JPS63158000A - 総コレステロ−ル定量用一体型多層分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、血液等の各種生物体液、飲食物その他の水性
液体試料に含まれている総コレステロールを定量分析す
るための、乾式の一体型多層分析要素の改良に関するも
のである。

〔従来の技術および本発明が解決しようとする問題点〕

リポプロティンの型で存在する血液等の体液中のコレス
テロールとコレステロールエステルの定量分析を乾式の
一体型多層分析要素を用いて行う場合、水性液体試料で
ある血液を水、生理的塩類水溶液、ｐＨバッファー等で
稀釈することなしに用いるために、分析要素中で呈色反
応が迅速に進まなかったり、体液中の共存物質（例、血
液中の中性脂肪）の干渉を受けて、正確な定量分析が困
難であった。この問題を解決するために、特開昭５３ｉ
６３７Ｂ　、特開昭６１−８５２００、ｒＣＬＩＮＩＣ
ＡＬ　ＣＵＥ門ｌ５ＴＲＹＪ到、　１）５９−１）６２
　（１９８２）等にアルキルフェノキシポリエトキシエ
タノールを併用することが提案されている。

しかし、これらの提案の技術においてもなお、以下のよ
うな問題点があることが判明した。

■コレステロールエステラーゼ活性が阻害される。

■乾式多層分析要素の使用前の保存時に、多層要素が水
を吸収する傾向が強く、そのために要素中の酵素活性が
減少又は失活するので、要素の性能が劣化しやすい。

ｒｃＬＩＮＩｃＡＬ　　ＣＨＥＭｒＳＴＲＹＪ　　２０
．　４７０−４７５（１９７４）及ヒ特開昭５０−１２
５７９６にはコレステロールエステラーゼと胆汁酸又は
その塩を併用して、水溶液中で効率的にコレステロール
エステルを加水分解することが記載されている。そこで
、乾式の一体型多層分析要素にこの技術を応用してみた
ところ、水性液体試料、特に血液（全血、血清、血清）
の多孔性展開層での展開が悪く、分析精度が著しく低下
することが判明した。

上述の諸問題点（コレステロールエステラーゼ活性の阻
害、保存経時での性能劣化、低い分析精度等）が解決さ
れた優れた総コレステロール定量分析用の乾式の一体型
多層分析要素が望まれている。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らはこのような問題を解決するべく鋭意検討を
行い胆汁酸又はその塩とオキシエチレン単位１６以上（
平均２０以上）のポリオキシエチレン鎖を含むアルキル
フェノキシポリエトキシエタノールの組合せを含むコレ
ステロール分析用試薬組成物を用いることにより、コレ
ステロールエステラーゼ活性を有する酵素の活性阻害が
少く保存安定性が向上した乾式の一体型多層分析要素が
得られることが明らかになった。

また、血液（全血、血漿、血清）のように呈色試薬組成
物の発色に干渉を与える諸種の物質が共存するような液
体試料を用いる場合に、胆汁酸又はその塩とオキシエチ
レン単位１６以上（平均２０以上）ポリオキシエチレン
鎖を含むアルキルフェノキシポリエトキシエタノールを
試薬組成物に共存させると、呈色反応が円滑に進行し、
大きな発色光学濃度が得られて正確な総コレステロール
含有量の比色分析が可能なことが明らかになった。

すなわち、本発明は、少なくとも、光透過性水不透過性
支持体、１層以上の親水性ポリマーを含む層（以下、親
水性層ということがある）、及び展開層がこの順に積層
されるとともにコレステロールエステラーゼ活性を有す
る少なく１種の酵素、コレステロールオキシダーゼ及び
ペルオキシダーゼの各酵素、並びに発色試薬組成物を展
開層、親水性層、又は要素内の他の親水性層中に含有す
る総コレステロール分析用乾式一体型多層分析要素にお
いて、胆汁酸化合物（胆汁酸類、胆汁酸誘導体及びそれ
らの塩のうちの少なくとも１種）とオキシエチレン単位
１６以上（平均２０以上）のポリオキシエチレン鎖を含
むアルキルフェノキシポリエトキシエタノールとの組合
せを展開層又はいずれかの親水性層に含有させた改良さ
れた、一体型多層分析要素に関するものである。

〔発明の構成の詳細な説明〕

光透過性水不透過性支持体は一般の多層分析要素に使用
されている公知のものを利用すればよい。

その具体例としては、ポリエチレンテレツクレート、ビ
スフェノールＡのポリカルボネート、ポリスチレン、セ
ルロースエステル（セルロースジアセテート、セルロー
ストリアセテート、セルロースアセテートプロピオネー
ト等）などのポリマーからなる厚さ約５０μｍから約１
胴、好ましくは約８０μｍから約３００μｍの範囲の透
明支持体を用いることができる。支持体の表面には必要
により前記の諸特許明細書等より公知の下塗層または接
着層を設けて支持体の上に設けられる親水性層等との接
着を強固にすることができる。

