DE69533756T2 - Analytisches vielschichtelement - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verbesserungen auf dem Gebiet der Materialanalyse. Insbesondere betrifft die Erfindung ein analytisches Vielschichtelement zum Messen der Cholesterinkonzentration auf menschlicher Haut oder anderem festem Material.
  • Die SU Nr. 1,054,784 beschreibt ein Analyseelement, das bei der Dünnschichtchromatographie von Lipiden verwendet wird und aus einem Träger (wie zum Beispiel einer Glasplatte) mit einer Schicht eines adsorbierenden Materials darauf, wie zum Beispiel einer Mischung von Kieselgel, Gips, Ammoniumsulfat und Kupferacetat, besteht. Ein solches Analyseelement eignet sich nicht zum Messen von Cholesterin auf menschlicher Haut.
  • Die SU Nr. 1,495,378 beschreibt ein analytisches Zweischichtelement, das einen Träger wie zum Beispiel eine Polyethylenfolie und eine Gelatineschicht mit immobilisierter Oxidase als Enzym umfaßt. Das Element ändert seine Farbe, wenn Amine oder wäßrige Lösungen derselben mit der Gelatineschicht in Kontakt kommen. Ein solches Analyseelement eignet sich auch nicht zum Messen von Cholesterin auf menschlicher Haut.
  • Das Kanadische Patent Nr. 1,335,968 beschreibt ein Verfahren zum Messen von Cholesterin, indem die Haut oder eine andere cholesterinhaltige Fläche mit einer affinitätsenzymatischen Verbindung der allgemeinen Formel A-C-B in Kontakt gebracht wird, wobei A ein Nachweismittel mit Affinität für Cholesterin ist, B ein enzymatisches Visualisierungsmittel ist, das mit einem farbproduzierenden Mittel reagieren kann, um ein farbiges Produkt zu bilden, und C ein Bindemittel ist, welches das Nachweis- und das Visualisierungsmittel miteinander verbindet.
  • Das Vorhandensein von Cholesterin wird ermittelt durch eine Farbänderung des farbproduzierenden Mittels. Ein solches Verfahren hat insoweit Nachteile, als die Lösungen und das farbige Reaktionsprodukt nicht stabil genug sind und die Emp findlichkeit und Reproduzierbarkeit bei niedrigen Cholesterinkonzentrationen ziemlich schlecht sind.
  • Aufgrund der mit den obigen bekannten Analyseelementen und mit dem obigen bekannten Verfahren zum Messen von Cholesterin verbundenen Nachteile ist es notwendig, ein Analyseelement zu entwickeln, das die Vorteile des bekannten Flüssigphasenvertahrens zum Cholesterinnachweis und die Annehmlichkeit der praktischen Anwendung analytischer Vielschichtelemente mit festen Trägern miteinander verbindet.
  • In dem US-Patent Nr. 4,895,704 wurde ein analytisches Vielschichtelement vorgeschlagen, das einen wasserundurchlässigen, lichtdurchlässigen festen Träger und eine hydrophile Schicht umfasst, die mindestens ein Reagens enthält, das mit einer Komponente einer Probe reagieren kann, um eine Substanz zu bilden, die durch Bestrahlung mit Licht nachgewiesen werden kann. Das analytische Element weist eine zusätzliche Schicht auf, die lichtstreuende Teilchen in einer Menge enthält, die eine Lichtdurchlässigkeit im Bereich von 10 bis 2,5% sicherstellt. Nachteile eines solchen bekannten analytischen Vielschichtelements sind seine mangelnde Eignung zum Messen der Cholesterinkonzentration auf Haut, seine schwache Farbreaktion und sein hoher Kontrast der Analysewirkung bei niedrigen Konzentrationen der untersuchten Substanz.
  • Das US-Patent Nr. 4,826,761 offenbart ein analytisches Vielschichtelement zur Analyse von Cholesterin, das in einer wäßrigen flüssigen Probe wie zum Beispiel Blut oder anderen Körperflüssigkeiten enthalten ist. Ein solches Analyseelement umfaßt einen wasserundurchlässigen lichtdurchlässigen Träger, eine hydrophile Schicht und eine Ausbreitungsschicht, die Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase enthält, die in dieser Reihenfolge übereinander angeordnet sind. Das Analyseelement enthält ferner Peroxidase und eine farbgebende Reagenzienzusammensetzung, die entweder in der hydrophilen Schicht oder in der Ausbreitungsschicht vorhanden sein kann. Als farbgebende Reagenzienzusammensetzung wird eine Kombination von 4-Aminoantipyrin oder seinem Derivat und 2-Hydroxy-3,5-dichlorbenzolsulfonsäure verwendet. Die Peroxidase oxidiert 4-Aminoantipyrin, indem sie sich mit Hilfe des durch die Cholesterinreaktionen erzeugten Wasserstoffperoxids mit 2-Hydroxy-3,5-dichlorbenzolsulfonsäure verbindet, wodurch eine Farbänderung oder Färbung in dem analytischen Vielschichtelement bereit gestellt wird. Da 4-Aminoantipyrin als farbproduzierendes Mittel wirkt und eine hydrophile Verbindung ist, würde es beim Kontakt des Analyseelements mit der Haut aus der hydrophilen Schicht entfernt werden.
