DE60115261T2 - Teststreifen mit positiv-geladenen membranen für tetrazolium basierte assays - Google Patents

Teststreifen mit positiv-geladenen membranen für tetrazolium basierte assays Download PDF

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
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    • Y10S435/975—Kit

Description

  • EINFÜHRUNG
  • Gebiet der Erfindung
  • Das Gebiet der Erfindung ist die Messung von Analyten.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Eine Messung von Analyten in Flüssigkeiten, z.B. Blut oder Produkten, die aus Blut stammen, ist weiterhin von zunehmender Wichtigkeit für die moderne Gesellschaft. Analytennachweis-Assays finden ihre Verwendung in einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich dem Durchführen von Tests in klinischen Laboratorien, dem Durchführen von Tests zu Hause etc., wo die Ergebnisse eines solchen Tests eine herausragende Rolle bei der Diagnose und der Handhabung in einer Vielzahl von Krankheitszuständen spielen. Analyten von Interesse schließen Alkohol, Formaldehyd, Glucose, Glutaminsäure, Glycerol, Beta-Hydroxybutyrat, L-Lactat, Leucin, Äpfelsäure, Brenztraubensäure, Steroide, etc., ein. In Antwort auf diese wachsende Wichtigkeit der Analytenmessung sind eine Vielzahl von Analytmeßprotokollen und -vorrichtungen für die Verwendung sowohl in der Klinik als auch zu Hause entwickelt worden. Viele Protokolle und Vorrichtungen, die bis heute entwickelt worden sind, verwenden ein Signal-erzeugendes System, um die Anwesenheit des Analyten von Interesse in einer physiologischen Probe, wie etwa Blut zu identifizieren.
  • Während eine Vielzahl von solchen Signal-erzeugenden Systemen bis heute zur Verwendung bei der Messung einer Vielzahl von verschiedenen Analyten entwickelt worden sind, besteht weiterhin ein Bedarf für die weitere Entwicklung solcher Systeme.
  • Relevante Literatur
  • Patentdokumente von Interesse schließen ein: EP 0 908 453 A1 , WO 94/01578 und WO 94/01544. Sock J et al: Analytical Biochemistry, Band. 171, Nr. 2, 1988, Seiten 310–319, betrifft ein Blotting-Verfahren zum Nachweis von Enzymen, die normalerweise kein farbiges Produkt ergeben.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Zusammensetzungen und Verfahren zu deren Verwendung bei dem Nachweis eines Analyten in einer Probe werden bereitgestellt. Die vorliegenden Zusammensetzungen sind charakterisiert dadurch, daß sie wenigstens ein wasserlösliches Tetrazoliumsalz auf einer Oberfläche eines positiv geladenen Substrats enthalten. Das wasserlösliche Tetrazoliumsalz liegt als Teil eines Analyt-oxidierenden, Signal-erzeugenden Systems vor, wobei das System eine Analyt-Oxidase enthält. Das System kann ebenso ein oder mehrere der folgenden zusätzlichen Bestandteile enthalten: ein Elektronentransfermittel; und einen Enzym-Cofaktor. Ebenso werden Teststreifen, Systeme und Kits bereitgestellt, die die vorliegenden Zusammensetzungen beinhalten. Die vorliegenden Zusammensetzungen, Teststreifen, Systeme und Kits finden Verwendung bei der Messung einer großen Vielzahl von Analyten in einer Probe, wie etwa einer physiologischen Probe, z.B. Blut, oder einem Bruchteil davon, oder ISF (Interstitial Flüssigkeit).
  • Insbesondere sind die wasserlöslichen Tetrazoliumsalze, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, solche, die in der Lage sind, Hydride aufzunehmen, um wasserlösliche farbige Formazanprodukte zu erzeugen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 stellt die Ergebnisse eines 400 mg/dl-Glucosetests dar, der auf positiv-geladenen und ungeladenen Membranen unter Verwendung eines wasserlöslichen Tetrazolium als Indikator gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt worden ist.
  • BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Bevor die vorliegende Erfindung weiter beschrieben wird, sollte verstanden werden, daß die Erfindung nicht auf die jeweiligen Ausführungsformen der unten beschriebenen Erfindung beschränkt ist, da Variationen der jeweiligen Ausführungsformen gemacht werden können und immer noch in den Umfang der angehängten Ansprüche fallen. Es sollte ebenso verstanden werden, daß die verwendete Terminologie zum Zwecke der Beschreibung von bestimmten Ausführungsformen verwendet wird und nicht als beschränkend beabsichtigt ist. Stattdessen wird der Umfang der vorliegenden Erfindung durch die angehängten Ansprüche festgelegt.
