich von 0 bis 16 mM DHBA anstiegen. Die Indikator-Reagenszusammensetzung, die für die jeweiligen Ergebnisse der Assayverfahren verwendet wurden, welche in Fig. 2 aufgetragen sind, war nicht optimiert. Demnach sollte sich nach Optimierung der Indikator- Reagenszusammensetzung die Linearität der Reaktionswechselwirkung verbessern lassen.
Zum Beweis, daß, zusätzlich zu Ellman's Reagens, weitere Thiolreaktive Indikator-Farbstoffe in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eingesetzt sein können, wurde ein Teststreifen in identischer Weise wie oben hergestellt, mit der Ausnahme, daß der mikroporöse Polyurethan- Film mit den folgenden beiden Lösungen nacheinander getränkt oder imprägniert wurde: Indikator-Reagenszusammensetzung Formulierung Nr. 2 Erste Eintauch-Lösung Bestandteil Konzentration IBTZ-I (Indikator-Farbstoff) D,L-Lipoamid (Enzym-Substrat) Methanol Zweite Eintauch-Lösung DHBA-Dehydrogenase (Enzym für DHBA) LADH (Enzym für D,L-Lipoamid) BICINE (Puffer, pH = 8) Wasser Einheiten
In Formulierung Nr. 2 wurde Ellman's Reagens weggelassen und durch ein Isobenzthiazolon der allgemeinen Strukturformel VI ersetzt. Teststreifen, die die Zusammensetzung der Formulierung Nr. 2 enthielten, wurden herangezogen, um ein Assayverfahren an standardisierten Lösungen von DHBA über einen Konzentrationsbereich von 0 bis 16 mM DHBA durchzuführen. Die Vorgehensweisen beim Assayverfahren waren identisch mit den oben beschriebenen, mit der Ausnahme, daß die Reflektionswerte bei 440 nm nach einer Inkubationsdauer von 10 Minuten gemessen wurden. Fig. 3 zeigt erneut die im wesentlichen lineare Korrelation der bei 440 nm ermittelten K/S-Werte zur Konzentration von DHBA, insbesondere über den Konzentrationsbereich von 0 bis 8 mM DHBA. Dieser Test wurde mit der Zusammensetzung von Formulierung Nr. 2 wiederholt, mit der nun eine Matrix aus Filterpapier gesättigt oder imprägniert war, und die Dosis-Reaktion-Korrelation der K/S-Werte zu DHBA- Konzentrationen war im wesentlichen identisch mit derjenigen, die bei Teststreifen unter Verwendung eines Polyurethan-Films ermittelt wurde. Demnach ist belegt worden, daß eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die entweder Ellman's Reagens oder ein substituiertes Isobenzthiazolon der allgemeinen Strukturformel (VI) enthält, in entweder eine saugfähige oder eine nicht-saugfähige Trägermatrix eingebracht werden kann, um eine Testunterlage zu ergeben, mit der eine Testprobe bezüglich DHBA einem genauen Assayverfahren unterzogen werden kann.
Zusätzlich zum Isobenzthiazolon IBTZ-I wurden weitere Isobenzthiazolon-Verbindungen der allgemeinen Strukturformel (VI) in eine Indikator- Reagenszuzsammensetzung der vorliegenden Erfindung eingebracht, und es wurde dabei festgestellt, daß das Vorhandensein oder die Konzentration von DHBA in einer Testprobe genau nachgewiesen werden. Insbesondere sind in der folgenden Tabelle II beispielhafte Isobenzthiazolon-Verbindungen aufgelistet, die bezüglich ihrer Befähigung zum Nachweis von DHBA in einer Testprobe untersucht werden. Es sollte festgehalten sein, daß weitere Isobenzthiazolon-Verbindungen ebenfalls in Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendbar sind und die in Tabelle II angegebenen Verbindungen lediglich nicht-einschränkende Beispiele geeigneter Isobenzthiazolon-Indikator-Farbstoffe darstellen. In jedem der in Tabelle II angegebenen Beispiele ist der Substituent R&sub3; der 3-(Dimethylamino)propyl-Rest. Dieser besondere Substituent R&sub3; verleiht der IBTZ-Verbindung eine verbesserte Wasserlöslichkeit Die Substituenten R&sub1; und R&sub2; wurden variiert, wie dies in Tabelle II angegeben ist. Die maximale Wellenlänge λmax für sowohl die oxidierte (ox) als auch die reduzierte (red) Form der jeweiligen IBTZ- Verbindung sind ebenfalls in Tabelle II angegeben. Tabelle II IBTZ- Indikator-Farbstoffe R&sub3; = 3-(Dimethylamino)propyl) λmax (red) NO&sub2; 5-Nitro 5-(4-Hydroxyphenylazo) 5-(4-Nitro-2-methylphenylazo) 5-(2,4-Dinitrobenzylidenamin) NO&sub2; 7-Nitro 5-Phenylazo 5-(2-Hy< droxy-1-naphthylazo) 5-(2-Hydroxy-5-methylphenylazo) 5-(2-Hydroxy-4-methyl-5-nitrophenylazo) 5-(4-Hydroxy-1-naphthylazo) 5-(4-Hydroxy-3-methyl-1-naphthylazo) 5-(4-Hydroxy-5-aza-1-naphthylazo) 5-(2-Amino-1-naphthylazo) 5-(1-Hydroxy-4-methoxy-2-naphthylazo)