親水性層は呈色反応して発色した色素が蓄積される層で
あり、また呈色反応時のｐＨを安定させるｐＨ緩衝剤組
成物を含有させることができる層であって、親水性ポリ
マーバインダーにより形成され、親水性ポリマーバイン
ダーのみ又はこれと他の成分から形成されるものである
。親水性層は試薬成分を含まず吸水して膨潤し、検出種
を受容して蓄積する吸水層、検出種を媒染固定できる陰
電荷又は陽電荷を有する媒染剤を含みかつ吸水して膨潤
する検出層として機能させることができる。親水性ポリ
マーバインダーは水吸収時の膨潤率が３０℃で約１５０
％から約２０００％、好ましくは約２５０％から約１５
００％の範囲の天然または合成親水性ポリマーである。

その例として、特開昭５９−１７１８６４、特開昭６０
−１０８７５３等に開示のゼラチン（酸処理ゼラチン、
脱イオンゼラチン等）、ゼラチン誘導体（フタル化ゼラ
チン、ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等）、
アガロース、プルラン、プルラン誘導体、ポリアクリル
アミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン
等をあげることができる。親水性層の乾燥時の厚さは約
１μｍから約１００μｍ１好ましくは約３μｍから約５
０μｍ、特に好ましくは約５μｍから約３０μｍの範囲
であり、また実質的に透明であることが好ましい。

親水性層にはｐＨ緩衝剤、酵素、発色試薬組成物、その
他の必要により組合せられる試薬（例、フェロシアン化
物）の一部又は全部、さらには公知の媒染剤、塩基性ポ
リマー、酸性ポリマー等を含有させることもできる。こ
の場合には親水性層は試薬層又は呈色試薬層として機能
する。

展開層としては特公昭５３−２１６７７号公報等に開示
のメンブランフィルタ（プラッシュポリマ一層）、ポリ
マーミクロビーズ、ガラスミクロビーズ、珪藻土が親水
性ポリマーバインダーに保持されてなる連続微空隙含有
多孔性層、特開昭５５−９０８５９号公報に開示のポリ
マーミクロビーズ、ガラスミクロビーズ等が水で膨潤し
ないポリマー接着剤で点接触状に接着されてなる連続微
空隙含有多孔性層（三次元格子状粒状構造物層）等の非
繊維質等方的多孔性展開層、特開昭５５−１６４３５６
号公報、特開昭５７、−６６３５９号公報等に開示の織
物展開層、特開昭６０−２２２７６９号明細書に開示の
編物展開層、特開昭５７−１４８２５０号公報に開示の
有機ポリマー繊維パルプを含む抄造紙からなる展開層等
の繊維質多孔性展開層等があげられる。

展開層は直接あるいは必要により接着層を介して前記の
親水性層の上に積層される。展開層に酵素、発色試薬組
成物、必要により組合せ含有されるフェロシアン化物そ
の他の試薬の一部又は全部を含有させることもできる。

特に酵素のうち、コレステロールエステラーゼ活性を有
する酵素は多孔性展開層に含有させることが好ましい。

本発明の一体型多層分析要素には、前述の諸特許明細書
に開示の試薬層、光遮蔽層、光反射層、濾過層、半透膜
層、バリヤ層、拡散防止層（マイグレーション防止層）
等やこれら単独の層を有する機能を二つ以上併せもつ層
を組みこむことができる。

試薬層は酵素、発色試薬組成物、必要により組合せられ
るフェロシアン化物、その他の試薬の一部又は全部を含
有する層であり、非孔性で吸水性の層又は微多孔性で水
浸透性の層である。

実質的に非孔性で吸水性の試薬層に用いられる親水性ポ
リマーバインダーは、試薬を実質的に均−に熔解または
分散させる媒体として作用し、また液体試料中の水を吸
収して水とともに被検成分を試薬層に到達させる作用を
少なくとも有するものである。親水性ポリマーバインダ
ーとしては前記の親水性層に用いられる吸水性の親水性
ポリマーバインダーと同じポリマーから適宜に選択して
用いることができる。実質的に非孔性の試薬層の乾燥厚
さは約３μｍから約５０μｍ、好ましくは約５μｍから
約３０μｍの範囲であり、また試薬層は実質的に透明で
あることが好ましい。

微多孔性で水浸透性の試薬層は固体微粒子とそのバイン
ダーである親水性ポリマーバインダーから構成される微
多孔性構造体層に試薬または試薬組成物が含有保持され
ている層である。ここでいう微多孔性構造体層とは微多
孔性微粒子または非多孔性微粒子と微粒子間を接着して
微多孔性連続空隙構造を保持する親水性ポリマーバイン
ダーからなる構造物の層である。