  • ZUSAMMENSETZUNGEN
  • Wie oben zusammengefasst, stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen zur Verwendung beim Nachweis einer großen Vielzahl von Analyten in einer Probe bereit. Die Zusammensetzungen schließen ein positiv geladenes Substrat und wasserlösliches Tetrazoliumsalz ein, das auf der Oberfläche des Substrats vorhanden ist, als ein Teil eines Analyt-oxidierenden, Signal-erzeugenden Systems. Die vorliegenden Zusammensetzungen liegen typischerweise als trockene Zusammensetzungen vor, wie sie in Reagenzteststreifen gefunden werden. Insbesondere bietet die Erfindung Streifen zum Testen eines individuellen Analyten, z.B. Glukose, Alkohol, mit Zuckerresten versehene Proteine („glycated proteins"), etc., in Vollblut oder einer daraus stammenden Fraktion. Im weitesten Sinne schließen die Reagenzteststreifen ein positiv geladenes Substrat und ein Analyt-oxidierendes, Signal-erzeugendes System ein, das auf einer Oberfläche des Substrates vorhanden ist, wobei das System ein wasserlösliches Tetrazoliumsalz und eine Analyt-Oxidase enthält.
  • Die obigen Elemente der vorliegenden Zusammensetzungen werden jetzt in größerem Detail beschrieben werden.
  • Positiv-geladenes Substrat
  • Ein Merkmal der vorliegenden Zusammensetzungen ist die Anwesenheit eines positiv geladenen Substrats. Mit positiv geladenem Substrat wird ein Substrat gemeint, das eine oder mehrere, gewöhnlich eine große Vielzahl von positiven Ladungen aufweist, wie sie z.B. auf positiv-geladenen Gruppen oder Teilen gefunden wird, auf wenigstens einer seiner Oberflächen. Das Substrat kann aus einem einzelnen Material hergestellt werden oder kann ein Verbund aus zwei oder mehreren unterschiedlichen Materialien sein, wobei diese unterschiedlichen Materialien gemischt, geschichtet oder anderweitig angeordnet sein können, um die erwünschte positiv geladene Oberfläche zu ergeben.
  • Zusätzlich kann das positiv geladene Substrat saugfähig oder nicht-saugfähig sein.
  • Mit saugfähig wird ein Material gemeint, das eine bevorzugte Retention von einem oder mehreren Bestandteilen aufweist, wie sie z.B. in Materialien auftreten würde, die in der Lage sind, einen oder mehrere Bestandteile zu absorbieren oder „aufzusaugen", wie es bei chroma tographischen Trennungen stattfindet. Beispiele für saugfähige Materialien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf: unbehandelte Formen von Papier, Nitrocellulose und ähnliches, die zu einer chromatographischen Trennung von Bestandteilen führen, die in Flüssigkeiten enthalten sind, die dadurch geleitet werden.
  • Alternativ kann das positiv geladene Substrat nicht-saugfähig sein. Nicht-saugfähige, positiv geladene Substrate schließen inerte poröse Matrizen ein, die einen Träger für die verschiedenen Teile des Signal-erzeugenden Systems bieten, unten beschrieben, und haben eine positive Ladung. Diese Matrizen sind im allgemeinen so konfiguriert, daß sie eine Stelle zur Aufbringung einer physiologischen Probe, z.B. Blut, und zum Nachweis des chromogenen Produkts bieten, das durch den Farbstoff des Signal-erzeugenden Systems erzeugt wird. Als solches ist die Matrix typischerweise eine, die den Fluß einer wäßrigen Flüssigkeit hindurch läßt und genügend Hohlraum dafür bietet, daß chemische Reaktionen des Signal-erzeugenden Systems stattfinden. Eine Anzahl von verschiedenen positiv geladenen porösen Matrizen sind zur Verwendung bei verschiedenen Analytenmessungs-Assays entwickelt worden, wobei sich die Matrizen hinsichtlich der Materialien, Porengrößen und Dimensionen und ähnliches unterscheiden, wobei repräsentative Matrizen diejenigen einschließen, die in US Patenten Nr.: 5,932,431; 5,874,099; 5,871,767; 5,869,077; 5,866,322; 5,834,001; 5,800,829; 5,800,828; 5,798,113; 5,670,381; 5,663,054; 5,459,080; 5,459,078; 5,441,894 und 5,212,061 beschrieben sind. Die Dimensionen und Porosität des Substrates kann stark variieren, wobei die Matrix ein Porösitätsgradienten haben kann oder nicht, z.B. mit größeren Poren nahe bei oder auf der Probenauftragungsregion und kleinere Poren an der Nachweisregion. Positiv geladene Membranen können unter Verwendung von positiv geladenen Polymeren, wie etwa Polyamid, hergestellt werden. Alternativ können solche Membranen mit verschiedenen Techniken hergestellt werden, wie etwa Oberflächenbeschichtung unter Verwendung von kationischen oberflächenaktiven Mitteln oder Polymeren. Die Beschichtung kann mittls Dip-coating, chemischer Behandlung, Photografting, Plasma-Polymerisation etc. aufgebracht werden. In noch weiteren Ausführungsformen kann die Membran durch Mischung von einem oder mehreren positiv geladenen Materialien mit dem Membran-bildenden Polymer hergestellt werden. Beispiele für positiv geladene Polymere sind Polyamid, Poly(vinyl-pyridin), Poly(vinyl-imidazol), Poly(allylamin), Poly(vinylbenzyldimethyl-ammoniumchlorid), Polylysin und Chitosan. Beispiele für kationische oberflächenaktive Mittel schließen diejenigen ein, die primäre, sekundäre und quaternäre Aminogruppen enthalten. Das Material kann funktionalisiert sein oder nicht, um eine kovalente oder nicht-kovalente Anhängung der verschiedenen Teile des Signal-erzeugenden Systems zu ermöglichen, das in größerem Detail unten beschrieben ist.