Einige der in Tabelle II dargestellten IBTZ-Verbindungen wurden in eine Indikator-Reagenszusammensetzung eingebracht, die, ihrerseits, in eine Trägermatrix aus einem vernetzten Gelatine-Film eingebracht wurde. Die Indikator-Reagenszusammensetzung kann in den Film aus vernetzter Gelatine nach Bildung des Films eingebracht werden, oder es wird die Indikator- Reagenszusammensetzung vorzugsweise mit den die Gelatine-Matrix ergebenden Komponenten zusammengebracht, welche Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, Ethylenglycol und Wasser einschließen, um die Indikator-Reagenszusammensetzung in den Gelatine-Film eingebracht zu enthalten, wenn der Gelatine-Film gebildet wird.
Zur Bildung einer Trägermatrix aus einem Gelatine-Film und zur gleichzeitigen Einbringung der Bestandteile der Indikator-Reagenszusammensetzung in den Film werden die Komponenten des Gelatine-Films und die Bestandteile der Indikator-Reagenszusammensetzung vermischt und die Mischung auf eine geeignete Unterlage aus Kunststoff unter Zuhilfenahme eines Mayer-Stabs (Nr. 42) gegossen, um einen Film aus unvernetzter Gelatine mit einer Dicke von ca. 100 µm (Mikron) zu erzeugen. Dieser Film aus unvernetzter Gelatine schließt alle Bestandteile der Indikator-Reagenszusammensetzung ein. Mach Lufttrocknung wurde eine wässrige Vernetzer-Lösung, enthaltend ca. 1,2% EDAC-Vernetzungsmittelverbindung, 5% OLIN 10G nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel und 93,8% Wasser, auf den Film aus unvernetzter Gelatine zur Vernetzung des Films aufgebracht. EDAC ist die Vernetzungsmittelverbindung 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Weitere geeignete Vernetzungsmittel schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Glutaraldehyd, Disuccinimidylcarbonat, Disuccinimidyloxalat, Dipyridylthionocarbonat und Cyclohexyl(morpholinoethyl)carbodiimid-Metho-p-toluolsulfonat ein. Die Vernetzungsmittel-Lösung wird mit einem Mayer-Stab (Nr. 22) aufgebracht, um die Vernetzungsmittell-Lösung in einer Dicke von ca. 20 µm aufzugießen. Nach Trocknung entsteht eine Test-Unterlage einer Dicke von annähernd 10 µm, die eine Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung einschließt, die in eine vernetzte Trägermatrix eingebracht ist.
Zum Beweis, daß eine Vielzahl von Isobenzthiazolonen der allgemeinen Strukturformel VI in Verfahren und Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann, wurden die Indikator-Reagenszusammensetzungen der Beispiele 1 bis 8, die in Tabelle III angegeben sind, hergestellt und in eine Matrix aus vernetzter Gelatine durch das oben beschriebene Verfahren eingebracht. Tabelle III Indikator-Reagenszusammensetzung, enthaltend einen IBTZ-Indikator-Farbstoff Bestandteile * Beispiel Beipsiel Gelatine (20% G/G) 1) OLIN 10G (4% G/G) 3) TRITON X-100 (4% G/G) 4) Ethylenglycol D,L-Lipoamid Methanol DHBA-Dehydrogenase Einheiten Fortsetzung Tabelle III Indikator-Reagenszusammensetzung, enthaltend einen IBTZ-Indikator-Farbstoff Bestandteile * Beispiel Beipsiel Gelatine (20% G/G) 1) OLIN 10G (4% G/G) 3) TRITON X-100 (4% G/G) 4) Ethylenglycol D,L-Lipoamid Methanol DHBA-Dehydrogenase Einheiten * Die Bestandteile liegen in Gewichtsmengen (Gramm) vor, wenn nichts anderes angegeben ist.
1) Gelatine mit 20 Gew.% in Wasser; pH = 7,5;
2) PVP ist Polyvinylpyrrolidon, 20 Gew.% in Wasser;
3) OLIN 10G ist ein oberflächenaktives Mittel auf Basis Nonylphenol-Polyglycidol, erhältlich von Olin Chemical Co., Stamford, Connecticut, 4 Gew.% in Wasser;
4) TRITON X-100 ist Octylphenoxypolyethoxyethanol, enthaltend ca. 9 Mol Ethylenoxid, erhältlich von Rohm and Haas Co., Philadelphia, PA, 4 Gew.% in Wasser;
5) HEPES ist der Puffer N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2- ethansulfonsäure; 1 M, pH = 7,5