微多孔性試薬層に用いられる微多孔性微粒子または非多
孔性微粒子の例として微結晶性セルロース、セルロース
微粉末または微粒子等のセルロース微粒子、シリカ、珪
藻上等の二酸化珪素化合物の微粒子、沸石等の珪酸塩の
微粒子、ポリマーミクロビーズ、ガラスミクロビーズ、
諸種のセラミックスビーズ等があげられる。親水性ポリ
マーバインダーとしては、前記の親水性層に用いられる
吸水性の親水性ポリマーと同じポリマーから適宜に選択
して用いることができるほか、特開昭５９−１４５９６
５等に開示の親水性構成繰返し単位を約２％以上含有す
るコポリマーの水性ラテックス等を用いることもできる
。微多孔性試薬層の乾燥層厚は約７μｍから約５０μｍ
、好ましくは約１０μｍから約３０μｍの範囲である。

試薬層には公知のｐ）（緩衝剤組成物、高分子ｐＨ緩衝
剤、塩基性ポリマー、酸性ポリマー、高分子媒染剤等を
含有させることができる。

試薬層と支持体の間に吸水層を配置する態様は好ましい
１実施態様例である。また、親水性層に発色試薬組成物
を、多孔性展開層に酵素、胆汁酸化合物及びアルキルフ
ェノキシポリエトキシエタノールを、それぞれ含有させ
る態様は特に好ましい１実施態様例である。

試薬層または親水性層の上に光遮蔽層を設けることがで
きる。光遮蔽層は光遮蔽性または光遮蔽性と光反射性を
兼ね備えた微粒子または微粉末（以下、単に微粒子とい
う）が少量の皮膜形成能を有する親水性ポリマーバイン
ダーに分散保持されている水透過性または水浸透性の層
である。光遮蔽層状薬層又は親水性層における発色を光
透過性支持体側から反射測光する際に展開層に点着供給
された水性液体試料の色、特に全血試料に含まれるヘモ
グロビンの赤色等を遮蔽するとともに光反射層または背
景層としても機能する。

光遮蔽性と光反射性とを兼ね備えた微粒子の例として二
酸化チタン微粒子（ルチル型、アナターゼ型またはプル
カイト型の粒子径約０．１μｍから約１．２μｍの微結
晶粒子等）、硫酸バリウム微粒子、アルミニウム微粒子
または微小フレーク等があり、光遮蔽性微粒子の例とし
てカーボンブラック、ガスブランク、カーボンミクロビ
ーズ等がある。これらのうちでは二酸化チタン微粒子及
び硫酸バリウム微粒子が好ましい。皮膜形成能を有する
親水性ポリマーバインダーとしては親水性層に用いられ
るのと同じ親水性ポリマーのほかに弱親水性の再生セル
ロース、セルロースアセテート等がある。これらのうち
では、ゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド
等が好ましい。ゼラチン、ゼラチン誘導体は公知の硬化
剤（架橋剤）を混合して用いることができる。

光遮蔽層は光遮蔽性微粒子と親水性ポリマーとの水性分
散液を公知の方法により試薬層または親水性層の上に塗
布し乾燥することにより設けることができる。光遮蔽性
微粒子と親水性ポリマーバインダーとの乾燥時の体積比
は光遮蔽性微粒子１０に対しポリマーバインダーが約２
．５から約７．５、好ましくは約３．０から約６．５の
範囲であり、光遮蔽性微粒子が二酸化チタン微粒子の場
合には重量比で二酸化チタン微粒子１０に対しポリマー
バインダーが約０．６から約１．８、好ましくは約０．
８から約１．５の範囲である。光遮蔽層の乾燥層厚は約
３μｍから約３０μｍ１好ましくは約５μｍから約２０
μｍの範囲である。

展開層、光遮蔽層等を接着し積層するために接着層を設
けることができる。光遮蔽層の上に多孔性展開層を設け
る場合には接着層は必須である。

接着層は水で湿潤しているとき、または水を含んで膨潤
しているときに展開層を接着して一体化できる親木性ポ
リマーから主としてなる。接着層に用いうる親水性ポリ
マーとしては親水性層に用いるのと同じ親水性ポリマー
があげられ、これらのうちでゼラチン、ゼラチン誘導体
、ポリアクリルアミド等が好ましい。接着層の乾燥層厚
は約０．５μｍから約２０μｍ、好ましくは約１μｍか
ら約１０μｍの範囲である。接着層には界面活性剤を含
有させることができる。界面活性剤としてはノニオン性
界面活性剤、例えばオキシエチレン基またはオキシプロ
ピレン基が８〜１５個連なった鎖状構造を含むノニオン
性界面活性剤が好ましい。

接着層は親木性ポリマーと所望により加えられる界面活
性剤等を含む水溶液を公知の方法で試薬層、親水性層、
又は光遮蔽層の上に塗布して設けることができる。

次に本発明の総コレステロール定量用一体型多層分析要
素に含有されるコレステロール分析用呈色試薬組成物に
ついて説明する。本発明の要素に含まれるコレステロー
ル分析用呈色試薬組成物はコレステロールエステラーゼ
活性を有する少なくとも１種の酵素、コレステロールオ
キシダーゼ、ペルオキシダーゼ、発色試薬組成物、胆汁
酸類、胆汁酸誘導体及びそれらの塩からなる群から選ら
ばれた少なくとも１種の化合物、及び１６以上（平均２
０以上）のオキシエチレン単位からなるポリオキシエチ
レン鎖を含むアルキルフェノキシポリエトキシエタノー
ルを含む。さらに組成物中にはフェロシアン化物を含ま
せることができる。