  • In vielen Ausführungsformen ist die Matrix als ein Membran-Testkissen konfiguriert und ist an einen festen Träger angehängt, wobei der Träger ein Plastik (z.B. Polystyrol, Nylon oder Polyester) oder ein metallisches Blatt oder jegliches andere geeignete Material sein kann, das auf dem Gebiet bekannt ist. Von Interesse in vielen Ausführungsformen sind die Teststreifenkonfigurationen, die in US-Patenten Nr. 5,972,294; 5,968,836; 5,968,760; 5,902,731; 5,846,486; 5,843,692; 5,843,691; 5,789,255; 5,780,304; 5,753,452; 5,753,429; 5,736,103; 5,719,034, 5,714,123; 383,550; 381,591; 5,620,863; 5,605,837; 5,563,042; 5,526,120; 5,515,170; 367,109; 5,453,360; 5,426,032; 5,418,142; 5,306,623; 5,304,468; 5,179,005; 5,059,394; 5,049,487; 4,935,346; 4,900,666 und 4,734,360 offenbart sind.
  • Signal-erzeugende Systeme
  • Wie oben zusammengefaßt, ist ein Merkmal der vorliegenden Zusammensetzungen, daß sie wenigstens ein wasserlösliches Tetrazoliumsalz und ein oder mehrere Teile eines Analyt-oxidierenden, Signal-erzeugenden Systems enthalten. Insbesondere ist ein Merkmal der vorliegenden Zusammensetzungen die Anwesenheit eines wasserlöslichen Tetrazoliumsalzes, das in der Lage ist, ein Hydrid aufzunehmen, um ein wasserlösliches, farbiges Formazanprodukt zu erzeugen. Wasserlösliche Tetrazoliumsalze von Interesse schließen diejenigen ein, die in EP 0 908 453 beschrieben sind. Eine Klasse von wasserlöslichen Tetrazoliumsalzen von Interesse schließen diejenigen ein, die durch Formel 2 auf Seite 2, Zeilen 35 bis 48 von EP 0 908 453 beschrieben sind. Eine andere Klasse von wasserlöslichen Tetrazoliumsalzen von Interesse schließen diejenigen ein, die durch Formel 1 auf Seite 3, Zeilen 10–25 von EP 0 908 453 beschrieben sind.
  • Spezifische wasserlösliche Tetrazoliumverbindungen oder Salze, die von besonderem Interesse sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf: 2,2'-Dibenzothiazolyl-5,5'-bis[4-di(2-Sulfoethyl)carbamoylphenyl]-3,3'-(3,3'-Dimethoxy-4.4'-biphenylen)-ditetrazolium, dinatriumsalz (WST-5); 2-Benzothiazolyl-3-(4-Carboxy-2-methoxyphenyl)-5-[4-(2-Sulfoethylcarbamoyl)phenyl]-2H-Tetrazolium (WST-4) und ähnliche. WST-5 wird in vielen Ausführungsformen bevorzugt, da es sich in leichter Weise in einem wässrigen Medium auflöst, das mit biologischen Proben am kompatibelsten ist. Darüberhinaus weist die resultieren de Formazanverbindung eine starke spektrale Absorption in der violett-blauen Region auf, was das Bedürfnis zum Korrigieren des Hintergrundsignals für Hämoglobin verringert.
  • Wie oben erwähnt, liegt das wasserlösliche Tetrazoliumsalz als ein Teil eines Analyt-oxidierenden, Signal-erzeugenden Systems vor. Mit Signal-erzeugendem System wird eine Sammlung von zwei oder mehreren Verbindungen oder Molekülen gemeint, die in der Lage sind, zusammenzuwirken, wenn sie kombiniert werden, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen, das auf die Anwesenheit von einem bestimmten Analyten in einer gegebenen Probe und oft auch die Menge davon hinweist. Der Begriff Signal-erzeugendes System wird in breiter Weise verwendet, um sowohl eine Mischung von allen Reagenzbestandteilen des Signal-erzeugenden Systems, als auch ein System zu umfassen, bei dem eines oder mehrere der Reagenzbestandteile von dem Rest der Reagenzbestandteile getrennt sind, z.B. wie in einem Kit vorhanden.
  • Wie oben erwähnt ist das Signal-erzeugende System der vorliegenden Zusammensetzungen und Teststreifen ein Analyt-oxidierendes, Signal-erzeugendes System. Das Analyten-oxidierende Mittel ist ein Analyt-Oxidase-Enzym, das in der Lage ist, ein Hydrid von dem Analyten von Interesse zu entfernen, um eine oxidierte Form des Analyt zu erzeugen. Analyt-Oxidasen von Interesse schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf: Glucose-Oxidase (wenn der Analyt Glucose ist); Cholesterin-Oxidase (wenn der Analyt Cholesterin ist); Alkohol-Oxidase (wenn der Analyt Alkohol ist); Bilirubinoxidase (wenn der Analyt Bilirubin ist); Cholinoxidase (wenn der Analyt Cholin ist); Glutamatoxidase (wenn der Analyt L-Glutaminsäure ist); Glycerol-Oxidase (wenn der Analyt Glycerol ist); Galactose-Oxidase (wenn der Analyt Galactose ist); L-Ascorbat-Oxidase (wenn der Analyt Ascorbinsäure ist); Lactat-Oxidase (wenn der Analyt Milchsäure ist); Leucin-Oxidase (wenn der Analyt Leucin ist); Malatoxidase (wenn der Analyt Äpfelsäure ist); Pyruvat-Oxidase (wenn der Analyt Brenztraubensäure ist); Urat-Oxidase (wenn der Analyt Harnsäure ist); und ähnliche.