Die Zusammensetzung von Beispiel 1, mit der die Bestandteile einer Indikator-Reagenszusammensetzung direkt in die Komponenten der Matrix für einen Gelatine-Film eingebracht wurden, wurde auf eine Unterlage aus Kunststoff aufgebracht, und es wurde, nach Vernetzung und Trocknung, der entstandene Teststreifen zum Assay für DHBA herangezogen. Teststreifen, die mit der Zusammensetzung von Beispiel 1 beaufschlagt waren, wurden zum Test standardisierter Lösungen herangezogen, die 0, 1,0, 2,5 und 5,0 mM DHBA enthielten. Die Teststreifen wurden einem Assayverfahren durch Reflektionsphotometrie bei 440 nm über eine Zeitdauer von 0 bis ca. 10 Minuten unterzogen, nachdem die Teststreifen mit der Testprobe in Kontakt gebracht waren. Fig. 4 zeigt ein Diagramm von K/S-Werten bei 440 nm gegen die Zeit für das Assayverfahren der vier standardisierten DHBA-Lösungen. Die Auftragungen in Fig. 4 belegen, daß ein vollständiger Farbübergang, d.h. der Endpunkt des Assay, nach ca. 8 Minuten auftritt, nachdem die Testprobe mit der Test-Unterlage des Teststreifens in Kontakt war. Fig. 4 und die folgenden Figuren 6, 8, 10, 12 und 13 zeigen, daß der Farbübergang seinen Endpunkt nach einer Inkubationsdauer von ca. 2 bis ca. 10 Minuten erreicht, und zwar in Abhängigkeit vom besonderen IBTZ-Indikator-Farbstoff, der in der Indikator-Reagenszusammensetzung eingesetzt ist, sowie von der in der Testprobe vorliegenden Konzentration von DHBA. Ebenso ist festgestellt worden, daß die auf der Test-Unterlage gebildete Farbe im wesentlichen nicht durch eine Oxidation des reduzierten IBTZ-Farbstoffs über eine Zeitdauer von wenigstens 24 Stunden hinweg und gewöhnlich sogar noch länger darüber hinaus abnimmt bzw. verschwindet. Daher ist, nach Festlegung einer ausreichenden Zeit für einen vollständigen Farbübergang, derjenige, der das Assayverfahren durchführt, frei bzw. ungebunden, die Test-unterlage bezüglich des entstandenen Ergebnisses zu jedem Zeitpunkt zu untersuchen, nachdem der Endpunkt erreicht worden ist, was einen Unterschied zu einem Teststreifen darstellt, dessen Ergebnis auf der Test-Unterlage zu einem bestimmten Zeitpunkt untersucht und festgestellt werden muß. Darüber hinaus bleibt demjenigen, der das Assayverfahren durchführt, genügend Zeit, um die Test- Unterlage bezüglich der entstandenen Reaktion zu untersuchen und ein genaues und verläßliches Assay-Ergebnis zu erhalten, bevor die auf der Test- Unterlage gebildete Farbe zu verschwinden beginnt.
Fig. 5 zeigt die Dosis-Reaktion-Auftragung für die DHBA-Konzentration gegen K/S bei 440 nm nach einer Inkubation von 8 Minuten. Die Dosis- Reaktion is im wesentlichen linear im niedrigen Konzentrationsbereich von 0 bis ca. 2,5 mM DHBA, und die Linearität bei höheren Konzentrationen verbessert sich bei Optimierung der Indikator- Reagenszusarrlmensetzungsformulierung. Demgemäß läßt sich eine Testprobe, enthaltend eine unbekannte Konzentration von DHBA, mit einem Assayverfahren untersuchen, indem man den K/S-Wert bei 440 nm nach einer Inkubationsdauer von 8 Minuten ermittelt und diesen K/S-Wert mit einer Dosis-Reaktion- Auftragung für standardisierte DHBA-Lösungen in Korrelation bringt, wie mit der Auftragung in Fg. 5, um die unbekannte Konzentration von DHBA in der Testprobe zu ermitteln. Es sollte dabei festgestellt sein, daß die in Fig. 4 und 5 aufgetragenen Ergebnisse Durchschnittswerte aus 3-fach wiederholten Assayverfahren darstellen, wobei 30 µl (Mikroliter) standardisierte DHBA- Lösung auf die Test-Vorrichtung aufgebracht und überschüssige DHBA-Lösung von der Test-Vorrichtung 1 Minute nach Kontakt abgelöscht wurden.
In der Zusammensetzung von Beispiel 2 ist das oberflächenaktive Mittel OLIN 10G weggelassen und statt dessen das oberflächenaktive Mittel TRITON X-100 eingesetzt. Fig. 6 und 7 ähneln Fig. 4 und 5 und stellen Auftragungen von K/S bei 440 nm gegen die Zeit bzw. von K/S bei 440 nm und 8 Minuten Inkubationszeit gegen die Konzentration von DHBA dar. Die in Fig. 6 und 7 aufgetragenen Assay-Ergebnisse ähneln den in Fig. 4 und 5 aufgetragenen Assay-Ergebnissen, allerdings ist in Fig. 7 die Linearität der Dosis-Reaktion im Bereich C bis 2 mM DHBA drastisch verbessert. Demgemäß zeigen Fig. 4 bis 7, daß der Indikator-Farbtoff IBTZ-I in eine Indikator- Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung in ein Assayverfahren für niedrige Konzentrationen von DHBA eingebracht werden kann, um angemessene qualitative Assayverfahren für höhere Konzentrationen von DHBA in einer Testprobe bereitzustellen.