コレステロールエステラーゼ（Ｅ、　　Ｃ，３，１゜１
．１３）は試料中に含まれているコレステロールエステ
ルをコレステロールに変える酵素であり、コレステロー
ルオキシダーゼ（Ｅ、　　Ｃ，１，１゜３．６）はコレ
ステロールを酸化して過酸化水素を生成させる酵素であ
る。ペルオキシダーゼ（Ｅ・Ｃ，１，１），１，７）は
この過酸化水素を利用して発色試薬組成物を酸化発色さ
せる反応に関与する酵素である。コレステロールエステ
ラーゼとしてはＥＣ３，１，１，１３に分類される酵素
を用いることができるだけでなく、コレステロールエス
テラーゼ活性を有する他の単独の酵素（例、特公昭５６
−４５５９９に記載のコレステロールエステラーゼ活性
を有するリパーゼＭｅ、リパーゼ３０００■）、および
２種以上の酵素の組合せ（例、特公昭５６−４５５９９
に記載のコレステロールエステラーゼ活性を有するリパ
ーゼ（例、リパーゼＭｅ、リパーゼ３０００Ｑ）　、と
プロテアーゼ（例、キモトリプシン（ＥＣ３，４，２１
，１）、パパイン（ＥＣ３，４゜２１．２Ｌプロメライ
ン（ＥＣ３，４，２２，４）、プロナーゼ０）との組合
せを用いることができる。

コレステロールオキシダーゼ（ＥＣ１，１，３゜６）は
コレステロールを酸化して過酸化水素を発生させる酵素
である。コレステロールオキシダーゼとしては、市販の
酵素から適宜に選択して用いることができる。必要に応
じて補酵素ＦＤＡ　（フラビン　アデニン　ジヌクレオ
チド）とともに用いることができる。

ペルオキシダーゼとしては特公昭５６−４５５９９号、
特公昭５７−５５２０号等に記載の植物起源および動物
起源のペルオキシダーゼ（ＥＣ１，１），１，７）、特
公昭５８−５０３５号等に記載の微生物起源のペルオキ
シダーゼ（ＥＣ１，１），１，７）を用いることができ
る。これらのうちでは植物起源または微生物起源の非特
異的ペルオキシダーゼが好ましい。

好ましいペルオキシダーゼの例として西洋わさび、大根
から抽出したペルオキシダーゼ、Ｃｏｃｈ　ｌ　ｉ　ｏ
ｂｏ　ｌｕｓ属、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ属の微生物から
抽出したペルオキシダーゼ等がある。

胆汁酸類としては、コール酸、デオキシコール酸、リト
コール酸、ケノデオキシコール酸があげられる。胆汁酸
誘導体としては、クウロコール酸、グリコール酸、タウ
ロデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸があげら
れる。胆汁酸類および胆汁酸誘導体の塩としては、上記
の酸のナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等があげ
られる。

本発明の多層分析要素においては、上記の胆汁酸類、胆
汁酸誘導体およびそれらの塩（本明細書ではこれらを総
称して胆汁酸化合物という）のうちの少なくとも１種の
化合物をいずれかの層に含有する。胆汁酸化合物は展開
層又は展開層に隣接する層に含有させることが好ましい
。胆汁酸化合物はアルキルフェノキシポリエトキシエタ
ノール、コレステロールエステラーゼ活性を有する単独
の酵素又は２種以上の酵素の組合せとともに同じ層に含
有させることが特に好ましい。

１６以上（平均２０以上）のオキシエチレン単位からな
るポリオキシエチレン鎖を含むアルキルフェノキシポリ
エトキシエタノール（以下、単にアルキルフェノキシポ
リエトキシエタノールということがある。またこの化合
物の別名はポリオキシエチレン　アルキルフェニル　エ
ーテル）のアルキル基としては、各種のアルキル基が用
いうるが、好ましくはオクチル基、１．１．３．３−テ
トラメチルブチル基、ノニル基等の炭素原子数８又は９
の直鎖状又は分岐枝状のアルキル基である。ポリオキシ
エチレン鎖中のオキシエチレン単位数としては１６から
約６０までの範囲、好ましくは平均２０から５０までの
範囲である。アルキルフェノキシポリエトキシエタノー
ルの例として、オクチルフェノキシポリエトキシエタノ
ール（オキシエチレン単位９〜１）含有物の混合物、平
均２０〜４０含有物等）、ノニルフェノキシポリエトキ
シエタノール（オキシエチレン単位平均２０〜４０含有
物等）、１，１゜３．３−テトラメチルブチルフェノキ
シポリエトキシエタノール（オキシエチレン単位平均２
０〜４０含有物等）がある。アルキルフェノキシポリエ
トキシエタノールはコレステロールエステラーゼ活性を
有する単独の酵素又は２種以上の酵素の組合せ、胆汁酸
化合物とともに同じ層に含有させるか、相互に隣接する
層に含有させることが好ましい。