  • In vielen Ausführungsformen schließen die vorliegenden Signal-erzeugenden Systeme ebenso einen Enzym-Cofaktor ein, der in der Lage ist, mit der Analyt-Oxidase auf eine solche Weise wechselzuwirken, daß der Analyt von Interesse durch das Oxidationsmittel oxidiert wird, wobei das Mittel gleichzeitig den Enzym-Cofaktor reduziert. Enzym-Cofaktoren von Interesse schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf: beta-Nikotinamidadenindinukleotid (beta-NAD); beta-Nikotinamidadenindinukleotidphosphat (beta-NADP); Thionikotinamidadenindi nukleotid; Thionikotinamidadenindinukleotidposphat; Nikotinamid-1,N6-ethenoadenindinukleotid; Nikotinamid-1,N6-ethenoadenindinukleotidphosphat; und Pyrrolochinolinchinon (PQQ). Enzym-Cofaktoren von besonderem Interesse, die in den vorliegenden Signal-erzeugenden Systemen eingeschlossen sein können, schließen ein: NADH oder NAD(P)H.
  • Zusätzlich zu der Analyt-Oxidase schließen die vorliegenden Signal-erzeugenden Systeme typischerweise ein Elektronentransfermittel ein. Mit Elektronentransfermittel ist eine Verbindung oder Molekül gemeint, die ein Elektron in der Form eines Hydridions von einem reduzierten Enzym-Cofaktor zu dem wasserlöslichen Tetrazoliumprodukt übertragen kann. Elektronentransfermittel von Interesse schließen sowohl Elektronentransfermittel mit niedrigem als auch hohem Molekulargewicht ein.
  • In dieser Beschreibung bedeutet niedriges Molekulargewicht ein Molekulargewicht, das ungefähr 2000 Daltons nicht überschreitet, gewöhnlich ungefähr 1000 Daltons und in vielen Ausführungsformen ungefähr 500 Daltons. Hohes Molekulargewicht bedeutet ein Molekulargewicht von wenigstens ungefähr 5000 Daltons und in vielen Ausführungsformen 10000 oder 20000 Daltons oder höher. Das Molekulargewicht des Elektronentransfermittels mit hohem Molekulargewicht wird oft ungefähr 100000 Daltons nicht überschreiten. In vielen Ausführungsformen ist das Elektronentransfermittel mit niedrigem Molekulargewicht eine nicht-proteinartige Verbindung, während das Elektronentransfermittel mit hohem Molekulargewicht eine proteinartige („proteinaceous") Verbindung ist. Mit proteinartig wird ein Polypeptid oder polymeres Mimetikum davon gemeint.
  • Eine Vielzahl von nicht-proteinartigen Elektronentransfermitteln mit niedrigem Molekulargewicht sind von Interesse. Diese Mittel schließen ein: Flavine, wie etwa Riboflavin (RBF), Alloxazin (ALL) und Lumichrom (LC), Phenazine, wie etwa Phenazin, Phenazinmethosulfat (PMS), Phenazinethosulfat, Methoxyphenazinmethosulfat und Safranin; Methyl-1,4-naphthol (Menadion), Phenothiazine, wie etwa PT und sein Radikal-Kation, PT+, Thionin (TH), Azur A (AA), Azur B (AB), Azur C (AC), Methylenblau (MB), Methylengrün (MG) und Toluidinblau-O (TOL); Phenoxazine, wie etwa Phenoxazin (POA), Basic blue 3 (BB3) und Brilliant-Cresyl-Blau-ALD (BCBA), Benzo-α-phenazoxoniumchlorid (Medola-Blau); Indophenole, wie etwa 2,6-Dichlorphenolindophenol (DCIP); und Indamine, wie etwa Bindschedler's-Grün und Phenylen-Blau; und ähnliches. Von besonderem Interesse in vielen Ausführungs formen sind Phenazinverbindungen, z.B. PMS, Phenazinethosulfat, Methoxyphenazinmethosulfat und Safranin, wobei PMS das nicht-proteinartige Elektronentransfermittel mit niedrigem Molekulargewicht in vielen Ausführungsformen ist.
  • In vielen Ausführungsformen ist das proteinartige Elektronentransfermittel mit hohem Molekulargewicht ein Enzym, das in der Lage ist, einen reduzierten Cofaktor, z.B. NAD(P)H, zu oxidieren, und gleichzeitig das Tetrazololiumsalz des Signal-erzeugenden Systems zu reduzieren. In vielen Ausführungsformen ist dieses Elektronentransferenzym eine Diaphorase, wie etwa Liponsäuredehydrogenase („lipoic dehydrogenase"), Ferredoxin-NADP-Reduktase, Lipoamiddehydrogenase, NADPH-Dehydrogenase etc. Eine Vielzahl von Diaphorasen stehen zur Verfügung und können verwendet werden, wobei repräsentative, kommerziell verfügbare Diaphorasen, die in den vorliegenden Signal-erzeugenden Systemen vorhanden sein können, Bacillus-Diaphorase, Clostridium-Diaphorase, Vibrio-Diaphorase, Schweine-Diaphorase und ähnliche einschließen.