Die Zusammensetzung von Beispiel 3, die das Isobenzthiazolon N-(3- Dimethylaminopropyl)-5-(2-hydroxy-1-naphthylazo) isobenthiazol-3-on enthält, das als IBTZ-VII bezeichnet ist, zeigte eine verbesserte Befähigung zum Nachweis von DHBA in einer Testprobe. Fig. 8 zeigt, daß ein vollständiger Farbübergang, oder der Endpunkt, für Indikator-Reagenszusammensetzungen, die IBTZ-VII enthalten, in ca. 2 bis ca. 4 Minuten nach Zusammenbringen der Testprobe mit der Test-Unterlage eintreten und beendet sind. Ferner zeigt das in Fig. 9 dargestellte Dosis-Reaktion-Diagramm eine ausgezeichnete Dosis-Reaktion der Indikator-Reagenszusammensetzung, die IBTZ-VII enthält, gegenüber DHBA über einen Konzentrationsbereich von 0 bis 5 mM, wobei die Reflektionsmessungen bei 580 nm und 4 Minuten Inkubationsdauer durchgeführt sind. Der im wesentlichen lineare Verlauf des Diagramms von Fig. 9 zeigt, daß genaue Assayverfahren für DHBA in einer Testprobe erhalten werden.
Visuelle Assayverfahren unter Einsatz der Zusammensetzung von Beispiel 3 wurden ebenfalls durchgeführt und zeigten, daß der Farbübergang auf der Test-Unterlage von hell orange für 0 mM DHBA bis dunkelrot-orange für 8, mM DHBA reichte. Fig. 10 und 11 zeigen eine Duplikation der in Fig. 8 und 9 dargestellten Assayverfahren. Daher zeigte, ganz allgemein, die Indikator- Reagenszusammensetzung von Beispiel 3 sowohl eine gute Dosis-Reaktion gegenüber DHBA über den Bereich von 0 bis 5 mM DHBA und eine kurze Inkubationsdauer von weniger als 5 Minuten. Insbesondere kann die für die Zusammensetzung von Beipsiel 3, enthaltend IBTZ-VII, dargelegte kurze Inkubationsdauer (Fig. 8 und 10) mit der längeren Inkubationsdauer verglichen werden kann, die für die Zusammensetzung von Beispiel 4 erforderlich ist, die den Farbstoff IBTZ-VIII mit der Bezeichnung N-3-(Dimethylaminopropyl)-5-(2- hydroxy-5-methylphenylazo)isobenzthiazol-3-on enthält (Fig. 12).
Die Zusammensetzung von Beispiel 3 wurde erneut bezüglich des Reaktionsergebnisses bei standardisierten Lösungen visuell getestet, die 0 bis 50 mM DHBA enthielten. Wie im ersten visuellen Test festgestellt, ist herausgefunden worden, daß die Farbe des Teststreifens, der einer DHBA-Lösung mit mM ausgesetzt war (negativ), blaß orange war. Allerdings war ein Teststreifen, der DHBA-Lösungen ausgesetzt wurde, die 25 bis 50 mM DHBA enthielten, glänzend purpurfarben nach ca. 3 bis ca. 5 Minuten Inkubationszeit. In einem weiteren Beispiel, Beispiel 3A, war die Zusammensetzung identisch mit der Zusammensetzung von Beispiel 3, mit der Ausnahme, daß die Menge von IBTZ-VII auf 0,0362 g verdoppelt war. In visuellen Nachweis- Assayverfahren für DHBA zeigten Teststreifen, die mit der Zusammensetzung von Beispiel 3A beaufschlagt waren, nach einer Inkubationszeit von 3 Minuten eine blaß orange Farbe für eine DHBA-Lösung von 0 mM, eine rot-orange Farbe über den Bereich von 2,5 bis 10 mM DHBA und eine purpurne Farbe über den Bereich von 25 bis 50 mM DHBA. Die Zusammensetzungen der beiden Beispiele 3 und 3A zeigten eine Farbänderung von rot nach blau im Bereich von 10 nach 25 mM DHBA. Insbesondere lieferte ein mit der Zusammensetzung von Beispiel 3 beaufschlagter Teststreifen die folgenden visuell wahrnehmbaren Assay-Ergebnisse. Tabelle III Visuelle Assay-Ergebnisse für DHBA-Assayverfahren mit Teststreifen, enthaltend die Zusammensetzung von Beispiel 3 Konzentration von DHBA (mM) beobachtete Farbe hell kürbisfarben tief orange rot orange braun rotbraun
Demnach können Zusammensetzung und Verfahren der vorliegenden Erfindung in einem durch Inaugenscheinnahme zu bewertenden Assayverfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins und der halbquantitativen Konzentration von DHBA in einer Testprobe verwendet werden.
Assay-Ergebnisse von DHBA unter Verwendung der Zusammensetzung von Beipsiel 5, welche den Indikator-Farbstoff IBTZ-IX, d.h. N-3- Dimethylaminopropyl)-5-(2-hydroxy-4-nitro-5-methylphenylazo)isobenzthiazol-3-on enthielten, sind in Fig. 13 und 14 dargestellt. Insbesondere zeigte eine Indikator-Reagenszusammensetzung, die den Indikator-Farbstoff IBTZ-IX enthielt, einen Farbübergangsendpunkt innerhalb von 8 Minuten (Fig. 13) sowie eine ausgezeichnete Dosis-Reaktion bezüglich der DHBA-Konzentration, insbesondere bei Konzentrationen im Bereich von ca 1 mM DHBA und darüber (Fig. 14).