アルキルフェノキシポリエトキシエタノールは２種以上
の化合物を組合せて用いることができるほか、他の種類
の界面活性剤、とくに他のノニオン性界面活性剤と併用
することもできる。

発色試薬組成物は■色原体とカプラーを含み、ペルオキ
シダーゼの存在下に過酸化水素により色原体とカプラー
が酸化カプリングしてキノンイミン染料を形成して発色
する組成物、または■ロイ３色素でペルオキシダーゼの
存在下に過酸化水素により酸化されて色素になり発色す
る化合物である。

色原体としては、Ａｎｎ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、、　６　、２４−２７　（１９６９）に記載の４−
アミノアンチピリン（別名４−アミノフェナジン、すな
わち１−フェニル−２，３−ジメチル−４−アミノ−３
−ピラゾリン−５−オン）、特開昭５９−５４９６２等
に記載の１−、（２，４，６−トリクロロフエニル）−
２゜３−ジメチル−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−
オン、１−（３，５−ジクロロフェニル）−２゜３−ジ
メチル−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オン等のト
リ置換−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オン、特公
昭５５−２５８４０等に記載の１−フェニル−２，３−
ジメチル−４−ジメチルアミノ−３−ピラゾリン−５−
オン等の４−アミノアンチピリン類似体を用いることが
できる。これらの化合物のうちでは、４−アミノアンチ
ピリン、１−　（２，４，６−トリクロロフエニル）−
２゜３−ジメチル−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−
オン、ｌ（３，５−ジクロロフェニル）−２゜３−ジメ
チル−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オン等が好ま
しい。

カプラーとしては、Ａｎｎ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、＋　６　＋２４−２７　（１９６９）、特公昭５
５−２５８４０、特公昭５８−４５５９９、特公昭５８
−１８６２８、特開昭５５−１６４３５６、特開昭５６
−１２４３９８、特開昭５６−１５５８５２等に記載の
フェノール；２−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホン酸
、４−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホン酸、３．５−
ジクロロ−２−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホン酸、
２−ヒドロキシ−３−メトキシ−１−ベンゼンスルホン
酸等のフェノールスルホン酸（アルカリ金属塩、アルカ
リ土類金属塩を含む）；１−ナフトール、２−ナフトー
ル；１．７−ジヒドロキシナフタレン等のジヒドロキシ
ナフタレン；１−ヒドロキシ−２−ナフタレンスルホン
酸、■−ヒドロキシー４−ナフタレンスルホン酸等のナ
フトールスルホン酸（アルカリ金属塩、アルカリ土類金
属塩を含む）；その他のフェノールまたはナフトール誘
導体がある。これらの化合物のうちでは、１．７−シヒ
ドロキシナフタレン、■−ヒドロキシー２−ナフタレン
スルホン酸（Ｎａ塩、Ｋ塩、Ｌｉ塩を含む）、３．５−
ジクロロ−２−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホン酸（
Ｎａ塩、Ｋ塩、Ｌｉ塩を含む）が好ましい。

ロイコ色素として、特公昭５７−５５１９に記載の２−
（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）−４
，５−ビス〔４−（ジメチルアミノ）フェニルコイミダ
ゾール等のトリアリールイミダゾールロイコ色素；特開
昭５９−１９３３５２に記載の２−（３，５−ジメトキ
シ−４−ヒドロキシフェニル）−４−（４−（ジメチル
アミノ）フェニルクー５−フェネチルイミダゾール等の
ジアリールイミダゾールロイコ色素；特開昭６１−４９
６０に記載の２−（２−フェニル−３−インドリル）−
４，５−ジ［４−（ジメチルアミノ）フェニルイミダゾ
ール等のジアリールインドリルイミダゾールロイコ色素
；特開昭６１−２２９８６８に記載の２−（４−ヒドロ
キシ−３，５−ジメトキシフェニル）−３−アセチル−
４，５−ビス〔４−（ジエチルアミノ）フェニルコイミ
ダゾール等のトリアリールモノアシルイミダゾールロイ
コ色素；　ｌ−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシ
フェニル）−３−メチル−４，５−ビス〔４−（ジエチ
ルアミノ）フェニルコイミダゾール等のトリアリールモ
ノアルキルイミダゾールロイコ色素等がある。

コレステロール分析用呈色試薬組成物には、オプショナ
ル成分として、フェロシアン化物を加えることができる
。

フェロジエン化物としては、フェロシアンイオン（ヘキ
サシアノ鉄（ｎ）酸イオン；すなわち（Ｆ　ｅ　（ＣＮ
）６）　’　ｅ）を含有するか、または放出しうる化合
物を用いることができる。フェロシアン化物としてはへ
キサシアノ鉄（ｎ）酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類
金属塩、これらの混合金属塩を用いることができる。