  • Die oben beschriebenen Signal-erzeugenden Systeme sind im allgemeinen in den vorliegenden Zusammensetzungen als Reagenzzusammensetzungen vorhanden. In vielen Ausführungsformen sind die Reagenzzusammensetzungen trockene Zusammensetzungen. Zumindest sind die vorliegenden Reagenzzusammensetzungen solche, die das wasserlösliche Tetrazoliumsalz und eine Analyt-Oxidase enthalten. In vielen Ausführungsformen schließen die Reagenzzusammensetzungen jedoch weiterhin einen Enzym-Cofaktor und ein Elektronentransfermittel ein, wobei diese Bestandteile wie oben beschrieben sind.
  • REAGENZTESTSTREIFEN
  • Von besonderem Interesse in vielen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind Reagenzteststreifen, die die oben beschriebenen Zusammensetzungen einschließen und zur Verwendung bei der Messung der Anwesenheit oder Konzentration eines Analyten in einer Probe vorgesehen sind. Insbesondere stellt die Erfindung trockene Streifen zum Testen eines jeweiligen Analyten in Vollblut bereit, z.B. beta-Hydroxybutyrat, Glucose etc. Im breitesten Sinne schließt der Reagenzteststreifen einen positiv-geladenen festen Träger und eine trockene Reagenzzusammensetzung darauf ein, wobei die trockene Reagenzzusammensetzung aus allen der Reagenzverbindungen gemacht ist, die zum Erzeugen eines nachweisbaren Signals in der Anwesenheit des Analyten von Interesse notwendig sind. In den meisten Ausführungs formen der vorliegenden Erfindung ist die trockene Reagenzzusammensetzung, die auf dem vorliegenden Teststreifen vorhanden ist, eine, die die folgenden Teile enthält: Ein Analyt-Oxidase-Enzym, ein Enzym-Cofaktor, ein Elektronentransfermittel und ein wasserlösliches Tetrazoliumsalz, wobei jeder dieser Bestandteile in größerem Detail oben beschrieben ist.
  • In vielen Ausführungsformen schließen die vorliegenden Teststreifen ein Membrantestkissen ein, das an einem festen Träger befestigt ist. Der Träger kann ein Plastik, z.B. Polystyrol, Nylon oder Polyester, oder ein metallisches Blatt oder irgendein anderes geeignetes Material sein, das auf dem Gebiet bekannt ist. Mit dem Testkissen assoziiert, z.B. auf das Testkissen aufgetragen, in das Testkissen eingebaut etc., ist die Reagenzzusammensetzung. Der Streifen kann ebenso in komplexeren Arrangements konfiguriert sein, z.B. wenn das Testkissen zwischen dem Träger und einer Oberflächenschicht vorhanden ist, wobei ein oder mehrere Reagenzien, die bei der Probenverarbeitung verwendet werden, auf der Oberflächenschicht vorhanden sein kann. Zusätzlich können Flußstrecken oder Kanäle auf dem Teststreifen vorhanden sein, wie auf dem Gebiet bekannt ist. Von Interesse in vielen Ausführungsformen sind die Teststreifenkonfigurationen, die in US-Patent Nr. 5, 902,731 offenbart sind.
  • Die vorliegenden Teststreifen können hergestellt werden, wobei jegliches übliche Protokoll verwendet wird. Ein übliches Protokoll ist es, wenigstens den Testkissenteil des Streifens mit einer wässrigen Zusammensetzung in Kontakt zu bringen, die alle Teile der Reagenzzusammensetzung enthält, die mit dem Testkissen in dem endgültigen Reagenzteststreifen assoziiert werden soll. Bequemerweise kann das Testkissen in die wässrige Zusammensetzung eingetaucht werden, für eine ausreichende Zeitperiode darin gehalten werden und dann getrocknet werden, wobei das Testkissen des Reagenzteststreifens, der die Reagenzzusammensetzung damit assoziiert hat, erzeugt wird. Wie oben festgestellt, wird die wässrige Zusammensetzung die verschiedenen Teile der Reagenzusammensetzung enthalten, die mit dem Testkissen des Reagenzteststreifens assoziiert werden soll, wobei die verschiedenen Teile in Mengen vorliegen, die ausreichen, um für die erwünschten Mengen der Reagenzzusammensetzung zu sorgen, die auf dem Testkissen erzeugt werden soll. Als solches reicht, wenn das Elektronen-Transfermittel nicht-proteinartig ist, die Konzentration an Elektronentransfermittel, die in dieser wäßrigen Zusammensetzung vorhanden ist, typischerweise von ungefähr 10 bis 50.000, gewöhnlich von 50 bis 10.000 und üblicher von ungefähr 100 bis 5000 μM. In einer anderen Ausführungsform, in der das Elektronentransfermittel proteinartig ist, reicht die Konzentration des Elektronentransfermittels, das in der wäßrigen Zusammensetzung vorhanden ist, typi scherweise von ungefähr 10 bis 10.000, gewöhnlich von ungefähr 50 bis 5.000 und gewöhnlicher von ungefähr 100 bis 3.000 U/ml. Die Konzentration an Tetrazoliumsalz, die in der wäßrigen Zusammensetzung vorhanden ist, reicht von ungefähr 3 mM bis 36 mM, gewöhnlich von ungefähr 6 mM bis 24 mM. Sofern vorhanden, reicht der Enzym-Cofaktor in seiner Konzentration von ungefähr 1,5 mM bis 28 mM, gewöhnlich von ungefähr 3,5 mM bis 14 mM. In ähnlicher Weise reicht das Analyt-Oxidase-Enzym in seiner Konzentration von ungefähr 100 U bis 2.000 U, und gewöhnlich von ungefähr 200 U bis 1.000 U. Siehe den experimentellen Abschnitt, unten, für eine detailliertere Beschreibung eines repräsentativen Verfahrens zum Herstellen der vorliegenden Reagenzteststreifen.