Die Zusammensetzung von Beispiel 8, die den Thiol-reaktiven Farbstoff IBTZ-XVI, d.h. N-(3-Dimethylaminopropyl)-5-(4-methoxy-1-hydroxy-2- naphthylazo)isobenzthiazol-3-on, enthielt, wurde in einem Teststreifen verwendet, um Assayverfahren mit standardisierten Lösungen durchzuführen, die bis 50 mM DHBA enthielten. Die standardisierten DHBA-Lösungen wurden auf die Test-Unterlage des Teststreifens aufgebracht, dann wurde, 1 Minute nach dem Kontakt, die überschüssige standardisierte Lösung von der Test- Unterlage abgelöscht. Nach 3 Minuten Inkubationszeit wurde die Testunterlage, visuell, bezüglich des Reaktionsergebnisses untersucht. Die Test-Unterlagen ergaben einen Farbübergang, und es wurden die folgenden Farbstufen wahrgenommen: 0 mM DHBA - dunkles Pink; 0,5 bis 1,0 mM DHBA - Lavendel; 2,5 bis 25 mM DHBA - dunkles Königsblau und 50 mM DHBA - tiefes Blau. Demnach ergeben unterschiedliche IBTZ-Indikator-Farbstoffe und unterschiedliche Derivate von Ellman's Reagens unterschiedliche Farbübergänge über verschiedene Konzentrationsbereiche hinweg, so daß eine Kombination von Thiol-reaktiven Farbstoffen IBTZ oder eine Kombination eines Thiolreaktiven Farbstoffs IBTZ mit Ellman's Reagens, einem Derivat von Ellman's Reagens oder mit weiteren Thiol-reaktiven Farbstoffen in eine Indikator- Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung eingebracht werden können, um drastischere und leichter auf lösbare bzw. wahrnehmbare und unterscheidbare Farbübergänge zu bewirken. Ein derartiger verbesserter Farbübergang liefert einen empfindlicheren und genaueren Trockenphasen- Teststreifen-Assay ganz besonders für DHBA und insbesondere für Ketokörper.
Aus den durch Inaugenscheinnahme bewerteten Assayverfahren und den in Fig. 1 bis 14 dargestellten Daten ist herausgefunden worden, daß ein besonders geeigneter IBTZ-Indikator-Farbstoff IBTZ-VII ist. Eine Indikator- Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die IBTZ-VII enthält, zeigt einen genügend drastischen Farbübergang, von hellgelb nach purpurfarben, um ein empfindliches und genaues Assayverfahren für in einer Testprobe vorhandene DHBA bereitzustellen. Der Farbübergang ist auch genügend auflösbar und unterscheidbar, entweder visuell oder mit einem Gerät, sodaß eine unbekannte Konzentration von in einer Testprobe vorliegender DHBA bestimmt werden kann. Ferner ist herausgefunden worden, daß der Indikator-Farbstoff IBTZ-VII die Wechselwirkung zwischen dem Indikator-Farbstoff und 6,8- Dimercaptooctamid beschleunigt, so daß der Farbübergangsendpunkt in ca. 1 bis 2 Minuten erreicht ist, gegenüber den 5 bis 10 Minuten, die für andere IBTZ-Indikator-Farbstoffe, für Ellman's Reagens und Derivate von Ellman's Reagens benötigt werden. Es ist die Theorie aufgestellt worden, daß die Struktur von IBTZ-VII, dargestellt als Strukturformel (VIII) es dem ortho- Hydroxyrest ermöglicht, die Öffnung des Stickstoff-Schwefel-Rings durch Komplexbildung mit einem Azo-Stickstoffatom zu stabilisieren:
Nach alldem hat die Befähigung von LADH, sequentiell mit DHBA- Dehydrogenase zu reagieren, um 6,8-Dimercaptooctamid zu erzeugen und dadurch einen Farbübergang in einem Thiol-reaktiven Indikator-Farbstoff zu verursachen, ein empfindliches Verfahren zur Durchführung eines genauen Assay für DHBA und somit für Ketokörper in einer Testprobe wie einer biologischen Flüssigkeit ergeben. Das Verfahren beinhaltet, daß man eine Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung in einen Trockenphasen-Teststreifen einbringt und den Trockenphasen-Teststreifen für ein Assayverfahren für Gesamtblut, Blutserum, Blutplasma, Urin oder für weitere Testproben in entweder einem Ablösch- oder Abwisch- oder einem Eintauch- und Ablese-Format verwendet. Die Empfindlichkeit des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ermöglicht es, das Vorliegen oder die Konzentration von DHBA in der Testprobe entweder visuell oder mit einem Gerät zu ermitteln.
Ferner werden, gemäß einem wichtigen Merkmal der vorliegenden Erfindung, die fortbestehenden und wesentlichen Probleme in Trockenphasen- Teststreifen für DHBA, welche die Instabilität des Tetrazolium-Indikator- Farbstoffs, der gemäß dem Stand der Technik verwendet wird, sowie die störende Wechselwirkung der Indikator-Reagenszusammensetzung, mit üblichen Komponenten der Testprobe einschließen, im wesentlichen eliminiert. Eine Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die einen stabilen Thiol-reaktiven Farbstoff, wie Ellman's Reagens, ein Derivat von Ellman's Reagens oder einen Isobenzthiazolon-Farbstoff der allgemeinen Strukturformel (VI) enthält, eliminiert im