  • Die veröffentlichte Europäische Patentanmeldung Nr. 60,518 offenbart ein Fluoreszenzverfahren zum Nachweis von Wasserstoffperoxid, das infolge enzymkatalysierter Reaktionen bestimmter Substrate wie zum Beispiel Glukose und Cholesterin gebildet wurde. Beispiel 4 betrifft Cholesterin, das in flüssiger Phase bestimmt wird, indem das Cholesterin dem Einfluß von Cholesterinoxidase unterworfen wird, um Wasserstoffperoxid zu bilden, und indem das so gebildete Wasserstoffperoxid quantitativ gemessen wird, indem es mit einem Wasserstoffdonator, Peroxidase und einem Reagens umgesetzt wird, das sich zusammensetzt aus einer Komponente, die einen durch Entfernen eines Wasserstoffatoms von einer aktiven Methylengruppe oder einer aktiven Methingruppe gebildeten Rest aufweist, und einer fluoreszierenden Komponente. Die von dem durch die Reaktion gebildeten fluoreszierenden Material abgestrahlte Fluoreszenz wird dann gemessen. Die Umsetzung des Wasserstoffdonators (d.h. des Entwicklungsmittels) mit dem Reagens (d.h. dem farbproduzierenden Mittel) findet dann in flüssiger und nicht in fester Phase statt.
  • Die veröffentlichte Europäische Patentanmeldung Nr. 285,998 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung von Dehydrogenase oder ihrem Substrat und betrifft somit nicht die Bestimmung von Cholesterin. Alle Reaktionen werden in flüssiger Phase durchgeführt. Das durch die Umsetzung von Dehydrogenase gebildete Wasserstoffperoxid wird mit einer Peroxidase und einem Chromogen zu einem Farbstoff umgesetzt, und der Farbstoff wird durch Spektralphotometrie gemessen. Die Chromogene, die in dieser Veröffentlichung beschrieben werden und 4-Aminoantipyrin/anilin-Derivate, 4-Aminoantipyrin/phenol-Derivate und Benzothiazolinonhydrazon/anilin-Derivate enthalten können, sind alles hydrophile Verbindungen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Intensität der Farbreaktion von Analyseelementen zu verbessern, das Zeitintervall, in dem die während der Enzymreaktion entwickelte Farbe konserviert wird, zu verlängern, die Methode des Messens der Cholesterinkonzentration auf Haut zu intensivieren, und die Möglichkeiten für eine Schnelldiagnose von Cholesterin auszuweiten.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein analytisches Vielschichtelement zur Ermittlung der Cholesterinkonzentration auf tierischem Gewebe und geeignet zur Verwendung mit Wasserstoffperoxid und einer affinitätsenzymatischen Verbindung der Formel A-C-B bereitgestellt, wobei A ein Nachweismittel mit Affinität für Cholesterin ist, B ein aus Peroxidase bestehendes enzymatisches Visualisierungsmittel ist und C ein Bindemittel ist, welches das Nachweis- und das Visualisierungsmittel miteinander verbindet. Das erfindungsgemäße analytische Vielschichtelement umfaßt einen festen Träger und eine hydrophile Schicht darauf, wobei die hydrophile Schicht aus Gelatine, Polyvinylalkohol oder einer Mischung davon gebildet ist und ein Entwicklungsmittel und ein hydrophobes farbproduzierendes Mittel in einer Gesamtmenge von 5 bis 30 Gew.-% enthält, wobei das Entwicklungsmittel und das farbproduzierende Mittel in einem Gewichtsverhältnis von 1 : 0,3 bis 1 : 3,0 vorhanden sind. Das Entwicklungsmittel kann durch das Wasserstoffperoxid in Gegenwart der über das Binde- und das Nachweismittel an Cholesterin auf dem tierischen Gewebe gebundenen Peroxidase oxidiert werden, wodurch das Entwicklungsmittel in oxidierter Form mit dem farbproduzierenden Mittel reagiert, um ein farbiges Produkt mit einer auf die Cholesterinkonzentration hinweisenden Farbe zu bilden.
  • BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Das verwendete Entwicklungsmittel ist vorzugsweise eine Verbindung der folgenden Formel:
    Figure 00040001
    wobei R, R' und R'' identisch oder verschieden sind und jeweils ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe oder eine Alkanolgruppe darstellen. Beispiele für solche Verbindungen umfassen N,N-Diethyl-paraphenylendiamin, Paraethylaminoorthotoluidin, Para-[N-ethyl-N-(β-methylsulfonylaminoethyl)amino]-orthotoluidin, Para-[N-ethyl-N-(β-hydroxyethyl)amino]-orthotoluidin und Para-[N-butyl-N-(γ-sulfopropyl)-amino]-anilin.
  • Man kann auch Diethyl-p-tolylendiamin, Ethyloxyethyl-p-phenylendiamin, Ethylmethansulfoaminoethyl-p-tolylendiamin, Ethyloxyethyl-p-tolylendiamin, Butylsulfopropyl-p-phenylendiamin oder Diethyl-p-phenylendiamin als Entwicklungsmittel verwenden.
  • Als farbproduzierende Mittel können Derivate von Pyrazolon-5, Benzoylessigsäure oder Naphthoesäure verwendet werden. Beispiele für geeignete farbproduzierende Mittel umfassen 1-(2,4,6-Trichlorphenyl)-3-pentadecylaminophenylaminopyrazolon, 3,5-Dicarboxyphenyloctadecylamid-1-oxy-2-naphthoesäure, 2-Chlor-5-[γ-(2,4-ditetraminphenoxy)-butiroylamino]-anilid-α-N-benzoylhidantoylpivaloylessigsäure, Meta-(N-methyl-N-octadecyl)amino-parabenzoylacetamidobenzolsulfonsäure, Metacarboxy-meta-{N-[parachlormeta-(N-orthooctadecyloxybenzoylacetyl)amido]benzolsulfonylamido}-carbonsäure, Orthophenoxy-meta(5-oxo-1,2-pyrazol-3-ino)-benzolsulfonsäure, 2'-Methyloctadecylamino-5'-sulfanilidbenzoylessigsäure, 2'-Chlor-5'-(3'',5''-dicarboxyphenylsulfamid)-anilid-2-octadecyloxybenzoylessigsäure, Octadecylamid-1-oxy-4-sulfo-2-naphthoesäure, 2'-Methyloctadecylamino-5'-sulfanilid-1,2-oxynaphthoesäure und 1-(4'-Phenoxy-3'-sulfophenyl)-3-steroyl-aminopyrazolon.
  • Die farbproduzierenden Mittel sind je nach Art des farbproduzierenden Mittels in der hydrophilen Schicht als Mikrokapseln, Mikropartikel oder einzelne Moleküle gleichmäßig verteilt. Um eine mikropartikuläre oder molekulare Verteilung des farbproduzierenden Mittels in der hydrophilen Schicht zu erreichen, werden Verbindungen mit hydrophilen (polaren) Seitenketten verwendet. Um eine Verteilung des farbproduzierenden Mittels als Mikrokapseln zu erreichen, werden Verbindungen mit hydrophoben (nichtpolaren) Seitenketten verwendet.
  • Als Träger wird vorzugsweise eine hydrophilisierte Folie aus Polyethylenterephthalat, Polyethylen oder Trinitrocellulose verwendet. Ein farbloses Polymer, Papier oder polyethylenbeschichtetes Papier kann ebenfalls verwendet werden.
  • Die hydrophile Schicht kann außerdem Befeuchtungsmittel und Gerbstoffe enthalten. Befeuchtungsmittel stellen ein gleichmäßiges Auftragen einer hydrophilen Schicht auf dem Träger mit einer konstanten Dicke von vorzugsweise 2–100 μm sicher. Gerbstoffe stellen den erforderlichen Grad an mechanisch-physikalischen Eigenschaften des analytischen Vielschichtelements sicher. Chromacetat und das Mononatriumsalz von 2,4-Dichlor-6-hydroxytriazin-1,3,5 können als Gerbstoffe verwendet werden.
  • Das analytische Vielschichtelement gemäß der Erfindung kann in Medizin und Pharmakologie sowie im Strafrecht verwendet werden.
  • Die folgenden nicht einschränkenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung noch weiter.