  • VERFAHREN ZUR ANALYTENMESSUNG
  • Die oben beschriebenen Signal-erzeugenden Systeme, Reagenzzusammensetzungen und Teststreifen finden Verwendung bei Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit von einem Analyten in einer Probe und oft der Menge, d.h. der Konzentration davon. Eine Vielzahl von verschiedenen Analyten kann unter Verwendung der vorliegenden Verfahren nachgewiesen werden, wobei repräsentative Analyten diejenigen einschließen, die oben beschrieben sind, z.B. Alkohol, Formaldehyd, Glucose, Glutaminsäure, Glycerol, beta-Hydroxybutyrat, L-Lactat, Leucin, Äpfelsäure, Brenztraubensäure, Steroide etc. Während grundsätzlich die vorliegenden Verfahren dazu verwendet werden können, die Anwesenheit und oft die Konzentration eines Analyten in einer Vielzahl von verschiedenen physiologischen Proben zu bestimmen, wie etwa Urin, Tränen, Speichel und ähnliches, sind sie besonders zur Verwendung bei der Bestimmung der Konzentration eines Analyten im Blut oder Blutfraktionen geeignet, z.B. aus Blut stammende Proben, und insbesondere in Vollblut oder ISF (Interstitial-Flüssigkeit).
  • Bei den vorliegenden Verfahren werden die Probe und das Signal-erzeugende System zu einer Reaktionsmischung kombiniert, man läßt die Reaktion für eine ausreichende Zeitperiode ablaufen, um ein Signal zu erzeugen, das auf die Anwesenheit eines Analyten in der Probe (und oft die Menge davon) hinweist, und das resultierende Signal wird nachgewiesen und mit der Anwesenheit von Analyt in der Probe (und oft der Menge davon) in Beziehung gesetzt. Die obigen Schritte finden auf einem Reagenzteststreifen, wie oben beschrieben, statt.
  • Ein Merkmal der vorliegenden Verfahren ist, daß das nachweisbare Signal aus einem nicht-waschbaren Fleck („spot") gemacht ist, der sich auf der Oberfläche des Substrats des Streifens bildet. Der nicht-waschbare Fleck ist aus einem wasserlöslichen Formazanprodukt hergestellt, das eng an die Substratoberfläche gebunden ist, so daß er nicht leicht von der Oberfläche unter Standard-Waschbedingungen entfernt werden kann. Mit Standard-Waschbedingungen sind die Bedingungen gemeint, die auf eine Substratoberfläche bei Analyt-Nachweis-Assays ausgeübt werden, bei denen ein ungebundener Bestandteil von der Oberfläche entfernt werden muß. Ein Beispiel für Standard-Waschbedingungen sind die diejenigen, die von Fachleuten in Array-basierenden Nukleinsäure-Hybridisierungs-Assays verwendet werden, wobei nicht-hybridisierte Nukleinsäuren von der Oberfläche eines Arrays nach einem Hybridisierungsschritt entfernt werden. Solche Bedingungen sind Fachleuten gut bekannt. Als solches ist ein Merkmal der vorliegenden Verfahren die Erzeugung eines nicht-waschbaren Flecks auf der Oberfläche des positiv geladenen Substrats, wobei der nicht-waschbare Fleck aus dem wasserlöslichen Formazanprodukt gemacht ist.
  • Beim Ausüben der vorliegenden Verfahren ist der erste Schritt, eine Menge der physiologischen Probe auf den Teststreifen aufzubringen, wobei der Teststreifen oben beschrieben ist. Die Menge an physiologischer Probe, z.B. Blut, die auf den Teststreifen aufgebracht wird, kann variieren, reicht aber im allgemeinen von ungefähr 2 μl bis 40 μl. gewöhnlich von ungefähr 5 μl bis 20 μl. Wegen der Natur des vorliegenden Teststreifens kann die Blutprobengröße, die auf den Teststreifen aufgebracht wird, relativ klein sein, im Bereich von ungefähr 2 μl bis 40 μl, gewöhnlich von ungefähr 5 μl bis 20 μl. Wenn Blut die physiologische Probe ist, können Blutproben mit einer Vielzahl von verschiedenen Hämatokrit-Werten mit den vorliegenden Verfahren getestet werden, wobei der Hämatokrit von ungefähr 20% bis 65%, gewöhnlich von ungefähr 25% bis 60% reichen kann.