フェロシアン化物の具体例としては、フェロシアン化ナ
トリウムＮ　ａ　４　（Ｆ　ｅ　（ＣＮ）６）　　ｉフ
ェロシアン化カリウムＫａ　（Ｆ　ｅ　（ＣＮ）６）　
　；ヘキサシアノ鉄（Ｕ）酸リチウム；ヘキサシアノ鉄
（ＩＩ）酸マグネシウム；ヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸カ
ルシウムがある。これらのうちではフェロシアン化カリ
ウム、フェロシアン化ナトリウムが好ましい。

上述のコレステロール分析用呈色試薬組成物の成分のう
ち、各酵素、胆汁酸化合物、及びアルキルフェノキシポ
リエトキシエタノールは多孔性展開層に含有させること
が好ましい。発色試薬組成物、さらにオプショナル成分
であるフェロシアン化物は多孔性展開層、多孔性展開層
に隣接する層、独立試薬層、親水性層、及び吸水層のい
ずれか１層又は複数の層に含有させることができる。

本発明の要素に用いられるコレステロール分析用呈色試
薬組成物の各成分の要素中の含有量（被覆量）は次のと
おりである（被覆量は要素１２当り）。

コレステロールエステラーゼ活性を有する少なくとも１
種の酵素； 約５００〜約５万ＩＵ、好、ましくは約１千〜約３万Ｉ
Ｕ（コレステロールエステラーゼ活性値として） コレステロールオキシダーゼ； 約１千〜約３万ＩＵ、好ましくは約１５００〜約２万Ｉ
Ｕ ペルオキシダーゼ； 約１千〜約１０万、好ましくは約２千〜約６万１色原体
又はロイコ色素； 約０．５〜約１０ミリモル、好ましくは約１〜５ミリモ
ル カプラー； 約２．５〜約５０ミリモル、好ましくは約５〜２５ミリ
モル フェロシアン化物； 約０．１〜約１０ミリモル、好ましくは約０．５〜５ミ
リモル 胆汁酸化合物； 約０．２ｇ〜約１０．０ｇ、好ましくは約０，５ｇ〜約
５．０ｇ１６以上（平均２０以上）のオキシエチレン単
位からなるポリオキシエチレン鎖を含むアルキルフェノ
キシポリエトキシエタノール； 約０．５ｇ〜約１２．０ｇ、好ましくは約０．８ｇ〜約
８．Ｏｇ本発明の一体型多層分析要素には液体試料を適
用してあ分析操作実施時のｐＨ値を約５．５から約９．
０、好ましくは約７．７から約８．５の範囲の所望の値
に緩衝できる公知の緩衝剤から適宜選択して含有させる
ことができる。

用いうる緩衝剤としては、日本化学会編「化学便覧　基
礎編」（東京、丸首■、１９６６年発行）１３１２−１
３２０頁、Ｒ，Ｍ、　　Ｃ，Ｄａｗｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ
ｌ　ｒＤａｔｅｆｏｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　Ｊ第２版（Ｏｘｆｏｒｄａｔ　ｔｈｅ　
Ｃ１ａｒｅｎｄｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、１９６９年発行）　
４７６−５０８頁、ｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　５
＋　４６７頁以降（１９６６年）、ｒＡｎａｌｙｔｉｃ
ａｌ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　１０４．３００−
３１０頁（１９８０年）等に記載のｐＨ緩衝剤系がある
。

ｐ　Ｈ５，５〜９．０の範囲のｐＨ緩衝剤の具体例とし
て、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉ
ｓ）を含む緩衝剤；燐酸塩を含む緩衝剤；硼酸塩を含む
緩衝剤；拘儲酸または拘儲酸塩を含む緩衝剤；グリシン
を含む緩衝剤ｉＮ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）
グリシン （Ｂｉｃｉｎｅ）　　；　Ｎ　−２−ヒドロキシエチル
ピペラジン−Ｎ′−２−ヒドロキシプロパン−３−スル
ホン酸（ＨＥＰＰＳ）　Ｎ　ａ塩またはに塩等；Ｎ−２
−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−３−スルホン酸
（ＥＰＰＳ）Ｎａ塩またはに塩等；Ｎ−（）リス（ヒド
ロキシメチル）メチルツー３−アミノプロパンスルホン
酸（ＴＡＰＳ）Ｎａ塩またはに塩等；Ｎ−２−ヒドロキ
シエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（Ｈ
ＥＰＥＳ）Ｎａ塩またはに塩等；およびこれらのいずれ
かと必要により組合せられる酸、アルカリまたは塩があ
る。好ましい緩衝剤の具体例として、燐酸二水素カリウ
ム−燐酸水素二ナトリウム；’ｌ’ｒｉｓ−硼酸ナトリ
ウム；Ｔｒｉｓ−硼酸ナトリウム−ＥＤＴＡ・２Ｎａ塩
；ＴｒｉＳ＄Ｊ＠酸；拘儲酸−燐酸二水素ナトリウム；
Ｂｉｃｉｎｅ；　ＨＥＰＰＳ　；　ＨＥＰＰＳナトリウ
ム塩、ＥＰＰＳ　、ＥＰＰＳナトリウム塩；ＴＡＰＳ；
ＴＡＰＳナトリウム塩等がある。