  • BEISPIEL 1
  • Ein analytisches Vielschichtelement zum Nachweis von Cholesterin in der Haut wurde hergestellt, indem auf einen festen Träger aus einer Polyethylenterephthalatfolie mit einer Dicke von 50 μm eine Schicht aus photographischer Gelatine aufgebracht wurde, die 7,5 Gew.-% eines aus 1-(2,4,6-Trichlorphenyl)-3-pentadecylaminophenyl-aminopyrazolon bestehenden hydrophoben purpurnen farbproduzierenden Mittels enthielt. Das farbproduzierende Mittel hatte eine durchschnittliche Teilchengröße kleiner als 0,1 μm. Die Gelatineschicht enthielt 7,5 Gew.-% N,N-Diethyl-paraphenylendiamin als auf molekularer Ebene verteiltes Entwicklungsmittel. Die Schicht enthielt außerdem Chromacetat als Gerbstoff.
  • Das analytische Vielschichtelement wurde zur Untersuchung der Cholesterinkonzentration auf Haut-Integument von der Hand eines an Atherosklerose leidenden Patienten sowie auf der Haut einer gesunden Person verwendet. Ein Tropfen einer wäßrigen Lösung einer affinitätsenzymatischen Verbindung der Formel A-C-B gemäß obiger Definition, bei der das enzymatische Visualisierungsmittel B eine Peroxidase ist, wurde auf die Haut der Handfläche jeder Person gegeben. Es wurde 1 Minute inkubiert, dann wurde die Flüssigkeit abwechselnd mit Hilfe trockener und angefeuchteter Tampons entfernt. In demselben Bereich wurde ein Tropfen Wasserstoffperoxid aufgebracht, und unmittelbar danach wurde das analytische Vielschichtelement aufgelegt und 1 Minute lang fest gegen die Hautobertfäche gedrückt. Das Analyseelement wurde dann 15–20 Sekunden in laufendem Wasser abgewaschen. Das Testergebnis erhielt man durch Vergleichen des erhaltenen Farbabdrucks mit einer Meßskala oder durch spektralphotometrisches Messen der Intensität des Farbfleckens, beispielsweise mit einem LCD-Spektralphotometer (LCD = Flüssigkristall-Anzeige).
  • Tabelle 1 zeigt die durch Verwendung bekannter Flüssigphasenverfahren zum Messen der Blut- und Hautcholesterinkonzentrationen sowie durch Verwendung des analytischen Vielschichtelements gemäß der Erfindung erhaltenen Ergebnisse.
  • TABELLE 1
    Figure 00070001
  • Die Reproduzierbarkeit der Farbreaktion wurde bei denselben Patienten mit 10 aufeinanderfolgenden Tests untersucht. Die Standardabweichung war nicht höher als 8%.
  • Die mit analytischen Vielschichtelementen durchgeführten Messungen, die entweder 1 Woche oder 6 Monate lang aufbewahrt wurden, zeigten dieselbe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.
  • Der Test dauerte 2–3 Minuten, und die Vorbereitung des Tests dauerte etwa 3 Minuten. Es können also Testkits zum Selbsttest von Patienten hergestellt werden, die das analytische Vielschichtelement enthalten.
  • BEISPIEL 2
  • Ein analytisches Vielschichtelement zum Messen der Cholesterinkonzentration auf Haut wurde hergestellt, indem auf einen Träger aus einem weißen polyethylenbeschichteten Photopapier eine Schicht Polyvinylalkohol aufgetragen wurde, die ein aus 3,5-Dicarboxyphenyloctadecylamid-1-oxy-2-naphthoesäure bestehendes, eine blaue Farbe produzierendes Mittel enthielt. Die Polyvinylalkoholschicht enthielt außerdem Paraethylamino-orthotoluidin als Entwicklungsmittel.
  • Dieses analytische Vielschichtelement wurde zum Nachweis von Cholesterin in der Haut nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren verwendet. Man erhielt im wesentlichen dieselben Ergebnisse.