  • Nach einem Auftragen der Probe auf den Teststreifen läßt man die Probe mit den Teilen des Signal-erzeugenden Systems reagieren, um ein nachweisbares Produkt zu erzeugen, d.h. den nicht-waschbaren Fleck, der in einer Menge vorliegt, die proportional der anfänglichen Menge des Analyten von Interesse ist, der in der Probe vorhanden ist. Die Menge an nachweisbarem Produkt, d.h. Signal, das durch das Signal-erzeugende System in der Form von nicht-waschbaren Flecken erzeugt wird, wird dann bestimmt und mit der Menge an Analyt in der anfänglichen Probe in Beziehung gesetzt. In bestimmten Ausführungsformen werden automatisierte Instrumente, die die oben erwähnten Nachweis- und Korrelationsschritte durchführen, verwendet. Die oben beschriebenen Reaktions-, Nachweis- und Korrelationsschritte, ebenso wie die Instrumente zum Durchführen derselben, werden weiter in US-Patenten Nr. 4,734,360; 4,900,666; 4,935,346; 5,059,394; 5,304,468; 5,306,623; 5,418,142; 5,426,032; 5,515,170; 5,526,120; 5,563,042; 5,620,863; 5,753,429; 5,573,452; 5,780,304; 5,789,255; 5,843,691; 5,846,486; 5,902,731; 5,968,836 und 5,972,294 beschrieben. In dem Korrelationsschritt berücksichtigt die ermittelte Analytkonzentration die konstante Verteilung von Reaktionen, die mit dem beobachteten Signal in Wettbewerb stehen, z.B. durch entsprechendes Kalibrieren des Instruments.
  • KITS
  • Ebenso werden von der vorliegenden Erfindung Kits zur Verwendung beim Ausüben der vorliegenden Verfahren bereitgestellt. Die Kits der vorliegenden Erfindung schließen wenigstens ein Signal-erzeugendes System, wie oben beschrieben, ein, wobei die Signal-erzeugenden Systembestandteile zu einer einzigen Reagenzzusammensetzung kombiniert oder getrennt werden können, die z.B. in verschiedenen Behältern vorhanden sind. In bestimmten Ausführungsformen wird das Signal-erzeugende System in den Kits in der Form eines Reagenz-Teststreifens, wie oben beschrieben, vorhanden sein. Die vorliegenden Kits können weiterhin ein Mittel zum Erhalt einer physiologischen Probe enthalten. Zum Beispiel können die vorliegenden Kits weiterhin, wenn die physiologische Probe Blut ist, ein Mittel zum Erhalt einer Blutprobe enthalten, wie etwa eine Lanzette zum Stechen in einen Finger, Mittel zum Bewegen der Lanzette („lance actuation means") und ähnliches. Zusätzlich können die vorliegenden Kits eine Kontroll-Lösung oder Standard enthalten, z.B. eine Analyt-Kontrolllösung, die eine standardisierte Konzentration an Analyt enthält. In bestimmten Ausführungsformen schließen die Kits ebenso ein automatisiertes Instrument, wie oben beschrieben, zum Nachweis der Menge an Produkt ein, das auf dem Streifen nach einer Probenauftragung erzeugt worden ist, und zum Korrelieren des nachgewiesenen Produkts mit der Menge an Analyt in der Probe. Schließlich schließen die Kits Anweisungen zum Verwenden der vorliegenden Kit-Bestandteile bei der Bestimmung einer Analyt-Konzentration in einer physiologischen Probe ein. Diese Anweisungen können auf einem oder mehreren von der Verpackung, einer eingelegten Markierung, Behältern, die in den Kits vorhanden sind, und ähnlichem vorhanden sein.
  • Die folgenden Beispiele werden zu Illustrations- und nicht zu Beschränkungszwecken dargeboten.
  • EXPERIMENTELLES
  • BEISPIEL 1
  • Eine 0,8 μm Nylonmembran, erhalten von Pall Corporation (East Hills, NY), wurde in das Reagenz von Tabelle 1 bis zur Sättigung getaucht. Das überschüssige Reagenz wurde sanft mit einem Glasstab abgekratzt. Die resultierende Membran wurde zum Trocknen in einem 56°C-Ofen für 10 Minuten aufgehängt. Porex (0,6 mm dick) wurde in der Nitrit-Lösung von Tabelle 2 gebadet und dann zum Trocknen in einen 100°C-Ofen für zehn Stunden gehängt. Schließlich wurde die Membran zwischen einem Polyesterstamm (0,4 mm Melenex® Polyester von ICI America, Wilmington, DE) und dem Nitrit-imprägnierten Porex laminiert.