wesentlichen das Problem eines falschen positiven Assay infolge einer Wechselwirkung des Indikator-Farbstoffs mit einem störenden Bestandteil der Testprobe. Eine solche Erkenntnis ist eine unerwartete und überraschende Verbesserung auf dem technischen Gebiet der Trockenphasen-Teststreifen-Assayverfahren für DHBA in einer biologischen Testprobe. Ausserdem hat die Indikator-Reagenszusammensetzung die Befähigung bewiesen, ein Assayverfahren für DHBA in einer Testprobe zur Verfügung zu stellen, indem man eine Chemie auf Basis von Enzymen anwendet und ausnützt, die spezifisch für DHBA ist, und diese Chemie auf Basis eines Enzyms mit einer Chemie zum Nachweis von Lipoamid kuppelt, um einen empfindlichen und genauen Assay für DHBA zu ergeben. Somit werden, gemäß einem wichtigen Merkmal der vorliegenden Erfindung, genauere und verläßlichere Assayverfahren für DHBA in Gesamtblut, Blutserum, Butplasma, Urin oder in weiteren Testproben durchgeführt, indem man die Indikator-Reagens zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zur Anwendung bringt.
Insbesondere kann eine Test-Unterlage, in die eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eingebracht ist, in einem Teststreifen zur Mehrfachbestimmung enthalten sein, um ein Assayverfahren für DHBA durchzuführen. Testet eine Person Gesamtblut bezüglich Glucose, um den Verlauf von Diabetes zu verfolgen und zu bestimmen, könnte die betreffende Person somit auch einen Test für DHBA, gleichzeitig mit dem Assay für Glucose, durchführen, um das Einsetzen von Ketosis zu überwachen und zu verfolgen. Demzufolge braucht die betreffende Person keine zwei separaten Test-Kits zur Durchführung von zwei separaten Assayverfahren, und es kann eine einzelne, kleine Blutprobe für beide Assayverfahren herangezogen werden. Führt eine betreffende Person ein Assayverfahren mit Urin durch, kann eine Test-Unterlage, in die eine Zusammensetzung der vorliegenden Zusammensetzung eingebracht ist, auf einem Teststreifen zur Mehrfachbestimmung enthalten sein, um Assayverfahren für Glucose und für DHBA gleichzeitig durchzuführen, um Ketonune nachzuweisen. Insbesondere sollten derartige Assayverfahren die Möglichkeit schaffen, eine klinisch signifikante Menge von DHBA von 0 bis ca. 10 mMol/l DHBA in einem Gesamtblut-Assay und von 0 bis ca. 60 mMol/l DHBA in einem Urin-Assay genau nachzuweisen.
Die Trockenphasen-Teststreifen-Assayverfahren der vorliegenden Erfindung für DHBA sind am geeignetsten für Assayverfahren, die zuhause, in Pnvatlabors von Ärzten und in Nothilferäumen durchgeführt werden. Beispielsweise könnte das Trockenphasen-Teststreifen-Assayverfahren in Gesamtblut für DHBA Teststreifen-Assayverfahren für urinäres Keton oder Tabletten- Assayverfahren bei der Nothilfe-Diagnose von Ketoazidose ersetzen. Ausserdem würde, neben der größeren Einfachheit bei Verwendung von Blut anstatt von Urin im Nothilferaum, der Test von Gesamtblut für DHBA auch alkohohsche Ketoacidose diagnostizieren. Ein derartiges Ergebnis ist extrem wichtig, weil in Fällen von alkoholischer Ketoacidose die Umwandlung von Acetoacetat in β-Hydroxybutyrat im wesentlichen vollständig verläuft. Daher sind Tests von Harn bezüglich Acetoacetat gewöhnlich negativ. Im Ergebnis wird die Diagnose alkoholischer Ketoacidose oft verfehlt.
Somit ist die Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die einen Thiol-reaktiven Indikator-Farbstoff, LADH, DHBA- Dehydrogenase, D,L-Lipoamid und NAD enthält, genügend stabil und selektiv bei der Reaktivität, um einen genauen und empfindlichen DHBA-Assay zur Verfügung zu stellen. Die Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung ergibt auch einen besser erfaßbaren Farbübergang in Abhängigkeit zur Konzentration von DHBA in einer Testprobe. Alles in allem zeigt daher eine Indikator-Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine Befähigung von DHBA-Dehydrogenase und LADH zur sequentiellen Wechselwirkung mit deren jeweiligen Substraten, sie zeigt verbesserte Stabilität und Selektivität und eliminiert somit die Entwicklung einer störenden Hintergrundfarbe in der Test-Unterlage infolge einer Wechselwirkung zwischen dem Indikator- Farbstoff und einer störenden Komponente in der Testprobe und erhöht die Verwendungsdauer der Testprobe wegen der Stabilität des Indikator- Farbstoffs.