ｐＨ緩衝剤は酵素が含有されている層に存在するのが好
ましいので、一般的には酵素含有する多孔性展開層また
は試薬層にｐＨ緩衝剤を含有させるのが好ましい。一方
で低分子量のｐ’Ｈ緩衝剤は点着された水性液体試料の
媒体である水の浸透に従って眉間を移動しろるので、酵
素と発色試薬組成物が含まれる全ての層にｐＨ緩衝剤が
含有される必要はなく、例えば親水性層又は吸水層だけ
にｐＨ緩衝剤を含有させてもよい。

本発明の一体型多層分析要素は、−通約１５ｍｍから約
３０ｒＭｒｌの正方形またはほぼ同サイズの円形等の小
片に裁断し、特開昭５７−６３４５２号公報、特開昭５
４−１５６０７９号公報、実開昭５６−１４２４５４号
公報、実開昭５８−３２３５０号公報、特表昭５８−５
０１）４４号公表等に開示のスライド枠等に収めて分析
スライドとして用いるのが、製造、包装、輸送、保存、
測定操作等の全ての観点が好ましい。

測定試料はコレステロールを含有する水性試料であれば
特に制限されるものではなく、例えば全血、血漿、血清
等の血液のほか、その他各種体液、食品、さらにはコレ
ステロールを製造しあるいは利用している工場の工程管
理用試料などを含む。

本発明の一体型多層分析要素は前述の諸特許明細書に開
示の方法に従い、約５μｌから約３０μｌ、好ましくは
８μ！から約１５μｌの水性液体試料を展開層に点着供
給し、必要に応じて約２０°Ｃから約４５°Ｃ１好まし
くは約３５°Ｃから約４０°Ｃの範囲の実質的に一定の
温度でインキュベーションする。そしてその後に、例え
ば光透過性支持体側から多層分析要素内の発色を反射測
光し、比色法の原理により液体試料中の総コレステロー
ル含有量を定量することができる。

実施例１ ゼラチン下塗りが施されである厚さ１８０７１ｍのポリ
エチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム上に、ゼラ
チン２６ｇ／ｎ（、ノニルフェノキシポリエトキシエタ
ノール（オキシエチレン単位（以下、ｎと略記する）平
均９〜１０含有）０．０３ｇ／留、ビス（ビニルスルホ
ニルメチル）エーテル３０ｍｇ／ｍになるように塗布乾
燥してゼラチン層（吸水Ｎ）を形成した。

次に、この吸水層に３０ｇ／＋ｙｒの割合で水を湿し水
として供給湿潤させたのちグロー放電で親水化したポリ
エチレンテレフタレート（ＰＥＴ）紡績糸（５０デニー
ル）からなるトリコット編物生地（平均厚さ２５０μｍ
）を圧着ラミネートして展開層を設けた。

ついで展開層中で下記の成分被覆量になるようにして、
編物展開層の上からコレステロール分析用呈色試薬組成
物水溶液を塗布含浸し乾燥して総コレステロール定量用
一体型多層分析要素を完成した。

コレステロール分析用呈色試薬組成物の成分被覆量（Ｉ
ｎ？当り） メチルセルロース（メトキシ基含有率２９％、２Ｗ％水
溶液２０℃で粘度１）２ｃｐｓ）　　　　３．０　ｇ二
酸化チタン微粒子（ルチル型；粒子 サイズ０．２５〜０．４０μｍ）　　　　　　　　　２
４ｇオクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ｎ：
平均４０）　　　　　　　　　　　　　１．１　ｇデオ
キシコール酸ナトリウム　　　　　　１．５ｇコレステ
ロールオキシダーゼ （ＥＣ１，１，３，６）　　　　　　　３５００１Ｕコ
レステロールエステラーゼ （ＥＣ３，１，１，１３）　　　　　　　２０００ＩＵ
ペルオキシダーゼ （ＥＣ１，１），１，７）　　　　　　　２９０（ＨＩ
Ｊ２−ヒドロキシ３．５−ビクロロベンゼンスルホン酸
ナトリウム　　　　　　　　１．８ｇ４−アミノアンチ
ピリン　　　　　　　０．３ｇ燐酸二水素ナトリウム　
　　　　　　　７．３ｇ比較例１ コレステロール分析用呈色試薬組成物の成分のうち、オ
クチルフェノキシポリエトキシエタノール（ｎ：平均４
０）、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ｎ：
平均９〜１０）、デキオシコール酸ナトリウムの配合の
有無について、第１表に記載の９とおりに変更したほか
は、実施例１と同様にして比較用総コレステロール定量
用一体型多層分析要素を完成した。