  • BEISPIEL 2
  • Die Prozedur von Beispiel 1 wurde wiederholt, außer daß das erste Tauchbad das Reagenz aus Tabelle 3 war, und es gab kein zweites Tauchbad, da das Porex nicht benötigt wurde. Tabelle 1. Reagenz für ein Glukose-Testkissen
    Figure 00130001
    Tabelle 2. Nitritreagenz
    Figure 00140001
    Tabelle 3. Reagenz für ein Glucose-Testkissen
    Figure 00140002
    • * Poly(methylvinylether-alt-maleinsäureanhydrid), MW 1.080.000, Kat# 41632-0, Aldrich Chemicals, Milwaukee, WI, USA) Auswiegen von Poly(methylvinylether-alt-maleinsäureanhydrid) 6% in Wasser (w/v) und Erhitzen der Suspension auf 95°C für 45 Minuten. Die resultierende Lösung ist gebrauchsfertig beim Abkühlen auf Zimmertemperatur.
  • Verschiedene Glucosestandards wurden auf den nicht-geladenen und positiv-geladenen Membranen getestet. Die Signale waren von 50 bis 450 mg/dl Glucose-Konzentration im Blut linear. 1 zeigt, daß dasselbe Tauchbad auf verschiedenen Membranen aufgetragen wurde. Eine ist eine positiv geladene Nylonmembran und eine ist eine nicht-positiv geladene Polysulfonmembran. Die beschichtete Membran wurde mit 400 mg/dl Glukose getestet.
  • Unter Verwendung des folgenden Protokolls wurden 10 μl wäßrige Proben, umfassend 400 mg/dl Glucose auf Streifen, wie oben beschrieben, getestet, wobei die Membran der Streifen hinsichtlich der positiv geladenen Nylonmembran und der (nicht-positiv geladenen) (nicht-geladenen) Polysulfonmembran auf dem Streifen variierte. Eine 10 μl wäßrige Probe wurde auf einen frisch hergestellten Teststreifen aufgetragen. Der Streifen wurde in ein Reflexionsmeßgerät eingeführt und die Datensammlung wurde begonnen. Die Reflexion des Ablesestreifens 14 („reading 14 strip") wurde bei 615 nm in einsekündigen Intervallen für fünfundvierzig Sekunden überwacht. Als nächstes wurden die Daten aus dem Speicherpuffer des Reflexionsmeßgeräts auf einen Personalcomputer mittels eines modifizierten seriellen Kabels hochgeladen. Das Reaktionsprofil wurde mit K/S gegen Sekunden aufgetragen.
  • (K/S ist ein Maß für die Reflexion („reflectance"), diskutiert und definiert in US-Patent 4,935,346, Spalte 14).
  • Es ist aus den obigen Resultaten und der Diskussion offensichtlich, daß die vorliegende Erfindung eine Verbesserung gegenüber früheren Reagenzteststreifenformaten bietet. Unter Verwendung eines wasserlöslichen Tetrazoliumsalzes in Kombination mit einem positiv-geladenen Substrat hat die vorliegende Erfindung alle Vorteile von Tetrazolium-Verbindungen und ist in der Lage, ein nicht-waschbares Reportersignal von dem resultierenden wasserlöslichen Formazan-Produkt zu erzeugen. Als solches stellt die vorliegende Erfindung einen signifikanten Beitrag zu dem Gebiet dar.

Claims (9)

  1. Stoffzusammensetzung, umfassend: Ein positiv geladenes Substrat, und wenigstens ein wasserlösliches Tetrazoliumsalz, das ein Hydrid aufnehmen kann, um ein wasserlösliches farbiges Formazan-Produkt auf wenigstens einer Oberfläche des positiv geladenen Substrats zu erzeugen, wobei das wasserlösliche Tetrazoliumsalz Teil eines Analyt-oxidierenden, Signal-erzeugenden Systems ist und das Analyt-oxidierende, Signal-erzeugende System eine Analyt-Oxidase umfaßt.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das positiv geladene Substrat ein saugfähiges Substrat ist.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das positiv geladene Substrat ein nicht-saugfähiges Substrat ist.
  4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Analyt-oxidierende, Signal-erzeugende System als eine Reagenzzusammensetzung vorliegt.
  5. Reagenzteststreifen, umfassend eine trockene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
  6. Analyt-Nachweis- oder Meßsystem, umfassend: a) einen Reagenzteststreifen nach Anspruch 5, und b) ein automatisiertes Instrument.
  7. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins oder zum Bestimmen der Konzentration eines Analyten in einer physiologischen Probe, wobei das Verfahren umfaßt: a) Auftragen der physiologischen Probe auf einen Reagenzteststreifen nach Anspruch 5, wobei ein nicht-waschbarer Fleck („spot"), umfassend ein Formazan-Produkt, auf dem Substrat hergestellt wird; b) Nachweisen des nicht-waschbaren Flecks; und c) In-Bezugsetzen des nachgewiesenen, nicht-waschbaren Flecks mit der Anwesenheit oder Konzentration des Analyten in der physiologischen Probe.
  8. Kit zur Verwendung beim Bestimmen der Konzentration eines Analyt in einer physiologischen Probe, wobei der Kit umfaßt: (a) einen Reagenzteststreifen nach Anspruch 5; und (b) wenigstens eines aus: (i) ein Mittel zum Erhalten der physiologischen Probe und (ii) ein Analyt-Standard.
  9. Kit nach Anspruch 8, wobei das Kit ein Mittel zum Erhalten der physiologischen Probe und einen Analyt-Standard umfaßt.
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