Claims

1. Zusammensetzung mit der Befähigung, einen ausreichenden Farbübergang bei Kontakt mit einer Testprobe zu ergeben, um das Vorhandensein oder die Konzentration von D-β-Hydroxybutyrat in der Testprobe aufzuzeigen, wobei die genannte Zusammensetzung enthält:

a) D-β-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase,

b) Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid,

c) ein Disulfid-Reduktasesystem, das ein Disulfid-Substrat und eine Disulfid-Reduktase umfaßt, sowie

d) einen Thiol-reaktiven Indikator-Farbstoff.

2. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die D-β-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase in einer Menge von ca. 50 bis ca. 5000 Einheiten vorhanden ist.

3. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin das Nictotinamid-Adenin-Dinucleotid in einer Konzentration von ca. 10 bis ca. 500 mM vorhanden ist.

4. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, die enthält:

a) ca. 50 bis ca. 5000 Einheiten D-β-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase pro Liter der Zusammensetzung,

b) ca. 10 bis ca. 500 mM Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid,

c) ein Disulfid-Reduktasesystem, das ca. 10 bis ca. 200 mM D,L- Lipoamid und ca. 100 bis ca. 2000 Einheiten Lipoamid-Dehydrogenase pro Liter der Zusammensetzung sowie

d) ca. 10 bis ca. 200 mM Thiol-reaktiven Farbstoff.

5. Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Konzentration von D-β-Hydroxybutyrat in einer Testprobe, wobei man:

a) die Testprobe mit einer Zusammensetzung zusammenbringt, die D-β-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase, Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid, ein Disulfid-Reduktasesystem, umfassend ein Disulfid-Substrat und eine Disulfid- Reduktase, sowie einen Thiol-reaktiven Indikator-Farbstoff enthält, und man

b) das Vorhandensein oder die Konzentration von D-β-Hydroxybutyrat in der Testprobe gemäß Intensität und Ausmaß einer Farbänderung der Zusammensetzung ermittelt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5,

wobei man:

a) die Testprobe mit einer Indikator-Reagenszusammensetzung in Kontakt bringt, die enthält:

ca. 50 bis ca. 5000 Einheiten D-β-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase,

ca. 10 bis ca. 500 mM Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid,

ein Disulfid-Reduktasesystem, das ca. 10 bis ca. 200 mM D,L-Lipoamid und ca. 100 bis ca. 2000 Einheiten Lipoamid-Dehydrogenase umfaßt, sowie

ca. 10 bis ca. 200 mM Thiol-reaktiven Farbstoff, und man

7. Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Gesamt- Ketokörpern in einer biologischen Flüssigkeit, wobei man:

a) die biologische Flüssigkeit mit einer Zusammensetzung in Kontakt bringt, die D-p-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase, Nicotinamid-Adenin- Dinucleotid, ein Disulfid-Reduktasesystem, das ein Disulfid-Substrat und eine Disulfid-Reduktase umfaßt, sowie einen Thiol-reaktiven Indikator- Farbstoff enthält, man

b) die Konzentration von D-β-Hydroxybutyrat in der biologischen Flüssigkeit aus einem in Abhängigkeit von in der biologischen Flüssigkeit vorhandenem D-β-Hydroxybutyrat erfolgenden Farbübergang der Zusammensetzung ermittelt, und wobei man

c) die Konzentration von Aceton und Acetoessigsäure bestimmt, und

d) die Konzentration von Gesamt-Ketokörpern in der biologischen Flüssigkeit berechnet.

8. Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Konzentration von D-β-Hydroxybutyrat in einer flüssigen Probe, wobei man:

a) die flüssige Probe mit einer Vorrichtung zum Nachweis eines Analyt in Kontakt bringt, welche eine Reagens-Testunterlage aufweist, die eine Zusammensetzung darin eingebracht enthält, die D-β-Hydroxybutyrat Dehydrogenase, Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid, ein Disulfid-Reduktasesystem aus einem Disulfid-Substrat und einer Disulfid-Reduktase sowie einen Thiolreaktiven Indikator-Farbstoff enthält, und man

b) die Vorrichtung zum Nachweis eines Analyt bezüglich eines in Abhängigeit zum in der flüssigen Probe vorhandenem D-β-Hydroxybutyrat- Gehalt erfolgenden Farbübergangs untersucht.

9. Vorrichtung zum Nachweis eines Analyt zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Konzentration von D-β-Hydroxybutyrat in einer flüssigen Testprobe, wobei die Vorrichtung aufweist:

einen Unterlagen-Streifen,

eine Reagens-Testunterlage, die zur Handhabung am Unterlagen-Streifen befestigt ist, sowie

eine Zusammensetzung, die in die Reagens-Testunterlage eingebracht ist, wobei die genannte Zusammensetzung enthält:

a) D-β-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase,

b) Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid,

c) ein Disulfid-Reduktasesystem aus einem Disulfid-Substrat und einer Disulfid-Reduktase sowie

d) einen Thiol-reaktiven Indikator-Farbstoff.

10. Verfahren zur überwachenden Verfolgung oder zum Nachweis von Diabetes mellitus, wobei man die Konzentration von D-β-Hydroxybutyrat in einer biologischen Flüssigkeit bestimmt, wobei das genannte Verfahren Stufen aufweist, in denen man:

1) die biologische Flüssigkeit mit einer Vorrichtung zum Nachweis eines Analyts in Kontakt bringt, die eine Test-Unterlage aufweist, die eine Reagenszusammensetzung enthält, die dazu befähigt ist, einen Farbübergang in Abhängigkeit zur in der biologischen Flüssigkeit vorhandenen Konzentration von D-β-Hydroxybutyrat zu ergeben, wobei die genannte Reagenszusammensetzung enthält:

a)D-β-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase,

b) Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid,

d) einen Thiol-reaktiven Indikator-Farbstoff, man

2) die Vorrichtung zum Nachweis des Analyt bezüglich des in Abhängigkeit von der in der Testprobe vorhandenen D-β-Hydroxybutyrat- Konzentration erfolgenden Farbübergangs untersucht und 3) die Konzentration von D-β-Hydroxybutyrat in der biologischen Flüssigkeit gemäß Intensität und Ausmaß des Farbübergangs bestimmt.