ついで実施例１及び比較例１で作成した総コレステロー
ル定量用一体型多層分析要素を１５ｔｍ　Ｘ　１５１貫
の正方形チップに裁断し、特開昭５７−６３４５２に開
示のプラスチックマウントに収めて総コレステロール定
量用化学分析スライドを完成した。

性能評価　実験−１ 上述の化学分析スライドを４℃相相対変５％以下と４５
℃相対湿度約４５％状能に３日間保存した時の発色光学
濃度値を比較した。各スライドにヘパリン採血したコレ
ステロール温度約４５０ｍｇ／ｄＬのヒト血漿を１０μ
β点着し３７℃６分間インキュベーションしたのち５４
０ｎｍの測定光でＰＥＴ支持体側から反射光学濃度を測
定した。

実験−２ 総コレステロール含有量の異なるヒト血漿について、標
準法としてＣ，Ｃ，Ａ１）ａｉｎ　ｅｔ　ａｌの溶液法
（ｒＣＬＩＮＩＣＡＬ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹＪ毅、　４
７０−４７５（１９７４））で総コレステロール値を求
めた。この値をもとにして、本発明および比較例の総コ
レステロール定量用一体型多層分析要素のヒト血漿用検
量線を作成した。

ついで中性脂肪温度約６２０ｍｇ／ｄＬのヒト血漿を用
い、実験−１と同様に操作して発色させ、前記検量線か
ら総コレステロール含有量を求めた。

実験−３ 総蛋白量約１）ｇ／ｃｌＬのヒト血漿を用いて実験−１
と同様に操作して発色させ、前記検量線から総コレステ
ロール含有量を求めた。

Ａ１）ａｉｎ　ｅｔ　ａｌの方法と上記の化学分析スラ
イドを用いて得られた実験−２及び−３のヒト血漿中の
総コレステロール含有量の比（化学分析スライドの値／
Ａ１）ａｉｎ　ｅｔ　ａｌの値）は第１表のとおりであ
った・ 第１表の値から、本発明の総コレステロール定量用一体
型多層分析要素は、４５℃４５％ＲＨａ日の加速劣化促
進試験後においても、発色光学濃度値の減少が１．３％
（以下）ときわめて少ないこと、標準測定法であるＣ、
　Ｃ，Ａ１）ａｉｎ　ｅｔ　ａｌの溶液法と同様に血液
中の中性脂肪の干渉（約マイナス１％）、総蛋白の干渉
（約マイナス３％）がきわめて少なく、総合性能として
標準法ときわめてよい相関を有することが明らかである
。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）光透過性水不透過性支持体の上に少なくとも１層
   の親水性ポリマーを含む層及び多孔性展開層がこの順に
   一体に積層されており、コレステロールエステラーゼ活
   性を有する少なくとも１種の酵素、コレステロールオキ
   シダーゼ、ペルオキシダーゼ、及び発色試薬組成物を含
   むコレステロール分析用呈色試薬組成物を含有する総コ
   レステロール定量用一体型多層分析要素において、多層
   分析要素内にさらに胆汁酸類、胆汁酸誘導体及びそれら
   の塩からなる群から選らばれた少なくとも１種の化合物
   、及び１６以上のオキシエチレン単位からなるポリオキ
   シエチレン鎖を含むアルキルフェノキシポリエトキシエ
   タノールを含有することを特徴とする総コレステロール
   定量用一体型多層分析要素。
2. （２）前記コレステロールエステラーゼ活性を有する酵
   素がコレステロールエステラーゼである特許請求の範囲
   第１項に記載の多層分析要素。
3. （３）前記胆汁酸類、胆汁酸誘導体及びそれらの塩から
   なる群がコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、
   ケノデオキシコール酸、タウロコール酸、グリコール酸
   、タウロデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、
   及びこれらのナトリウム塩、カリウム塩及びリチウム塩
   からなる群であり、前記アルキルフェノキシポリエトキ
   シエタノールのアルキル基が炭素原子数８又は９の直鎖
   状又は分岐アルキル基、ポリオキシエチレン鎖のオキシ
   エチレン単位の数が１６から６０の範囲である特許請求
   の範囲第１項に記載の多層分析要素。
4. （４）前記アルキルフェノキシポリエトキシエタノール
   のポリオキシエチレン鎖のオキシエチレン単位の数が平
   均２０から５０の範囲である特許請求の範囲第３項に記
   載の多層分析要素。
5. （５）前記コレステロールエステラーゼ活性を有する少
   なくとも１種の酵素、コレステロールオキシダーゼ、胆
   汁酸類、胆汁酸誘導体及びそれらの塩からなる群から選
   らばれた少なくとも１種の化合物、及びアルキルフェノ
   キシポリエトキシエタノールが前記展開層に含有されて
   いる特許請求の範囲第１項に記載の多層分析要素。