Claims (9)

  1. Analytisches Vielschichtelement zur Ermittlung einer Konzentration einer zu analysierenden Substanz auf einem Substrat und geeignet zur Verwendung mit Wasserstoffperoxid und einer affinitätsenzymatischen Verbindung der Formel A-C-B, wobei A ein Nachweismittel mit einer Affinität für die zu analysierende Substanz ist, B ein aus Peroxidase bestehendes enzymatisches Visualisierungsmittel ist und C ein Bindemittel ist, welches das Nachweis- und das Visualisierungsmittel miteinander verbindet, wobei das analytische Vielschichtelement einen festen Träger und eine hydrophile Schicht darauf umfaßt, wobei die hydrophile Schicht aus Gelatine, Polyvinylalkohol oder einer Mischung davon gebildet ist und ein Entwicklungsmittel und ein hydrophobes farbproduzierendes Mittel in einer Gesamtmenge von 5 bis 30 Gew.-% enthält, wobei das Entwicklungsmittel und das farbproduzierende Mittel in einem Gewichtsverhältnis von 1 : 0,3 bis 1 : 3,0 vorhanden sind, wobei das Entwicklungsmittel durch das Wasserstoffperoxid in Gegenwart der über das Binde- und das Nachweismittel an die zu analysierende Substanz auf dem Substrat gebundenen Peroxidase oxidiert werden kann, wodurch das Entwicklungsmittel in oxidierter Form mit dem farbproduzierenden Mittel reagiert, um ein farbiges Produkt mit einer auf die Konzentration der zu analysierenden Substanz hinweisenden Farbe zu bilden, wobei das Entwicklungsmittel eine Verbindung der folgenden Formel ist:
    Figure 00090001
    wobei R, R' und R'' identisch oder verschieden sind und jeweils ein Wasserstoffatom, eine Alkyl- oder Alkanolgruppe oder eine Verbindung darstellen, die aus der aus Para-[N-ethyl-N-(β-methylsulfonylaminoethyl)amino]-orthotoluidin, Para-[N-butyl-N-(γ-sulfopropyl)-amino]-anilin, Ethyl-methansulfoaminoethyl-p-tolylendiamin, Butylsulfopropyl-p-phenylendiamin bestehenden Gruppe ausgewählt ist; und wobei das farbproduzierende Mittel eine Verbindung ist, die aus der aus Derivaten von Pyrazolon-5, Benzoylessigsäure und Naphthoesäure bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  2. Analytisches Vielschichtelement nach Anspruch 1, wobei das Entwicklungsmittel eine Verbindung ist, die aus der aus N,N-Diethyl-para-phenylendiamin, Paraethylamino-orthotoluidin, Para-[N-ethyl-N-β-hydroxyethyl)amino]-orthotoluidin, Diethyl-p-tolylendiamin, Ethyloxyethyl-p-phenylendiamin, Ethyloxy-ethyl-p-tolylendiamin und Diethyl-p-phenylendiamin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  3. Analytisches Vielschichtelement nach Anspruch 1, wobei das farbproduzierende Mittel eine Verbindung ist, die aus der aus 1-(2,4,6-Trichlorphenyl)-3-pentadecylaminophenyl-aminopyrazolon, 3,5-Dicarboxyphenyloctadecylamid-1-oxy-2-naphthoesäure, 2-Chlor-5-[γ-(2,4-ditetraminphenoxy)-butiroylamino]-anilid-α-N-benzoylhidantoylpivaloylessigsäure, Meta-(N-methyl-N-octadecyl)amino-parabenzoylacetamidobenzolsulfonsäure, Metacarboxy-meta-(N-[parachlormeta-(N-orthooctadecyloxybenzoylacetyl)-amido]benzolsulfonylamido)-carbonsäure, Orthophenoxy-meta(5-oxo-1,2-pyrazol-3-ino)-benzolsulfonsäure, 2'-Methyloctadecylamino-5'-sulfanilidbenzoylessigsäure, 2'-Chlor-5'-(3'',5''-dicarboxyphenylsulfamid)-anilid-2-octadecyloxybenzoylessigsäure, Octadecylamid-1-oxy-4-sulfo-2-naphthoesäure, 2'-Methyloctadecylamino-5'-sulfanilid-1,2-oxynaphthoesäure und 1-(4'-Phenoxy-3'-sulfophenyl)-3-steroyl-aminopyrazolon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  4. Analytisches Vielschichtelement nach Anspruch 1, wobei das farbproduzierende Mittel eine hydrophobe Verbindung mit einer Teilchengröße kleiner als 0,1 μm ist.
  5. Analytisches Vielschichtelement nach Anspruch 4, wobei die hydrophobe Verbindung 1-(2,4,6-Trichlorphenyl)-3-pentadecylaminophenyl-aminopyrazolon oder 2-Chlor-5-[γ-(2,4-ditetraminphenoxy)-butiroylamino]-anilid-α-N-benzoylhidantoylpivaloylessigsäure ist.
  6. Analytisches Vielschichtelement nach Anspruch 1, wobei die hydrophile Schicht eine Dicke im Bereich von 2 bis 100 μm hat.
  7. Analytisches Vielschichtelement nach Anspruch 1, wobei die hydrophile Schicht ferner mindestens ein Befeuchtungsmittel enthält.
  8. Analytisches Vielschichtelement nach Anspruch 1, wobei die hydrophile Schicht ferner mindestens einen Gerbstoff enthält.
  9. Analytisches Vielschichtelement nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die zu analysierende Substanz Cholesterin ist und das Substrat Haut ist.
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